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Neuroscience

Registrazione di transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare di topo ad alta risoluzione temporale mediante microscopia confocale

Published: December 1, 2021 doi: 10.3791/63308
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2
1Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, FRC Kazan Scientific Center of RAS, 2Department of Radiophotonics and Microwave Technologies, Kazan National Research Technical University named after A.N. Tupolev, 3Department of Normal Physiology, Kazan State Medical University

Summary

Il protocollo descrive il metodo di caricamento di un colorante di calcio fluorescente attraverso il nervo tagliato nei terminali nervosi motori del topo. Inoltre, viene presentato un metodo unico per registrare i transitori di calcio veloci nelle terminazioni nervose periferiche utilizzando la microscopia confocale.

Abstract

La stima del livello di calcio presinaptico è un compito chiave nello studio della trasmissione sinaptica poiché l'ingresso del calcio nella cellula presinaptica innesca una cascata di eventi che portano al rilascio di neurotrasmettitori. Inoltre, i cambiamenti nei livelli di calcio presinaptico mediano l'attività di molte proteine intracellulari e svolgono un ruolo importante nella plasticità sinaptica. Studiare la segnalazione del calcio è anche importante per trovare modi per trattare le malattie neurodegenerative. La giunzione neuromuscolare è un modello adatto per studiare la plasticità sinaptica, in quanto ha un solo tipo di neurotrasmettitore. Questo articolo descrive il metodo per caricare un colorante sensibile al calcio attraverso il fascio nervoso tagliato nelle terminazioni nervose motorie dei topi. Questo metodo consente la stima di tutti i parametri relativi alle variazioni intracellulari del calcio, come il livello basale di calcio e il calcio transitorio. Poiché l'afflusso di calcio dall'esterno cellulare nelle terminazioni nervose e il suo legame / slegamento al colorante sensibile al calcio avvengono nell'intervallo di pochi millisecondi, è necessario un sistema di imaging veloce per registrare questi eventi. In effetti, le telecamere ad alta velocità sono comunemente utilizzate per la registrazione di cambiamenti rapidi del calcio, ma hanno bassi parametri di risoluzione dell'immagine. Il protocollo qui presentato per la registrazione dei transitori di calcio consente una risoluzione spazio-temporale estremamente buona fornita dalla microscopia confocale.

Introduction

Il problema di misurare le onde veloci di calcio nelle cellule eccitabili è uno degli aspetti più importanti e impegnativi dello studio della trasmissione del segnale nel sistema nervoso centrale e periferico. Gli ioni calcio svolgono un ruolo importante nell'innescare il rilascio di neurotrasmettitori, la plasticità sinaptica e la modulazione dell'attività di varie proteine intracellulari 1,2,3,4,5. Studiare la segnalazione del calcio è anche importante per trovare modi per trattare le malattie neurodegenerative6. Per misurare i cambiamenti nei livelli di calcio, i coloranti fluorescenti sensibili al calcio sono comunemente usati e i cambiamenti nel loro livello di fluorescenza sono analizzati 7,8,9.

Il caricamento di coloranti di calcio nelle cellule può essere ottenuto in diversi modi. Principalmente, i coloranti cellula-permeant sono usati10,11. Tuttavia, in tal caso, non è solo difficile controllare la concentrazione di un colorante all'interno della cellula, ma è anche difficile selezionare le cellule bersaglio per il caricamento. Questo metodo non è applicabile per lo studio delle terminazioni nervose periferiche poiché il colorante entra nelle cellule postsinaptiche. Invece, i coloranti impermeant cellulari sono più adatti per tali preparazioni. In questo caso, i coloranti vengono consegnati alle cellule mediante microiniezione o attraverso una pipetta patch12,13,14. C'è anche un metodo di caricamento attraverso un moncone nervoso. Quest'ultimo metodo è più adatto per le preparazioni della giunzione neuromuscolare 15,16,17,18,19,20. Permette di eseguire la colorazione solo per le cellule di interesse. Sebbene questo metodo non fornisca una valutazione accurata della concentrazione del colorante nella cellula bersaglio, la concentrazione può essere stimata approssimativamente confrontando il livello di fluorescenza delle cellule a riposo in soluzioni con una concentrazione nota di calcio21. In questo studio, viene presentata una modifica di questo metodo applicato alle sinapsi dei mammiferi.

