Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Registrering av kalsiumtransienter i mus Neuromuscular Junction med høy temporal oppløsning ved bruk av konfokal mikroskopi

Published: December 1, 2021 doi: 10.3791/63308
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2
1Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, FRC Kazan Scientific Center of RAS, 2Department of Radiophotonics and Microwave Technologies, Kazan National Research Technical University named after A.N. Tupolev, 3Department of Normal Physiology, Kazan State Medical University

Summary

Protokollen beskriver metoden for å laste et fluorescerende kalsiumfargestoff gjennom kuttnerven i musemotoriske nerveterminaler. I tillegg presenteres en unik metode for registrering av raske kalsiumtransienter i perifere nerveender ved hjelp av konfokalmikroskopi.

Abstract

Estimering av det presynaptiske kalsiumnivået er en nøkkeloppgave for å studere synaptisk overføring siden kalsiuminngang i den presynaptiske cellen utløser en kaskade av hendelser som fører til frigjøring av nevrotransmittere. Videre formidler endringer i presynaptiske kalsiumnivåer aktiviteten til mange intracellulære proteiner og spiller en viktig rolle i synaptisk plastisitet. Å studere kalsiumsignalering er også viktig for å finne måter å behandle nevrodegenerative sykdommer på. Det nevromuskulære krysset er en egnet modell for å studere synaptisk plastisitet, da den bare har en type nevrotransmitter. Denne artikkelen beskriver metoden for å laste et kalsiumfølsomt fargestoff gjennom kuttnervebunten inn i musens motoriske nerveender. Denne metoden tillater estimering av alle parametere relatert til intracellulære kalsiumendringer, slik som basal kalsiumnivå og kalsiumforbigående. Siden tilstrømningen av kalsium fra cellens ytre inn i nerveterminalene og dets binding / ubinding til kalsiumfølsomt fargestoff forekommer innenfor noen få millisekunder, er det nødvendig med et raskt bildebehandlingssystem for å registrere disse hendelsene. Faktisk brukes høyhastighetskameraer ofte til registrering av raske kalsiumendringer, men de har lave bildeoppløsningsparametere. Protokollen som presenteres her for registrering av kalsiumtransient, tillater ekstremt god romlig-temporal oppløsning levert av konfokal mikroskopi.

Introduction

Problemet med å måle raske kalsiumbølger i eksitable celler er en av de viktigste og utfordrende aspektene ved å studere signaloverføring i sentrale og perifere nervesystemer. Kalsiumioner spiller en viktig rolle i å utløse nevrotransmitterfrigivelse, synaptisk plastisitet og modulering av aktiviteten til forskjellige intracellulære proteiner 1,2,3,4,5. Å studere kalsiumsignalering er også viktig for å finne måter å behandle nevrodegenerativesykdommer 6. For å måle endringer i kalsiumnivået, brukes ofte fluorescerende kalsiumfølsomme fargestoffer, og endringer i fluorescensnivået analyseres 7,8,9.

Lasting av kalsiumfargestoffer i celler kan oppnås på forskjellige måter. Overveiende brukes celle-permeant fargestoffer10,11. I et slikt tilfelle er det imidlertid ikke bare vanskelig å kontrollere konsentrasjonen av et fargestoff inne i cellen, men det er også vanskelig å velge målceller for lasting. Denne metoden er ikke anvendelig for å studere perifere nerveender siden fargestoffet kommer inn i postsynaptiske celler. I stedet er celle impermeant fargestoffer mer egnet for slike preparater. I dette tilfellet leveres fargestoffene til cellene ved mikroinjeksjon eller gjennom en lapppipette12,13,14. Det er også en metode for lasting gjennom en nervestubbe. Sistnevnte metode er mest egnet for nevromuskulære krysspreparater 15,16,17,18,19,20. Det gjør det mulig å utføre farging for bare celler av interesse. Selv om denne metoden ikke gir en nøyaktig evaluering av konsentrasjonen av fargestoffet i målcellen, kan konsentrasjonen estimeres omtrent ved å sammenligne nivået av fluorescens av cellene i ro i løsninger med en kjent konsentrasjon av kalsium21. I denne studien presenteres en modifikasjon av denne metoden anvendt på synapser av pattedyr.

Kalsiuminngang i den depolariserende fasen av handlingspotensialet er en rask prosess, spesielt i det nevromuskulære krysset; Derfor, for registrering, er det nødvendig med passende utstyr1. En nylig studie ved bruk av et spenningsfølsomt fluorescerende fargestoff viste at varigheten av handlingspotensialet i den perifere synapsen til en mus er ca. 300 μs22. Kalsiumforbigående, evaluert ved bruk av kalsiumfølsomme fargestoffer i froskens perifere synapser, har lengre varighet: stigningstiden er ca. 2-6 ms og forfallstiden er ca. 30-90 ms, avhengig av kalsiumfargestoffet som brukes23,24. For å måle raske prosesser ved hjelp av fluorescerende fargestoffer, brukes vanligvis CCD- eller CMOS-kameraer, med raske og følsomme CCD-matriser. Imidlertid har disse kameraene ulempen med lav oppløsning, begrenset av størrelsen på de følsomme elementene i matrisen25,26,27,28. De raskeste kameraene med tilstrekkelig følsomhet til å registrere både aksjonspotensialer og kalsiumtransienter som respons på lavfrekvent stimulering av celler har en skannefrekvens på 2000 Hz, og en matrise med en dimensjon på 80 x 8029. For å oppnå signaler med høyere romlig oppløsning, brukes konfokal mikroskopi, spesielt hvis det er nødvendig å vurdere noen volumetriske endringer i signalet30,31,32. Men det bør huskes at konfokal mikroskopi har høy skannehastighet i linjeskanningsmodus, men det er fortsatt betydelige begrensninger på hastigheten på opptak av raske prosesser når du bygger et romlig bilde33. Det er konfokale mikroskoper basert på roterende Nipkow-disker (spalteskanningsmikroskopi) og Multipoint-Array Scanners, som har høyere skannehastighet. Samtidig er de dårligere enn de klassiske konfokale mikroskopene i konfokal bildefiltrering (pinholes crosstalk for mikroskoper med en Nipkow-disk)32,34,35. Konfokal avbildning med resonansskanning kan også gi en høy spatio-temporal oppløsning som kreves for høye temporale målinger36. Vær imidlertid oppmerksom på at registrering av svake fluorescerende responser med høy skannehastighet ved bruk av resonansskannere krever svært følsomme detektorer som hybriddetektorer36.

