Summary
O presente protocolo descreve um método aprimorado para aumentar a co-expressão dos fatores de transcrição PDX1 e NKX6.1 em progenitores pancreáticos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em monocamadas planares. Isto é conseguido reabastecendo a matriz fresca, manipulando a densidade celular e dissociando as células endodérmicas.
Abstract
As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) são uma excelente ferramenta para estudar o desenvolvimento pancreático precoce e investigar os contribuintes genéticos para o diabetes. As células secretoras de insulina derivadas de hPSC podem ser geradas para terapia celular e modelagem de doenças, no entanto, com eficiência e propriedades funcionais limitadas. Os progenitores pancreáticos derivados de hPSC que são precursores de células beta e outras células endócrinas, quando co-expressam os dois fatores de transcrição PDX1 e NKX6.1, especificam os progenitores para células beta funcionais e secretoras de insulina, tanto in vitro quanto in vivo. Progenitores pancreáticos derivados de hPSC são atualmente usados para terapia celular em pacientes com diabetes tipo 1 como parte de ensaios clínicos. No entanto, os procedimentos atuais não geram uma alta proporção de NKX6.1 e progenitores pancreáticos, levando à cogeração de células endócrinas não funcionais e poucas células secretoras de insulina responsivas à glicose. Este trabalho desenvolveu, assim, um protocolo aprimorado para a geração de progenitores pancreáticos derivados de hPSC que maximizam a co-expressão de PDX1 e NKX6.1 em uma monocamada 2D. Fatores como densidade celular, disponibilidade de matriz fresca e dissociação de células endodérmicas derivadas de hPSC são modulados que aumentaram os níveis de PDX1 e NKX6.1 nos progenitores pancreáticos gerados e minimizaram o comprometimento com a linhagem hepática alternada. O estudo destaca que a manipulação do ambiente físico da célula durante a diferenciação in vitro pode afetar a especificação da linhagem e a expressão gênica. Portanto, o protocolo otimizado atual facilita a geração escalável de progenitores co-expressores PDX1 e NKX6.1 para terapia celular e modelagem de doenças.
Introduction
O diabetes é um distúrbio metabólico complexo que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. A suplementação de insulina é considerada a única opção de tratamento para diabetes. Casos mais avançados são tratados com terapia de reposição de células beta, obtida por meio de transplante de pâncreas cadavérico inteiro ou ilhotas 1,2. Diversas questões envolvem a terapia de transplante, como a limitação com a disponibilidade e qualidade do tecido, a invasividade dos procedimentos de transplante, além da necessidade contínua de imunossupressores. Isso requer a necessidade de descobrir opções novas e alternativas para a terapia de reposição de células beta 2,3. As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) emergiram recentemente como uma ferramenta promissora para a compreensão da biologia do pâncreas humano e como uma fonte não exaustiva e potencialmente mais personalizada para a terapia de transplante 4,5,6,7. As hPSCs, incluindo as células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e as células estaminais pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs), têm uma elevada capacidade de auto-renovação e dão origem a qualquer tipo de tecido do corpo humano. As hESCs são derivadas da massa celular interna do embrião e as hiPSCs são reprogramadas a partir de qualquer célula somática 4,8.
Os protocolos de diferenciação dirigida são otimizados para gerar células beta pancreáticas a partir de hPSCs que direcionam sequencialmente as hPSCs através dos estágios de desenvolvimento pancreático invitro. Esses protocolos geram organoides de ilhotas derivados de hPSC. Embora tenham melhorado muito no aumento da proporção de células beta pancreáticas, a eficiência dos protocolos é altamente variável. Não aumenta para mais de ~40% das células NKX6.1+/INSULIN+ ou C-PEPTIDE+ 5,9,10,11,12,13. No entanto, as células beta geradas não são inteiramente idênticas às células beta humanas adultas em termos de seus perfis transcricionais e metabólicos e sua resposta à glicose 4,5,14. As células beta derivadas de hPSC não têm expressão gênica de marcadores de células beta chave, como PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 e KCNK3 em comparação com ilhotas humanas adultas5. Além disso, as células beta derivadas de hPSC diminuíram a sinalização de cálcio em resposta à glicose. Eles estão contaminados com as células poli-hormonais cogeradas que não secretam quantidades adequadas de insulina em resposta ao aumento dos níveis de glicose5. Por outro lado, os progenitores pancreáticos derivados de hPSC, que são precursores de ilhotas, poderiam ser gerados de forma mais eficiente in vitro em comparação com as células beta e, quando transplantados in vivo, poderiam amadurecer em células beta funcionais e secretoras de insulina15,16. Os ensaios clínicos estão atualmente focados em demonstrar sua segurança e eficácia após o transplante em indivíduos com DM1.
