Summary
Detta protokoll beskriver en förbättrad metod för att öka samuttrycket av PDX1- och NKX6.1-transkriptionsfaktorer i pankreasförfäder härledda från humana pluripotenta stamceller (hPSC) i plana monolager. Detta uppnås genom att fylla på den färska matrisen, manipulera celldensiteten och dissociera de endodermala cellerna.
Abstract
Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) är ett utmärkt verktyg för att studera tidig bukspottkörtelutveckling och undersöka de genetiska bidragsgivarna till diabetes. hPSC-härledda insulinutsöndrande celler kan genereras för cellterapi och sjukdomsmodellering, dock med begränsad effektivitet och funktionella egenskaper. hPSC-härledda pankreasförfäder som är föregångare till betaceller och andra endokrina celler, när de tillsammans uttrycker de två transkriptionsfaktorerna PDX1 och NKX6.1, specificerar förfäderna till funktionella, insulinutsöndrande betaceller både in vitro och in vivo. hPSC-härledda pankreasprogenitorer används för närvarande för cellterapi hos typ 1-diabetespatienter som en del av kliniska prövningar. Nuvarande procedurer genererar emellertid inte en hög andel NKX6.1 och pankreasförfäder, vilket leder till samgenerering av icke-funktionella endokrina celler och få glukosresponsiva, insulinutsöndrande celler. Detta arbete utvecklade således ett förbättrat protokoll för att generera hPSC-härledda pankreasförfäder som maximerar samuttrycket av PDX1 och NKX6.1 i ett 2D-monolager. Faktorerna såsom celltäthet, tillgänglighet av färsk matris och dissociation av hPSC-härledda endodermala celler moduleras som förstärkte PDX1- och NKX6.1-nivåerna i de genererade pankreasförfäderna och minimerade engagemanget för alternativ leverlinje. Studien belyser att manipulering av cellens fysiska miljö under in vitro-differentiering kan påverka härstamningsspecifikation och genuttryck. Därför underlättar det nuvarande optimerade protokollet den skalbara genereringen av PDX1- och NKX6.1-samuttryckande förfäder för cellterapi och sjukdomsmodellering.
Introduction
Diabetes är en komplex metabolisk störning som påverkar miljontals människor globalt. Tillskott av insulin anses vara det enda behandlingsalternativet för diabetes. Mer avancerade fall behandlas med betacellsersättningsterapi, uppnådd genom transplantation av antingen hela kadaveriska bukspottkörteln eller holmar 1,2. Flera frågor omger transplantationsterapi, såsom begränsning med vävnadens tillgänglighet och kvalitet, invasivitet av transplantationsprocedurer utöver det kontinuerliga behovet av immunsuppressiva medel. Detta kräver att man upptäcker nya och alternativa alternativ för betacellsersättningsterapi 2,3. Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) har nyligen framträtt som ett lovande verktyg för att förstå mänsklig bukspottkörtelbiologi och som en icke-uttömmande och potentiellt en mer personlig källa för transplantationsterapi 4,5,6,7. HPSC, inklusive mänskliga embryonala stamceller (hESC) och humaninducerade pluripotenta stamceller (hiPSC), har en hög självförnyelsekapacitet och ger upphov till alla vävnadstyper i människokroppen. hESC härrör från embryots inre cellmassa, och hiPSC omprogrammeras från vilken somatisk cellsom helst 4,8.
Riktade differentieringsprotokoll är optimerade för att generera betaceller i bukspottkörteln från hPSC som sekventiellt leder hPSC genom pankreasutvecklingsstadier invitro. Dessa protokoll genererar hPSC-härledda öorganoider. Medan de har förbättrats avsevärt för att öka andelen beta-celler i bukspottkörteln däri, är protokollens effektivitet mycket varierande. Det ökar inte till mer än ~ 40% av NKX6.1 + / INSULIN + eller C-PEPTIDE + celler 5,9,10,11,12,13. De genererade betacellerna är emellertid inte helt identiska med de vuxna humana betacellerna när det gäller deras transkriptionella och metaboliska profiler och deras svar på glukos 4,5,14. De hPSC-härledda betacellerna saknar genuttryck av viktiga betacellmarkörer som PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 och KCNK3 jämfört med vuxna människor öar5. Dessutom har de hPSC-härledda betacellerna minskat kalciumsignalering som svar på glukos. De är förorenade med de samgenererade polyhormonella cellerna som inte utsöndrar lämpliga mängder insulin som svar på ökande glukosnivåer5. Å andra sidan skulle hPSC-härledda pankreasförfäder, som är öprekursorer, kunna genereras mer effektivt in vitro jämfört med betaceller och, när de transplanteras in vivo, mogna till funktionella, insulinutsöndrande betaceller15,16. Kliniska prövningar är för närvarande inriktade på att visa deras säkerhet och effekt vid transplantation hos T1D-försökspersoner.