Denne artikkelen presenterer en metode for å øke den tidsmessige oppløsningen av signaler registrert med Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM) samtidig som den romlige oppløsningenopprettholdes 37. Dagens metode er en videreutvikling av metodene beskrevet tidligere og overført til LSCM-plattformen38,39,40. Denne tilnærmingen krever ikke endringer i mikroskopmaskinvaren og er basert på anvendelse av en algoritme for opptak av periodisk fremkalte fluorescerende signaler med et tidsskift i forhold til stimuleringsmomentet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsøk ble utført på isolerte nervemuskelpreparater av levator auris longus (m. LAL) fra musene BALB/C (20-23 g, 2-3 måneder gamle)41. De eksperimentelle prosedyrene ble utført i samsvar med retningslinjene for bruk av laboratoriedyr fra Kazan Federal University og Kazan Medical University, i samsvar med NIH-guiden for pleie og bruk av laboratoriedyr. Den eksperimentelle protokollen oppfylte kravene i EUs rådsdirektiv 86/609 / EØF og ble godkjent av den etiske komiteen ved Kazan Medical University.

1. Utarbeidelse av Ringer- og arkiveringsløsninger

  1. Forbered Ringer-løsningen for pattedyrmuskel ved å blande følgende ingredienser: NaCl (137 mM), KCl (5 mM), CaCl 2 (2 mM), MgCl 2 (1 mM), NaH2PO4 (1 mM), NaHCO3 (11,9 mM) og glukose (11 mM). Bubble gjennom løsningen med 95% O 2 og 5% CO 2 og juster pH til 7,2-7,4 ved å legge til HCl / NaOH om nødvendig.
  2. Forbered fargestoffbelastningsløsningen.
    1. Forbered HEPES-løsning (10 mM) med pH i området 7,2-7,4. 500 μg kommersielt fargestoff kommer i et 500 μL hetteglass. Oppløs fargestoffet i 14 μL av HEPES-løsningen for å oppnå en fargestoffkonsentrasjon på 30 mM. Rist godt og sentrifugen til den er helt oppløst.
    2. Fortynn løsningen av Ca2+ indikator med HEPES-løsning ned til 1 mM konsentrasjon. Oppbevar den i en fryser (-20 °C) og unngå eksponering for lys.

2. Prosedyre for lasting av fargestoff

MERK: Fargestoffbelastningsprosedyren utføres i henhold til protokollen for lasting gjennom nervestubben, tilpasset fra protokollene som tidligere ble publisert 19,42,43,44,45,46.

  1. Dissekere LAL-muskel i henhold til disseksjonsprosedyren for dette preparatet som beskrevet i de tidligere publiserte protokollene47,48.
    1. Fest vevet litt strukket (ikke mer enn 30% fra opprinnelig lengde) i den elastomerbelagte petriskålen med fine pinner i rustfritt stål og tilsett Ringers løsning til muskelen er helt dekket.
      MERK: Petriskålen var ferdigfylt med elastomer i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabell).
  2. Klargjør fyllpipetten
    1. Bruk en mikropipetteavtrekker (se Materialfortegnelse), og lag en mikropipette med en fin spiss som er så skarp som mulig for de intracellulære opptakene. Bruk kapillærer uten indre filamenter (1,5 mm i ytre diameter og 0,86 eller 1,10 mm i indre diameter).
    2. Bryt av mikropipettespissen etter å ha scoret avsmalningen med et slipemiddel, slik at spissen er åpen til ca. 100 μm i diameter. Firepoler spissen ned for å begrense når den indre diameteren krymper fra >80 μm til 12-13 μm. Fest et silikonrør til den ene siden av Fyllingspipetten og en sprøyte (uten kanyle) til den andre siden.
  3. Under et stereomikroskop, finn stedet der nervestammen blir til separate nervegrener. Plasser fyllepipetten med det monterte røret og sprøyten på petriskålen med voks. Flytt pipettespissen til den står over nerven.
  4. Med fin saks, kutt nerven nær muskelfiberen, og la et lite stykke av nervestubben være ca 1 mm lang. Aspirer nervestubben forsiktig sammen med litt Ringer-løsning, uten å klemme den, inn i tuppen av Fyllingspipetten. Fjern silikonrøret fra fyllepipetten.
  5. Trekk en viss mengde fargestoffladningsløsning (~0,3 μL) ved hjelp av en sprøyte med et langt filament. Dette volumet tilsvarer omtrent 3 cm av filamentet.
    MERK: I utgangspunktet er det nødvendig å lage et filament fra en pipettespiss med et volum på 10 μL ved å trekke på brannen ved hjelp av en alkohollampe eller en gassbrenner.
  6. Sett filamentspissen forsiktig med lasteløsningen inn i fyllingspipetten. Slipp blandingen direkte på nervestubben. Inkuber preparatet ved romtemperatur i mørket i 30 minutter.
  7. Skyll deretter preparatet med fersk Ringer-løsning og inkuber ved 25 °C i opptil 2 timer i et glassbeger med 50 ml (eller mer) Ringers løsning (preparatet må dekkes med løsningen). I løpet av denne tiden vil fargestoffet nå synapsene.

