Summary
プロトコルは、切断された神経を通してマウス運動神経終末に蛍光カルシウム色素をロードする方法を説明しています。さらに、共焦点顕微鏡を使用して末梢神経終末の高速カルシウム過渡現象を記録するためのユニークな方法が提示されます。
Abstract
シナプス前細胞へのカルシウムの侵入は神経伝達物質の放出につながる一連の事象を引き起こすため、シナプス前カルシウムレベルの推定はシナプス伝達を研究する上で重要な課題である。さらに、シナプス前カルシウムレベルの変化は、多くの細胞内タンパク質の活性を媒介し、シナプス可塑性において重要な役割を果たす。カルシウムシグナル伝達の研究は、神経変性疾患の治療方法を見つけるためにも重要です。神経筋接合部は、神経伝達物質の種類が1つしかないため、シナプス可塑性の研究に適したモデルです。この記事では、切断された神経束を通してマウスの運動神経終末にカルシウム感受性色素をロードする方法について説明します。この方法は、基礎カルシウムレベルおよびカルシウム一過性などの細胞内カルシウム変化に関連する全てのパラメータの推定を可能にする。細胞外から神経終末へのカルシウムの流入とカルシウム感受性色素への結合/脱離は数ミリ秒以内に起こるため、これらの事象を記録するには迅速なイメージングシステムが必要です。実際、高速カメラはカルシウムの速い変化の登録に一般的に使用されていますが、画像解像度パラメータは低くなっています。カルシウム過渡を記録するためにここに提示されたプロトコルは、共焦点顕微鏡によって提供される非常に優れた空間的-時間分解能を可能にします。
Introduction
興奮性細胞における高速カルシウム波を測定する問題は、中枢神経系および末梢神経系におけるシグナル伝達を研究する上で最も重要かつ困難な側面の1つです。カルシウムイオンは、神経伝達物質の放出、シナプス可塑性、およびさまざまな細胞内タンパク質の活性の調節を引き起こすのに重要な役割を果たします1,2,3,4,5。カルシウムシグナル伝達の研究は、神経変性疾患の治療方法を見つけるためにも重要です6。カルシウムレベルの変化を測定するために、蛍光カルシウム感受性色素が一般的に使用され、それらの蛍光レベルの変化が分析されます7、8、9。
カルシウム色素の細胞への装填は、さまざまな方法で達成できます。主に、細胞透過性染料が使用される10,11。しかし、このような場合、細胞内の色素の濃度を制御することが難しいだけでなく、ロードする標的細胞を選択することも困難である。この方法は、色素がシナプス後細胞に入るため、末梢神経終末の研究には適用できません。代わりに、細胞不透過性染料がそのような調製物により適している。この場合、色素は、マイクロインジェクションによって、またはパッチピペット12、13、14を介して細胞に送達される。神経断端を通して負荷をかける方法もあります。後者の方法は、神経筋接合部調製物15、16、17、18、19、20に最も適している。目的の細胞に対してのみ染色を行うことができます。この方法では、標的細胞中の色素の濃度を正確に評価することはできませんが、濃度は、溶液中の安静細胞の蛍光レベルを既知の濃度のカルシウム21と比較することによっておおよそ推定できます。本研究では、哺乳類のシナプスに適用されるこの方法の修正を提示する。
活動電位の脱分極期におけるカルシウムの侵入は、特に神経筋接合部において速いプロセスである。したがって、その登録には、適切な機器が必要です1。電位感受性蛍光色素を用いた最近の研究では、マウスの末梢シナプスにおける活動電位の持続時間は約300μsであることが実証された22。カエルの末梢シナプスでカルシウム感受性染料を使用して評価されたカルシウム過渡性は、より長い持続時間を有する:上昇時間は約2〜6ミリ秒であり、崩壊時間は約30〜90ミリ秒である23,24。蛍光色素を使用して高速プロセスを測定するには、CCDまたはCMOSカメラが一般的に使用され、高速で感度の高いCCDマトリックスが使用されます。しかしながら、これらのカメラは、マトリックス25、26、27、28の敏感な要素のサイズによって制限される低解像度の欠点を有する。細胞の低周波刺激に応答して活動電位とカルシウム過渡現象の両方を記録するのに十分な感度を有する最速のカメラは、2,000Hzのスキャン周波数を有し、80×80の寸法を有するマトリックスを有する29。より高い空間分解能を有する信号を得るために、特に信号30、31、32におけるいくらかの体積変化を評価する必要がある場合には、共焦点顕微鏡が使用される。しかし、共焦点顕微鏡はラインスキャンモードでは高いスキャン速度を有するが、空間画像33を構築する際の高速プロセスの記録速度には依然として大きな制限があることに留意すべきである。回転するニプコウディスクをベースにした共焦点顕微鏡(スリット走査顕微鏡)や、より高速なスキャン速度を持つマルチポイントアレイスキャナーがあります。同時に、それらは共焦点画像フィルタリング(ニポウディスクを備えた顕微鏡のピンホールクロストーク)において古典的な共焦点顕微鏡より劣っています32,34,35。共鳴スキャンによる共焦点画像化はまた、高時間測定に必要な高い時空間分解能を提供することができる36。しかしながら、共鳴スキャナを使用する場合、高速走査速度での弱い蛍光応答の登録には、ハイブリッド検出器36などの高感度検出器が必要であることを考慮する。
本稿では、空間分解能を維持しながら、レーザー走査型共焦点顕微鏡(LSCM)で記録された信号の時間分解能を高める方法を紹介します37。現在の方法は、前述の方法のさらなる発展であり、LSCMプラットフォーム38、39、40に転送される。このアプローチは、顕微鏡ハードウェアの変更を必要とせず、刺激の瞬間に対する時間シフトで周期的に誘発される蛍光シグナルを記録するためのアルゴリズムの適用に基づいています。