L'ingresso di calcio durante la fase depolarizzante del potenziale d'azione è un processo veloce, specialmente nella giunzione neuromuscolare; Pertanto, per la sua registrazione, è necessaria un'attrezzatura appropriata1. Un recente studio che utilizza un colorante fluorescente sensibile alla tensione ha dimostrato che la durata del potenziale d'azione nella sinapsi periferica di un topo è di circa 300 μs22. Il calcio transitorio, valutato utilizzando coloranti calcio-sensibili nelle sinapsi periferiche della rana, ha una durata maggiore: il tempo di salita è di circa 2-6 ms e il tempo di decadimento è di circa 30-90 ms, a seconda del colorante di calcio utilizzato23,24. Per misurare processi veloci con l'aiuto di coloranti fluorescenti, vengono generalmente utilizzate telecamere CCD o CMOS, con matrici CCD veloci e sensibili. Tuttavia, queste telecamere hanno lo svantaggio della bassa risoluzione, limitata dalla dimensione degli elementi sensibili della matrice25,26,27,28. Le telecamere più veloci con sensibilità sufficiente per registrare sia i potenziali d'azione che i transitori di calcio in risposta alla stimolazione a bassa frequenza delle cellule hanno una frequenza di scansione di 2.000 Hz e una matrice con una dimensione di 80 x 8029. Per ottenere segnali con una risoluzione spaziale più elevata, viene utilizzata la microscopia confocale, soprattutto se è necessario valutare alcune variazioni volumetriche nel segnale30,31,32. Ma va tenuto presente che la microscopia confocale ha un'alta velocità di scansione in modalità di scansione lineare, ma ci sono ancora limitazioni significative sulla velocità delle registrazioni di processi veloci quando si costruisce un'immagine spaziale33. Esistono microscopi confocali basati su dischi Nipkow rotanti (microscopia a scansione a fessura) e scanner multipoint-array, che hanno una maggiore velocità di scansione. Allo stesso tempo, sono inferiori ai microscopi confocali classici nel filtraggio delle immagini confocali (diafonia forica per microscopi con un disco di Nipkow)32,34,35. L'imaging confocale con scansione a risonanza può anche fornire un'elevata risoluzione spazio-temporale richiesta per misurazioni temporali elevate36. Tuttavia, tenere conto del fatto che la registrazione di risposte fluorescenti deboli ad alta velocità di scansione quando si utilizzano scanner a risonanza richiede rivelatori altamente sensibili come i rilevatori ibridi36.

Questo articolo presenta un metodo per aumentare la risoluzione temporale dei segnali registrati con la microscopia confocale a scansione laser (LSCM) mantenendo la risoluzione spaziale37. Il metodo attuale è un ulteriore sviluppo dei metodi descritti in precedenza e trasferiti alla piattaforma LSCM38,39,40. Questo approccio non richiede modifiche nell'hardware del microscopio e si basa sull'applicazione di un algoritmo per la registrazione di segnali fluorescenti periodicamente evocati con uno spostamento temporale rispetto al momento della stimolazione.

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Protocol

Sono stati condotti esperimenti su preparati nervo-muscolari isolati di levator auris longus (m. LAL) dai topi BALB/C (20-23 g, 2-3 mesi di età)41. Le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con le linee guida per l'uso di animali da laboratorio dell'Università Federale di Kazan e dell'Università di Medicina di Kazan, in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il protocollo sperimentale ha soddisfatto i requisiti della direttiva 86/609/CEE del Consiglio delle Comunità europee ed è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Medicina di Kazan.

1. Preparazione delle soluzioni Ringer's e di archiviazione

  1. Preparare la soluzione di Ringer per il muscolo dei mammiferi mescolando i seguenti ingredienti: NaCl (137 mM), KCl (5 mM), CaCl 2 (2 mM), MgCl 2 (1 mM), NaH 2 PO4 (1 mM), NaHCO3 (11,9 mM) e glucosio (11 mM). Far bollire attraverso la soluzione con 95% O 2 e 5% CO 2 e regolare il suo pH a 7,2-7,4 aggiungendo HCl / NaOH se necessario.
  2. Preparare la soluzione di caricamento del colorante.
    1. Preparare la soluzione HEPES (10 mM) con pH compreso tra 7,2 e 7,4. 500 μg di colorante commerciale sono disponibili in una fiala da 500 μL. Sciogliere il colorante in 14 μL della soluzione HEPES per ottenere una concentrazione di colorante di 30 mM. Agitare bene e centrifugare fino a completa dissoluzione.
    2. Diluire la soluzione dell'indicatore Ca2+ con la soluzione HEPES fino a 1 mM di concentrazione. Conservare in freezer (-20 °C) ed evitare l'esposizione alla luce.

2. Procedura di caricamento del colorante

NOTA: La procedura di caricamento del colorante viene eseguita secondo il protocollo per il caricamento attraverso il moncone nervoso, adattato dai protocolli precedentemente pubblicati 19,42,43,44,45,46.

  1. Sezionare il muscolo LAL secondo la procedura di dissezione per questa preparazione come descritto nei protocolli47,48 precedentemente pubblicati.
    1. Fissare il tessuto leggermente allungato (non più del 30% dalla lunghezza iniziale) nella piastra di Petri rivestita di elastomero con sottili perni in acciaio inossidabile e aggiungere la soluzione di Ringer fino a quando il muscolo è completamente coperto.
      NOTA: La capsula di Petri è stata pre-riempita con elastomero secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
  2. Preparare la pipetta di riempimento
    1. Utilizzando un estrattore di micropipette (vedere Tabella dei materiali), preparare una micropipetta con una punta fine che sia il più affilata possibile per le registrazioni intracellulari. Utilizzare capillari senza filamenti interni (1,5 mm di diametro esterno e 0,86 o 1,10 mm di diametro interno).
    2. Rompere la punta della micropipetta dopo aver inciso la conicità con un abrasivo, lasciando la punta aperta a circa 100 μm di diametro. Lucidare a fuoco la punta verso il basso per limitare quando il diametro interno si riduce da >80 μm a 12-13 μm. Collegare un tubo di silicone su un lato della pipetta di riempimento e una siringa (senza ago) sull'altro lato.
  3. Sotto uno stereomicroscopio, trova il punto in cui il tronco nervoso si trasforma in rami nervosi separati. Posizionare la pipetta di riempimento con il tubo montato e la siringa sulla capsula di Petri usando la cera. Spostare la punta della pipetta fino a quando non si trova sopra il nervo.
  4. Con le forbici sottili, tagliare il nervo vicino alla fibra muscolare, lasciando un piccolo pezzo del moncone nervoso lungo circa 1 mm. Aspirare delicatamente il moncone nervoso insieme alla soluzione di Ringer, senza pizzicarlo, nella punta della pipetta di riempimento. Rimuovere il tubo di silicone dalla pipetta di riempimento.
  5. Aspirare una certa quantità della soluzione di caricamento del colorante (~0,3 μL) usando una siringa con un filamento lungo. Questo volume corrisponde a circa 3 cm del filamento.
    NOTA: Inizialmente, è necessario realizzare un filamento da una punta di pipetta con un volume di 10 μL tirando sul fuoco usando una lampada ad alcool o un bruciatore a gas.
  6. Inserire delicatamente la punta del filamento con la soluzione di caricamento nella pipetta di riempimento. Rilasciare la miscela direttamente sul moncone nervoso. Incubare la preparazione a temperatura ambiente al buio per 30 min.
  7. Successivamente, sciacquare il preparato con una soluzione fresca di Ringer e incubare a 25 °C per un massimo di 2 ore in un becher di vetro con 50 mL (o più) di soluzione di Ringer (la preparazione deve essere coperta con la soluzione). Durante questo periodo, il colorante raggiungerà le sinapsi.

3. Acquisizione video con microscopia confocale

NOTA: La registrazione dei transitori di calcio viene eseguita con un microscopio confocale a scansione laser (LSCM) (vedere Tabella dei materiali). Per registrare i transitori di calcio veloci, è stato utilizzato un protocollo originale che consentiva la registrazione di segnali con una risoluzione spaziale e temporale sufficiente. Il metodo è stato descritto dettagliatamente nella pubblicazione di Arkhipov et al37. Il microscopio era dotato di un obiettivo ad immersione in acqua 20x (1,00 NA). La linea laser a 488 nm è stata attenuata al 10% di intensità e la fluorescenza di emissione è stata raccolta da 503 a 558 nm.

  1. Montare il preparato nella camera sperimentale rivestita di elastomero di silicio e fissarlo, leggermente allungato, con una serie di microaghi in acciaio. Risciacquare abbondantemente la preparazione con la soluzione di Ringer.
    NOTA: È stata utilizzata una semplice camera sperimentale di perfusione su misura in vetro organico con il fondo della camera coperto da un elastomero (preparato secondo le istruzioni del produttore; vedi Tabella dei materiali). La camera ha un tubo di alimentazione della soluzione. La soluzione viene pompata fuori tramite un ago da siringa, montato su un supporto magnetico (vedere Tabella dei materiali). Come camera sperimentale, potrebbe essere utilizzata una capsula di Petri (come quella utilizzata per l'incubazione del preparato) ma con annessi tubi di alimentazione e aspirazione.
  2. Installare l'elettrodo di aspirazione che verrà utilizzato per stimolare il nervo.
    NOTA: La costruzione dell'elettrodo è simile a quella pubblicata nell'articolo del 2015 di Kazakov et al49. Posizionare e fissare l'elettrodo con la ceretta accanto al bagno. Spostare la punta vicino al moncone nervoso e aspirarla nell'elettrodo.
  3. Montare la camera di preparazione sul palco del microscopio e posizionare i raccordi di ingresso e uscita nella camera.
  4. Per perfondere la preparazione, utilizzare un semplice sistema a gravità azionato. Accendere la pompa di aspirazione a perfusione per rimuovere la soluzione in eccesso.
  5. Collegare l'elettrodo di aspirazione stimolante a uno stimolatore elettrico e assicurarsi che le contrazioni muscolari si verifichino dopo gli stimoli. Vedere paragrafo 3.9-3.12 per le condizioni di stimolazione e la registrazione.
  6. Riempire il sistema di perfusione con la soluzione di Ringer con d-tubocurarina (10 μM).
    NOTA: Questa soluzione aiuta a prevenire le contrazioni muscolari. I bloccanti specifici della D-tubocurarina o dell'alfa-bungarotossina dei recettori nicotinici dell'acetilcolina sulla membrana postsinaptica bloccherebbero completamente o parzialmente le contrazioni muscolari50. Inoltre, per prevenire le contrazioni muscolari, potrebbero essere utilizzati bloccanti specifici dei canali postsinaptici del sodio come la μ-conotossina GIIIB51.
  7. Accendere la pompa di aspirazione a perfusione e avviare la perfusione del preparato con la soluzione di Ringer contenente d-tubocurarina.
  8. Impostare i parametri di imaging nel software LSCM come segue.
    1. Nel software LSCM (LAS AF; vedere Tabella dei materiali), scegliere Elettrofisiologia.
      NOTA: In questa modalità, quando un'immagine viene acquisita nel punto temporale, un impulso di sincronizzazione viene inviato allo stimolatore con l'aiuto della scatola di attivazione. Ciò provoca la generazione di potenziale d'azione nella preparazione (Figura 1; unità stimolatore).
    2. Selezionare Modalità di acquisizione. Per attivare lo stimolatore utilizzando l'impulso di sincronizzazione del microscopio, nelle impostazioni del menu Lavoro , selezionare Impostazioni trigger . Impostare il campo Trigger Out On Frame sul canale out1 .
    3. Utilizzare le seguenti impostazioni: Modalità di scansione: XYT, Frequenza di scansione: 1400 Hz, Fattore di zoom: 6,1, Foro stenopeico: completamente aperto. Assicurarsi che la modalità X bidirezionale di trans-passaggio sequenziale sia attivata.
    4. Imposta il tempo minimo per formare un fotogramma a 52 ms e i fotogrammi da raccogliere in un video raw a 20 fotogrammi.
      NOTA: queste impostazioni consentono di acquisire immagini con una risoluzione di 128 x 128 pixel mentre si scatta un singolo fotogramma ogni 52 ms.
    5. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione del laser argon a 488 nm con l'8% della potenza di uscita.

Figure 1
Figura 1: Lo schema del setup sperimentale. 1. Microscopio confocale a scansione laser (LSCM). 2. Modulo di sincronizzazione di LSCM (trigger box). 3. Stimolatore. 4. Unità di isolamento. 5. Il campione biologico. 6. Elettrodo di aspirazione per la stimolazione elettrica del nervo. 7. Sistemi di perfusione (7a: serbatoio di perfuffato, 7b: contagocce, 7c: regolatore di flusso, 7d: pallone a vuoto). Le frecce indicano la direzione di propagazione dell'impulso di sincronizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

  1. Premere il pulsante Live Mode per passare alla modalità Live , che aiuta a ottenere un'anteprima delle terminazioni nervose caricate con il colorante.

Figure 2
Figura 2: Nervo e terminali del mouse caricati con l'indicatore Ca2+. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

  1. Unità di stimolazione
    NOTA: In questo lavoro, è stato utilizzato lo stimolatore descritto nell'articolo di Land et al.52 . Questo dispositivo consente di impostare i parametri temporali di stimolazione tramite il software MatLab.
    1. Creare un nuovo file, incollare il codice dall'articolo sopra menzionato nella finestra del codice MatLab e salvare il file. Fare clic su Esegui, quindi viene visualizzata una finestra con i parametri di stimolazione. Imposta il tempo di ritardo e la durata dello stimolo.
      NOTA: Il ritardo determina la risoluzione temporale del segnale fluorescente ricostituito. L'impulso elettrico della durata di 0,2 ms viene ritardato e quindi inviato all'unità di isolamento. Quest'ultimo forma l'ampiezza e la polarità dell'impulso stimolante e isola elettricamente l'oggetto biologico dall'apparecchiatura di registrazione.
    2. Per stimolare il nervo, selezionare l'ampiezza sovramassimale dell'impulso stimolante (25% -50% maggiore dell'intensità massima di stimolazione necessaria per attivare tutte le fibre nervose).
      NOTA: Il metodo presentato si basa su uno speciale algoritmo per la registrazione di singoli segnali fluorescenti veloci utilizzando LSCM con sweep minimizzato. Ad ogni fase dell'algoritmo sviluppato, il segnale fluorescente registrato viene spostato dal precedente di un intervallo di tempo più breve rispetto alla scansione del microscopio. Il valore degli spostamenti temporali determina la risoluzione temporale del segnale richiesto. Il numero di passaggi (spostamenti) nell'algoritmo dipende dalla risoluzione temporale richiesta e dalla risoluzione temporale originale. Con questo metodo di registrazione, la stimolazione della preparazione viene effettuata con una frequenza di 0,25 Hz.
  2. Nella modalità Live, cerca il ROI e ottieni la migliore messa a fuoco. Eseguire il software di acquisizione dati.
  3. Spostare il ritardo sullo stimolatore di 2 ms in meno rispetto al valore precedente ed eseguire il software di acquisizione dati.
  4. Ripetere il passaggio 3.11 26 volte per acquisire 26 sequenze, con ogni sequenza spostata di 2 ms rispetto alla precedente.

4. Elaborazione video

NOTA: Una serie di immagini video acquisite dal microscopio confocale viene esportata in formato TIFF con il software gratuito LAS X (vedi Tabella dei Materiali). Questa serie è stata divisa in cornici ed esportata in una cartella. Per generare la sequenza di immagini con una risoluzione temporale più elevata, è stato utilizzato il software ImageJ, che ha un codice iniziale aperto per l'analisi e l'elaborazione dei dati. L'algoritmo di elaborazione dei segnali è rappresentato schematicamente nella Figura 3.

Figure 3
Figura 3: Schema per la compilazione di un file video ad alta risoluzione (2 ms su fotogramma) da file video originali con una bassa risoluzione temporale (52 ms su fotogramma). I file video originali e i segnali corrispondenti sono colorati in nero, magenta e verde. Il file video compilato e il segnale risultante sono colorati in rosso. Lo schema a destra, riga per riga, mostra le immagini video ottenute con un microscopio confocale. A sinistra, i corrispondenti segnali di fluorescenza cambiano rispetto al ROI selezionato. La linea più in alto è formata fotogramma per fotogramma dai fotogrammi ricevuti secondo lo schema. Il risultato è un'immagine video composta dall'intera matrice di fotogrammi in modo che ci sia un tempo di ritardo di 2 ms tra i fotogrammi anziché 52 ms. Ogni linea corrisponde a un offset del segnale di stimolazione di (n - 1) * t, dove t è lo spostamento temporale (2 ms) e n è il numero di iterazioni di spostamento. k indica il numero di fotogrammi nei file video originali (righe 2-4) e dipende dalla durata del segnale registrato. In questo caso, per registrare un segnale con una durata di 1 s, è necessario selezionare k = 20 (52 ms * 20 = 1040 ms). t0 è il ritardo richiesto prima della stimolazione. Per calcolare il numero di iterazioni di spostamento n, la risoluzione temporale iniziale tra i fotogrammi (52 ms) deve essere divisa per la risoluzione temporale richiesta (2 ms). In questo caso, n = 26, che corrisponde a 26 sweep registrati. Come risultato delle manipolazioni eseguite, si ottiene un'immagine video composta da n * k = 520 fotogrammi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

  1. Esegui il software LAS X. Aprire il progetto creato durante l'esecuzione dell'esperimento. Fare clic su Esporta, quindi su Salva con nome per salvare i fotogrammi in formato .tiff nella cartella di destinazione.
  2. Eseguire il software ImageJ. Fare clic su File > Importa > sequenza di immagini.
  3. Nella finestra Apri sequenza di immagini , scegliete la cartella di destinazione e aprite il primo fotogramma.
  4. Nel campo Immagine iniziale della finestra Opzioni sequenza impostate il numero di fotogramma su 1 per il primo fotogramma. Nel campo Incremento, impostare il valore uguale al numero di fotogrammi nella registrazione iniziale del segnale (20 per il caso in esame) e fare clic su OK.
  5. Per salvare il file generato dei primi fotogrammi cuciti in una cartella separata, fare clic su File > Salva > cartella.
  6. Ripetete i passaggi 4.3-4.5 per i successivi 19 fotogrammi. Nella finestra Opzioni sequenza , impostate il numero di fotogramma corrispondente nel campo Immagine iniziale .
  7. Per generare il video completo ad alta risoluzione temporale, unire tutti i fotogrammi. Per fare ciò, fare clic su File > Importa > sequenza di immagini e selezionare 1 nei campi Immagine iniziale e Incremento . Il risultato sarà il video finale con risoluzione temporale aumentata. Salvare il file in .tiff o in qualsiasi altro formato adatto.

5. Analisi video

NOTA: in ImageJ, selezionare ROI e background. Sottrarre lo sfondo dal ROI. I dati sono rappresentati come il rapporto, (ΔF / F 0 - 1) * 100%, dove F0 è l'intensità della fluorescenza a riposo e ΔF è l'intensità della fluorescenza durante la stimolazione.

  1. Clicca su Image > Stacks > Tools > Stack Sorter. Quindi, fai clic su Strumenti di analisi > > Gestione ROI.
  2. Trascinare e rilasciare il file .tiff salvato nel passaggio 4.7 nella finestra di ImageJ. Espandi l'immagine per una visione migliore. Per migliorare la visualizzazione delle immagini, fare clic su Immagine > Regola > luminosità / contrasto > Auto. Questo passaggio non influirà sui dati.
  3. Imposta lo sfondo vicino al terminale nervoso disegnando il ROI. Aggiungilo al gestore del ROI. Calcola lo sfondo facendo clic su Altro > Multi misura. Copiare i valori medi, incollarli nel programma Foglio di calcolo e calcolare la media.
  4. Sottrarre il valore medio calcolato dalle pile facendo clic su Elabora > Principale > Sottrai. Immettere il valore.
  5. Disegna il ROI attorno a un terminale nervoso tramite una linea poligonale. Aggiungilo al gestore del ROI.
  6. Misurare l'intensità del terminale nervoso: fare clic su Altro > Multi Measure. Copia i valori medi e incollali nel programma Spreadsheet.
  7. Calcolare l'offset medio dei segnali.
    NOTA: Utilizzare i punti corrispondenti a seconda del tempo di ritardo prima della stimolazione. Questo passaggio stabilisce il valore F0 che verrà utilizzato nei calcoli successivi.
  8. Dividere i valori del segnale per il valore di offset medio.
    NOTA: dopo questo passaggio, il segnale non contiene il contributo dello sfondo e della fluorescenza grezza ai valori di ampiezza per il ROI selezionato.
  9. Sottrarre 1 dai valori ottenuti nel passaggio 5.8, quindi moltiplicare per 100%.
  10. Tracciare un grafico di Ca2+- transitorio e calcolare l'ampiezza.

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Representative Results

Dopo aver caricato la preparazione con colorante secondo la tecnica presentata, la maggior parte delle sinapsi situate vicino al moncone nervoso aveva un livello sufficiente di fluorescenza (vedi Figura 2). Dopo aver caricato la preparazione con il colorante eapplicando il metodo descritto di registrazione e di elaborazione delle immagini, sono stati ottenuti transitori di calcio con la risoluzione spaziale e temporale desiderata (vedi Figura 4). Il calcio transitorio è stato recuperato con il metodo proposto (vedi Figura 3).

Sono stati analizzati anche i parametri di ampiezza e tempo dei segnali recuperati. I dati medi sono presentati nella tabella 1.

Figure 4
Figura 4: Traccia rappresentativa del segnale di calcio da un esperimento. Sono indicati alcuni importanti parametri di segnale, come l'ampiezza media (MA), il tempo di salita (RT) e il tempo di decadimento (DecT) e le sue proiezioni sugli assi. MA è calcolato facendo la media dei punti al picco, colorati in verde. RT è il tempo impiegato per l'ampiezza per salire dal 20% all'80%, che viene calcolato come la differenza tra le proiezioni sull'asse x colorato in blu. DecT è il tempo durante il quale l'ampiezza diminuisce di e volte, che viene calcolato come la differenza tra le proiezioni sull'asse x colorato in rosso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Picco ΔF/F (%) Tempo di salita 20%-80% (ms) Τ (MS)
27,0±4,6 (n=5) 6,8±0,48 (n=5) 456±53(n=5)

Tabella 1: I parametri medi del transitorio Ca2+ . I dati sono presentati come media ± s.e.m. e n è il numero di misurazioni nelle distinte giunzioni nervo-muscolo. Il picco ΔF/F è l'ampiezza media di ΔF/F.

L'analisi dei transitori di calcio consente di valutare le caratteristiche ampie-dinamiche dei cambiamenti nel livello di calcio presinaptico nella terminazione nervosa durante il potenziale d'azione11. La variazione dell'ampiezza del transitorio di calcio si correla bene con la variazione del contenuto quantistico53. L'analisi dell'ampiezza transitoria del calcio è comunemente utilizzata per studiare l'effetto di composti fisiologicamente attivi associati alla modulazione dei livelli di calcio presinaptico sulla trasmissione sinaptica54,55. Il decorso temporale del transitorio di calcio riflette la cinetica del legame del calcio con il colorante e la sua dissociazione23,56. È ovvio quando si usano coloranti con diversa affinità per il calcio23,56. Sebbene i parametri temporali del calcio transitorio riflettano la cinetica del colorante sensibile al calcio e non rappresentino la cinetica del calcio libero nel terminale nervoso, i metodi di modellazione matematica basati su dati sperimentali possono ripristinare il comportamento del calcio libero nella cellula e calcolare la concentrazione di tamponi di calcio23.

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Discussion

Il metodo per caricare il colorante sensibile al Ca2+ nelle terminazioni nervose del topo attraverso il moncone nervoso e per registrare un transitorio di calcio veloce utilizzando un microscopio confocale è presentato in questo articolo. Come risultato dell'implementazione di questo metodo di carico, la maggior parte delle sinapsi situate vicino al moncone nervoso aveva un livello sufficiente di fluorescenza per consentire la registrazione dell'ingresso di calcio nelle terminazioni nervose in risposta alla stimolazione a bassa frequenza del nervo motorio.

A differenza dei protocolli precedentemente presentati per il caricamento di coloranti di calcio attraverso il moncone, questo protocollo è progettato per l'uso sulle sinapsi dei mammiferi. I protocolli precedenti utilizzati nelle preparazioni animali a sangue freddo richiedevano un'incubazione notturna43. In questo protocollo, l'incubazione richiesta con il colorante è di sole 2 ore. A seconda della lunghezza del segmento nervoso rimasto dopo il taglio, la velocità di caricamento del colorante e il numero di terminali caricati possono variare. È stato possibile ridurre ulteriormente il tempo di incubazione nella soluzione colorante per monconi nervosi più corti. Un metodo simile è descritto per il caricamento delle sinapsi di mosca18,19. Inoltre, l'incubazione del muscolo è stata effettuata con un leggero aumento della temperatura al di sopra della temperatura ambiente, che migliora la diffusione del colorante lungo il nervo. Ha quindi contribuito a ridurre il tempo di incubazione e, pertanto, l'attuale metodo di caricamento del colorante può essere utilizzato per caricare sinapsi di mammiferi che non tollerano incubazioni prolungate. È importante scegliere i preparativi appropriati per lo studio. Il muscolo LAL è adatto per questo metodo, in quanto è possibile tagliare un moncone nervoso abbastanza vicino ai terminali sinaptici. Anche altri muscoli sottili possono essere adatti a tale applicazione57. Uno dei passaggi più importanti di questo protocollo è che il moncone nervoso deve essere inserito nella soluzione contenente colorante nei primi minuti dopo aver tagliato il nervo. Poiché la lunghezza del nervo è breve, è necessario utilizzare un design specifico dell'elettrodo di aspirazione per la stimolazione. In questa ricerca sono stati utilizzati sia elettrodi di vetro che di plastica, con un diametro paragonabile a quello del segmento nervoso.

L'acquisizione di transitori di calcio deve essere effettuata utilizzando attrezzature speciali. Le registrazioni di cambiamenti di lunga durata nel livello di calcio in risposta alla stimolazione della frequenza del nervo motorio richiedono telecamere regolari o un microscopio confocale. Mentre la registrazione dei transitori di calcio è in risposta alla stimolazione a bassa frequenza del nervo, sono necessarie telecamere sensibili quando il segnale del colorante ha bassa intensità e alta velocità11. Le telecamere CCD ad alta sensibilità o le matrici costituite da fotodiodi vengono utilizzate principalmente per registrare questi processi veloci. Tuttavia, le fotocamere con alta sensibilità e velocità tendono ad avere una bassa risoluzione. Se è richiesta la registrazione ad alta risoluzione, i metodi di microscopia confocale sono più adatti. Nei microscopi confocali, i fotomoltiplicatori vengono utilizzati per registrare la fluorescenza e, più recentemente, sono stati utilizzati rivelatori ibridi. Hanno una sensibilità molto elevata rispetto alle telecamere CCD e sono adatti per rilevare una debole fluorescenza. Ma lo svantaggio principale di LSCM è la bassa velocità di scansione durante la costruzione di un'immagine spaziale. In questo studio, per registrare il calcio transitorio, è stato utilizzato il metodo di registrazione originale tramite LSCM, che è descritto dettagliatamente nell'articolo di Arkhipov et al. relativo alle sinapsi della rana37. Utilizzando questo metodo, è stato possibile stimare il gradiente prossimale-distale del calcio transitorio nelle sinapsi di rana allungate37. Questo metodo di registrazione può essere utile per valutare la dinamica del calcio subcellulare nelle cellule eccitabili, ad esempio nei dendriti e nelle spine nei preparati di fette di cervello. Nel presente studio, è stato applicato alle sinapsi dei mammiferi. Ha permesso di ottenere immagini video confocali con campionamento di 2 ms di segnali per analizzare i parametri del transitorio di calcio.

Il metodo descritto si occupa di segnali fluorescenti, innescati da uno stimolo esterno e ha un ritardo fisso prima che lo stimolo sia arrivato. La variazione del ritardo sullo stimolatore consente di modificare il punto di inizio del segnale e registrare il segnale spostato tramite LSCM. Quindi, il segnale originale con un'alta risoluzione temporale viene ripristinato, utilizzando la convoluzione inversa secondo l'algoritmo descritto in precedenza. Uno dei limiti del metodo attuale è che i segnali originali devono avere poca variabilità nei parametri e avere una buona riproducibilità. Per applicare il metodo, è necessario eseguire diverse scansioni per ottenere dati sufficienti per la convoluzione. Nel caso considerato, sono stati registrati 26 studi con 20 fotogrammi ciascuno, cioè 520 fotogrammi in totale. La durata dell'imaging e il numero di prove dipendono dalla risoluzione temporale richiesta e dalla durata del segnale. Pertanto, è necessaria la stabilità della posizione di messa a fuoco della preparazione durante l'imaging. L'accuratezza del recupero del segnale con il metodo proposto è determinata principalmente dalla dimensione del ROI. Minore è la dimensione del ROI, minore è il tempo necessario per la scansione e meno errori si verificano durante il recupero del segnale con la risoluzione temporale richiesta37.

Questo studio ha presentato un metodo per caricare coloranti fluorescenti nelle sinapsi periferiche dei mammiferi e un metodo per registrare segnali di calcio fluorescenti veloci tramite un microscopio a fluorescenza confocale. Utilizzando il metodo descritto, è stato possibile registrare un segnale con una buona risoluzione spaziale e temporale. La registrazione dei transitori di calcio è un potente strumento per studiare i processi cellulari, come la regolazione del rilascio di neurotrasmettitori e la plasticità sinaptica54,55.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli studi sulla fluorescenza di questo lavoro sono stati condotti con il sostegno finanziario della Russian Science Foundation Grant (progetto n. 19-15-00329). Il metodo è stato sviluppato sotto finanziamento dell'incarico governativo per FRC Kazan Scientific Center di RAS АААА-А18-118022790083-9. La ricerca è stata sviluppata con l'uso delle attrezzature del Centro di ricerca federale "Kazan Scientific Center of RAS". Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Victor I. Ilyin per la lettura critica di questo manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capillary Glass Clark Electromedical instruments, UK GC150-10
Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP Leica Microsystems , Heidelberg, Germany
Flaming/Brown Micropipette Puller P 97 Sutter Instrument, USA P-97
Flow regulator KD Medical GmbH Hospital Products, Germany KD REG Disposable infusion set with Flow regulator
HEPES Sigma-Aldrich, USA H0887 100mL
Illumination system Leica CLS 150X Leica Microsystems, Germany
ImageJ National Institutes of Health, USA http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Las AF software Leica Microsystems, Heidelberg, Germany
Las X software Leica Microsystems, Heidelberg, Germany https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Magnetic Holder with Suction Tubing BIOSCIENCE TOOLS, USA MTH-S
Microspin FV 2400 Biosan, Latvia BS-010201-AAA
Minutien Pins Fine science tools, Canada 26002-20
Multi-spin MSC 3000 Biosan, Latvia BS-010205-AAN
Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt Molecular Probes, USA O6806 500 μg
Pipette Biohit, Russia 720210 0.5-10 µL
Pipette tip Biohit, Russia 781349 10 µL
Plasticine local producer
Single-use hypodermic needles Bbraun 100 Sterican 0.4×40 mm
Spreadsheet program Microsoft, USA Microsoft Office Excel
Stereomicroscope, Leica M80 Leica Microsystems , Germany
Suction electrode Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal. - 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16. http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/
Sylgard 184 elastomer Dow Corning, USA
Syringe local producer 0.5 mL
Syringe local producer 60 mL

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Neuroscienze Numero 178
Registrazione di transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare di topo ad alta risoluzione temporale mediante microscopia confocale
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Zhilyakov, N. V., Arkhipov, A. Y., Khaziev, E. F., Mukhamedyarov, M. A., Samigullin, D. V. Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63308, doi:10.3791/63308 (2021).

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