Notavelmente, a expressão dos fatores de transcrição PDX1 (Pancreatic and Duodenal Homeobox 1) e NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) dentro da mesma célula progenitora pancreática é crucial para o comprometimento com uma linhagem de células beta5. Progenitores pancreáticos que não expressam NKX6.1 dão origem a células endócrinas poli-hormonais ou células beta não funcionais17,18. Portanto, uma alta co-expressão de PDX1 e NKX6.1 no estágio progenitor pancreático é essencial para gerar um grande número de células beta funcionais. Estudos têm demonstrado que um corpo embrionário ou cultura 3D aumenta PDX1 e NKX6.1 em progenitores pancreáticos onde as células diferenciadoras são agregadas, variando entre 40%-80% da população PDX1+/NKX6.1+12,19. No entanto, em comparação com as culturas de suspensão, as culturas de diferenciação 2D são mais econômicas, viáveis e convenientes para aplicação em múltiplas linhagens celulares5. Recentemente, mostramos que as culturas de diferenciação de monocamadas produzem mais de até 90% de progenitores pancreáticos derivados de hPSC coexpressivos PDX1+/NKX6.1+20,21,22. O método relatado conferiu alta capacidade de replicação aos progenitores pancreáticos gerados e evitou especificações de destino alternativo, como a linhagem hepática21. Portanto, neste documento, este protocolo demonstra um método altamente eficiente para a diferenciação de hPSCs para precursores de células beta pancreáticas co-expressando PDX1 e NKX6.1. Este método utiliza a técnica de dissociação da endoderme derivada da hPSC e manipulação da densidade celular, seguida de uma sinalização estendida de FGF e Retinóide, bem como inibição de Hedgehog para promover a co-expressão de PDX1 e NKX6.1 (Figura 1). Este método pode facilitar uma geração escalável de precursores de células beta pancreáticas derivados de hPSC para terapia de transplante e modelagem de doenças.
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Protocol
O estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa institucional apropriado e realizado de acordo com os padrões éticos estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1964 e suas alterações posteriores ou padrões éticos comparáveis. O protocolo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) do HMC (nº 16260/16) e pelo Qatar Biomedical Research Institute (QBRI) (nº 2016-003). Este trabalho é otimizado para hESCs como H1, H9 e HUES8. Amostras de sangue foram obtidas de indivíduos saudáveis do hospital Hamad Medical Corporation (HMC) com consentimento informado completo. As iPSCs são geradas a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de controle, indivíduo saudável23.
1. Preparação dos meios de cultura
- Preparar meios de cultura de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)
- Preparar meios de cultura hPSC a partir do meio comercialmente disponível para manter e expandir células-tronco embrionárias humanas suplementando 100 unidades/mL de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina (ver Tabela de Materiais). Aliquotar e conservar o meio completo a -20 °C a longo prazo ou a 4 °C para utilização imediata.
- Preparar meios de diferenciação de Estágio 1 (para Endoderme Definitivo (DE)).
- Preparar meios basais a partir de meios MCDB 131 suplementando com 0,5% de albumina sérica bovina isenta de ácidos gordos (FFA-BSA), 1,5 g/L de bicarbonato de sódio (NaHCO3), 10 mM de glicose, 2 mM de glutamax, 100 unidades/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina (ver Tabela de Materiais). Filtrar o meio preparado utilizando um filtro de 0,2 μm e conservar a 4 °C.
- Preparar o meio de Estágio 1 contendo CHIR99021 do meio basal (preparado na etapa 1.2.1) aquecendo o meio basal a 37 °C e, em seguida, suplementando com 2 μM de CHIR99021, 100 ng/mL de Activin A, 10 μM de inibidor de rocha (Y-27632) e 0,25 mM de vitamina C (ver Tabela de Materiais). Misture bem o meio suplementado e cubra-o com papel alumínio para protegê-lo da luz.
NOTA: Esta mídia será usada somente no primeiro dia de diferenciação. - Prepare o meio de Estágio 1 sem CHIR99021 do meio Basal, aquecendo-o a 37 °C e suplementando-o com 100 ng/mL de Activin A e 0,25 mM de vitamina C e misture bem.
NOTA: 5 ng/mL de FGF básico ou FGF2 podem ser opcionalmente adicionados a este meio. Esta mídia será usada para os dias restantes da Fase 1.
- Preparar meios de diferenciação de Estágio 2 (para Tubo Intestinal Primitivo; PGT).