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Protocol
マウスBALB/C(20-23 g、生後2-3ヶ月)から分離された長耳 挙筋 (m. LAL)の単離された神経筋調製物について実験を行った41。実験手順は、実験動物の世話と使用のためのNIHガイドに準拠して、カザン連邦大学およびカザン医科大学の実験動物の使用に関するガイドラインに従って実施されました。実験プロトコルは、欧州共同体理事会指令86/609 / EECの要件を満たし、カザン医科大学の倫理委員会によって承認されました。
1.リンガーおよびファイリングソリューションの準備
- 次の成分を混合することにより、哺乳類の筋肉用のリンゲル溶液を調製します:NaCl(137 mM)、KCl(5 mM)、CaCl 2(2 mM)、MgCl 2(1 mM)、NaH 2 PO4(1 mM)、NaHCO3(11.9 mM)、およびグルコース(11 mM)。95%O 2および5%CO 2で溶液を泡立て、必要に応じてHCl / NaOHを加えてpHを7.2〜7.4に調整します。
- 色素担持液を調製します。
- pHが7.2〜7.4の範囲のHEPES(10 mM)溶液を調製します。500 μgの市販の染料は、500 μLのバイアルに入っています。色素を14 μLのHEPES溶液に溶解し、色素濃度30 mMを得た。よく振って、完全に溶解するまで遠心分離します。
- Ca2+指示薬の溶液をHEPES溶液で1 mM濃度まで希釈します。冷凍庫(-20°C)に保管し、光にさらさないでください。
2. 色素の装填手順
注:色素の装填手順は、以前に公開されたプロトコル19、42、43、44、45、46から適応された、神経断端を介した負荷のプロトコルに従って実行されます。
- 以前に公開されたプロトコル47、48に記載されているように、この調製のための解剖手順に従ってLAL筋肉を解剖する。
- エラストマーでコーティングされたペトリ皿にわずかに伸ばした組織(初期の長さから30%以下)を細かいステンレス鋼ピンで固定し、筋肉が完全に覆われるまでリンガー溶液を追加します。
注意: ペトリ皿には、製造元の指示に従ってエラストマーが事前に充填されていました(材料表を参照)。
- エラストマーでコーティングされたペトリ皿にわずかに伸ばした組織(初期の長さから30%以下)を細かいステンレス鋼ピンで固定し、筋肉が完全に覆われるまでリンガー溶液を追加します。
- 充填ピペットの準備
- マイクロピペットプラー( 材料表を参照)を使用して、細胞内記録用にできるだけ鋭利な先端のマイクロピペットを準備します。内部フィラメントのないキャピラリー(外径1.5 mm、内径0.86または1.10 mm)を使用してください。
- テーパーを研磨剤で刻んだ後、マイクロピペットチップを切り離し、チップを直径約100μmまで開いたままにします。内径が>80μmから12-13μmに縮小するまで、先端をファイアポリッシュします。充填ピペットの片側にシリコンチューブを取り付け、反対側にシリンジ(針なし)を取り付けます。
- 実体顕微鏡下で、神経幹が別々の神経枝に変わる場所を見つけます。ワックスを使用して、取り付けられたチューブとシリンジを備えた充填ピペットをペトリ皿に置きます。ピペットチップを神経の上に立つまで動かします。
- 細かいハサミで、筋線維に近い神経を切り、長さ約1 mmの神経断端の小片を残します。神経断端をリンガー液と一緒に、つまむことなく、充填ピペットの先端にそっと吸引します。充填ピペットからシリコンチューブを取り外します。
- 色素ローディング溶液(~0.3 μL)を、長いフィラメントのシリンジを使用して吸引します。この体積はフィラメントの約3cmに相当する。
注:最初に、アルコールランプまたはガスバーナーを使用して火を引くことによって、10μLの容量のピペットチップからフィラメントを作る必要があります。 - ローディング溶液を入れたフィラメントチップを充填ピペットにそっと挿入します。混合物を神経断端に直接放出します。調製物を室温で暗所で30分間インキュベートする。
- その後、調製物を新鮮なリンゲル溶液ですすぎ、50 mL(またはそれ以上)のリンゲル溶液を入れたガラスビーカーで25°Cで最大2時間インキュベートします(調製物は溶液で覆われている必要があります)。この間、染料はシナプスに到達します。
3. 共焦点顕微鏡によるビデオキャプチャ
注:カルシウム過渡現象の登録は、レーザー走査型共焦点顕微鏡(LSCM)を使用して実行されます( 材料の表を参照)。高速カルシウムトランジェントを登録するために、十分な空間的および時間的分解能で信号の記録を可能にする独自のプロトコルが使用されました。この方法は、Arkhipovらによる出版物37に完全に記載されている。顕微鏡には20倍の水浸対物レンズ(1.00NA)が装備されていました。488 nmのレーザーラインを10%の強度に減衰させ、503〜558 nmの発光蛍光を収集しました。
- 調製物をシリコンエラストマーコーティングされた実験チャンバーに取り付け、わずかに伸ばしてスチール製のマイクロニードルのセットで固定します。リンゲル溶液で製剤を広範囲にすすいでください。
注:チャンバーの底部をエラストマーで覆った有機ガラス製の単純なカスタムメイド灌流実験チャンバーを使用しました(製造元の指示に従って調製; 材料表を参照)。チャンバーには溶液供給チューブがあります。溶液は、磁気ホルダーに取り付けられたシリンジ針 を介して 汲み出されます( 材料の表を参照)。実験チャンバーとして、ペトリ皿(調製物のインキュベーションに使用されるものと同様)を使用することができるが、供給チューブおよび吸引チューブが取り付けられている。 - 神経を刺激するために使用される吸引電極を取り付けます。