3. Videoopptak med konfokal mikroskopi

MERK: Registrering av kalsiumtransienter utføres med et laserskanning konfokalt mikroskop (LSCM) (se Materialfortegnelse). For å registrere raske kalsiumtransienter ble det brukt en original protokoll som tillot opptak av signaler med tilstrekkelig romlig og tidsmessig oppløsning. Metoden er grundig beskrevet i publikasjonen til Arkhipov et al37. Mikroskopet var utstyrt med et 20x vann nedsenkningsmål (1, 00 NA). 488 nm laserlinjen ble dempet til 10% intensitet og utslippsfluorescens ble samlet inn fra 503 til 558 nm.

  1. Monter preparatet i silisiumelastomerbelagt eksperimentelt kammer og fest det, litt strukket, med et sett med mikronåler av stål. Skyll preparatet grundig med Ringers løsning.
    MERK: Et enkelt skreddersydd perfusjonseksperimentelt kammer laget av organisk glass med bunnen av kammeret dekket med en elastomer (utarbeidet i samsvar med produsentens instruksjoner, se Materialfortegnelse) ble brukt. Kammeret har et løsningsforsyningsrør. Oppløsningen pumpes ut via en sprøytekanyle, montert på en magnetisk holder (se Materialfortegnelse). Som et eksperimentelt kammer kan en petriskål brukes (som den som brukes til inkubering av preparatet), men med vedlagte forsynings- og sugerør.
  2. Installer sugeelektrode som skal brukes til å stimulere nerven.
    MERK: Konstruksjonen av elektroden ligner på det som ble publisert i 2015-papiret av Kazakov et al49. Plasser og fest elektroden ved å vokse ved siden av badekaret. Flytt spissen nær nervestubben og aspirer den inn i elektroden.
  3. Monter forberedelseskammeret på mikroskoptrinnet og plasser innløps- og utløpsbeslagene i kammeret.
  4. For å perfuse preparatet, bruk et enkelt tyngdekraft-strømningsdrevet system. Slå på perfusjonssugepumpen for å fjerne overflødig oppløsning.
  5. Koble den stimulerende sugeelektroden til en elektrisk stimulator og sørg for at muskulære sammentrekninger oppstår etter stimuli. Se pkt. 3.9-3.12 for stimuleringsforhold og registrering.
  6. Fyll opp perfusjonssystemet med Ringers løsning med d-tubocurarine (10 μM).
    MERK: Denne løsningen bidrar til å forhindre muskulære sammentrekninger. D-tubocurarine eller alfa-bungarotoxin-spesifikke blokkere av nikotin acetylkolinreseptorer på postsynaptisk membran ville helt eller delvis blokkere muskelkontraksjoner50. For å forhindre muskulære sammentrekninger kan også spesifikke blokkere av postsynaptiske natriumkanaler som μ-konotoksin GIIIB brukes51.
  7. Slå på perfusjonssugepumpen og start perfusjonen av preparatet med Ringers oppløsning som inneholder d-tubocurarine.
  8. Angi bildeparametere i LSCM-programvaren som følger.
    1. I LSCM-programvaren (LAS AF; se Materialfortegnelse) velger du Elektrofysiologi.
      MERK: I denne modusen, når et bilde er tatt på tidspunktet, sendes en synkroniserende puls til stimulatoren ved hjelp av utløserboksen. Dette fremkaller aksjonspotensialgenerering i preparatet (figur 1; stimulatorenhet).
    2. Velg Brukeranskaffelsesmodus. For å utløse stimulatoren ved hjelp av mikroskopsynkroniseringspulsen, velger du utløserinnstillingene i jobbmenyinnstillingene. Sett feltet Utløsing ved ramme til kanalen ut1.
    3. Bruk følgende innstillinger: Skannemodus: XYT, Skannefrekvens: 1400 Hz, Zoomfaktor: 6.1, Pinhole: helt åpen. Kontroller at sekvensiell transpassing toveis X-modus er på.
    4. Angi minimumstid for å danne en ramme på 52 ms og rammer som skal samles i en råvideo med 20 bilder.
      MERK: Disse innstillingene tillater bildeopptak med en oppløsning på 128 x 128 piksler mens du tar en enkelt ramme hver 52 ms.
    5. Sett eksitasjonsbølgelengden til argonlaseren til 488 nm med 8% utgangseffekt.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk for det eksperimentelle oppsettet. 1. Laserskanning konfokalmikroskop (LSCM). 2. Synkroniseringsmodul av LSCM (utløserboks). 3. Stimulator. 4. Isolasjon enhet. 5. Den biologiske prøven. 6. Sugeelektrode for elektrisk stimulering av nerve. 7. Perfusjonssystemer (7a: perfusatreservoar, 7b: dropper, 7c: strømningsregulator, 7d: vakuumkolbe). Pilene peker på forplantningsretningen for synkroniserende puls. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Trykk på Live Mode-knappen for å bytte til Live-modus , som hjelper deg med å få en forhåndsvisning av nerveterminaler lastet med fargestoffet.