I synnerhet är uttryck av transkriptionsfaktorerna PDX1 (Pankreas och Duodenal Homeobox 1) och NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) inom samma pankreasstamcell avgörande för engagemang mot en betacellslinje5. Bukspottkörtelprogenitorer som inte uttrycker NKX6.1 ger upphov till polyhormonella endokrina celler eller icke-funktionella betaceller17,18. Därför är ett högt samuttryck av PDX1 och NKX6.1 i bukspottkörtelns stamfaderstadium avgörande för att i slutändan generera ett stort antal funktionella betaceller. Studier har visat att en embryoidkropp eller 3D-odling förbättrar PDX1 och NKX6.1 hos pankreasförfäder där de differentierande cellerna aggregeras och varierar mellan 40% -80% av PDX1 + / NKX6.1+ -populationen12,19. Men jämfört med suspensionskulturer är 2D-differentieringskulturer mer kostnadseffektiva, genomförbara och praktiska för applicering på flera cellinjer5. Vi visade nyligen att monolagerdifferentieringskulturer ger mer än upp till 90% av PDX1+/NKX6.1+ samuttryckande hPSC-härledda pankreasförfäder20,21,22. Den rapporterade metoden gav en hög replikeringskapacitet till de genererade pankreasprogenitorerna och förhindrade alternativa ödesspecifikationer såsom leverlinje21. Därför visar detta protokoll här en mycket effektiv metod för differentiering av hPSC till pankreas beta-cellprekursorer som samuttrycker PDX1 och NKX6.1. Denna metod använder tekniken för att dissociera hPSC-härledd endoderm och manipulera celltätheten, följt av en utökad FGF- och Retinoid-signalering samt Hedgehog-hämning för att främja PDX1 och NKX6.1 samuttryck (Figur 1). Denna metod kan underlätta en skalbar generering av hPSC-härledda betacellprekursorer i bukspottkörteln för transplantationsterapi och sjukdomsmodellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien har godkänts av lämplig institutionell forskningsetisk kommitté och utförts i enlighet med de etiska normer som fastställs i 1964 års Helsingforsdeklaration och dess senare ändringar eller jämförbara etiska normer. Protokollet godkändes av Institutional Review Board (IRB) för HMC (nr 16260/16) och Qatar Biomedical Research Institute (QBRI) (nr 2016-003). Detta arbete är optimerat för hESC som H1, H9 och HUES8. Blodprover erhölls från friska individer från Hamad Medical Corporation (HMC) sjukhus med fullt informerat samtycke. iPSC: erna genereras från mononukleära celler i perifert blod (PBMC) för kontroll, friska individer23.
1. Förberedelse av kulturmediet
- Bereda humana pluripotenta stamceller (hPSC) odlingsmedier
- Bered hPSC-odlingsmedier från det kommersiellt tillgängliga mediet för att bibehålla och expandera mänskliga embryonala stamceller genom att komplettera 100 enheter/ml penicillin och 100 ug/ml streptomycin (se materialförteckning). Alikvotera och förvara hela mediet vid -20 °C på lång sikt eller 4 °C för omedelbar användning.
- Förbered steg 1 differentieringsmedia (för definitiv endoderm (DE)).
- Bered basala medier från MCDB 131-media genom att komplettera med 0,5% fettsyrafritt bovint serumalbumin (FFA-BSA), 1,5 g / L natriumbikarbonat (NaHCO3), 10 mM glukos, 2 mM glutamax, 100 enheter / ml penicillin och 100 μg / ml streptomycin (se materialtabell). Filtrera det beredda mediet med ett 0,2 μm filter och förvara det vid 4 °C.
- Bered steg 1-media som innehåller CHIR99021 från basalmediet (framställt i steg 1.2.1) genom att värma basalmediet vid 37 °C och sedan komplettera med 2 μM CHIR99021, 100 ng/ml aktivin A, 10 μM berghämmare (Y-27632) och 0,25 mM C-vitamin (se materialtabell). Blanda det kompletterade mediet väl och täck det med aluminiumfolie för att skydda det från ljus.
OBS: Detta media kommer endast att användas den första dagen av differentiering. - Förbered steg 1-media utan CHIR99021 från basalmediet genom att värma det vid 37 °C och komplettera det med 100 ng/ml aktivin A och 0,25 mM C-vitamin och blanda väl.