注:電極の構造は、Kazakovらによる2015年の論文で発表されたものと同様です49。浴槽の横にワックスを塗って電極を置き、固定します。先端を神経断端に近づけ、電極に吸引します。 - 試料作製チャンバーを顕微鏡ステージに取り付け、入口と出口のフィッティングをチャンバーに配置します。
- 調製物を灌流するには、単純な重力流駆動システムを使用します。灌流吸引ポンプをオンにして、余分な溶液を取り除きます。
- 刺激吸引電極を電気刺激装置に接続し、刺激後に筋肉の収縮が発生することを確認します。刺激条件と記録については、セクション3.9-3.12を参照してください。
- 灌流系にd-ツボクラリン(10μM)を含むリンガー溶液を入れます。
注意: このソリューションは、筋肉の収縮を防ぐのに役立ちます。シナプス後膜上のニコチン性アセチルコリン受容体のD−ツボクラリンまたはα−ブンガロトキシン特異的遮断薬は、筋肉収縮を完全にまたは部分的に遮断するであろう50。また、筋肉収縮を予防するために、μ-コノトキシンGIIIBなどのシナプス後ナトリウムチャネルの特異的遮断薬を使用することができる51。 - 灌流吸引ポンプのスイッチを入れ、d-ツボクラリンを含むリンゲル溶液で製剤の灌流を開始します。
- LSCMソフトウェアでイメージングパラメータを次のように設定します。
- LSCMソフトウェア(LAS AF、 材料表を参照)で、 電気生理学を選択します。
注:このモードでは、画像が時点でキャプチャされると、トリガーボックスを使用して同期パルスが刺激装置に送信されます。これは、調製物における活動電位発生を誘発する(図1;刺激装置ユニット)。 - [取得モード] を選択します。顕微鏡同期パルスを使用して刺激装置をトリガーするには、ジョブメニュー設定でトリガー設定を選択します。「フレームでトリガーアウト」フィールドを out1 チャンネルに設定します。
- スキャン モード: XYT, スキャン周波数: 1400 Hz, ズーム係数: 6.1, ピンホール: 全開.シーケンシャル トランスパス双方向 X モードがオンになっていることを確認します。
- フレームを形成する最小時間を 52 ミリ秒に設定し、生のビデオに収集されるフレームを 20 フレームに設定します。
注: これらの設定では、128 x 128 ピクセルの解像度で画像をキャプチャし、52 ミリ秒ごとに 1 つのフレームを取得できます。 - アルゴンレーザーの励起波長を488nmに設定し、出力パワーを8%に設定します。
- LSCMソフトウェア(LAS AF、 材料表を参照)で、 電気生理学を選択します。
図1:実験セットアップの概略図。 1.レーザー走査型共焦点顕微鏡(LSCM)。2. LSCM(トリガーボックス)の同期モジュール。3.刺激装置。4.アイソレーションユニット。5.生物学的サンプル。6.神経の電気刺激のための吸引電極。7.灌流システム(7a:灌流液リザーバー、7b:スポイト、7c:流量調整器、7d:真空フラスコ)。矢印は同期パルスの伝搬方向を指しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- ライブモードボタンを押して ライブモード に切り替えると、色素がロードされた神経終末のプレビューを取得するのに役立ちます。
図2:Ca2+ インジケーターを搭載したマウスの神経と終末。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 刺激ユニット
注:この研究では、Landらの記事に記載されている刺激装置を使用しました52 。このデバイスは、MatLabソフトウェア を介して 刺激の時間的パラメータを設定することができます。- 新しいファイルを作成し、上記の記事のコードをMatLabコードウィンドウに貼り付けて、ファイルを保存します。 [実行]をクリックすると、刺激パラメータを含むウィンドウが表示されます。刺激の遅延時間と持続時間を設定します。
注:遅延は、再構成された蛍光シグナルの時間分解能を決定します。0.2msの持続時間の電気パルスが遅延され、絶縁ユニットに送信されます。後者は刺激パルスの振幅および極性を形成し、生物学的物体を記録装置から電気的に隔離する。 - 神経を刺激するには、刺激インパルスの最大振幅を選択します(すべての神経線維を活性化するために必要な最大刺激強度より25%〜50%大きい)。
注:提示された方法は、スイープを最小限に抑えたLSCMを使用して単一の高速蛍光シグナルを記録するための特別なアルゴリズムに基づいています。開発されたアルゴリズムの各ステップで、記録された蛍光シグナルは、顕微鏡掃引よりも短い時間間隔で前の蛍光シグナルからシフトされます。タイムシフトの値は、必要な信号の時間分解能を決定します。アルゴリズムのステップ (シフト) の数は、必要な時間解像度と元の時間解像度によって異なります。この登録方法では、調製物の刺激は0.25Hzの周波数で行われる。
- 新しいファイルを作成し、上記の記事のコードをMatLabコードウィンドウに貼り付けて、ファイルを保存します。 [実行]をクリックすると、刺激パラメータを含むウィンドウが表示されます。刺激の遅延時間と持続時間を設定します。
- ライブモードで、ROIを検索し、最適なフォーカスを取得します。データ集録ソフトウェアを実行します。
- 刺激装置の遅延を前の値に対して2ミリ秒少なくシフトし、データ収集ソフトウェアを実行します。
- 手順 3.11 を 26 回繰り返して 26 個のシーケンスを取得し、各シーケンスを前のシーケンスから 2 ミリ秒シフトします。
4.ビデオ処理
注:共焦点顕微鏡で取得した一連のビデオ画像は、フリーソフトウェアLAS Xを使用してTIFF形式でエクスポートされます( 材料表を参照)。このシリーズはフレームに分割され、フォルダーにエクスポートされました。より高い時間分解能で画像シーケンスを生成するために、データの分析と処理のためのオープン初期コードを持つImageJソフトウェアが使用されました。信号処理のアルゴリズムを 図3に概略的に表します。