- Preparar o meio de diferenciação do Estágio 2 contendo inibidor de rocha do meio basal, aquecendo-o a 37 °C e suplementando com 50 ng/mL de FGF10, 50 ng/mL de NOGGIN, 0,25 μM de CHIR99021, 10 μM de Y-27632 (inibidor de rocha) e 0,25 mM de vitamina C.
NOTA: Este meio é usado no dia da dissociação das células endodérmicas. - Preparar o meio de diferenciação da fase 2 sem inibidor de rocha seguindo o mesmo procedimento para o meio preparado no passo 1.3.1, excluindo o inibidor de rocha.
Observação : essa mídia é usada no segundo dia do estágio 2.
- Preparar o meio de diferenciação do Estágio 2 contendo inibidor de rocha do meio basal, aquecendo-o a 37 °C e suplementando com 50 ng/mL de FGF10, 50 ng/mL de NOGGIN, 0,25 μM de CHIR99021, 10 μM de Y-27632 (inibidor de rocha) e 0,25 mM de vitamina C.
- Prepare o meio de diferenciação do Estágio 3 (para o Intestino Anterior Posterior).
- Preparar meios DMEM contendo 4,5 g/L de glicose, em seguida, suplementar com 1% de penicilina-estreptomicina e 2 mM de glutamax e usar como meio basal para os estágios 3 e 4.
- Aqueça o meio DMEM (preparado na etapa 1.4.1) e suplemente com 2 μM de ácido retinóico, 0,25 μM de SANT-1, 50 ng/mL de FGF10, 50 ng/mL de NOGGIN, 0,25 mM de vitamina C e suplemento de B27 a 1% sem vitamina A (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Esta mídia é usada para 4 dias do Estágio 3 para P2-D (Protocolo 2, otimizado, dissociado) e 2 dias do Estágio 3 para P1-ND (Protocolo 1, não otimizado, não dissociado).
- Prepare o meio de diferenciação do Estágio 4 (para Progenitores Pancreáticos).
- Adicione DMEM contendo 4,5 g/L de glicose com 100 ng/mL de EGF, 10 mM de nicotinamida, 50 ng/mL de NOGGIN, 0,25 mM de vitamina C e 1% de suplemento de B27 sem vitamina A (ver Tabela de Materiais). Use essa mídia para todos os dias do Estágio 4.
NOTA: Mantenha todos os reagentes a temperaturas apropriadas e todos os reagentes sensíveis e citocinas precisam ser alíquotados. Descongelar os reagentes alicitados e adicionar ao meio basal no momento da mudança do meio de diferenciação. As composições dos diferentes meios de diferenciação são apresentadas na Tabela 1.
- Adicione DMEM contendo 4,5 g/L de glicose com 100 ng/mL de EGF, 10 mM de nicotinamida, 50 ng/mL de NOGGIN, 0,25 mM de vitamina C e 1% de suplemento de B27 sem vitamina A (ver Tabela de Materiais). Use essa mídia para todos os dias do Estágio 4.
2. Preparação de pratos revestidos de matriz de membrana basal
- Descongelar a matriz de cave comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) e a alíquota no gelo; congelar as alíquotas a -20 °C.
- Antes de revestir as placas de cultura de tecidos, descongele as alíquotas congeladas no gelo. Adicionar o volume adequado da solução da matriz de membrana ao meio KO-DMEM/F-12 refrigerado (KnockOut DMEM/F-12) (ver Tabela de Materiais) para atingir a concentração diluída desejada e misturar bem. Conservar a solução de matriz diluída a 4 °C para utilização imediata.
- Cobrir a superfície das placas tratadas com cultura de tecidos (ver Tabela de Materiais) com solução de matriz de membrana diluída e colocar as placas a 37 °C durante, pelo menos, 60 minutos antes de chapear as células. Utilizar uma diluição de 1:50 da solução de matriz de membrana em KO-DMEM/F-12 para células de revestimento para experimento de diferenciação pancreática e 1:80 para expansão de hPSCs indiferenciadas.
3. Cultura de hPSCs indiferenciadas
- Passar as hPSCs quando as colônias atingirem uma confluência de 70% a 80%.
- Para a passagem, lave as hPSCs uma vez com PBS quente, aspirar usando um aspirador de vácuo portátil dentro do exaustor de cultura de tecidos e adicione 0,5 mM de solução de EDTA em PBS para cobrir a superfície da colônia. Incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 1 min ou até que as bordas das colónias se desprendam da superfície da placa.