OBS: 5 ng / ml grundläggande FGF eller FGF2 kan valfritt läggas till i detta media. Detta media kommer att användas under de återstående dagarna av steg 1.
- Förbered steg 2 differentieringsmedia (för primitivt tarmrör; PGT).
- Förbered steg 2-differentieringsmedia som innehåller rockhämmare från basalmediet genom att värma det vid 37 ° C och komplettera med 50 ng / ml FGF10, 50 ng / ml NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 10 μM Y-27632 (Rock-hämmare) och 0,25 mM C-vitamin.
OBS: Detta media används på dagen för dissociation av endodermala celler. - Förbered steg 2-differentieringsmedier utan Rock-hämmare enligt samma procedur för de medier som beretts i steg 1.3.1, med undantag av Rock-hämmaren.
OBS: Detta media används den andra dagen av steg 2.
- Förbered steg 2-differentieringsmedia som innehåller rockhämmare från basalmediet genom att värma det vid 37 ° C och komplettera med 50 ng / ml FGF10, 50 ng / ml NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 10 μM Y-27632 (Rock-hämmare) och 0,25 mM C-vitamin.
- Förbered steg 3 differentieringsmedia (för bakre foregut).
- Förbered DMEM-media som innehåller 4,5 g / L glukos, komplettera sedan med 1% penicillin-streptomycin och 2 mM glutamax och använd som basala medier för steg 3 och 4.
- Värm DMEM-mediet (berett i steg 1.4.1) och komplettera med 2 μM retinsyra, 0,25 μM SANT-1, 50 ng/ml FGF10, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 mM C-vitamin och 1 % B27-tillskott utan vitamin A (se materialförteckning).
OBS: Detta media används i 4 dagar av steg 3 för P2-D (protokoll 2, optimerad, dissocierad) och 2 dagar i steg 3 för P1-ND (protokoll 1, icke-optimerad, icke-dissocierad).
- Förbered steg 4 differentieringsmedia (för pankreasprogenitorer).
- Tillsätt DMEM innehållande 4,5 g/l glukos med 100 ng/ml EGF, 10 mM nikotinamid, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 mM C-vitamin och 1 % B27-tillskott utan vitamin A (se materialförteckning). Använd det här mediet för alla dagar i steg 4.
OBS: Håll alla reagenser vid lämpliga temperaturer, och alla cytokin och känsliga reagenser måste alikvoteras. Tina de aliciterade reagenserna och lägg till det basala mediet vid tidpunkten för förändring av differentieringsmediet. Kompositionerna för de olika differentieringsmedierna anges i tabell 1.
- Tillsätt DMEM innehållande 4,5 g/l glukos med 100 ng/ml EGF, 10 mM nikotinamid, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 mM C-vitamin och 1 % B27-tillskott utan vitamin A (se materialförteckning). Använd det här mediet för alla dagar i steg 4.
2. Beredning av källarmembranmatrisbelagda rätter
- Tina kommersiellt tillgänglig källarmatris (se materialtabell) och alikvot på is; frysa alikvoterna vid -20 °C.
- Innan du täcker vävnadsodlingsskålarna, tina de frysta alikvoterna på is. Tillsätt lämplig volym av membranmatrislösningen till det kylda KO-DMEM/F-12-mediet (KnockOut DMEM/F-12) (se materialtabell) för att uppnå önskad utspädd koncentration och blanda väl. Förvara den utspädda matrislösningen vid 4 °C för omedelbar användning.
- Täck ytan på de vävnadsodlingsbehandlade plattorna (se materialtabellen) med utspädd membranmatrislösning och placera plattorna vid 37 °C i minst 60 minuter innan cellerna pläteras. Använd en utspädning av 1:50 av membranmatrislösningen i KO-DMEM / F-12 för plätering av celler för pankreasdifferentieringsexperiment och 1:80 för expansion av odifferentierade hPSC.
3. Kultur av odifferentierade hPSC
- Passera hPSC när kolonierna når en 70% -80% sammanflöde.
- För att passera, tvätta hPSC: erna en gång med varm PBS, aspirera med en bärbar vakuumsugare inuti vävnadsodlingshuven och tillsätt 0,5 mM EDTA-lösning i PBS för att täcka koloniytan. Inkubera vid 37 °C, 5 %CO2 i 1 min eller tills koloniernas gränser lossnar från plattans yta.