Figure 2
Figur 2: Musenerve og terminaler lastet med Ca2+ -indikatoren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Stimulering enhet
    MERK: I dette arbeidet ble stimulatoren beskrevet i artikkelen av Land et al.52 brukt. Denne enheten gjør det mulig å stille tidsmessige parametere for stimulering via MatLab-programvaren.
    1. Opprett en ny fil, lim inn koden fra ovennevnte artikkel i MatLab-kodevinduet, og lagre filen. Klikk på Kjør, så vises et vindu med stimuleringsparametere. Angi forsinkelsestiden og varigheten av stimulansen.
      MERK: Forsinkelsen bestemmer den tidsmessige oppløsningen til det rekonstituerte fluorescerende signalet. Den elektriske pulsen på 0,2 ms varighet forsinkes, og sendes deretter til isolasjonsenheten. Sistnevnte danner amplituden og polariteten til den stimulerende pulsen og isolerer det biologiske objektet elektrisk fra opptaksutstyret.
    2. For å stimulere nerven, velg supramaksimal amplitude av den stimulerende impulsen (25% -50% større enn den maksimale stimuleringsintensiteten som er nødvendig for å aktivere alle nervefibrene).
      MERK: Den presenterte metoden er basert på en spesiell algoritme for opptak av enkelt raske fluorescerende signaler ved hjelp av LSCM med minimert feie. Ved hvert trinn i den utviklede algoritmen forskyves det registrerte fluorescerende signalet fra det forrige med et tidsintervall som er kortere enn mikroskopets feie. Verdien av tidsforskyvninger bestemmer den tidsmessige oppløsningen til det nødvendige signalet. Antall trinn (skift) i algoritmen avhenger av den nødvendige tidsmessige oppløsningen og den opprinnelige tidsmessige oppløsningen. Med denne registreringsmetoden utføres stimuleringen av preparatet med en frekvens på 0, 25 Hz.
  2. I Live-modus, søk etter avkastningen og få det beste fokuset. Kjør datainnsamlingsprogramvaren.
  3. Skift forsinkelsen på stimulatoren med 2 ms mindre i forhold til forrige verdi, og kjør datainnsamlingsprogramvaren.
  4. Gjenta trinn 3.11 26 ganger for å få 26 sekvenser, med hver sekvens forskjøvet med 2 ms fra den forrige.

4. Videobehandling

MERK: En serie videobilder anskaffet av det konfokale mikroskopet eksporteres i TIFF-format med den gratis programvaren LAS X (se Materialfortegnelse). Denne serien ble delt inn i rammer og eksportert til en mappe. For å generere bildesekvensen med høyere tidsoppløsning ble ImageJ-programvaren, som har en åpen startkode for analyse og behandling av dataene, brukt. Algoritmen for signalbehandling er representert skjematisk i figur 3.

Figure 3
Figur 3: Skjema for kompilering av en høyoppløselig videofil (2 ms på ramme) fra originale videofiler med lav tidsoppløsning (52 ms på ramme). De originale videofilene og de tilsvarende signalene er farget i svart, magenta og grønt. Den kompilerte videofilen og det resulterende signalet er farget rødt. Skjemaet til høyre, linje for linje, viser videobildene som er oppnådd med et konfokalt mikroskop. Til venstre endres de tilsvarende signalene for fluorescens fra den valgte avkastningen. Den øverste linjen dannes ramme for ramme fra de mottatte rammene i henhold til skjemaet. Resultatet er et videobilde som består av hele matrisen av rammer, slik at det er en forsinkelsestid på 2 ms mellom rammer i stedet for 52 ms. Hver linje tilsvarer en forskyvning av stimuleringssignalet med (n - 1) * t, hvor t er tidsforskyvning (2 ms), og n er antall skift iterasjoner. k angir antall bilder i de originale videofilene (linje 2-4) og avhenger av varigheten av det innspilte signalet. I dette tilfellet, for å registrere et signal med en varighet på 1 s, er det nødvendig å velge k = 20 (52 ms * 20 = 1040 ms). t0 er den nødvendige forsinkelsen før stimulering. For å beregne antall skift iterasjoner n, må den opprinnelige temporale oppløsningen mellom rammer (52 ms) deles med den nødvendige temporale oppløsningen (2 ms). I dette tilfellet n = 26, som tilsvarer 26 registrerte feier. Som et resultat av de utførte manipulasjonene oppnås et videobilde bestående av n * k = 520 rammer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Kjør LAS X-programvare. Åpne prosjektet som ble opprettet under utføring av eksperimentet. Klikk på Eksporter, og deretter på Lagre som for å lagre rammer i .tiff format i målmappen.
  2. Kjør ImageJ-programvaren. Klikk på Fil > Importer > bildesekvens.
  3. I vinduet Åpne bildesekvens velger du målmappen og åpner det første bildet.
  4. I vinduet Sekvensalternativer, i feltet Startbilde, angir du rammenummeret til 1 for det første bildet. I Increment-feltet angir du verdien lik antall bilder i det første signalopptaket (20 for det foreliggende tilfellet) og klikker på OK.
  5. For å lagre den genererte filen med sydde første rammer i en egen mappe, klikk på File > Save > Folder.
  6. Gjenta trinn 4.3–4.5 for de neste 19 bildene. I vinduet Sekvensalternativer angir du det tilsvarende rammenummeret i feltet Startbilde .
  7. For å generere full video med høy oppløsning, sy alle rammene sammen. For å gjøre dette, klikk på Fil > Importer > bildesekvens og velg 1 i feltene Startbilde og Trinn . Resultatet blir den endelige videoen med økt tidsmessig oppløsning. Lagre filen i .tiff eller et annet passende format.