図3:低時間解像度(フレームで52ミリ秒)の元のビデオファイルから高解像度ビデオファイル(フレームで2ミリ秒)をコンパイルするためのスキーム。 元のビデオファイルと対応する信号は、黒、マゼンタ、緑で色分けされています。コンパイルされたビデオファイルと結果の信号は赤で着色されています。右側のスキームは、共焦点顕微鏡で得られたビデオ画像を行ごとに示しています。左側では、対応する蛍光シグナルが選択したROIから変化します。一番上の行は、スキームに従って受信フレームからフレームごとに形成されます。その結果、フレームのアレイ全体で構成されるビデオ画像が作成され、フレーム間の遅延時間は52ミリ秒ではなく2ミリ秒になります。各線は、刺激信号のオフセットに(n − 1)* tで対応し、ここで、tは時間シフト(2ms)、nはシフト反復回数である。kは、元のビデオファイル(2〜4行目)のフレーム数を示し、記録された信号の持続時間に依存します。この場合、持続時間が1秒の信号を登録するには、k = 20(52 ms * 20 = 1040 ms)を選択する必要があります。t0 は刺激までの必要な遅延である。シフト反復回数 n を計算するには、フレーム間の初期時間分解能 (52 ミリ秒) を必要な時間分解能 (2 ミリ秒) で割る必要があります。この場合、n = 26であり、これは26の登録済みスイープに相当します。実行された操作の結果として、n * k = 520フレームからなるビデオ画像が得られる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- LAS Xソフトウェアを実行します。実験中に作成したプロジェクトを開きます。[ エクスポート]、[ 名前を付けて保存 ]の順にクリックして、フレーム.tiff形式で宛先フォルダーに保存します。
- ImageJソフトウェアを実行します。ファイルをクリックして >画像シーケンス>インポートします。
- 画像シーケンスを開くウィンドウで、コピー先のフォルダーを選択し、最初のフレームを開きます。
- シーケンスオプションウィンドウの開始イメージフィールドで、最初のフレームのフレーム番号を 1 に設定します。[インクリメント]フィールドで、最初の信号記録のフレーム数(この場合は20)に等しい値を設定し、[OK]をクリックします。
- ステッチされた最初のフレームの生成ファイルを別のフォルダに保存するには、[ ファイル]>[フォルダを保存]をクリックします>。
- 次の19フレームに対して手順4.3〜4.5を繰り返します。 シーケンスオプション ウィンドウで、「 開始イメージ 」フィールドに対応するフレーム番号を設定します。
- フルハイタイム解像度のビデオを生成するには、すべてのフレームをつなぎ合わせます。これを行うには、[ ファイル>インポート>イメージシーケンス ]をクリックし、[ 開始イメージ ]フィールドと [増分 ]フィールドで1を選択します。その結果、時間分解能が向上した最終的なビデオが作成されます。ファイルを.tiffまたはその他の適切な形式で保存します。
5.ビデオ分析
注: ImageJ で [ROI と背景] を選択します。ROIから背景を差し引きます。データは、比(ΔF/F0−1)*100 %として表され、ここでF0 は静止時の蛍光の強度であり、ΔFは刺激中の蛍光の強度である。
- スタックソー ター>画像>スタック>ツールをクリックします。次に、 ROIマネージャー>分析>ツールをクリックします。
- 手順 4.7 で保存した .tiff ファイルを ImageJ ウィンドウにドラッグ アンド ドロップします。画像を拡大して見やすくします。画像の視覚化を改善するには、[ 画像]をクリックして、[明るさ/コントラスト>調整>>自動]をクリックします。この手順はデータに影響しません。
- ROIを描画して、背景を神経終末に近づけます。ROI マネージャーに追加します。背景を計算するには 、[詳細>マルチメジャー]をクリックします。平均値をコピーし、スプレッドシート プログラムに貼り付けて、平均を計算します。
- 計算された平均値をスタックから減算するには 、[プロセス]>[メイン]>[減算]をクリックします。値を入力します。
- 多角形の線 を介して 神経終末の周囲にROIを描画します。ROI マネージャーに追加します。
- 神経終末の強度を測定する:[ 詳細]>[マルチメジャー]をクリックします。平均値をコピーして、スプレッドシート プログラムに貼り付けます。
- 信号の平均オフセットを計算します。
注意: 刺激までの遅延時間に応じて、対応するポイントを使用してください。この手順では、後続の計算で使用される F0 値を設定します。 - 信号値を平均オフセット値で割ります。
注:このステップの後、シグナルには、選択したROIの振幅値に対するバックグラウンドと生の蛍光の寄与は含まれません。 - 手順5.8で取得した値から1を引き、100%を掛けます。
- Ca2+-過渡のグラフをプロットし、振幅を計算します。
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Representative Results
提示された技術に従って調製物に色素をロードした後、神経断端の近くに位置するシナプスのほとんどは十分なレベルの蛍光を有していた( 図2を参照)。色素をロード調製し、記載されたレジストレーションと画像処理の方法を適用した後、所望の空間的および時間的分解能を有するカルシウム過渡現象が得られました( 図4を参照)。カルシウム過渡現象は提案手法により回収した( 図3参照)。
回収された信号の振幅および時間パラメータも解析した。平均データを 表1に示す。
図4:1回の実験からのカルシウムシグナルの代表的な痕跡。 平均振幅(MA)、立ち上がり時間(RT)、減衰時間(DecT)などの信号の重要なパラメータと、軸上の投影が示されています。MAは、緑色で着色されたピークのポイントを平均することによって計算されます。RTは、振幅が20%から80%に上昇するのにかかる時間であり、青色で着色されたx軸上の投影間の差として計算されます。DecTは、振幅がe倍減少する時間であり、赤で着色されたx軸上の投影間の差として計算されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ピーク ΔF/F (%) | 立ち上がり時間 20%-80% (ミリ秒) | τ (ミリ秒) |
| 27.0±4.6 (n=5) | 6.8±0.48 (n=5) | 456±53(n=5) |
表1:Ca2+ 過渡現象 の平均パラメータ。データは平均±s.e.m.として表示され、nは異なる神経-筋肉接合部における測定値の数である。ピークΔF/FはΔF/Fの平均振幅です。
カルシウム過渡解析は、活動電位11の間に終末する神経におけるシナプス前カルシウムレベルの変化の振幅−動的特性を評価することを可能にする。カルシウム過渡の振幅の変化は、定量的含有量の変化とよく相関する53。カルシウム過渡振幅分析は、シナプス伝達に対するシナプス前カルシウムレベルの調節に関連する生理活性化合物の効果を研究するために一般的に使用される54,55。カルシウム過渡現象の時間経過は、色素とのカルシウム結合およびその解離の速度論を反映している23,56。カルシウム23,56に対して異なる親和性を有する染料を使用する場合、それは明らかである。カルシウム過渡の時間的パラメータは、カルシウム感受性色素の動態を反映しており、神経終末における遊離カルシウムの動態を表していないが、実験データに基づく数学的モデリング方法は、細胞内の遊離カルシウムの挙動を回復し、カルシウム緩衝液の濃度を計算することができる23。
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Discussion
本稿では、Ca2+感受性色素を神経断端を介してマウスの神経終末に装填する方法、および共焦点顕微鏡を使用して高速カルシウム過渡現象を記録する方法について説明します。この負荷法の実施の結果として、神経断端の近くに位置するシナプスのほとんどは、運動神経の低周波刺激に応答して神経終末へのカルシウムの侵入の登録を可能にするのに十分なレベルの蛍光を有していた。
切り株を通してカルシウム色素をロードするための以前に提示されたプロトコルとは異なり、このプロトコルは哺乳類シナプスで使用するように設計されています。冷血動物調製物で使用されていた以前のプロトコルでは、一晩のインキュベーションが必要でした43。このプロトコルでは、染料との必要なインキュベーションはわずか2時間です。切断後に残った神経セグメントの長さに応じて、染料の装填速度、および装填された末端の数は変わり得る。より短い神経断端のための色素溶液でさらにインキュベーション時間を短縮することができた。同様の方法が、ハエシナプス18,19の負荷について記載されている。また、筋肉のインキュベーションは室温を超える温度のわずかな上昇で行われ、それは神経に沿った染料の拡散を改善する。したがって、インキュベーション時間を短縮するのに役立ち、したがって、現在の色素ローディング法は、長時間のインキュベーションに耐えられない哺乳類のシナプスのローディングに使用できます。研究のための適切な準備を選択することが重要です。LAL筋は、シナプス終末に十分近い神経断端を切断することが可能であるため、この方法に非常に適しています。他の薄い筋肉も、このような用途57に適していることができる。このプロトコルの最も重要なステップの1つは、神経を切断した後の最初の数分で神経断端を色素含有溶液に入れなければならないことです。神経の長さが短いため、刺激には吸引電極の特定の設計を使用する必要があります。この研究では、神経セグメントの直径に匹敵する直径のガラス電極とプラスチック電極の両方を使用しました。
カルシウム過渡現象の取得は特別な装置を使用して実行する必要があります。運動神経の周波数刺激に応答したカルシウムレベルの長期的な変化の記録には、通常のカメラまたは共焦点顕微鏡が必要です。カルシウム過渡現象の登録は神経の低周波刺激に応答するが、色素からの信号が低強度かつ高速である場合には高感度カメラが必要である11。高感度CCDカメラまたはフォトダイオードで構成されるマトリックスは、主にこれらの高速プロセスを記録するために使用されます。ただし、感度と速度が高いカメラは解像度が低くなる傾向があります。高解像度レジストレーションが必要な場合は、共焦点顕微鏡法がより適しています。共焦点顕微鏡では、蛍光を記録するために光電子増倍管が使用され、最近ではハイブリッド検出器が使用されるようになりました。CCDカメラに比べて感度が非常に高く、微弱な蛍光の検出に適しています。しかし、LSCMの主な欠点は、空間画像を構築する際のスキャン速度が遅いことです。本研究では、カルシウム一過性を記録するために、カエル37のシナプスに関連するArkhipovらの記事に完全に記載されているLSCMを介した元の登録方法を使用しました。この方法を用いて、細長いカエルシナプス37におけるカルシウム一過性の近位遠位勾配を推定することができた。この登録方法は、興奮性細胞、例えば脳スライス調製物中の樹状突起および棘における細胞内カルシウム動態を評価するのに有用であり得る。本研究では、哺乳類のシナプスに適用した。これにより、カルシウム過渡現象のパラメータを分析するために、信号を2ミリ秒サンプリングして共焦点ビデオ画像を取得することができました。
記載された方法は、外部刺激によって誘発され、刺激が来る前に一定の遅延を有する蛍光シグナルを扱います。刺激装置の遅延を変化させることで、信号開始点を変更し、シフトした信号をLSCMで登録することができます。次に、前述のアルゴリズムに従って逆畳み込みを使用して、時間分解能の高い元の信号が復元されます。現在の方法の制限の1つは、元の信号がパラメータの変動性が少なく、再現性が良好でなければならないことです。この方法を適用するには、畳み込みに十分なデータを取得するためにいくつかのスキャンを実行する必要があります。検討されたケースでは、それぞれ20フレームの26回の試行、つまり合計520フレームが記録されました。イメージングの期間と試行回数は、必要な時間分解能と信号の持続時間によって異なります。そのため、撮像時の調製物の焦点位置安定性が要求される。提案手法による信号回復の精度は,ROIの大きさによって大きく左右される.ROIサイズが小さいほど、スキャンにかかる時間が短くなり、必要な時間分解能37で信号回復中に発生するエラーが少なくなります。
本研究では、哺乳類の末梢シナプスに蛍光色素をロードする方法と、共焦点蛍光顕微鏡による高速蛍光カルシウムシグナルの記録方法を提示しました。記載された方法を用いて、良好な空間分解能および時間分解能を有する信号を登録することができた。カルシウム一過性の登録は、神経伝達物質の放出やシナプス可塑性の調節などの細胞プロセスを研究するための強力なツールです54,55。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究の蛍光研究は、ロシア科学財団助成金(プロジェクト番号19-15-00329)の財政的支援を受けて実施されました。この方法は、RAS АААА-А18-118022790083-9のFRCカザン科学センターの政府割り当てからの資金提供を受けて開発されました。研究は、連邦研究センター「RASのカザン科学センター」の機器を使用して開発されました。著者は、この原稿を批判的に読んでくれたVictor I. Ilyin博士に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary Glass | Clark Electromedical instruments, UK | GC150-10 | |
| Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP | Leica Microsystems , Heidelberg, Germany | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller P 97 | Sutter Instrument, USA | P-97 | |
| Flow regulator | KD Medical GmbH Hospital Products, Germany | KD REG | Disposable infusion set with Flow regulator |
| HEPES | Sigma-Aldrich, USA | H0887 | 100mL |
| Illumination system Leica CLS 150X | Leica Microsystems, Germany | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
| Las AF software | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | ||
| Las X software | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Magnetic Holder with Suction Tubing | BIOSCIENCE TOOLS, USA | MTH-S | |
| Microspin FV 2400 | Biosan, Latvia | BS-010201-AAA | |
| Minutien Pins | Fine science tools, Canada | 26002-20 | |
| Multi-spin MSC 3000 | Biosan, Latvia | BS-010205-AAN | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt | Molecular Probes, USA | O6806 | 500 μg |
| Pipette | Biohit, Russia | 720210 | 0.5-10 µL |
| Pipette tip | Biohit, Russia | 781349 | 10 µL |
| Plasticine | local producer | ||
| Single-use hypodermic needles | Bbraun | 100 Sterican | 0.4×40 mm |
| Spreadsheet program | Microsoft, USA | Microsoft Office Excel | |
| Stereomicroscope, Leica M80 | Leica Microsystems , Germany | ||
| Suction electrode | Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal. - 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/ | |
| Sylgard 184 elastomer | Dow Corning, USA | ||