- Remover a solução de EDTA e recolher as colónias de descolamento com meio de cultura hPSC utilizando uma micropipeta P1000. Centrifugar as células recolhidas a 128 x g durante 4 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e suplemente as células com meios de cultura de hPSC contendo 10 μM de Y-27632 (inibidor de rocha)23,24.
NOTA: Passar as hPSCs em pelo menos uma proporção de 1:3 em placas revestidas de matriz de membrana de 1:80. No entanto, para experimentos de diferenciação, pratique as hPSCs em pratos revestidos de 1:50.
4. Indução da diferenciação definitiva do endoderme (DE) em hPSCs (Estágio 1)
- Quando as colônias de hPSC atingirem uma confluência de 70%-80%, lave-as duas vezes com PBS quente e aspirar usando um aspirador de vácuo portátil dentro do exaustor de cultura de tecidos para iniciar a diferenciação do Estágio 1.
- Adicionar meio de diferenciação de Estágio 1 contendo CHIR99021 (da etapa 1.2.2) às colônias, 2 mL por placa de 6 poços, e incubar a 37 °C por 24 h.
- No dia seguinte, substitua a mídia gasta pelo meio de diferenciação do Estágio 1 sem CHIR99021 (etapa 1.2.3).
- A cada 24 h, aspirar o meio gasto usando um aspirador de vácuo portátil dentro do exaustor de cultura de tecidos e substituí-lo por um meio de diferenciação Estágio 1 fresco sem CHIR99021.
NOTA: A fase 1 pode ser prolongada até 4 dias. O comprimento do Estágio 1 depende da linha hPSC que está sendo usada e deve ser otimizado de acordo.
5. Análise de imunofluorescência do DE derivado de hPSC (Estágio 1)
- Para imunofluorescência, aspirar o meio gasto usando um aspirador de vácuo portátil dentro do exaustor de cultura de tecidos dos poços e lavar duas vezes com PBS quente. Gire a placa para se livrar de quaisquer detritos celulares.
- Cobrir a superfície dos poços com 4% de paraformaldeído (PFA) para fixar as células DE; por exemplo, adicione 250 uL de PFA por poço de uma placa de 24 poços. Coloque a placa em um agitador 2D a 20 x g por 20 min.
- Após a fixação, lavar as células DE com solução salina tristamponada com 0,5% de Tween (TBST) (ver Tabela de Materiais) e colocar a placa no agitador a 20 x g durante 10 min. Repita este passo mais uma vez.
- Permeabilizar as células fixas adicionando um volume generoso de solução salina tamponada com fosfato com 0,5% de Triton X-100 (PBST); por exemplo, adicione 1 mL de PBST por poço de uma placa de 24 poços e coloque a placa de volta no agitador a 20 x g por 20 min.
- Preparar recentemente 5%-6% de BSA em PBST como tampão de bloqueio e adicioná-lo às células permeabilizadas. Incubar a placa durante, pelo menos, 1 h na solução de bloqueio no agitador.
- Diluir os anticorpos primários contra SOX17 e FOXA2 em conjunto (ver Tabela de Materiais) em BSA a 2%-3% em solução de PBST. Adicionar os anticorpos combinados às células bloqueadas e colocar a placa no agitador a 4 °C durante a noite a uma velocidade baixa com agitação suave.
NOTA: SOX17 e FOXA2 são marcadores DE bem estabelecidos25,26. - No dia seguinte, aspirar os anticorpos primários usando um filtro de vácuo portátil e lavar os poços com TBST três vezes, cada uma lavando por 10 minutos no agitador.
- Preparar 1:500 diluição de Alexa fluor 488- e 568- anticorpos secundários conjugados (ver Tabela de Materiais) contra as espécies em que os anticorpos primários foram criados.
- Adicione a combinação secundária de anticorpos ao poço corado e cubra a placa com papel alumínio para proteger da luz. Coloque a placa no agitador durante 1 h à temperatura ambiente.
- Aspirar a solução de anticorpos secundários utilizando um filtro de vácuo portátil e lavar os poços corados com TBST no agitador durante 10 min, cobrindo a placa com folha. Repita a etapa de lavagem um total de três vezes.
- Preparar uma diluição de 1 μg/ml de Hoechst 33342 em PBS para corar os núcleos. Adicione a solução Hoechst aos poços e coloque a placa no agitador durante 2-3 min.
- Aspirar a solução Hoechst utilizando um filtro de vácuo portátil e enxaguar os poços com PBS duas vezes.
- Finalmente, adicione PBS às células coradas e visualize-as usando um microscópio de fluorescência invertida (consulte Tabela de Materiais) no escuro. Mantenha a placa coberta com papel alumínio quando não estiver de imagem para minimizar o branqueamento do fluoróforo.