5. Videoanalyse

MERK: I ImageJ velger du ROI og bakgrunn. Trekk bakgrunn fra avkastning. Data er representert som forholdet, (ΔF / F0 - 1) * 100%, hvor F0 er intensiteten av fluorescens i ro og ΔF er intensiteten av fluorescens under stimulering.

  1. Klikk på Image > Stacks > Tools > Stack Sorter. Klikk deretter på Analyse > verktøy > ROI Manager.
  2. Dra og slipp den .tiff filen som ble lagret i trinn 4.7 inn i ImageJ-vinduet. Utvid bildet for å få bedre visning. For å forbedre bildevisualiseringen, klikk på Bilde > Juster > Lysstyrke / kontrast > Auto. Dette trinnet vil ikke påvirke dataene.
  3. Sett bakgrunnen nær nerveterminalen ved å tegne avkastning. Legg den til avkastningsansvarlig. Beregn bakgrunnen ved å klikke på Mer > Multi Measure. Kopier middelverdier, lim inn i regnearkprogrammet og beregn gjennomsnittet.
  4. Trekk den beregnede gjennomsnittsverdien fra stablene ved å klikke på Process > Main > Subtrahere. Angi verdien.
  5. Tegn ROI rundt en nerveterminal via en polygonlinje. Legg den til avkastningsansvarlig.
  6. Mål intensiteten til nerveterminalen: Klikk på More > Multi Measure. Kopier middelverdier og lim dem inn i regnearkprogrammet.
  7. Beregn gjennomsnittlig forskyvning av signaler.
    MERK: Bruk de tilsvarende punktene avhengig av forsinkelsestiden før stimulering. Dette trinnet oppretter verdien F0 som skal brukes i etterfølgende beregninger.
  8. Del signalverdiene med gjennomsnittlig forskyvningsverdi.
    MERK: Etter dette trinnet inneholder ikke signalet bidraget fra bakgrunnen og rå fluorescens til amplitudeverdiene for den valgte avkastningen.
  9. Trekk 1 fra verdier oppnådd i trinn 5.8, og multipliser deretter med 100%.
  10. Plott en graf over Ca2+- forbigående og beregn amplituden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter å ha belastet preparatet med fargestoff i henhold til den presenterte teknikken, hadde de fleste synapsene som befant seg nær nervestubben et tilstrekkelig nivå av fluorescens (se figur 2). Etter lasting av klargjøring med fargestoffet ogpåføring av den beskrevne metoden for registrering og bildebehandling ble kalsiumtransienter med ønsket romlig og tidsmessig oppløsning oppnådd (se figur 4). Kalsiumtransienten er gjenfunnet ved den foreslåtte metoden (se figur 3).

Amplitude og tidsparametere for de gjenopprettede signalene ble også analysert. Gjennomsnittlige data er presentert i tabell 1.

Figure 4
Figur 4: Representativt spor av kalsiumsignal fra ett eksperiment. Noen viktige parametere for signal, som gjennomsnittlig amplitude (MA), stigningstid (RT) og forfallstid (DecT) og dens fremspring på akser er indikert. MA beregnes ved gjennomsnittlig poeng på toppen, farget i grønt. RT er tiden det tar for amplituden å stige fra 20% til 80%, som beregnes som forskjellen mellom fremskrivninger på x-aksen farget i blått. DecT er tiden over hvilken amplituden avtar med e ganger, som beregnes som forskjellen mellom fremskrivninger på x-aksen farget i rødt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Topp ΔF/F (%) Stigningstid 20%-80% (ms) τ (MS)
27,0±4,6 (n=5) 6,8±0,48 (n=5) 456±53(n=5)

Tabell 1: De gjennomsnittlige parametrene til Ca2+ forbigående. Data er presentert som gjennomsnitt ± s.e.m., og n er antall målinger i de distinkte nerve-muskel-kryssene. Topp ΔF/F er den gjennomsnittlige amplituden til ΔF/F.