- Ta bort EDTA-lösningen och samla de lösgörande kolonierna med hPSC-odlingsmedium med en P1000-mikropipett. Centrifugera de uppsamlade cellerna vid 128 x g i 4 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och komplettera cellerna med hPSC-odlingsmedium som innehåller 10 μM Y-27632 (Rock-hämmare)23,24.
OBS: För hPSC: erna i minst ett förhållande 1: 3 på 1:80 membranmatrisbelagda rätter. För differentieringsexperiment, platta dock hPSC på 1:50 belagda rätter.
4. Induktion av definitiv endoderm (DE) differentiering i hPSC (steg 1)
- När hPSC-kolonierna når en sammanflöde på 70% -80%, tvätta dem två gånger med varm PBS och aspirera med en bärbar vakuumsugare inuti vävnadsodlingshuven för att påbörja steg 1-differentiering.
- Tillsätt steg 1-differentieringsmedium innehållande CHIR99021 (från steg 1.2.2) till kolonierna, 2 ml per 6-brunnsplatta, och inkubera vid 37 °C i 24 timmar.
- Nästa dag, byt ut det förbrukade mediet med steg 1-differentieringsmedium utan CHIR99021 (steg 1.2.3).
- Var 24: e timme, aspirera det förbrukade mediet med en bärbar vakuumsugare inuti vävnadsodlingshuven och ersätt den med ett nytt steg 1-differentieringsmedium utan CHIR99021.
OBS: Steg 1 kan förlängas upp till 4 dagar. Längden på steg 1 är beroende av att hPSC-linjen används och bör optimeras i enlighet med detta.
5. Immunofluorescensanalys av hPSC-härledd DE (steg 1)
- För immunofluorescens, aspirera det förbrukade mediet med en bärbar vakuumsugare inuti vävnadsodlingshuven från brunnarna och tvätta två gånger med varm PBS. Virvla plattan för att bli av med cellskräp.
- Täck brunnarnas yta med 4% paraformaldehyd (PFA) för att fixera DE-cellerna; tillsätt till exempel 250 uL PFA per brunn på en 24-brunnsplatta. Lägg plattan på en 2D-shaker vid 20 x g i 20 min.
- Efter fixering, tvätta DE-cellerna med trisbuffrad saltlösning med 0,5% tween (TBST) (se materialtabell) och placera plattan på skakapparaten vid 20 x g i 10 min. Upprepa detta steg en gång till.
- Permeabilisera de fasta cellerna genom att tillsätta en generös volym fosfatbuffrad saltlösning med 0,5% Triton X-100 (PBST); tillsätt till exempel 1 ml PBST per brunn på en 24-brunnsplatta och lägg tillbaka plattan på shakern vid 20 x g i 20 minuter.
- Nyberedd 5% -6% av BSA i PBST som blockerande buffert och lägg till den i de permeabiliserade cellerna. Inkubera plattan i minst 1 timme i blockeringslösningen på skakapparaten.
- Späd de primära antikropparna mot SOX17 och FOXA2 tillsammans (se materialförteckning) i 2%-3% BSA i PBST-lösning. Tillsätt de kombinerade antikropparna till blockerade celler och placera plattan på skakapparaten vid 4 °C över natten med låg hastighet med försiktig skakning.
OBS: SOX17 och FOXA2 är väletablerade DE-markörer25,26. - Nästa dag, aspirera de primära antikropparna med ett bärbart vakuumfilter och tvätta brunnarna med TBST tre gånger, var och en tvätt i 10 minuter på skakaren.
- Förbered 1:500 utspädning av Alexa fluor 488- och 568- konjugerade sekundära antikroppar (se materialtabell) mot de arter som de primära antikropparna höjdes i.
- Tillsätt den sekundära antikroppskombinationen till den färgade brunnen och täck plattan med aluminiumfolie för att skydda mot ljus. Placera plattan på skakapparaten i 1 timme vid rumstemperatur.
- Aspirera den sekundära antikroppslösningen med ett bärbart vakuumfilter och tvätta de färgade brunnarna med TBST på skakaren i 10 minuter och täck plattan med folie. Upprepa tvättsteget totalt tre gånger.
- Bered en utspädning på 1 μg/ml Hoechst 33342 i PBS för att färga kärnorna. Tillsätt Hoechst-lösningen i brunnarna och placera plattan på skakaren i 2-3 minuter.
- Aspirera Hoechst-lösningen med ett bärbart vakuumfilter och skölj brunnarna med PBS två gånger.
- Slutligen lägg till PBS i de färgade cellerna och avbilda dem med ett inverterat fluorescensmikroskop (se materialtabell) i mörkret. Håll plattan täckt med folie när du inte avbildar för att minimera fluoroforblekningen.