NOTA: Alternativamente, a citometria de fluxo pode ser usada para avaliar a eficiência da EAD, conforme descrito na etapa 9.2.
6. Geração do tubo intestinal primitivo (PGT) a partir de hPSCs (Estágio 2)
NOTA: Se a análise de imunofluorescência na etapa 5.13 for determinada como sendo uma co-expressão SOX17-FOXA2 de 80% e acima, o experimento prossegue para o estágio 2. Se a eficiência for <80%, estenda a duração do Estágio 1 a 4 dias.
- No dia 1 do Estágio 2, dissociar as células endodérmicas derivadas de hPSC usando TrypLE ou Accutase (ver Tabela de Materiais) para o protocolo P2-D otimizado. Lave as células aderentes com PBS quente e adicione 1 ml de solução de TrypLE ou Accutase a quente por poço de uma placa de 6 poços durante 3-5 min a 37 °C, 5% de CO2, ou até que as células comecem a desligar-se umas das outras.
- Dissociar as folhas separadas ou a monocamada de células nos poços e, em seguida, recolhê-las juntas em um tubo de polipropileno de 15 mL usando meios basais de estágio 1/2 sem citocinas contendo pelo menos 0,5% de soro fetal bovino (FBS) ou soro KnockOut (KOSR) (ver Tabela de Materiais).
- Girar as células a 800 x g durante 5 minutos a 4 °C e eliminar o sobrenadante. Adicione 1 mL de PBS estéril e ressuspenda o pellet em células únicas.
- Conte as células usando um contador automatizado (consulte Tabela de materiais) carregando o volume recomendado de células no slide da câmara. Girar as células ressuspensas a 800 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet no volume apropriado do meio de diferenciação do estágio 2 contendo inibidor de rocha a uma densidade de 2,5-3,5 x 105 células/cm2.
NOTA: Esta contagem pode descer para uma proporção de divisão de 1:2 para a maioria das linhagens celulares, dependendo da taxa de proliferação. O volume total será de 2 mL de meio com células ressuspensas em 1 poço de placa de 6 poços. - Chapear as células ressuspensas em placas revestidas de matriz de membrana 1:50 (preparadas na etapa 2) e incubá-las a 37 °C, 5% de CO2 na incubadora.
- 24 h mais tarde, substituir o meio por meio de diferenciação de estádio 2 sem inibidor de rocha (preparado no passo 1.3.2).
7. Geração de intestino anterior posterior a partir de hPSCs (Estágio 3)
- Aspirar o meio Estágio 2 gasto usando um aspirador de vácuo portátil dentro do exaustor de cultura de tecidos e lavar as células com PBS quente.
- Adicionar meios de diferenciação da fase 3 da fase 1.4 às células e incubar a 37 °C, 5% de CO2.
- Após 24 h, substitua a mídia gasta por uma mídia de diferenciação Stage 3 recém-preparada. Repita isso por um total de 4 dias para o protocolo P2-D (otimizado) e apenas 2 dias para o P1-DE não dissociado.
8. Geração de Progenitores Pancreáticos a partir de hPSCs (Estágio 4)
- Após 4 dias de tratamento de Estágio 3, lave as células com PBS quente, gire suavemente a placa e aspire usando um aspirador de vácuo portátil. Em seguida, adicione a mídia de diferenciação do Estágio 4 da etapa 1.5 às células.
- Após 24 horas, substitua a mídia gasta por uma mídia recém-preparada do Estágio 4. Repita isso por um total de 4 dias.
9. Avaliação da eficiência de diferenciação de progenitores pancreáticos geradores de hPSCs
- Realizar a análise de imunofluorescência dos progenitores pancreáticos derivados de hPSC (Estágio 4) para expressão de PDX1 e NKX6.1.
NOTA: PDX1 e NKX6.1 são marcadores progenitores pancreáticos bem estabelecidos17,18.- Realizar fixação, permeabilização, bloqueio e incubação e lavagens de anticorpos de acordo com a etapa 5.
- Coloração dos progenitores pancreáticos derivados de hPSC com uma combinação de anticorpos PDX1 e NKX6.1 (ver Tabela de Materiais) diluídos em 2%-3% de BSA em PBST.
- Use diluições de 1:500 de anticorpos secundários conjugados Alexa fluor 488 e 568 apropriados (ver Tabela de Materiais).
- Realizar análise de citometria de fluxo de progenitores pancreáticos derivados de hPSC para expressão de PDX1 e NKX6.1.