Kalsiumtransientanalyse gjør det mulig å vurdere de amplitudedynamiske egenskapene til endringer i det presynaptiske kalsiumnivået i nerveenden under aksjonspotensialet11. Endringen i amplituden til kalsiumtransienten korrelerer godt med endringen i kvantalinnholdet53. Kalsiumforbigående amplitudeanalyse brukes ofte til å studere effekten av fysiologisk aktive forbindelser assosiert med modulering av presynaptiske kalsiumnivåer på synaptisk overføring54,55. Tidsforløpet av kalsiumtransienten reflekterer kinetikken til kalsiumbinding med fargestoffet og dets dissosiasjon23,56. Det er åpenbart når du bruker fargestoffer med forskjellig affinitet for kalsium23,56. Selv om de tidsmessige parametrene til kalsiumtransienten reflekterer kinetikken til det kalsiumfølsomme fargestoffet, og ikke representerer kinetikken til fritt kalsium i nerveterminalen, kan matematiske modelleringsmetoder basert på eksperimentelle data gjenopprette oppførselen til fritt kalsium i cellen og beregne konsentrasjonen av kalsiumbuffere23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden for å laste Ca2+-sensitivt fargestoff inn i musenerveender gjennom nervestubben og for å registrere en rask kalsiumtransient ved hjelp av et konfokalt mikroskop er presentert i denne artikkelen. Som et resultat av implementeringen av denne belastningsmetoden hadde de fleste synapsene som befant seg nær nervestubben et tilstrekkelig nivå av fluorescens for å muliggjøre registrering av innføring av kalsium i nerveenden som svar på lavfrekvent stimulering av motornerven.

I motsetning til de tidligere presenterte protokollene for lasting av kalsiumfargestoffer gjennom stubben, er denne protokollen designet for bruk på pattedyrsynapser. Tidligere protokoller brukt i kaldblodige dyrepreparater krevde en inkubasjonover natten 43. I denne protokollen er den nødvendige inkubasjonen med fargestoffet bare 2 timer. Avhengig av lengden på nervesegmentet som ble igjen etter skjæringen, kan hastigheten på fargestoffbelastning og antall lastede terminaler variere. Det var mulig å redusere inkubasjonstiden ytterligere i fargestoff for kortere nervestubber. En lignende metode er beskrevet for lasting av fluesynapser18,19. Inkubasjonen av muskelen ble også utført med en liten temperaturøkning over romtemperaturen, noe som forbedrer diffusjonen av fargestoff langs nerven. Det bidro dermed til å redusere inkubasjonstiden, og derfor kan dagens fargestoffbelastningsmetode brukes til å laste synapser av pattedyr som ikke tåler langvarige inkubasjoner. Det er viktig å velge passende forberedelser til studien. LAL-muskelen er godt egnet for denne metoden, da det er mulig å kutte en nervestubbe nær nok til de synaptiske terminalene. Andre tynne muskler kan også være egnet for slik applikasjon57. Et av de viktigste trinnene i denne protokollen er at nervestubben må plasseres i den fargestoffholdige løsningen i de første minuttene etter å ha kuttet nerven. Siden lengden på nerven er kort, må en spesifikk utforming av sugeelektroden brukes til stimulering. I denne undersøkelsen ble både glass- og plastelektroder brukt, med diameteren sammenlignbar med nervesegmentet.

Innsamling av kalsiumtransienter bør utføres ved bruk av spesialutstyr. Registreringer av langvarige endringer i kalsiumnivå som respons på frekvensstimulering av motornerven krever regelmessige kameraer eller et konfokalt mikroskop. Mens registrering av kalsiumtransienter er som svar på lavfrekvent stimulering av nerven, er det nødvendig med følsomme kameraer når signalet fra fargestoffet har lav intensitet og høy hastighet11. Svært følsomme CCD-kameraer eller matriser bestående av fotodioder brukes hovedsakelig til å registrere disse raske prosessene. Imidlertid har kameraer med høy følsomhet og hastighet en tendens til å ha lav oppløsning. Hvis høyoppløselig registrering er nødvendig, er konfokale mikroskopimetoder mer egnet. I konfokale mikroskoper brukes fotomultiplikatorer til å registrere fluorescens, og mer nylig kom hybriddetektorer til bruk. De har en veldig høy følsomhet sammenlignet med CCD-kameraer og er godt egnet for å oppdage svak fluorescens. Men den største ulempen med LSCM er lav skannehastighet når du bygger et romlig bilde. I denne studien, for å registrere kalsiumtransienten, ble den opprinnelige registreringsmetoden brukt via LSCM, som er beskrevet grundig i artikkelen av Arkhipov og medarbeidere relatert til froskens synapser37. Ved hjelp av denne metoden var det mulig å estimere den proksimal-distale gradienten av kalsiumtransient i de langstrakte frosksynapsene37. Denne registreringsmetoden kan være nyttig for å vurdere subcellulær kalsiumdynamikk i eksitable celler, for eksempel i dendritter og pigger i hjerneskivepreparater. I denne studien ble det brukt på pattedyrsynapser. Det tillot å skaffe konfokale videobilder med 2 ms prøvetaking av signaler for å analysere parametrene til kalsiumtransienten.

Den beskrevne metoden omhandler fluorescerende signaler, utløst av en ekstern stimulus og har en fast forsinkelse før stimulansen har kommet. Varierende forsinkelse på stimulatoren gjør det mulig å endre signalstartpunktet og registrere det forskjøvne signalet ved LSCM. Deretter gjenopprettes det opprinnelige signalet med høy tidsmessig oppløsning ved hjelp av invers konvolusjon i henhold til algoritmen beskrevet tidligere. En av begrensningene ved dagens metode er at de opprinnelige signalene må ha liten variasjon i parametere og ha god reproduserbarhet. For å bruke metoden, må man utføre flere skanninger for å få nok data for konvolusjon. I det vurderte tilfellet ble det registrert 26 forsøk med 20 bilder hver, det vil si 520 bilder totalt. Varigheten av bildebehandlingen og antall forsøk avhenger av den nødvendige tidsoppløsningen og signalvarigheten. Så fokusposisjonsstabilitet av preparatet under avbildning er nødvendig. Nøyaktigheten av signalgjenoppretting ved den foreslåtte metoden bestemmes for det meste av størrelsen på avkastningen. Jo mindre ROI-størrelsen er, desto mindre tid tar det å skanne, og jo færre feil oppstår under signalgjenoppretting med den nødvendige tidsmessige oppløsningen37.