OBS: Alternativt kan flödescytometri användas för att bedöma DE-effektivitet enligt beskrivningen i steg 9.2.
6. Generering av det primitiva tarmröret (PGT) från hPSC (steg 2)
OBS: Om immunofluorescensanalysen i steg 5.13 bestäms vara ett SOX17-FOXA2-samuttryck på 80% och högre, fortsätter experimentet till steg 2. Om effektiviteten är <80%, förläng varaktigheten av steg 1 till 4 dagar.
- På dag 1 i steg 2, dissociera de hPSC-härledda endodermala cellerna med trypLE eller Accutase (se materialtabell) för det optimerade P2-D-protokollet. Tvätta de vidhäftande cellerna med varm PBS och tillsätt varm 1 ml TrypLE- eller Accutas-lösning per brunn på en 6-brunnsplatta i 3-5 minuter vid 37 ° C, 5% CO2, eller tills cellerna börjar lossna från varandra.
- Dissociera de lossnade arken eller monolagret av celler i brunnarna och samla dem sedan ihop i ett 15 ml polypropenrör med hjälp av basal steg 1/2-media utan cytokiner som innehåller minst 0,5% av antingen fosterbovint serum (FBS) eller KnockOut-serum (KOSR) (se materialtabell).
- Snurra ner cellerna vid 800 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten. Tillsätt 1 ml steril PBS och återsuspendera pelleten i enstaka celler.
- Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad räknare (se Materialförteckning) genom att ladda den rekommenderade volymen celler i kammarbilden. Snurra de återsuspenderade cellerna vid 800 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i lämplig volym av steg 2-differentieringsmedium som innehåller Rock-hämmare med en densitet av 2,5-3,5 x 105 celler/cm2.
OBS: Detta antal kan komma ner till ett delningsförhållande på 1: 2 för de flesta cellinjer, beroende på spridningshastigheten. Den totala volymen kommer att vara 2 ml media med återsuspenderade celler i 1 en brunn med 6-brunnsplatta. - Platta de återsuspenderade cellerna på 1:50 membranmatrisbelagda plattor (beredda i steg 2) och inkubera dem vid 37 °C, 5%CO2 i inkubatorn.
- 24 timmar senare, byt ut mediet mot steg 2-differentieringsmedium utan Rock-hämmare (beredd i steg 1.3.2).
7. Generering av bakre framgut från hPSC (steg 3)
- Aspirera det förbrukade steg 2-mediet med en bärbar vakuumsugare inuti vävnadsodlingshuven och tvätta cellerna med varm PBS.
- Lägg till steg 3-differentieringsmedia från steg 1.4 till cellerna och inkubera vid 37 °C, 5 %CO2.
- Efter 24 timmar, byt ut det förbrukade mediet med nyberedda steg 3-differentieringsmedier. Upprepa detta i totalt 4 dagar för P2-D-protokollet (optimerat) och endast 2 dagar för det icke-dissocierade P1-ND.
8. Generering av pankreasprogenitorer från hPSC (steg 4)
- Efter 4 dagars steg 3-behandling, tvätta cellerna med varm PBS, virvla försiktigt plattan och aspirera med en bärbar vakuumsugare. Lägg sedan till steg 4-differentieringsmedia från steg 1.5 till cellerna.
- Efter 24 timmar, byt ut det förbrukade mediet med nyberedda steg 4-media. Upprepa detta i totalt 4 dagar.
9. Bedömning av differentieringseffektiviteten hos generering av pankreasprogenitorer från hPSC
- Utför immunofluorescensanalysen av hPSC-härledda pankreasförfäder (steg 4) för uttryck av PDX1 och NKX6.1.
OBS: PDX1 och NKX6.1 är väletablerade pankreasprogenitormarkörer17,18.- Utför fixering, permeabilisering, blockering och antikroppsinkubation och tvättar enligt steg 5.
- Färga de hPSC-härledda förfäderna i bukspottskörteln med en kombination av PDX1- och NKX6.1-antikroppar (se materialtabell) utspädd i 2%-3% BSA i PBST.
- Använd 1:500 utspädningar av lämpliga Alexa-fluor 488- och 568- konjugerade sekundära antikroppar (se materialförteckning).
- Utföra flödescytometrianalys av hPSC-härledda pankreasprogenitorer för uttryck av PDX1 och NKX6.1.