| Syringe | local producer | 0.5 mL | |
| Syringe | local producer | 60 mL |
References
- Llinas, R., Steinberg, I. Z., Walton, K. Presynaptic calcium currents and their relation to synaptic transmission: voltage clamp study in squid giant synapse and theoretical model for the calcium gate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (8), 2918-2922 (1976).
- Augustine, G. J. How does calcium trigger neurotransmitter release. Current Opinion in Neurobiology. 11 (3), 320-326 (2001).
- Burnashev, N., Rozov, A. Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy. Cell Calcium. 37 (5), 489-495 (2005).
- Schneggenburger, R., Neher, E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion. Current Opinion in Neurobiology. 15 (3), 266-274 (2005).
- Pang, Z. P., Südhof, T. C.
- Leal, S. S., Gomes, C. M. Calcium dysregulation links ALS defective proteins and motor neuron selective vulnerability. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 225 (2015).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Tsien, R. Y.
- Adams, S. R. How calcium indicators work. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
- Macleod, G. T. Topical application of indicators for calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 786-790 (2012).
- Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 307-314 (2005).
- Eilers, J., Konnerth, A. Dye loading with patch pipettes. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (4), 5201 (2009).
- Coleman, W. L., et al. Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals. Journal of Physiology. 586 (19), 4649-4673 (2008).
- Macleod, G. T. Direct injection of indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 797-801 (2012).
- Peng, Y. Y., Zucker, R. S. Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia. Neuron. 10 (3), 465-473 (1993).
- Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. α-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals. The Journal of Neuroscience. 20 (23), 8685-8692 (2000).
- Newman, Z., et al. Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction. The European Journal of Neuroscience. 25 (6), 1619-1630 (2007).
- Macleod, G. T. Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 791-796 (2012).
- Rossano, A. J., Macleod, G. T. Loading drosophila nerve terminals with calcium indicators. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e250 (2007).
- Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
- Suzuki, S., et al. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 440 (3), 351-365 (2000).
- Ojala, K. S., et al. A high-affinity, partial antagonist effect of 3,4-diaminopyridine mediates action potential broadening and enhancement of transmitter release at NMJs. Journal of Biological Chemistry. 296, 100302 (2021).
- Samigullin, D., et al. Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 29 (2015).
- DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 505, 585-592 (1997).
- Bullen, A., Patel, S. S., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: I. High-resolution optical recording with voltage-sensitive dyes and ion indicators. Biophysical Journal. 73 (1), 477-491 (1997).
- Bullen, A., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: II. Fast quantitative measurements with voltage-sensitive dyes. Biophysical Journal. 76 (4), 2272-2287 (1999).
- Bullen, A., Saggau, P. Optical recording from individual neurons in culture. Modern Techniques in Neuroscience Research. (4), 89-126 (1999).
- Bullen, A., Saggau, P. Indicators and optical configuration for simultaneous high-resolution recording of membrane potential and intracellular calcium using laser scanning microscopy. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 436 (5), 788-796 (1998).
- Redshirt Imaging. , Available from: http://www.redshirtimaging.com/redshirt_neuro/hardware_overview.htm (2021).
- Wilson, T.
- Cox, G.
- Mukhitov, A., Arkhipova, S., Nikolsky, E. Modern Light Microscopy in Biological and Medical Research. Nauka. , Moscow. (2011).
- Mertz, J. Optical sectioning microscopy with planar or structured illumination. Nature Methods. 8 (10), 811-819 (2011).
- Webb, R. H.
- Toomre, D., Pawley, J. B. Disk-scanning confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , 221-238 (2006).
- Venkateswarlu, K., et al. Three-dimensional imaging and quantification of real-time cytosolic calcium oscillations in microglial cells cultured on electrospun matrices using laser scanning confocal microscopy. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3108-3123 (2020).
- Arkhipov, A. Y., Khaziev, E. F., Skorinkin, A. I., Bukharaeva, E. A., Samigullin, D. V. Enhancement of the temporal resolution of fluorescent signals acquired by the confocal microscope. Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 204-210 (2020).
- Rama, S. Shift and mean algorithm for functional imaging with high spatio-temporal resolution. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
- Chan, K. G., Streichan, S. J., Trinh, L. A., Liebling, M. Simultaneous temporal superresolution and denoising for cardiac fluorescence microscopy. IEEE Transactions on Computational Imaging. 2 (3), 348-358 (2016).
- Veeraraghavan, A., Reddy, D., Raskar, R. Coded strobing photography: compressive sensing of high speed periodic videos. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 33 (4), 671-686 (2011).
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neuroscience Letters. 82 (1), 83-88 (1987).
- Macleod, G. T. Calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (7), 758-766 (2012).
- Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Loading a calcium dye into frog nerve endings through the nerve stump: calcium transient registration in the frog neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e55122 (2017).
- Samigullin, D. V., et al. Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction. BioNanoScience. 7 (1), 162-166 (2017).
- Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 31 (31), 11268-11281 (2011).
- Luo, F., Dittrich, M., Cho, S., Stiles, J. R., Meriney, S. D. Transmitter release is evoked with low probability predominately by calcium flux through single channel openings at the frog neuromuscular junction. Journal of Neurophysiology. 113 (7), 2480-2489 (2015).
- Wright, M., Kim, A., Son, Y. -J. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e3124 (2011).
- Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator Auris Longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57482 (2018).
- Kazakov, A., Alexandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects. Meždunarodnyj naučno-issledovatel'skij žurnal (International Research Journal). 9 (40), 13-16 (2015).
- Bowman, W. C.
- Hill, J. M., Alewood, P. F., Craik, D. J. Three-dimensional solution structure of µ-conotoxin GIIIB, a specific blocker of skeletal muscle sodium channels. Biochemistry. 35 (27), 8824-8835 (1996).
- Land, B. R., Johnson, B. R., Wyttenbach, R. A., Hoy, R. R. Tools for physiology labs: Inexpensive equipment for physiological stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 3 (1), 30-35 (2004).
- Samigullin, D. V., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Calcium transient and quantal release in mouse neuromuscular junction under extracellular calcium concentration change. BioNanoScience. 8 (4), 984-987 (2018).
- Khaziev, E., et al. acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction. Frontiers in Physiology. 7, 621 (2016).
- Zhilyakov, N., Arkhipov, A., Malomouzh, A., Samigullin, D. Activation of neuronal nicotinic receptors inhibits acetylcholine release in the neuromuscular junction by increasing ca2+ flux through cav1 channels. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 9031 (2021).
- Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Optical measurement of presynaptic calcium currents. Biophysical Journal. 74 (3), 1549-1563 (1998).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. Journal of Neuroscience Methods. 4 (2), 109-115 (1981).
