Summary
Le présent protocole décrit une méthode améliorée pour augmenter la co-expression des facteurs de transcription PDX1 et NKX6.1 chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) dans des monocouches planes. Ceci est réalisé en reconstituant la matrice fraîche, en manipulant la densité cellulaire et en dissociant les cellules endodermiques.
Abstract
Les cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) sont un excellent outil pour étudier le développement pancréatique précoce et étudier les facteurs génétiques contribuant au diabète. Des cellules sécrétrices d’insuline dérivées de l’hPSC peuvent être générées pour la thérapie cellulaire et la modélisation de la maladie, cependant, avec une efficacité et des propriétés fonctionnelles limitées. Les progéniteurs pancréatiques dérivés de l’hPSC qui sont des précurseurs des cellules bêta et d’autres cellules endocrines, lorsqu’ils expriment conjointement les deux facteurs de transcription PDX1 et NKX6.1, spécifient les progéniteurs des cellules bêta fonctionnelles sécrétant de l’insuline in vitro et in vivo. Les progéniteurs pancréatiques dérivés de l’hPSC sont actuellement utilisés pour la thérapie cellulaire chez les patients atteints de diabète de type 1 dans le cadre d’essais cliniques. Cependant, les procédures actuelles ne génèrent pas une proportion élevée de NKX6.1 et de progéniteurs pancréatiques, ce qui conduit à la cogénération de cellules endocrines non fonctionnelles et à peu de cellules sensibles au glucose et sécrétant de l’insuline. Ce travail a donc développé un protocole amélioré pour générer des progéniteurs pancréatiques dérivés de hPSC qui maximisent la co-expression de PDX1 et NKX6.1 dans une monocouche 2D. Les facteurs tels que la densité cellulaire, la disponibilité de la matrice fraîche et la dissociation des cellules endodermiques dérivées de hPSC sont modulés pour augmenter les niveaux de PDX1 et NKX6.1 dans les progéniteurs pancréatiques générés et minimiser l’engagement à alterner la lignée hépatique. L’étude souligne que la manipulation de l’environnement physique de la cellule lors de la différenciation in vitro peut avoir un impact sur la spécification de la lignée et l’expression des gènes. Par conséquent, le protocole optimisé actuel facilite la génération évolutive de progéniteurs co-exprimant PDX1 et NKX6.1 pour la thérapie cellulaire et la modélisation de la maladie.
Introduction
Le diabète est un trouble métabolique complexe qui touche des millions de personnes dans le monde. La supplémentation en insuline est considérée comme la seule option de traitement du diabète. Les cas plus avancés sont traités par thérapie de remplacement des cellules bêta, obtenue par transplantation du pancréas cadavérique entier ou des îlots 1,2. Plusieurs problèmes entourent la thérapie de transplantation, tels que la limitation de la disponibilité et de la qualité des tissus, le caractère invasif des procédures de transplantation en plus du besoin continu d’immunosuppresseurs. Cela nécessite la découverte d’options nouvelles et alternatives pour la thérapie de remplacement des cellules bêta 2,3. Les cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) sont récemment apparues comme un outil prometteur pour comprendre la biologie du pancréas humain et comme une source non exhaustive et potentiellement plus personnalisée pour la thérapie de transplantation 4,5,6,7. Les CSPh, y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPh), ont une capacité d’auto-renouvellement élevée et donnent naissance à tout type de tissu du corps humain. Les CSEh sont dérivées de la masse cellulaire interne de l’embryon et les CSPh sont reprogrammées à partir de toute cellule somatique 4,8.
Les protocoles de différenciation dirigée sont optimisés pour générer des cellules bêta pancréatiques à partir de CSPh qui dirigent séquentiellement les CSPh à travers les stades de développement pancréatique in vitro. Ces protocoles génèrent des organoïdes d’îlots dérivés de hPSC. Bien qu’ils se soient grandement améliorés pour augmenter la proportion de cellules bêta pancréatiques dans ceux-ci, l’efficacité des protocoles est très variable. Il n’augmente pas à plus de ~40% des cellules NKX6.1+/INSULIN+ ou C-PEPTIDE+ 5,9,10,11,12,13. Cependant, les cellules bêta générées ne sont pas entièrement identiques aux cellules bêta humaines adultes en termes de profils transcriptionnels et métaboliques et de leur réponse au glucose 4,5,14. Les cellules bêta dérivées de hPSC manquent d’expression génique de marqueurs cellulaires bêta clés tels que PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 et KCNK3 par rapport aux îlots humains adultes5. De plus, les cellules bêta dérivées de hPSC ont une signalisation calcique diminuée en réponse au glucose. Ils sont contaminés par les cellules polyhormonales co-générées qui ne sécrètent pas des quantités appropriées d’insuline en réponse à l’augmentation des niveaux de glucose5. D’autre part, les progéniteurs pancréatiques dérivés de l’hPSC, qui sont des précurseurs d’îlots, pourraient être générés plus efficacement in vitro que les cellules bêta et, lorsqu’ils sont transplantés in vivo, pourraient mûrir en cellules bêta fonctionnelles sécrétant de l’insuline15,16. Les essais cliniques visent actuellement à démontrer leur innocuité et leur efficacité lors de la transplantation chez des sujets atteints de DT1.
Notamment, l’expression des facteurs de transcription PDX1 (Pancreatic and Duodenal Homeobox 1) et NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) au sein d’une même cellule progénitrice pancréatique est cruciale pour l’engagement vers une lignée de cellules bêta5. Les progéniteurs pancréatiques qui n’expriment pas NKX6.1 donnent naissance à des cellules endocrines polyhormonales ou à des cellules bêta non fonctionnelles17,18. Par conséquent, une co-expression élevée de PDX1 et NKX6.1 au stade progéniteur pancréatique est essentielle pour générer un grand nombre de cellules bêta fonctionnelles. Des études ont démontré qu’un corps embryoïde ou une culture 3D améliore PDX1 et NKX6.1 chez les progéniteurs pancréatiques où les cellules différenciantes sont agrégées, variant entre 40% et 80% de la population PDX1+/NKX6.1+12,19. Cependant, par rapport aux cultures en suspension, les cultures de différenciation 2D sont plus rentables, réalisables et pratiques pour une application sur plusieurs lignées cellulaires5. Nous avons récemment montré que les cultures de différenciation monocouche produisent plus de 90% des progéniteurs pancréatiques dérivés de PDX1+/NKX6.1+ co-exprimant hPSC20,21,22. La méthode rapportée conférait une capacité de réplication élevée aux progéniteurs pancréatiques générés et empêchait d’autres spécifications de devenir telles que la lignée hépatique21. Par conséquent, ce protocole démontre une méthode très efficace pour la différenciation des CSPh en précurseurs pancréatiques des cellules bêta co-exprimant PDX1 et NKX6.1. Cette méthode utilise la technique de dissociation de l’endoderme dérivé de hPSC et de manipulation de la densité cellulaire, suivie d’une signalisation étendue FGF et rétinoïde ainsi que de l’inhibition de Hedgehog pour promouvoir la co-expression de PDX1 et NKX6.1 (Figure 1). Cette méthode peut faciliter une génération évolutive de précurseurs bêta-cellulaires pancréatiques dérivés de hPSC pour la thérapie de transplantation et la modélisation de la maladie.
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Protocol
L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche de l’établissement approprié et réalisée conformément aux normes éthiques énoncées dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs ou à des normes éthiques comparables. Le protocole a été approuvé par l’Institutional Review Board (IRB) de HMC (n° 16260/16) et l’Institut de recherche biomédicale du Qatar (QBRI) (n° 2016-003). Ce travail est optimisé pour les CSEh tels que H1, H9 et HUES8. Des échantillons de sang ont été prélevés sur des personnes en bonne santé de l’hôpital Hamad Medical Corporation (HMC) avec leur plein consentement éclairé. Les CSPi sont générées à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de contrôle, individu en bonne santé23.
1. Préparation des milieux de culture
- Préparer des milieux de culture de cellules souches pluripotentes humaines (CSPh)
- Préparer des milieux de culture de CSPh à partir du milieu disponible sur le marché pour maintenir et développer les cellules souches embryonnaires humaines en complétant 100 unités/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (voir le tableau des matières). Aliquote et conserver le média complet à -20 °C pour une utilisation prolongée ou à 4 °C pour une utilisation immédiate.
- Préparer les milieux de différenciation de stade 1 (pour l’endoderme définitif (DE)).
- Préparer les milieux basaux à partir du milieu MCDB 131 en complétant avec 0,5 % d’albumine sérique bovine sans acides gras (FFA-BSA), 1,5 g/L de bicarbonate de sodium (NaHCO3), 10 mM de glucose, 2 mM de glutamax, 100 unités/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (voir le tableau des matières). Filtrer le média préparé à l’aide d’un filtre de 0,2 μm et conserver à 4 °C.
- Préparer les milieux de stade 1 contenant du CHIR99021 à partir du milieu basal (préparé à l’étape 1.2.1) en chauffant le milieu basal à 37 °C, puis en complétant avec 2 μM de CHIR99021, 100 ng/mL d’activine A, 10 μM d’inhibiteur de roche (Y-27632) et 0,25 mM de vitamine C (voir le tableau des matières). Mélangez bien le média supplémenté et recouvrez-le de papier d’aluminium pour le protéger de la lumière.
REMARQUE: Ce support ne sera utilisé que le premier jour de différenciation. - Préparer le milieu de stade 1 sans CHIR99021 à partir du milieu basal en le chauffant à 37 °C et en le complétant avec 100 ng/mL d’activine A et 0,25 mM de vitamine C et bien mélanger.
REMARQUE: 5 ng / mL de FGF ou FGF2 de base peuvent être ajoutés en option à ce support. Ce support sera utilisé pour les jours restants de l’étape 1.
- Préparer les milieux de différenciation de l’étape 2 (pour le tube intestinal primitif; PGT).
- Préparer le milieu de différenciation de stade 2 contenant l’inhibiteur de roche du milieu basal en le chauffant à 37 °C et en complétant avec 50 ng/mL de FGF10, 50 ng/mL de NOGGIN, 0,25 μM de CHIR99021, 10 μM de Y-27632 (inhibiteur de roche) et 0,25 mM de vitamine C.
NOTE: Ce milieu est utilisé le jour de la dissociation des cellules endodermiques. - Préparer le milieu de différenciation de stade 2 sans inhibiteur de roche en suivant la même procédure pour le milieu préparé à l’étape 1.3.1, à l’exclusion de l’inhibiteur de roche.
REMARQUE : Ce support est utilisé le deuxième jour de l’étape 2.
- Préparer le milieu de différenciation de stade 2 contenant l’inhibiteur de roche du milieu basal en le chauffant à 37 °C et en complétant avec 50 ng/mL de FGF10, 50 ng/mL de NOGGIN, 0,25 μM de CHIR99021, 10 μM de Y-27632 (inhibiteur de roche) et 0,25 mM de vitamine C.
- Préparer les milieux de différenciation de l’étape 3 (pour l’intestin antérieur postérieur).
- Préparer des milieux DMEM contenant 4,5 g/L de glucose, puis compléter avec 1 % de pénicilline-streptomycine et 2 mM de glutamax et utiliser comme milieu basal pour les stades 3 et 4.
- Réchauffer le milieu DMEM (préparé à l’étape 1.4.1) et compléter avec 2 μM d’acide rétinoïque, 0,25 μM de SANT-1, 50 ng/mL de FGF10, 50 ng/mL de NOGGIN, 0,25 mM de vitamine C et 1 % de supplément de B27 sans vitamine A (voir le tableau des matières).
REMARQUE : Ce milieu est utilisé pendant 4 jours de l’étape 3 pour P2-D (protocole 2, optimisé, dissocié) et 2 jours de l’étape 3 pour P1-ND (protocole 1, non optimisé, non dissocié).
- Préparer les milieux de différenciation de l’étape 4 (pour les progéniteurs pancréatiques).
- Ajouter du DMEM contenant 4,5 g/L de glucose avec 100 ng/mL d’EGF, 10 mM de nicotinamide, 50 ng/mL de NOGGIN, 0,25 mM de vitamine C et 1 % de supplément de B27 sans vitamine A (voir le tableau des matières). Utilisez ce média pendant tous les jours de l’étape 4.
REMARQUE: Maintenez tous les réactifs à des températures appropriées, et toutes les cytokines et les réactifs sensibles doivent être aliquotes. Décongeler les réactifs aliquotes et les ajouter au milieu de base au moment de changer le milieu de différenciation. Les compositions des différents milieux de différenciation sont présentées dans le tableau 1.
- Ajouter du DMEM contenant 4,5 g/L de glucose avec 100 ng/mL d’EGF, 10 mM de nicotinamide, 50 ng/mL de NOGGIN, 0,25 mM de vitamine C et 1 % de supplément de B27 sans vitamine A (voir le tableau des matières). Utilisez ce média pendant tous les jours de l’étape 4.
2. Préparation de vaisselle revêtue de matrice membranaire basale
- Décongeler la matrice de sous-sol disponible sur le marché (voir le tableau des matériaux) et l’aliquote sur la glace; congeler les aliquotes à -20 °C.
- Avant d’enrober les boîtes de culture tissulaire, décongeler les aliquotes congelées sur de la glace. Ajouter le volume approprié de la solution à matrice membranaire dans le milieu KO-DMEM/F-12 refroidi (KnockOut DMEM/F-12) (voir le tableau des matériaux) pour obtenir la concentration diluée désirée et bien mélanger. Conserver la solution matricielle diluée à 4 °C pour une utilisation immédiate.
- Couvrir la surface des plaques traitées par culture tissulaire (voir le tableau des matières) avec une solution de matrice membranaire diluée et placer les plaques à 37 °C pendant au moins 60 minutes avant de plaquer les cellules. Utiliser une dilution de 1:50 de la solution à matrice membranaire dans KO-DMEM/F-12 pour les cellules de placage pour l’expérience de différenciation pancréatique et 1:80 pour l’expansion des CSPh indifférenciées.
3. Culture des CSPh indifférenciées
- Passage des CSPh lorsque les colonies atteignent une confluence de 70% à 80%.
- Pour le passage, laver les CSPh une fois avec du PBS chaud, aspirer à l’aide d’un aspirateur sous vide portatif à l’intérieur de la hotte de culture tissulaire et ajouter 0,5 mM de solution d’EDTA dans du PBS pour couvrir la surface de la colonie. Incuber à 37 °C, 5% de CO2 pendant 1 min ou jusqu’à ce que les bordures des colonies se détachent de la surface de la plaque.
- Retirer la solution d’EDTA et recueillir les colonies détachées avec le milieu de culture hPSC à l’aide d’une micropipette P1000. Centrifuger les cellules collectées à 128 x g pendant 4 min à température ambiante. Jeter le surnageant et compléter les cellules avec des milieux de culture hPSC contenant 10 μM de Y-27632 (inhibiteur de roche)23,24.
NOTE: Passer les CSPh dans un rapport d’au moins 1:3 sur des boîtes revêtues de matrice membranaire 1:80. Cependant, pour les expériences de différenciation, éclouer les CSPh sur des plats enrobés de 1:50.
4. Induction de la différenciation définitive de l’endoderme (DE) dans les CSPh (stade 1)
- Lorsque les colonies de CSPh atteignent une confluence de 70 % à 80 %, lavez-les deux fois avec du PBS chaud et aspirez à l’aide d’un aspirateur à vide portatif à l’intérieur de la hotte de culture tissulaire pour commencer la différenciation de stade 1.
- Ajouter le milieu de différenciation de stade 1 contenant CHIR99021 (à partir de l’étape 1.2.2) aux colonies, 2 mL par plaque de 6 puits, et incuber à 37 °C pendant 24 h.
- Le lendemain, remplacez le milieu usé par le milieu de différenciation de l’étape 1 sans CHIR99021 (étape 1.2.3).
- Toutes les 24 h, aspirer le milieu usé à l’aide d’un aspirateur sous vide portable à l’intérieur de la hotte de culture tissulaire et le remplacer par un nouveau milieu de différenciation de stade 1 sans CHIR99021.
REMARQUE: L’étape 1 peut être prolongée jusqu’à 4 jours. La longueur de l’étape 1 dépend de la ligne hPSC utilisée et doit être optimisée en conséquence.
5. Analyse par immunofluorescence du DE dérivé de hPSC (stade 1)
- Pour l’immunofluorescence, aspirer les milieux usés à l’aide d’un aspirateur à vide portatif à l’intérieur de la hotte de culture tissulaire des puits et laver deux fois avec du PBS chaud. Faites tourner la plaque pour vous débarrasser de tout débris cellulaire.
- Couvrir la surface des puits avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) pour fixer les cellules DE; par exemple, ajoutez 250 uL de PFA par puits d’une plaque de 24 puits. Placer la plaque sur un shaker 2D à 20 x g pendant 20 min.
- Après la fixation, laver les cellules DE avec une solution saline tamponnée au tris avec 0,5 % de Tween (TBST) (voir le tableau des matières) et placer la plaque sur le shaker à 20 x g pendant 10 min. Répétez cette étape une fois de plus.
- Perméabiliser les cellules fixes en ajoutant un volume généreux de solution saline tamponnée au phosphate avec 0,5% de Triton X-100 (PBST); par exemple, ajouter 1 mL de PBST par puits d’une plaque de 24 puits et remettre la plaque sur l’agitateur à 20 x g pendant 20 min.
- Préparez fraîchement 5% à 6% de BSA dans PBST comme tampon bloquant et ajoutez-le aux cellules perméabilisées. Incuber la plaque pendant au moins 1 h dans la solution de blocage sur l’agitateur.
- Diluer les anticorps primaires dirigés contre SOX17 et FOXA2 ensemble (voir le tableau des matériaux) dans du BSA à 2 % à 3 % dans une solution PBST. Ajouter les anticorps combinés aux cellules bloquées et placer la plaque sur l’agitateur à 4 °C pendant une nuit à basse vitesse en agitant doucement.
REMARQUE: SOX17 et FOXA2 sont des marqueurs DEbien établis 25,26. - Le lendemain, aspirez les anticorps primaires à l’aide d’un filtre à vide portatif et lavez les puits avec TBST trois fois, chaque lavage pendant 10 minutes sur le shaker.
- Préparer une dilution de 1:500 d’anticorps secondaires conjugués Alexa fluor 488- et 568- (voir le tableau des matériaux) contre les espèces dans lesquelles les anticorps primaires ont été élevés.
- Ajoutez la combinaison d’anticorps secondaires au puits coloré et couvrez la plaque de papier d’aluminium pour la protéger de la lumière. Placer la plaque sur le shaker pendant 1 h à température ambiante.
- Aspirer la solution d’anticorps secondaires à l’aide d’un filtre à vide portatif et laver les puits colorés avec du TBST sur l’agitateur pendant 10 min, en recouvrant la plaque de papier d’aluminium. Répétez l’étape de lavage trois fois au total.
- Préparer une dilution de 1 μg/mL de Hoechst 33342 dans du PBS pour colorer les noyaux. Ajouter la solution Hoechst dans les puits et placer la plaque sur l’agitateur pendant 2-3 min.
- Aspirez la solution Hoechst à l’aide d’un filtre à vide portable et rincez les puits avec du PBS deux fois.
- Enfin, ajoutez du PBS aux cellules colorées et imagez-les à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée (voir Tableau des matériaux) dans l’obscurité. Gardez la plaque recouverte de papier d’aluminium lorsque vous n’imagez pas pour minimiser le blanchiment fluorophore.
REMARQUE: Alternativement, la cytométrie en flux peut être utilisée pour évaluer l’efficacité de l’ED, comme décrit à l’étape 9.2.
6. Génération du tube intestinal primitif (PGT) à partir de CSPh (stade 2)
REMARQUE: Si l’analyse d’immunofluorescence à l’étape 5.13 est déterminée comme étant une co-expression SOX17-FOXA2 de 80% et plus, l’expérience passe à l’étape 2. Si l’efficacité est de <80%, prolongez la durée de l’étape 1 à 4 jours.
- Au jour 1 de l’étape 2, dissocier les cellules endodermiques dérivées de l’hPSC à l’aide de TrypLE ou d’Accutase (voir le tableau des matériaux) pour le protocole P2-D optimisé. Laver les cellules adhérentes avec du PBS chaud et ajouter 1 mL chaud de solution de TrypLE ou d’Accutase par puits d’une plaque à 6 puits pendant 3-5 minutes à 37 °C, 5% CO2, ou jusqu’à ce que les cellules commencent à se détacher les unes des autres.
- Dissocier les feuilles détachées ou la monocouche de cellules dans les puits, puis les recueillir ensemble dans un tube en polypropylène de 15 mL à l’aide d’un milieu basal de stade 1/2 sans cytokines contenant au moins 0,5 % de sérum fœtal bovin (FBS) ou de sérum KnockOut (KOSR) (voir le tableau des matières).
- Faire tourner les cellules à 800 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant. Ajouter 1 mL de PBS stérile et remettre la pastille en suspension dans des cellules individuelles.
- Comptez les cellules à l’aide d’un compteur automatisé (voir le tableau des matériaux) en chargeant le volume recommandé de cellules dans la lame de la chambre. Faire tourner les cellules remises en suspension à 800 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
- Resuspendre la pastille dans le volume approprié du milieu de différenciation de stade 2 contenant un inhibiteur de roche à une densité de 2,5-3,5 x 105 cellules/cm2.
REMARQUE: Ce nombre peut se réduire à un rapport de division de 1: 2 pour la plupart des lignées cellulaires, en fonction du taux de prolifération. Le volume total sera de 2 mL de média avec cellules remises en suspension dans 1 puits de plaque de 6 puits. - Plaquer les cellules remises en suspension sur des plaques à matrice membranaire 1:50 (préparées à l’étape 2) et les incuber à 37 °C, 5% de CO2 dans l’incubateur.
- 24 h plus tard, remplacer le milieu par un milieu de différenciation de stade 2 sans inhibiteur de roche (préparé à l’étape 1.3.2).
7. Génération de l’intestin antérieur postérieur à partir de CSPh (stade 3)
- Aspirer les milieux usés de l’étape 2 à l’aide d’un aspirateur à vide portatif à l’intérieur de la hotte de culture tissulaire et laver les cellules avec du PBS chaud.
- Ajouter le milieu de différenciation de l’étape 3 de l’étape 1.4 aux cellules et incuber à 37 °C, 5% CO2.
- Après 24 h, remplacez le média usagé par un milieu de différenciation Stage 3 fraîchement préparé. Répétez cette opération pendant un total de 4 jours pour le protocole P2-D (optimisé) et seulement 2 jours pour le protocole P1-ND non dissocié.
8. Génération de progéniteurs pancréatiques à partir de CSPh (stade 4)
- Après 4 jours de traitement de stade 3, laver les cellules avec du PBS chaud, agiter doucement la plaque et aspirer à l’aide d’un aspirateur à vide portable. Ensuite, ajoutez le milieu de différenciation de l’étape 4 de l’étape 1.5 aux cellules.
- Après 24 h, remplacez les milieux usagés par des supports de l’étape 4 fraîchement préparés. Répétez cette opération pendant un total de 4 jours.
9. Évaluation de l’efficacité de différenciation de la génération de progéniteurs pancréatiques à partir de CSPh
- Effectuer l’analyse d’immunofluorescence des progéniteurs pancréatiques dérivés de hPSC (stade 4) pour l’expression de PDX1 et NKX6.1.
REMARQUE: PDX1 et NKX6.1 sont des marqueurs progéniteurs pancréatiques bien établis17,18.- Effectuer la fixation, la perméabilisation, le blocage et l’incubation des anticorps et les lavages conformément à l’étape 5.
- Colorer les progéniteurs pancréatiques dérivés de hPSC avec une combinaison d’anticorps PDX1 et NKX6.1 (voir le tableau des matériaux) dilués dans 2% -3% BSA dans PBST.
- Utiliser des dilutions 1:500 d’anticorps secondaires conjugués au fluor 488 et 568 appropriés d’Alexa (voir le tableau des matériaux).
- Effectuer une analyse par cytométrie de flux des progéniteurs pancréatiques dérivés de hPSC pour l’expression de PDX1 et NKX6.1.
REMARQUE : L’analyse par cytométrie en flux des marqueurs pancréatiques dans les progéniteurs pancréatiques générés dérivés du CSPh permet de quantifier les cellules co-exprimant PDX1 et NKX6.1.- À la fin de l’étape 4, lavez les cellules deux fois avec du PBS chaud et ajoutez suffisamment de TrypLE ou d’Accutase pour couvrir la surface des puits, par exemple, 1 mL de TrypLE ou d’Accutase par puits de plaque à 6 puits. Placez la plaque dans l’incubateur pendant 5-7 minutes ou jusqu’à ce que les cellules se détachent de la surface.
- Dissocier les feuilles adhérentes des cellules à l’intérieur du puits à l’aide d’une micropipette P1000 avant de les recueillir dans un tube en polypropylène de 15 mL.
- Faire tourner les cellules dans les progéniteurs pancréatiques dérivés de hPSC à 800 x g pendant 5 min à 4 °C, puis jeter le surnageant. Lavez les cellules avec du PBS en les dissociant en cellules individuelles. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur automatisé (voir le tableau des matières) et notez la concentration dans le nombre de cellules par mL.
- Faire tourner à 800 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant. Ajouter 200 μL de PBS réfrigéré à la pastille et dissocier.
- Ajouter 2 mL d’éthanol réfrigéré à 80 % goutte à goutte, avec le tube sur un vortex à basse et moyenne vitesse (400 x g à température ambiante). Fermez hermétiquement les bouchons et placez les tubes légèrement inclinés sur le vibreur à 4 °C pendant la nuit.
- Faire tourner les cellules à 800 x g pendant 5 min à 4 °C et laver avec du PBS pour dissocier les amas de cellules fixes.
- Bloquer les cellules fixes avec une solution de BSA à 5%-6% dans du PBST pendant au moins 1 h à température ambiante ou 4 °C pendant une nuit sur l’agitateur.
- Coloration pour les marqueurs progéniteurs pancréatiques en suivant les étapes ci-dessous.
- Répartir 2 00 000 cellules par affection, y compris les témoins d’isotypes appropriés en fonction de la sous-classe d’IgG de l’espèce hôte de l’anticorps primaire, les témoins d’anticorps non colorés et secondaires dans une plaque inférieure en V à 96 puits ou des tubes à centrifuger de 1,5 mL.
- Faire tourner la plaque à 800 x g pendant 5 min à 4 °C et retourner la plaque d’un mouvement rapide pour éliminer le surnageant sans perdre les granulés. Préparer les dilutions d’anticorps primaires dans une solution de BSA à 3 % (voir le tableau des matières).
REMARQUE: La concentration d’anticorps primaires peut être comprise entre 1:50 et 1:200. - Incuber les cellules colorées pendant au moins 2 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C sur un agitateur en agitant doucement à basse vitesse.
- Lavez les cellules colorées avec du TBST trois fois en pipetant les cellules de haut en bas dans les puits. Faire tourner et jeter le surnageant comme à l’étape 9.2.8.2.
- Ajouter une dilution de 1:500 des anticorps secondaires (anticorps conjugués Alexa fluor 488 et 647) préparés dans du PBS (voir le tableau des matériaux). Incuber pendant 30 min à température ambiante.
- Lavez les cellules colorées avec TBST au moins deux fois en pipetant les cellules de haut en bas. Faire tourner la plaque et jeter le surnageant comme à l’étape 9.2.8.2.
- Recueillir les cellules colorées dans au moins 100 μL de PBS et les transférer dans des tubes FACS protégés par la lumière (voir le tableau des matériaux). Exécutez les échantillons sur une machine de cytométrie en flux.
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Representative Results
Les résultats montrent que le protocole optimisé P2-D (figures 1A) a amélioré l’efficacité de différenciation des progéniteurs pancréatiques en régulant à la hausse la co-expression PDX1 et NKX6.1 (Figure 2A, B et Figure 3A). En particulier, les résultats ont montré que la dissociation des cellules endodermiques et leur replacage sur la matrice membranaire fraîche ainsi qu’une durée plus longue de stade 3 augmentaient l’expression de NKX6.1 chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de hPSC (protocole optimisé, P2-D) (Figure 2 et Figure 3A), par rapport au protocole non dissocié (P1-ND) qui a été modifié à partir d’une étude publiée précédemment27 . Le présent protocole amélioré a également généré la plus forte proportion de progéniteurs PDX1+/NKX6.1+ par rapport à « P1-D » (protocole 1, S3 = 2 jours, dissocié) et « P2-ND » (protocole 2, S3 = 4 jours, non dissocié), et les résultats détaillés ont été publiés précédemment21. Les progéniteurs pancréatiques générés à l’aide de P2-D ont également un nombre accru de cellules SOX9+ par rapport aux cellules P1-ND non dissociées (Figure 3B). La méthode optimisée a également généré une proportion plus élevée de cellules NKX6.1+ prolifératives qui co-expriment le marqueur de prolifération Ki67 (Figure 3C).
Les résultats représentatifs présentés ici proviennent de CSPi générées à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de contrôle, en bonne santé. Cependant, nous avons appliqué de manière reproductible le protocole amélioré actuel sur plusieurs lignées hPSC telles que H1-hESC, H9-hESC, HUES8-hESC et plusieurs autres lignées iPSC de contrôle pour obtenir ~90% PDX1 et NKX6.1 co-exprimant les progéniteurs pancréatiques20,21,28.
Après l’induction de l’ED dans les CSPh, de légers niveaux de mort cellulaire sont attendus. Cependant, si un taux élevé de mortalité cellulaire était observé, l’expérience était arrêtée et recommencée avec un nouveau lot de cellules. L’efficacité de l’induction de l’ED doit être supérieure à 70%-80% pour assurer une proportion élevée de cellules DE dans la culture qui servira de source de départ idéale pour l’induction des progéniteurs pancréatiques (Figure 1C).
La densité des cellules endodermiques de replacage après la dissociation peut être manipulée en fonction du taux de croissance de cette cellule particulière. Par exemple, les cellules à croissance lente peuvent être replaquées à une densité plus élevée que celle recommandée. Cela minimisera les chances d’obtenir des populations pancréatiques non pertinentes au stade 4. Une co-expression élevée de PDX1 et NKX6.1 peut être obtenue après dissociation après stade 1 et replatage à mi-densité (Figure 1A, Figure 2A, B et Figure 3A). Si une expression élevée de PDX1 est observée mais seulement une expression modérée de NKX6.1, le stade 4 peut être prolongé de 2 jours pour améliorer l’expression de NKX6.1 dans les cellules exprimant PDX1.
Figure 1 : Chronologie de l’ajout de cytokines et de facteurs de croissance au cours de la différenciation des progéniteurs pancréatiques. (A) Représentation schématique du protocole optimisé (P1-D) pour la génération de PDX1 et NKX6.1 à partir de CSPh. L’endoderme définitif (DE) dérivé de l’hPSC est dissocié et replaqué à moitié densité, puis dirigé séquentiellement vers un devenir progéniteur pancréatique. (B) Images de CSPh en fond clair avant le début de la différenciation au jour 0. (C) Analyse d’immunomarquage pour l’expression des marqueurs endodermiques SOX17 et FOXA2 dans les cellules endodermiques dérivées de hPSC (stade 1). SOX17, vert; FOXA2, rouge. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Génération de progéniteurs pancréatiques dérivés de hPSC, co-exprimant PDX1 et NKX6.1. Analyse d’immunomarquage pour la comparaison de l’expression de PDX1 et NKX6.1 chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de hPSC à l’aide du protocole amélioré (P2-D) (A) et d’un protocole non optimisé et précédemment publié (P1-ND) (B). Le protocole amélioré a obtenu la co-expression la plus élevée de PDX1 et NKX6.1. PDX1, vert; NKX6.1, rouge. Les images agrandies sont fournies dans le deuxième panneau pour chaque protocole. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Quantification des marqueurs pancréatiques chez les progéniteurs pancréatiques générés à l’aide du protocole amélioré. L’analyse de cytométrie en flux chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de hPSC a permis d’obtenir P2-D par rapport au P1-ND non dissocié. (A) Histogrammes pour l’expression PDX1 et NKX6.1 et graphiques de coloration double positif. (B) Les histogrammes pour l’expression de SOX9 et (C) la co-expression de NKX6.1 avec le marqueur de prolifération Ki67. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Étape | Média | Cytokines | Jours | ||||||
| 1 | MCDB 131 milieu + 0,5 % d’albumine sérique bovine sans acides gras (FFA-BSA), 1,5 g/L de bicarbonate de sodium (NaHCO3), 10 mM de glucose | Jour 1 : 2 μM CHIR99021, 100 ng/mL d’activine A, 10 μM Inhibiteur de roche (Y-27632), 0,25 mM de vitamine C. À partir du jour 2 : 100 ng/mL d’activine A, 0,25 mM de vitamine C | 3 ou 4 | ||||||
| 2 | MCDB 131 milieu + 0,5 % d’albumine sérique bovine sans acides gras (FFA-BSA), 1,5 g/L de bicarbonate de sodium (NaHCO3), 10 mM de glucose | Jour 1 (dissociation) : 50 ng/mL FGF10, 50 ng/mL NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 10 μM Y-27632 (inhibiteur de roche), 0,25 mM de vitamine C. Jour 2 : 50 ng/mL FGF10, 50 ng/mL NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 0,25 mM de vitamine C. | 2 | ||||||
| 3 | DMEM + 4,5 g/L de glucose | 2 μM d’acide rétinoïque, 0,25 μM SANT-1, 50 ng/mL FGF10, 50 ng/mL de NOGGIN, 0,25 mM de vitamine C, supplément de B27 à 1 % sans vitamine A | 4 | ||||||
| 4 | DMEM + 4,5 g/L de glucose | 100 ng/mL EGF, 10 mM de nicotinamide, 50 ng/mL de NOGGIN, 0,25 mM de vitamine C, supplément de B27 à 1 % sans vitamine A. | 4 | ||||||
Tableau 1 : Les compositions des différents milieux de différenciation utilisés dans l’étude.
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Discussion
Ce travail décrit un protocole amélioré pour générer des progéniteurs pancréatiques à partir de CSPh avec une co-expression élevée de PDX1 et NKX6.1. La dissociation et le replatage de l’endoderme dérivé de hPSC à demi-densité sur une matrice fraîche ont entraîné une augmentation de PDX1 et NKX6,1 chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de hPSC.
Bien que le cocktail de facteurs de croissance pour chaque stade soit très similaire à P1-ND 27, il a été démontré qu’un traitement de stade 3 plus étendu comprenant la signalisation FGF et rétinoïde et BMP et hérisson augmente l’expression de NKX6.1, ce qui contraste avec les résultats de Nostro et al.27. Alors que l’expression de PDX1 dans le pancréas au cours du développement embryonnaire est régulée positivement par la signalisation FGF et rétinoïde et l’inhibition de BMP et de hérisson27,29,30, les résultats actuels ont démontré que l’extension de ce cocktail de signalisation régule également à la hausse NKX6.1. Néanmoins, l’effet d’un traitement prolongé de stade 3 a été aidé par la dissociation et le placage des cellules endodermiques qui ont conduit à une augmentation de l’expression de PDX1 et NKX6.1. De plus, cette méthode (P2-D) a également augmenté les cellules exprimant SOX9 dans les progéniteurs pancréatiques dérivés de hPSC, en plus de la proportion de cellules prolifératives NKX6.1+ qui co-expriment le marqueur de prolifération Ki67.
Un autre facteur crucial affectant l’efficacité de la différenciation était la disponibilité d’une matrice membranaire fraîche pour les cellules dissociées. Il a déjà été démontré que les composants de la matrice extracellulaire régulent la spécification du devenir des cellules souches31,32. Dans l’ensemble, les effets favorables des composants de la matrice extracellulaire sur le développement pancréatique ont été enregistrés 33,34,35, en particulier pour la matrice membranaire, qui, avec la laminine, s’est avérée avoir un effet pro-endocrinien sur les cellules de la lignée pancréatique 36. Par conséquent, le placage des cellules endodermiques sur une matrice membranaire fraîche peut avoir amélioré l’expression de NKX6.1 chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de l’hPSC.
La densité cellulaire des cellules différenciantes contrôle également l’expression des gènes. De nombreuses études ont démontré l’importance du contact cellule-cellule dans la régulation du développement pancréatique37,38,39. Il a été démontré que l’agrégation cellulaire ou la formation de corps embryoïdes induisent une expression génique endocrinienne pancréatique plus élevée que les cultures 2D19. Cependant, les résultats démontrent qu’une expression pancréatique plus élevée, en particulier NKX6.1, peut être obtenue en cultivant des cellules dans une monocouche 2D à la moitié de la densité endodermique en utilisant notre protocole optimisé21. Fait intéressant, cette méthode a également inhibé le devenir des cellules hépatiques (le devenir alternatif de l’ED dérivé des CSPh), comme le montre la diminution de l’expression des gènes hépatiques AFP (alpha-fœtoprotéine) et ALB (albumine)21, indiquant que les facteurs physiques jouent un rôle dans la spécification de la lignée des CSPh.
Dans l’ensemble, les résultats démontrent que la modulation de l’environnement physique des cellules différenciantes peut améliorer l’expression des gènes pancréatiques21. Plus précisément, la dissociation de l’endoderme dérivé du hPSC et le replacage sur la matrice membranaire fraîche avec une signalisation FGF et rétinoïde plus longue et l’inhibition du hérisson et de la BMP peuvent améliorer la co-expression de PDX1 et NKX6.1 dans les progéniteurs pancréatiques dérivés des CSPh. Cependant, le protocole optimisé est au moins 2 jours plus long que les protocoles précédemment publiés. De plus, la durée de l’étape 4 peut être prolongée au-delà du minimum recommandé, c’est-à-dire 4 jours, en fonction de la lignée cellulaire utilisée. Plusieurs facteurs de croissance humaine recombinants sont utilisés dans le protocole optimisé qui peuvent être remplacés par leurs composés à petites molécules moins coûteux qui effectuent la même action. Néanmoins, ce protocole optimisé peut faciliter la génération évolutive de progéniteurs pancréatiques à partir de CSPh pour la thérapie cellulaire et la modélisation de la maladie.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par une subvention du Fonds national de recherche du Qatar (QNRF) (Subvention No. NPRP10-1221-160041).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
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