Denne studien presenterte en metode for å laste fluorescerende fargestoffer i perifere synapser av pattedyr og en metode for registrering av raske fluorescerende kalsiumsignaler via et konfokalt fluorescensmikroskop. Ved hjelp av den beskrevne metoden var det mulig å registrere et signal med god romlig og tidsmessig oppløsning. Registrering av kalsiumtransienter er et kraftig verktøy for å studere cellulære prosesser, for eksempel regulering av nevrotransmitterfrigivelse og synaptisk plastisitet54,55.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Fluorescensstudier av dette arbeidet ble utført med økonomisk støtte fra Russian Science Foundation Grant (prosjekt nr. 19-15-00329). Metoden ble utviklet under finansiering fra regjeringsoppdraget til FRC Kazan Scientific Center of RAS АААА-А18-118022790083-9. Forskningen ble utviklet med bruk av utstyret til Federal Research Center "Kazan Scientific Center of RAS". Forfatterne vil gjerne takke Dr. Victor I. Ilyin for kritisk lesing av dette manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capillary Glass Clark Electromedical instruments, UK GC150-10
Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP Leica Microsystems , Heidelberg, Germany
Flaming/Brown Micropipette Puller P 97 Sutter Instrument, USA P-97
Flow regulator KD Medical GmbH Hospital Products, Germany KD REG Disposable infusion set with Flow regulator
HEPES Sigma-Aldrich, USA H0887 100mL
Illumination system Leica CLS 150X Leica Microsystems, Germany
ImageJ National Institutes of Health, USA http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Las AF software Leica Microsystems, Heidelberg, Germany
Las X software Leica Microsystems, Heidelberg, Germany https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Magnetic Holder with Suction Tubing BIOSCIENCE TOOLS, USA MTH-S
Microspin FV 2400 Biosan, Latvia BS-010201-AAA
Minutien Pins Fine science tools, Canada 26002-20
Multi-spin MSC 3000 Biosan, Latvia BS-010205-AAN
Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt Molecular Probes, USA O6806 500 μg
Pipette Biohit, Russia 720210 0.5-10 µL
Pipette tip Biohit, Russia 781349 10 µL
Plasticine local producer
Single-use hypodermic needles Bbraun 100 Sterican 0.4×40 mm
Spreadsheet program Microsoft, USA Microsoft Office Excel
Stereomicroscope, Leica M80 Leica Microsystems , Germany
Suction electrode Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal. - 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16. http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/
Sylgard 184 elastomer Dow Corning, USA
Syringe local producer 0.5 mL
Syringe local producer 60 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Llinas, R., Steinberg, I. Z., Walton, K. Presynaptic calcium currents and their relation to synaptic transmission: voltage clamp study in squid giant synapse and theoretical model for the calcium gate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (8), 2918-2922 (1976).
  2. Augustine, G. J. How does calcium trigger neurotransmitter release. Current Opinion in Neurobiology. 11 (3), 320-326 (2001).
  3. Burnashev, N., Rozov, A. Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy. Cell Calcium. 37 (5), 489-495 (2005).
  4. Schneggenburger, R., Neher, E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion. Current Opinion in Neurobiology. 15 (3), 266-274 (2005).
  5. Pang, Z. P., Südhof, T. C. Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 496-505 (2010).
  6. Leal, S. S., Gomes, C. M. Calcium dysregulation links ALS defective proteins and motor neuron selective vulnerability. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 225 (2015).
  7. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  8. Tsien, R. Y. Fluorescent indicators of ion concentrations. Methods in Cell Biology. 30, 127-156 (1989).
  9. Adams, S. R. How calcium indicators work. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
  10. Macleod, G. T. Topical application of indicators for calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 786-790 (2012).
  11. Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 307-314 (2005).
  12. Eilers, J., Konnerth, A. Dye loading with patch pipettes. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (4), 5201 (2009).
  13. Coleman, W. L., et al. Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals. Journal of Physiology. 586 (19), 4649-4673 (2008).
  14. Macleod, G. T. Direct injection of indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 797-801 (2012).
  15. Peng, Y. Y., Zucker, R. S. Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia. Neuron. 10 (3), 465-473 (1993).
  16. Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. α-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals. The Journal of Neuroscience. 20 (23), 8685-8692 (2000).
  17. Newman, Z., et al. Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction. The European Journal of Neuroscience. 25 (6), 1619-1630 (2007).
  18. Macleod, G. T. Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 791-796 (2012).
  19. Rossano, A. J., Macleod, G. T. Loading drosophila nerve terminals with calcium indicators. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e250 (2007).
  20. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  21. Suzuki, S., et al. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 440 (3), 351-365 (2000).
  22. Ojala, K. S., et al. A high-affinity, partial antagonist effect of 3,4-diaminopyridine mediates action potential broadening and enhancement of transmitter release at NMJs. Journal of Biological Chemistry. 296, 100302 (2021).
  23. Samigullin, D., et al. Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 29 (2015).
  24. DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 505, 585-592 (1997).