OBS: Flödescytometrianalys av pankreasmarkörer i de genererade hPSC-härledda pankreasprogenitorerna ger ett sätt att kvantifiera PDX1- och NKX6.1-samuttryckande celler.- I slutet av steg 4, tvätta cellerna två gånger med varm PBS och tillsätt tillräckligt med TrypLE eller Accutase för att täcka brunnarnas yta, till exempel 1 ml TrypLE eller Accutase per brunn på 6-brunnsplattan. Placera plattan i inkubatorn i 5-7 minuter eller tills cellerna lossnar från ytan.
- Dissociera de vidhäftande arken av celler i brunnen med hjälp av en P1000-mikropipett innan du samlar dem i ett 15 ml polypropenrör.
- Snurra ner cellerna i hPSC-härledda förfäder i bukspottskörteln vid 800 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera sedan supernatanten. Tvätta cellerna med PBS genom att dissociera dem i enstaka celler. Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad räknare (se materialförteckning) och notera koncentrationen i antalet celler per ml.
- Snurra på 800 x g i 5 minuter vid 4 °C och kasta supernatanten. Tillsätt 200 μl kyld PBS till pelleten och dissociera.
- Tillsätt 2 ml kyld 80% etanol droppvis, med röret på en virvel vid låg medelhastighet (400 x g vid rumstemperatur). Stäng locken ordentligt och placera rören något lutade på skakapparaten vid 4 °C över natten.
- Snurra ner cellerna vid 800 x g i 5 minuter vid 4 ° C och tvätta med PBS för att dissociera eventuella klumpar av fasta celler.
- Blockera de fasta cellerna med 5%-6% BSA-lösning i PBST i minst 1 h vid rumstemperatur eller 4 °C över natten på skakapparaten.
- Fläck för pankreas stamfadermarkörer enligt stegen nedan.
- Distribuera 2 00 000 celler per tillstånd, inklusive lämpliga isotypkontroller beroende på IgG-underklassen för värdarten för den primära antikroppen, ostoppade och sekundära antikroppskontroller i en 96-brunn V-bottenplatta eller 1,5 ml centrifugrör.
- Snurra ner plattan vid 800 x g i 5 min vid 4 °C och vänd plattan med en snabb rörelse för att kasta supernatanten utan att förlora pelletsen. Bered primära antikroppsutspädningar i 3% BSA-lösning (se materialförteckning).
OBS: Koncentrationen av primära antikroppar kan vara mellan 1:50 och 1:200. - Inkubera de färgade cellerna i minst 2 timmar vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C på en skakapparat med försiktig skakning vid låg hastighet.
- Tvätta de färgade cellerna med TBST tre gånger genom att pipettera cellerna upp och ner i brunnarna. Snurra och kassera supernatanten som i steg 9.2.8.2.
- Tillsätt 1:500 utspädning av sekundära antikroppar (Alexa-fluor 488- och 647-konjugerade antikroppar) framställda i PBS (se materialförteckning). Inkubera i 30 min vid rumstemperatur.
- Tvätta de färgade cellerna med TBST minst två gånger genom att pipettera cellerna upp och ner. Snurra på plattan och kasta supernatanten som i steg 9.2.8.2.
- Samla de färgade cellerna i minst 100 μL PBS och överför dem till ljusskyddade FACS-rör (se materialförteckning). Kör proverna på en flödescytometridator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten visar att det optimerade protokollet P2-D (figur 1A) förbättrade pankreasprogenitordifferentieringseffektiviteten genom att uppreglera PDX1- och NKX6.1-samuttryck (figur 2A, B och figur 3A). I synnerhet visade resultaten att dissociation av endodermala celler och deras replating på färsk membranmatris tillsammans med en längre varaktighet av steg 3 förbättrade NKX6.1-uttryck i hPSC-härledda pankreasförfäder (optimerat protokoll, P2-D) (figur 2 och figur 3A), jämfört med det icke-dissocierade protokollet (P1-ND) som modifierades från en tidigare publicerad studie27 . Det nuvarande förbättrade protokollet genererade också den högsta andelen PDX1+/NKX6.1+ stamfäder jämfört med "P1-D" (Protokoll 1, S3 = 2 dagar, dissocierad) och "P2-ND" (Protokoll 2, S3 = 4 dagar, icke-dissocierad), och de detaljerade resultaten har tidigare publicerats21. Bukspottkörtelprogenitorer som genereras med P2-D har också ökat antal SOX9 + -celler jämfört med den icke-dissocierade P1-ND (figur 3B). Den optimerade metoden genererade också en högre andel proliferativa NKX6.1+ celler som samuttrycker proliferationsmarkören Ki67 (figur 3C).
De representativa resultaten som presenteras här är från iPSCs genererade från mononukleära celler i perifert blod (PBMC) av kontroll, frisk individ. Vi har dock reproducerbart tillämpat det nuvarande förbättrade protokollet på flera hPSC-linjer som H1-hESCs, H9-hESCs, HUES8-hESCs och flera andra iPSC-kontrolllinjer för att ge ~ 90% PDX1 och NKX6.1 samuttryckande pankreasförfäder20,21,28.
Efter DE-induktion i hPSC förväntas milda nivåer av celldöd. Men om en hög celldödlighet observerades stoppades experimentet och startades igen med en ny sats celler. Effektiviteten av DE-induktion bör vara högre än 70%-80% för att säkerställa en hög andel DE-celler i kulturen som kommer att fungera som en idealisk startkälla för pankreasprogenitorinduktion (figur 1C).
Tätheten av replating endodermala celler efter dissociation kan manipuleras baserat på tillväxthastigheten för den specifika cellen. Till exempel kan långsamt växande celler replateras med en högre densitet än rekommenderat. Detta minimerar chanserna att få irrelevanta bukspottkörtelpopulationer vid steg 4. Ett högt samuttryck av PDX1 och NKX6.1 kan erhållas efter dissociation efter steg 1 och replating vid halv densitet (figur 1A, figur 2A, B och figur 3A). Om ett högt uttryck av PDX1 observeras men endast ett måttligt uttryck av NKX6.1, kan steg 4 förlängas med 2 dagar för att förbättra NKX6.1-uttrycket i PDX1-uttryckande celler.
Figur 1: Tidslinje för tillsats av cytokiner och tillväxtfaktorer under pankreasprogenitordifferentiering. (A) Schematisk representation av det optimerade protokollet (P1-D) för generering av PDX1 och NKX6.1 från hPSC. hPSC-härledd definitiv endoderm (DE) dissocieras och replateras vid halv densitet och riktas sedan sekventiellt mot en pankreas stamfader öde. (B) Bilder av hPSC i brightfield innan differentiering påbörjas vid dag 0. (C) Immunostaining-analys för uttryck av endodermala markörer SOX17 och FOXA2 i hPSC-härledda endodermceller (steg 1). SOX17, grön; FOXA2, röd. Skalstänger = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Generering av hPSC-härledda förfäder i bukspottskörteln, samuttryckande PDX1 och NKX6.1. Immunostaining-analys för jämförelse av PDX1- och NKX6.1-uttryck i hPSC-härledda pankreasprogenitorer med hjälp av det förbättrade protokollet (P2-D) (A) och ett icke-optimerat, tidigare publicerat protokoll (P1-ND) (B). Det förbättrade protokollet uppnådde det högsta samuttrycket av PDX1 och NKX6.1. PDX1, grön; NKX6.1, röd. Förstorade bilder finns i den andra panelen för varje protokoll. Skalstänger = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kvantifiering av pankreasmarkörer i pankreasprogenitorer genererade med hjälp av det förbättrade protokollet. Flödescytometrianalys i hPSC-härledda pankreasprogenitorer gav användning av P2-D i jämförelse med den icke-dissocierade P1-ND. (A) Histogram för PDX1- och NKX6.1-uttryck och dubbelpositiva färgningsdiagram. (B) Histogrammen för SOX9-uttryck och (C) samuttryck av NKX6.1 med spridningsmarkören Ki67. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Etapp | Media | Cytokiner | Dagar | ||||||
| 1 | MCDB 131 media + 0,5% fettsyrafritt bovint serumalbumin (FFA-BSA), 1,5 g/L natriumbikarbonat (NaHCO3), 10 mM glukos | Dag 1: 2 μM CHIR99021, 100 ng/ml Activin A, 10 μM Rockhämmare (Y-27632), 0,25 mM Vitamin C. Dag 2 och framåt: 100 ng/ml Activin A, 0,25 mM C-vitamin | 3 eller 4 | ||||||
| 2 | MCDB 131 media + 0,5% fettsyrafritt bovint serumalbumin (FFA-BSA), 1,5 g/L natriumbikarbonat (NaHCO3), 10 mM glukos | Dag 1 (Dissociation): 50 ng/ml FGF10, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 10 μM Y-27632 (Rockhämmare), 0,25 mM Vitamin C. Dag 2: 50 ng/ml FGF10, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 0,25 mM C-vitamin. | 2 | ||||||
| 3 | DMEM + 4,5 g / L glukos | 2 μM Retinsyra, 0,25 μM SANT-1, 50 ng/ml FGF10, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 mM C-vitamin, 1% B27-tillskott utan vitamin A | 4 | ||||||
| 4 | DMEM + 4,5 g / L glukos | 100 ng/ml EGF, 10 mM nikotinamid, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 mM C-vitamin, 1 % B27-tillskott utan vitamin A. | 4 | ||||||
Tabell 1: Kompositionerna av de olika differentieringsmedier som används i studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete beskriver ett förbättrat protokoll för att generera pankreasprogenitorer från hPSCs med ett högt samuttryck av PDX1 och NKX6.1. Dissociation och replating av hPSC-härledd endoderm vid halv densitet på färsk matris resulterade i högre PDX1 och NKX6.1 hos hPSC-härledda pankreasförfäder.
Även om tillväxtfaktorcocktailen för varje steg är mycket lik P1-ND 27, har det visat sig att en mer utökad steg 3-behandling inklusive FGF- och retinoidsignalering och BMP- och igelkottshämning ökar NKX6.1-uttrycket, vilket står i kontrast till Nostro et al.s resultat27. Medan PDX1-uttryck i bukspottkörteln under embryonal utveckling regleras positivt av FGF- och retinoidsignalering och BMP- och igelkottshämning27,29,30, visade de nuvarande resultaten att förlängningen av denna signalcocktail också uppreglerar NKX6.1. Ändå underlättades effekten av en förlängd steg 3-behandling av dissociation och replating av endodermala celler som ledde till ökat PDX1- och NKX6.1-uttryck. Dessutom ökade denna metod (P2-D) också SOX9-uttryckande celler i hPSC-härledda pankreasförfäder, förutom andelen proliferativa NKX6.1+ celler som samuttrycker proliferationsmarkören Ki67.
En annan avgörande faktor som påverkade differentieringens effektivitet var tillgängligheten av färsk membranmatris till de dissocierade cellerna. De extracellulära matriskomponenterna har tidigare visat sig reglera stamcellsspecifikation31,32. Sammantaget har de gynnsamma effekterna av extracellulära matriskomponenter på bukspottkörtelns utveckling registrerats 33,34,35, särskilt för membranmatrisen, som tillsammans med laminin visade sig ha en pro-endokrin effekt på bukspottskörtelns härstamningsceller 36. Därför kan replatering av endodermala celler på färsk membranmatris ha förbättrat NKX6.1-uttryck i hPSC-härledda pankreasförfäder.
Celltätheten hos differentierande celler styr också genuttrycket. Flera studier har visat betydelsen av cell-cellkontakt för att reglera bukspottkörtelns utveckling37,38,39. Cellulär aggregering eller embryoid kroppsbildning har visat sig inducera högre endokrina genuttryck i bukspottskörteln än 2D-kulturer19. Resultaten visar dock att högre bukspottkörteluttryck, särskilt NKX6.1, kan erhållas genom att odla celler i ett 2D-monolager vid halva endodermala densiteten med hjälp av vårt optimerade protokoll21. Intressant nog hämmade denna metod också levercellens öde (det alternativa ödet för hPSC-härledd DE) vilket märktes av det minskade uttrycket av levergener AFP (Alpha-fetoprotein) och ALB (Albumin)21, vilket indikerar att fysiska faktorer spelar en roll i härstamningsspecifikationen för hPSC.
Sammantaget visar resultaten att modulering av den fysiska miljön hos de differentierande cellerna kan förbättra pankreasgenuttrycket21. Specifikt kan dissociationen av hPSC-härledd endoderm och replating på färsk membranmatris med en längre FGF- och retinoidsignalering och igelkotts- och BMP-hämning förbättra PDX1- och NKX6.1-samuttrycket i hPSC-härledda pankreasförfäder. Det optimerade protokollet är dock minst 2 dagar längre än tidigare publicerade protokoll. Dessutom kan längden på steg 4 förlängas utöver det rekommenderade minimumet, dvs. 4 dagar, baserat på den cellinje som används. Flera rekombinanta mänskliga tillväxtfaktorer används i det optimerade protokollet som kan ersättas av deras billigare, småmolekylära föreningar som utför samma åtgärd. Ändå kan detta optimerade protokoll underlätta den skalbara genereringen av pankreasförfäder från hPSC för cellterapi och sjukdomsmodellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av ett bidrag från Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
- Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
- Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
- Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283 (2020).
- Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152 (2021).
- Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15 (2018).
- Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83 (2018).
- Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
- Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705 (2020).
- Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
- Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103 (2021).
- Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
- Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
- Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
- Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
- Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56 (2010).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
- Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076 (2013).