NOTA: A análise por citometria de fluxo de marcadores pancreáticos nos progenitores pancreáticos derivados de hPSC gerados fornece uma maneira de quantificar as células co-expressas de PDX1 e NKX6.1.- No final do Estágio 4, lave as células duas vezes com PBS quente e adicione TrypLE ou Accutase suficientes para cobrir a superfície dos poços, por exemplo, 1 mL de TrypLE ou Accutase por poço de placa de 6 poços. Coloque a placa na incubadora por 5-7 min ou até que as células se desprendam da superfície.
- Dissociar as folhas aderentes de células dentro do poço usando uma micropipeta P1000 antes de coletá-las em um tubo de polipropileno de 15 mL.
- Gire as células em progenitores pancreáticos derivados de hPSC a 800 x g durante 5 min a 4 °C e, em seguida, elimine o sobrenadante. Lave as células com PBS, dissociando-as em células únicas. Conte as células usando um contador automatizado (consulte Tabela de Materiais) e observe a concentração no número de células por mL.
- Gire a 800 x g durante 5 min a 4 °C e elimine o sobrenadante. Adicionar 200 μL de PBS refrigerado ao pellet e dissociar.
- Adicionar 2 mL de etanol refrigerado a 80% gota a gota, com o tubo sobre um vórtice a baixa velocidade média (400 x g à temperatura ambiente). Fechar bem as tampas e colocar os tubos ligeiramente inclinados sobre o agitador a 4 °C durante a noite.
- Girar as células a 800 x g durante 5 min a 4 °C e lavar com PBS para dissociar quaisquer aglomerados de células fixas.
- Bloquear as células fixas com solução de BSA a 5%-6% em PBST durante, pelo menos, 1 h à temperatura ambiente ou 4 °C durante a noite no agitador.
- Coloração para os marcadores progenitores pancreáticos seguindo os passos abaixo.
- Distribuir 2.00.000 células por condição, incluindo controles isotípicos apropriados dependentes da subclasse IgG da espécie hospedeira do anticorpo primário, controles de anticorpos não corados e secundários em uma placa inferior de 96 poços V ou tubos de centrífuga de 1,5 mL.
- Gire a placa a 800 x g durante 5 minutos a 4 °C e vire a placa com um movimento rápido para eliminar o sobrenadante sem perder os pellets. Preparar diluições de anticorpos primários em solução de BSA a 3% (ver Tabela de Materiais).
NOTA: A concentração de anticorpos primários pode ser entre 1:50 e 1:200. - Incubar as células coradas durante, pelo menos, 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C num agitador com agitação suave a baixa velocidade.
- Lave as células coradas com TBST três vezes, pipetando as células para cima e para baixo nos poços. Gire e descarte o sobrenadante como na etapa 9.2.8.2.
- Adicionar diluição de 1:500 de anticorpos secundários (anticorpos conjugados Alexa fluor 488 e 647) preparados em PBS (ver Tabela de Materiais). Incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
- Lave as células coradas com TBST pelo menos duas vezes, pipetando as células para cima e para baixo. Gire a placa e elimine o sobrenadante como indicado no passo 9.2.8.2.
- Recolher as células coradas em, pelo menos, 100 μL de PBS e transferi-las para tubos FACS protegidos contra a luz (ver Tabela de Materiais). Execute as amostras em uma máquina de citometria de fluxo.
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Representative Results
Os resultados mostram que o protocolo otimizado P2-D (Figuras 1A) aumentou a eficiência de diferenciação do progenitor pancreático ao regular positivamente a co-expressão de PDX1 e NKX6.1 (Figura 2A, B e Figura 3A). Em particular, os resultados mostraram que a dissociação das células endodérmicas e seu replating na matriz de membrana fresca, juntamente com uma duração mais longa do Estágio 3, aumentaram a expressão de NKX6.1 em progenitores pancreáticos derivados de hPSC (protocolo otimizado, P2-D) (Figura 2 e Figura 3A), em comparação com o protocolo não dissociado (P1-ND) que foi modificado de um estudo publicado anteriormente27 . O presente protocolo aprimorado também gerou a maior proporção de progenitores PDX1+/NKX6.1+ em comparação com "P1-D" (Protocolo 1, S3 = 2 dias, dissociado) e "P2-ND" (Protocolo 2, S3 = 4 dias, não dissociado), e os resultados detalhados foram publicados anteriormente21. Progenitores pancreáticos gerados usando P2-D também têm um número aumentado de células SOX9+ em comparação com o P1-ND não dissociado (Figura 3B). O método otimizado também gerou maior proporção de células proliferativas NKX6.1+ que co-expressam o marcador de proliferação Ki67 (Figura 3C).
Os resultados representativos aqui apresentados são de iPSCs geradas a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de indivíduo controle e saudável. No entanto, aplicamos de forma reprodutível o protocolo aprimorado atual em várias linhas de hPSC, como H1-hESCs, H9-hESCs, HUES8-hESCs e várias outras linhas de iPSC de controle para produzir ~90% de progenitores pancreáticos co-expressos PDX1 e NKX6.120,21,28.
Após a indução de DE em hPSCs, níveis leves de morte celular são esperados. No entanto, se uma alta taxa de mortalidade celular fosse observada, o experimento era interrompido e recomeçado com um novo lote de células. A eficiência da indução de DE deve ser superior a 70%-80% para garantir uma alta proporção de células DE na cultura que servirá como fonte de partida ideal para a indução de progenitores pancreáticos (Figura 1C).
A densidade de células endodérmicas replatantes após a dissociação pode ser manipulada com base na taxa de crescimento dessa célula em particular. Por exemplo, células de crescimento lento podem ser rechapeadas a uma densidade maior do que a recomendada. Isso minimizará as chances de obtenção de populações pancreáticas irrelevantes no Estágio 4. Uma alta co-expressão de PDX1 e NKX6.1 pode ser obtida após dissociação após o Estágio 1 e replating a meia densidade (Figura 1A, Figura 2A,B e Figura 3A). Se uma alta expressão de PDX1 for observada, mas apenas uma expressão moderada de NKX6.1, o Estágio 4 pode ser estendido por 2 dias para melhorar a expressão de NKX6.1 em células que expressam PDX1.
Figura 1: Linha do tempo para a adição de citocinas e fatores de crescimento durante a diferenciação do progenitor pancreático. (A) Representação esquemática do protocolo otimizado (P1-D) para geração de PDX1 e NKX6.1 a partir de hPSCs. A endoderme definitiva (DE) derivada da hPSC é dissociada e rechapeada a meia densidade e, em seguida, sequencialmente direcionada para um destino progenitor pancreático. (B) Imagens de hPSCs em campo brilhante antes de iniciar a diferenciação no Dia 0. (C) Análise de imunocoloração para expressão de marcadores endodérmicos SOX17 e FOXA2 em células endodérmicas derivadas de hPSC (Estágio 1). SOX17, verde; FOXA2, vermelho. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Geração de progenitores pancreáticos derivados de hPSC, co-expressando PDX1 e NKX6.1. Análise de imunocoloração para comparação da expressão de PDX1 e NKX6.1 em progenitores pancreáticos derivados de hPSC usando o protocolo aprimorado (P2-D) (A) e um protocolo não otimizado e previamente publicado (P1-ND) (B). O protocolo aprimorado alcançou a maior co-expressão de PDX1 e NKX6.1. PDX1, verde; NKX6.1, vermelho. Imagens ampliadas são fornecidas no segundo painel para cada protocolo. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação de marcadores pancreáticos em progenitores pancreáticos gerados pelo protocolo aprimorado. A análise por citometria de fluxo em progenitores pancreáticos derivados de hPSC resultou no uso de P2-D em comparação com o P1-DE não dissociado. (A) Histogramas para expressão de PDX1 e NKX6.1 e gráficos de coloração duplamente positivos. (B) Os histogramas para expressão de SOX9 e (C) co-expressão de NKX6.1 com o marcador de proliferação Ki67. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Palco | Mídia | Citocinas | Dias | ||||||
| 1 | MCDB 131 meio + 0,5% de albumina sérica bovina livre de ácidos graxos (FFA-BSA), 1,5 g/L de bicarbonato de sódio (NaHCO3), 10 mM de glicose | Dia 1: 2 μM CHIR99021, 100 ng/mL de Activin A, 10 μM Inibidor de rocha (Y-27632), 0,25 mM de vitamina C. Dia 2 em diante: 100 ng/mL Activin A, 0,25 mM Vitamina C | 3 ou 4 | ||||||
| 2 | MCDB 131 meio + 0,5% de albumina sérica bovina isenta de ácidos gordos (FFA-BSA), 1,5 g/L de bicarbonato de sódio (NaHCO3), 10 mM de glucose | Dia 1 (Dissociação): 50 ng/mL FGF10, 50 ng/mL NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 10 μM Y-27632 (Inibidor de rochas), 0,25 mM de vitamina C. Dia 2: 50 ng/mL FGF10, 50 ng/mL NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 0,25 mM de vitamina C. | 2 | ||||||
| 3 | DMEM + 4,5 g/L de glicose | 2 μM de ácido retinóico, 0,25 μM SANT-1, 50 ng/mL FGF10, 50 ng/mL NOGGIN, 0,25 mM de vitamina C, suplemento de B27 a 1% sem vitamina A | 4 | ||||||
| 4 | DMEM + 4,5 g/L de glicose | 100 ng/mL EGF, 10 mM Nicotinamida, 50 ng/mL NOGGIN, 0,25 mM Vitamina C, 1% B27 suplemento sem vitamina A. | 4 | ||||||
Tabela 1: As composições dos diferentes meios de diferenciação utilizados no estudo.
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Discussion
Este trabalho descreve um protocolo aprimorado para a geração de progenitores pancreáticos a partir de hPSCs com alta co-expressão de PDX1 e NKX6.1. A dissociação e o replating da endoderma derivada de hPSC à meia densidade em matriz fresca resultaram em PDX1 e NKX6.1 mais elevados em progenitores pancreáticos derivados de hPSC.
Embora o coquetel do fator de crescimento para cada estágio seja altamente semelhante ao P1-ND 27, foi demonstrado que um tratamento mais prolongado do Estágio 3, incluindo sinalização FGF e retinóide e inibição de BMP e ouriço, aumenta a expressão de NKX6.1, o que contrasta com os achados de Nostro et al.27. Enquanto a expressão de PDX1 no pâncreas durante o desenvolvimento embrionário é regulada positivamente pela sinalização FGF e retinóide e inibição de BMP e ouriço27,29,30, os presentes resultados demonstraram a extensão desse coquetel de sinalização também regula positivamente a NKX6.1. No entanto, o efeito de um tratamento prolongado de Estágio 3 foi auxiliado pela dissociação e replatização das células endodérmicas que levaram ao aumento da expressão de PDX1 e NKX6.1. Além disso, esse método (P2-D) também aumentou as células expressivas de SOX9 em progenitores pancreáticos derivados de hPSC, além da proporção de células proliferativas de NKX6.1+ que coexpressam o marcador de proliferação Ki67.
Outro fator crucial que afetou a eficiência da diferenciação foi a disponibilidade de matriz de membrana fresca para as células dissociadas. Os componentes da matriz extracelular foram previamente demonstrados para regular a especificação do destino das células-tronco31,32. De modo geral, os efeitos favoráveis dos componentes da matriz extracelular sobre o desenvolvimento pancreático foram registrados 33,34,35, particularmente para a matriz de membrana, que, juntamente com a laminina, demonstrou ter um efeito pró-endócrino sobre as células da linhagem pancreática 36. Portanto, o replating de células endodérmicas na matriz de membrana fresca pode ter aumentado a expressão de NKX6.1 em progenitores pancreáticos derivados de hPSC.
A densidade celular das células diferenciadoras também controla a expressão gênica. Múltiplos estudos têm demonstrado a importância do contato célula-célula na regulação do desenvolvimento pancreático37,38,39. Demonstrou-se que a agregação celular ou a formação do corpo embrionário induzem maior expressão gênica endócrina pancreática do que as culturas 2D19. No entanto, os resultados demonstram que maior expressão pancreática, especialmente NKX6.1, pode ser obtida pela cultura de células em monocamada 2D a metade da densidade endodérmica usando nosso protocolo otimizado21. Curiosamente, esse método também inibiu o destino das células hepáticas (o destino alternativo da DE derivada da hPSC), como observado pela diminuição da expressão dos genes hepáticos AFP (Alfa-fetoproteína) e ALB (Albumina)21, indicando que fatores físicos desempenham um papel na especificação da linhagem das hPSCs.
De modo geral, os resultados demonstram que a modulação do ambiente físico das células diferenciadoras pode aumentar a expressão gênica pancreática21. Especificamente, a dissociação da endoderme derivada de hPSC e o replating na matriz de membrana fresca com uma sinalização mais longa de FGF e retinóide e inibição de ouriço e BMP podem aumentar a co-expressão de PDX1 e NKX6.1 em progenitores pancreáticos derivados de hPSC. No entanto, o protocolo otimizado é pelo menos 2 dias a mais do que os protocolos publicados anteriormente. Além disso, a duração do Estágio 4 pode ser estendida além do mínimo recomendado, ou seja, 4 dias, com base na linhagem celular que está sendo usada. Múltiplos fatores de crescimento humano recombinantes são empregados no protocolo otimizado que podem ser substituídos por seus compostos de moléculas pequenas e menos dispendiosas que executam a mesma ação. No entanto, esse protocolo otimizado pode facilitar a geração escalável de progenitores pancreáticos a partir de hPSCs para terapia celular e modelagem de doenças.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma doação do Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
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