  25. Bullen, A., Patel, S. S., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: I. High-resolution optical recording with voltage-sensitive dyes and ion indicators. Biophysical Journal. 73 (1), 477-491 (1997).
  26. Bullen, A., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: II. Fast quantitative measurements with voltage-sensitive dyes. Biophysical Journal. 76 (4), 2272-2287 (1999).
  27. Bullen, A., Saggau, P. Optical recording from individual neurons in culture. Modern Techniques in Neuroscience Research. (4), 89-126 (1999).
  28. Bullen, A., Saggau, P. Indicators and optical configuration for simultaneous high-resolution recording of membrane potential and intracellular calcium using laser scanning microscopy. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 436 (5), 788-796 (1998).
  29. Redshirt Imaging. , Available from: http://www.redshirtimaging.com/redshirt_neuro/hardware_overview.htm (2021).
  30. Wilson, T. Optical aspects of confocal microscopy. Confocal Microscopy. , 93-141 (1990).
  31. Cox, G. Biological confocal microscopy. Materials Today. 5 (3), 34-41 (2002).
  32. Mukhitov, A., Arkhipova, S., Nikolsky, E. Modern Light Microscopy in Biological and Medical Research. Nauka. , Moscow. (2011).
  33. Mertz, J. Optical sectioning microscopy with planar or structured illumination. Nature Methods. 8 (10), 811-819 (2011).
  34. Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427-471 (1996).
  35. Toomre, D., Pawley, J. B. Disk-scanning confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , 221-238 (2006).
  36. Venkateswarlu, K., et al. Three-dimensional imaging and quantification of real-time cytosolic calcium oscillations in microglial cells cultured on electrospun matrices using laser scanning confocal microscopy. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3108-3123 (2020).
  37. Arkhipov, A. Y., Khaziev, E. F., Skorinkin, A. I., Bukharaeva, E. A., Samigullin, D. V. Enhancement of the temporal resolution of fluorescent signals acquired by the confocal microscope. Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 204-210 (2020).
  38. Rama, S. Shift and mean algorithm for functional imaging with high spatio-temporal resolution. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  39. Chan, K. G., Streichan, S. J., Trinh, L. A., Liebling, M. Simultaneous temporal superresolution and denoising for cardiac fluorescence microscopy. IEEE Transactions on Computational Imaging. 2 (3), 348-358 (2016).
  40. Veeraraghavan, A., Reddy, D., Raskar, R. Coded strobing photography: compressive sensing of high speed periodic videos. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 33 (4), 671-686 (2011).
  41. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neuroscience Letters. 82 (1), 83-88 (1987).
  42. Macleod, G. T. Calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (7), 758-766 (2012).
  43. Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Loading a calcium dye into frog nerve endings through the nerve stump: calcium transient registration in the frog neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e55122 (2017).
  44. Samigullin, D. V., et al. Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction. BioNanoScience. 7 (1), 162-166 (2017).
  45. Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 31 (31), 11268-11281 (2011).
  46. Luo, F., Dittrich, M., Cho, S., Stiles, J. R., Meriney, S. D. Transmitter release is evoked with low probability predominately by calcium flux through single channel openings at the frog neuromuscular junction. Journal of Neurophysiology. 113 (7), 2480-2489 (2015).
  47. Wright, M., Kim, A., Son, Y. -J. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e3124 (2011).
  48. Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator Auris Longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57482 (2018).
  49. Kazakov, A., Alexandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects. Meždunarodnyj naučno-issledovatel'skij žurnal (International Research Journal). 9 (40), 13-16 (2015).
  50. Bowman, W. C. Neuromuscular block. British Journal of Pharmacology. 147, 277-286 (2006).
  51. Hill, J. M., Alewood, P. F., Craik, D. J. Three-dimensional solution structure of µ-conotoxin GIIIB, a specific blocker of skeletal muscle sodium channels. Biochemistry. 35 (27), 8824-8835 (1996).
  52. Land, B. R., Johnson, B. R., Wyttenbach, R. A., Hoy, R. R. Tools for physiology labs: Inexpensive equipment for physiological stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 3 (1), 30-35 (2004).
  53. Samigullin, D. V., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Calcium transient and quantal release in mouse neuromuscular junction under extracellular calcium concentration change. BioNanoScience. 8 (4), 984-987 (2018).
  54. Khaziev, E., et al. acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction. Frontiers in Physiology. 7, 621 (2016).
  55. Zhilyakov, N., Arkhipov, A., Malomouzh, A., Samigullin, D. Activation of neuronal nicotinic receptors inhibits acetylcholine release in the neuromuscular junction by increasing ca2+ flux through cav1 channels. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 9031 (2021).
  56. Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Optical measurement of presynaptic calcium currents. Biophysical Journal. 74 (3), 1549-1563 (1998).
  57. McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. Journal of Neuroscience Methods. 4 (2), 109-115 (1981).

Tags

Nevrovitenskap utgave 178
Registrering av kalsiumtransienter i mus Neuromuscular Junction med høy temporal oppløsning ved bruk av konfokal mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhilyakov, N. V., Arkhipov, A. Y.,… More

Zhilyakov, N. V., Arkhipov, A. Y., Khaziev, E. F., Mukhamedyarov, M. A., Samigullin, D. V. Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63308, doi:10.3791/63308 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter