Summary
이 프로토콜은 절단 된 신경을 통해 형광 칼슘 염료를 마우스 운동 신경 말단에 로딩하는 방법을 설명합니다. 또한, 컨포칼 현미경을 사용하여 말초 신경 종말에서 빠른 칼슘 과도 현상을 기록하는 독특한 방법이 제시됩니다.
Abstract
시냅스 전 칼슘 수준의 추정은 시냅스 전 세포로의 칼슘 유입이 신경 전달 물질 방출로 이어지는 일련의 사건을 유발하기 때문에 시냅스 전달을 연구하는 핵심 작업입니다. 또한, 시냅스 전 칼슘 수준의 변화는 많은 세포 내 단백질의 활성을 매개하고 시냅스 가소성에 중요한 역할을합니다. 칼슘 신호 전달을 연구하는 것은 신경 퇴행성 질환을 치료하는 방법을 찾는 데에도 중요합니다. 신경근 접합부는 한 가지 유형의 신경 전달 물질 만 가지고 있기 때문에 시냅스 가소성을 연구하는 데 적합한 모델입니다. 이 기사에서는 절단 된 신경 다발을 통해 칼슘에 민감한 염료를 마우스의 운동 신경 종말에 넣는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 기저 칼슘 수준 및 칼슘 과도 상태와 같은 세포 내 칼슘 변화와 관련된 모든 매개 변수를 추정 할 수 있습니다. 세포 외부에서 신경 말단으로 칼슘이 유입되고 칼슘에 민감한 염료에 대한 결합/결합 해제가 몇 밀리초 범위 내에서 발생하기 때문에 이러한 이벤트를 기록하려면 빠른 이미징 시스템이 필요합니다. 실제로 고속 카메라는 빠른 칼슘 변화를 등록하는 데 일반적으로 사용되지만 이미지 해상도 매개 변수가 낮습니다. 칼슘 과도 기록을 위해 여기에 제시된 프로토콜은 컨포칼 현미경이 제공하는 매우 우수한 공간-시간 분해능을 허용합니다.
Introduction
흥분성 세포에서 빠른 칼슘 파를 측정하는 문제는 중추 및 말초 신경계에서 신호 전달을 연구하는 가장 중요하고 도전적인 측면 중 하나입니다. 칼슘 이온은 신경 전달 물질 방출, 시냅스 가소성 및 다양한 세포 내 단백질 1,2,3,4,5의 활성 조절을 유발하는 데 중요한 역할을합니다. 칼슘 신호 전달을 연구하는 것은 신경 퇴행성 질환을 치료하는 방법을 찾는 데에도 중요합니다6. 칼슘 수준의 변화를 측정하기 위해 형광 칼슘 민감성 염료가 일반적으로 사용되며 형광 수준의 변화가 분석됩니다 7,8,9.
칼슘 염료를 세포에 로딩하는 것은 다른 방법으로 달성 될 수 있습니다. 주로 세포 투과성 염료가 사용됩니다10,11. 그러나, 이러한 경우, 세포 내부의 염료 농도를 조절하는 것은 어려울 뿐만 아니라, 로딩할 표적 세포를 선택하는 것도 어렵다. 이 방법은 염료가 시냅스 후 세포에 들어가기 때문에 말초 신경 종말을 연구하는 데 적용 할 수 없습니다. 대신에, 세포 불 투과성 염료가 그러한 제제에 더 적합하다. 이 경우, 염료는 미세주입에 의해 또는 패치 피펫(12,13,14)을 통해 세포에 전달된다. 신경 그루터기를 통해 로딩하는 방법도 있습니다. 후자의 방법은 신경근 접합 제제 15,16,17,18,19,20에 가장 적합합니다. 관심있는 세포에 대해서만 염색을 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 표적 세포에서 염료의 농도에 대한 정확한 평가를 제공하지는 않지만, 농도는 알려진 칼슘21 농도와 용액에서 휴지 상태의 세포의 형광 수준을 비교함으로써 대략 추정 될 수있다. 이 연구에서는 포유류의 시냅스에 적용된이 방법의 변형이 제시됩니다.
활동 전위의 탈분극 단계 동안 칼슘 진입은 특히 신경근 접합부에서 빠른 과정입니다. 따라서 등록을 위해서는 적절한 장비가 필요합니다1. 전압에 민감한 형광 염료를 사용한 최근의 연구는 마우스의 말초 시냅스에서의 활동 전위의 지속 시간이 대략 300 μs22임을 입증했다. 개구리의 말초 시냅스에서 칼슘에 민감한 염료를 사용하여 평가 된 일시적인 칼슘은 더 긴 지속 시간을 갖는다 : 상승 시간은 약 2-6 ms이고 붕괴 시간은 약 30-90 ms이며, 사용 된 칼슘 염료에 따라23,24. 형광 염료의 도움으로 빠른 공정을 측정하기 위해 일반적으로 빠르고 민감한 CCD 매트릭스와 함께 CCD 또는 CMOS 카메라가 사용됩니다. 그러나, 이들 카메라는 매트릭스(25,26,27,28)의 민감한 요소들의 크기에 의해 제한되는 저해상도의 단점을 갖는다. 세포의 저주파 자극에 반응하여 활동 전위와 칼슘 과도 상태를 모두 기록하기에 충분한 감도를 가진 가장 빠른 카메라는 스캔 주파수가 2,000Hz이고 치수가 80 x 8029인 매트릭스를 갖습니다. 더 높은 공간 분해능을 가진 신호를 얻기 위해, 특히 신호30,31,32의 일부 체적 변화를 평가할 필요가있는 경우 컨 포칼 현미경이 사용됩니다. 그러나 공초점 현미경은 라인 스캔 모드에서 높은 스캐닝 속도를 갖지만, 공간 이미지(33)를 구축할 때 빠른 프로세스의 기록 속도에는 여전히 상당한 제한이 있음을 명심해야 한다. 회전 Nipkow 디스크 (슬릿 스캐닝 현미경)를 기반으로하는 컨 포칼 현미경과 스캔 속도가 더 빠른 멀티 포인트 어레이 스캐너가 있습니다. 동시에 컨포칼 이미지 필터링(Nipkow 디스크가 있는 현미경의 핀홀 누화)32,34,35에서 기존의 컨포칼 현미경보다 열등합니다. 공명 스캐닝을 이용한 컨포칼 이미징은 또한 높은 시간 측정에 요구되는 높은 시공간 해상도를 제공할 수 있다(36). 그러나, 공명 스캐너를 사용할 때 높은 스캐닝 속도에서 약한 형광 응답의 등록은 하이브리드 검출기(36)와 같은 고도로 민감한 검출기를 필요로 한다는 것을 고려한다.
이 기사에서는 공간 분해능(37)을 유지하면서 레이저 스캐닝 공초점 현미경(LSCM)으로 기록된 신호의 시간 분해능을 증가시키는 방법을 제시합니다. 현재의 방법은 앞에서 설명한 방법의 추가 개발이며 LSCM 플랫폼(38,39,40)으로 이전됩니다. 이 접근법은 현미경 하드웨어의 변경을 요구하지 않으며 자극 순간과 관련하여 시간 이동으로 주기적으로 유발 된 형광 신호를 기록하기위한 알고리즘의 적용을 기반으로합니다.
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Protocol
실험은 마우스 BALB/C(20-23g, 2-3개월)41로부터 레바토르 아우리스 롱구스(m. LAL)의 분리된 신경-근육 제제에 대해 수행되었습니다. 실험 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 카잔 연방 대학 및 카잔 의과 대학의 실험실 동물 사용 지침에 따라 수행되었습니다. 실험 프로토콜은 유럽 공동체 이사회 지침 86 / 609 / EEC의 요구 사항을 충족했으며 카잔 의과 대학의 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 링거 및 파일링 용액의 준비
- NaCl (137 mM), KCl (5 mM), CaCl 2 (2 mM), MgCl 2 (1 mM), NaH 2 PO4 (1 mM), NaHCO3 (11.9 mM) 및 포도당 (11 mM)의 성분을 혼합하여 포유류 근육에 대한 링거 용액을 준비하십시오. 95 % O 2 및 5 % CO 2로 용액을 거품을 내고 필요한 경우 HCl / NaOH를 첨가하여 pH를 7.2-7.4로 조정합니다.
- 염료 로딩 용액을 준비하십시오.
- pH가 7.2-7.4 범위 인 hepes (10 mM) 용액을 준비하십시오. 500μg의 상업용 염료가 500μL 바이알에 들어 있습니다. 염료를 14 μL의 HEPES 용액에 용해시켜 30 mM의 염료 농도를 얻었다. 잘 흔들어 완전히 녹을 때까지 원심분리합니다.
- Ca2+ 지시약의 용액을 hepes 용액으로 1mM 농도까지 희석하십시오. 냉동실 (-20 ° C)에 보관하고 빛에 노출되지 않도록하십시오.
2. 염료 로딩 절차
참고 : 염료 로딩 절차는 이전에 발표 된 프로토콜 19,42,43,44,45,46에서 채택 된 신경 그루터기를 통한 로딩 프로토콜에 따라 수행됩니다.
- 이전에 발표된 프로토콜47,48에 설명된 대로 이 제제에 대한 해부 절차에 따라 LAL 근육을 해부합니다.
- 미세한 스테인리스 스틸 핀으로 엘라스토머로 코팅 된 페트리 접시에 약간 늘어난 조직 (초기 길이에서 30 % 이하)을 고정하고 근육이 완전히 덮일 때까지 링거 용액을 첨가하십시오.
알림: 페트리 접시는 제조업체의 지침에 따라 엘라스토머로 미리 채워졌습니다( 재료 표 참조).
- 미세한 스테인리스 스틸 핀으로 엘라스토머로 코팅 된 페트리 접시에 약간 늘어난 조직 (초기 길이에서 30 % 이하)을 고정하고 근육이 완전히 덮일 때까지 링거 용액을 첨가하십시오.
- 충진 피펫 준비
- 마이크로피펫 풀러( 재료 표 참조)를 사용하여 세포 내 기록을 위해 가능한 한 날카로운 미세한 팁이 있는 마이크로피펫을 준비합니다. 내부 필라멘트가없는 모세 혈관 (외경 1.5mm, 내경 0.86 또는 1.10mm)을 사용하십시오.
- 연마제로 테이퍼를 채점한 후 마이크로피펫 팁을 떼어내고 팁을 직경 약 100μm까지 열어 둡니다. 내부 직경이 >80 μm에서 12-13 μm로 줄어들 때 제한하기 위해 팁을 파이어 폴리싱하십시오. 충전 피펫의 한쪽에는 실리콘 튜브를 부착하고 다른쪽에는 주사기 (바늘 없음)를 부착합니다.
- 실체 현미경으로 신경 줄기가 별도의 신경 가지로 변하는 곳을 찾으십시오. 장착 된 튜브와 주사기가 있는 충전 피펫을 왁스를 사용하여 페트리 접시에 놓습니다. 피펫 팁이 신경 위에 올 때까지 움직입니다.
- 가는 가위로 근육 섬유에 가까운 신경을 자르고 약 1mm 길이의 작은 신경 그루터기 조각을 남깁니다. 신경 그루터기를 꼬집지 않고 링거 용액과 함께 충전 피펫의 끝 부분에 부드럽게 흡입하십시오. 충진 피펫에서 실리콘 튜브를 제거합니다.
- 긴 필라멘트가 있는 주사기를 사용하여 일정량의 염료 로딩 용액(~0.3μL)을 그립니다. 이 부피는 필라멘트의 약 3cm에 해당합니다.
알림: 처음에는 알코올 램프 또는 가스 버너를 사용하여 불을 당겨 10μL 부피의 피펫 팁에서 필라멘트를 만들어야합니다. - 로딩 용액이 있는 필라멘트 팁을 필링 피펫에 부드럽게 삽입합니다. 혼합물을 신경 그루터기에 직접 방출하십시오. 제제를 어두운 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 그런 다음 새로운 링거 용액으로 제제를 헹구고 25mL(또는 그 이상)의 링거 용액이 있는 유리 비커에서 최대 50시간 동안 2°C에서 배양합니다(제제는 용액으로 덮어야 함). 이 시간 동안 염료는 시냅스에 도달합니다.
3. 컨포칼 현미경으로 비디오 캡처
참고: 과도 칼슘의 등록은 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경(LSCM)으로 수행됩니다( 재료 표 참조). 빠른 칼슘 과도 상태를 등록하기 위해 충분한 공간 및 시간 분해능으로 신호를 기록할 수 있는 원래 프로토콜이 사용되었습니다. 이 방법은 Arkhipov et al37의 간행물에 철저히 기술되어있다. 현미경에는 20x 수침 대물렌즈(1.00 NA)가 장착되었습니다. 488 nm 레이저 라인은 10% 강도로 감쇠되었고 방출 형광은 503 내지 558 nm로 수집되었습니다.
- 실리콘 엘라스토머 코팅 실험 챔버에 제제를 장착하고 강철 마이크로 바늘 세트로 약간 늘어난 상태로 고정하십시오. 링거 용액으로 제제를 광범위하게 헹굽니다.
참고: 챔버 바닥이 엘라스토머로 덮인 유기 유리로 만든 간단한 맞춤형 관류 실험 챔버(제조업체의 지침에 따라 준비, 재료 표 참조)가 사용되었습니다. 챔버에는 용액 공급 튜브가 있습니다. 용액은 마그네틱 홀더에 장착 된 주사기 바늘을 통해 펌핑됩니다 ( 재료 표 참조). 실험 챔버로 페트리 접시 (제제 배양에 사용되는 것과 같은)를 사용할 수 있지만 공급 및 흡입 튜브가 부착되어 있습니다. - 신경을 자극하는 데 사용할 흡입 전극을 설치하십시오.
참고 : 전극의 구조는 Kazakov et al49의 2015 년 논문에 발표 된 것과 유사합니다. 욕조 옆에 왁싱하여 전극을 놓고 고정합니다. 팁을 신경 그루터기에 가깝게 이동하여 전극으로 흡입하십시오. - 준비 챔버를 현미경 스테이지에 장착하고 입구 및 출구 피팅을 챔버에 넣습니다.
- 준비를 관류하려면 간단한 중력 흐름 구동 시스템을 사용하십시오. 관류 흡입 펌프를 켜서 과도한 용액을 제거하십시오.
- 자극 흡입 전극을 전기 자극기에 연결하고 자극 후 근육 수축이 발생하는지 확인하십시오. 자극 조건 및 기록에 대해서는 섹션 3.9-3.12를 참조하십시오.
- 관류 시스템에 d-튜보쿠라린(10μM)이 있는 링거 용액을 채웁니다.
알림: 이 솔루션은 근육 수축을 예방하는 데 도움이 됩니다. 시냅스 후 막상의 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체의 D- 투보 쿠라 린 또는 알파 - 붕가 로톡신 특이 적 차단제는 근육 수축을 완전히 또는 부분적으로 차단합니다50. 또한, 근육 수축을 방지하기 위해, μ- 코노 톡신 GIIIB와 같은 시냅스 후 나트륨 채널의 특정 차단제를 사용할 수있다51. - 관류 흡입 펌프를 켜고 d- 튜보 쿠라 린이 함유 된 링거 용액으로 제제의 관류를 시작하십시오.
- LSCM 소프트웨어에서 이미징 파라미터를 다음과 같이 설정합니다.
- LSCM 소프트웨어(LAS AF, 재료 표 참조)에서 전기 생리학을 선택합니다.
알림: 이 모드에서는 시점의 이미지가 캡처되면 트리거 박스의 도움으로 동기 펄스가 자극기로 전송됩니다. 이것은 제제에서 활동 전위 생성을 유도한다 (도 1; 자극기 유닛). - 획득 모드를 선택합니다. 현미경 동기 펄스를 사용하여 자극기를 트리거하려면 작업 메뉴 설정에서 트리거 설정을 선택합니다. 프레임에서 트리거 출력 필드를 out1 채널로 설정합니다.
- 다음 설정을 사용합니다: 스캔 모드: XYT, 스캔 주파수: 1400Hz, 줌 팩터: 6.1, 핀홀: 완전히 열림. 순차 트랜스 패스 양방향 X 모드가 켜져 있는지 확인합니다.
- 프레임을 형성하는 최소 시간을 52ms로 설정하고 원시 비디오에서 수집할 프레임을 20프레임으로 설정합니다.
참고: 이 설정을 사용하면 52ms마다 단일 프레임을 촬영하면서 128 x 128 픽셀의 해상도로 이미지를 캡처할 수 있습니다. - 아르곤 레이저의 여기 파장을 출력 전력의 8%로 488nm로 설정합니다.
- LSCM 소프트웨어(LAS AF, 재료 표 참조)에서 전기 생리학을 선택합니다.
그림 1: 실험 설정의 개략도. 1. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경(LSCM). 2. LSCM (트리거 박스)의 동기화 모듈. 3. 자극기. 4. 격리 장치. 5. 생물학적 샘플. 6. 신경의 전기 자극을위한 흡입 전극. 7. 관류 시스템 (7a : 관류 저장소, 7b : 점 적기, 7c : 유량 조절기, 7d : 진공 플라스크). 화살표는 동기화 펄스의 전파 방향을 가리 킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 라이브 모드 버튼을 눌러 라이브 모드로 전환하면 염료가 로드된 신경 말단을 미리 볼 수 있습니다.
그림 2: Ca2+ 표시기가 장착된 마우스 신경 및 말단. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 자극 장치
참고 :이 작업에서는 Land et al.52 의 기사에 설명 된 자극기가 사용되었습니다. 이 장치를 사용하면 MatLab 소프트웨어를 통해 자극의 시간 매개 변수를 설정할 수 있습니다.- 새 파일을 만들고, 위에서 언급한 기사의 코드를 MatLab 코드 창에 붙여넣고, 파일을 저장합니다. 실행을 클릭하면 자극 매개 변수가있는 창이 나타납니다. 자극의 지연 시간과 지속 시간을 설정합니다.
참고: 지연은 재구성된 형광 신호의 시간 분해능을 결정합니다. 0.2ms 지속 시간의 전기 펄스가 지연된 다음 격리 장치로 전송됩니다. 후자는 자극 펄스의 진폭과 극성을 형성하고 생물학적 물체를 기록 장비로부터 전기적으로 격리시킨다. - 신경을 자극하려면 자극 임펄스의 초 최대 진폭 (모든 신경 섬유를 활성화하는 데 필요한 최대 자극 강도보다 25 % -50 % 큼)을 선택하십시오.
참고: 제시된 방법은 스윕이 최소화된 LSCM을 사용하여 단일 고속 형광 신호를 기록하기 위한 특수 알고리즘을 기반으로 합니다. 개발된 알고리즘의 각 단계에서 기록된 형광 신호는 현미경 스윕보다 짧은 시간 간격으로 이전 신호와 이동합니다. 시간 이동 값은 필요한 신호의 시간 분해능을 결정합니다. 알고리즘의 단계(이동) 수는 필요한 시간 해상도와 원래 시간 해상도에 따라 다릅니다. 이 등록 방법으로, 제제의 자극은 0.25 Hz의 주파수로 수행된다.
- 새 파일을 만들고, 위에서 언급한 기사의 코드를 MatLab 코드 창에 붙여넣고, 파일을 저장합니다. 실행을 클릭하면 자극 매개 변수가있는 창이 나타납니다. 자극의 지연 시간과 지속 시간을 설정합니다.
- 라이브 모드에서 ROI를 검색하고 최상의 초점을 얻으십시오. 데이터 수집 소프트웨어를 실행합니다.
- 자극기의 지연을 이전 값에 비해 2ms 적게 이동하고 데이터 수집 소프트웨어를 실행합니다.
- 3.11단계를 26번 반복하여 26개의 시퀀스를 획득하고 각 시퀀스는 이전 시퀀스에서 2ms씩 이동합니다.
4. 비디오 처리
참고: 컨포칼 현미경으로 획득한 일련의 비디오 이미지는 무료 소프트웨어 LAS X와 함께 TIFF 형식으로 내보내집니다( 재료 표 참조). 이 시리즈는 프레임으로 나뉘어 폴더로 내보내졌습니다. 더 높은 시간 해상도로 이미지 시퀀스를 생성하기 위해 데이터 분석 및 처리를 위한 개방형 초기 코드가 있는 ImageJ 소프트웨어가 사용되었습니다. 신호 처리 알고리즘은 그림 3에 개략적으로 표현되어 있습니다.
그림 3: 낮은 시간 해상도(프레임에서 52ms)의 원본 비디오 파일에서 고해상도 비디오 파일(프레임에서 2ms)을 컴파일하는 체계입니다. 원본 비디오 파일과 해당 신호는 검정색, 자홍색 및 녹색으로 표시됩니다. 컴파일된 비디오 파일과 결과 신호는 빨간색으로 표시됩니다. 오른쪽의 구성표는 컨포칼 현미경으로 얻은 비디오 이미지를 한 줄씩 보여줍니다. 왼쪽에는 선택한 ROI에서 형광의 해당 신호가 변경됩니다. 맨 위 라인은 구성표에 따라 수신된 프레임으로부터 프레임별로 형성됩니다. 결과는 전체 프레임 배열로 구성된 비디오 이미지이므로 프레임 사이에 52ms 대신 2ms의 지연 시간이 있습니다. 각 라인은 (n - 1) * t에 의한 자극 신호의 오프셋에 해당하며, 여기서 t는 시간 이동 (2ms)이고 n은 교대 반복 횟수입니다. k는 원본 비디오 파일(라인 2-4)의 프레임 수를 나타내며 기록된 신호의 지속 시간에 따라 다릅니다. 이 경우 지속 시간이 1 초 인 신호를 등록하려면 k = 20 (52ms * 20 = 1040ms)을 선택해야합니다. t0 는 자극 전 필요한 지연이다. 시프트 반복 횟수 n을 계산하려면 프레임 간의 초기 시간 해상도(52ms)를 필요한 시간 해상도(2ms)로 나누어야 합니다. 이 경우 n = 26이며, 이는 등록된 26개의 스윕에 해당합니다. 수행 된 조작의 결과로서, n * k = 520 프레임으로 구성된 비디오 이미지가 얻어진다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- LAS X 소프트웨어를 실행합니다. 실험을 수행하는 동안 만든 프로젝트를 엽니다. 내보내기를 클릭한 다음 다른 이름으로 저장을 클릭하여 대상 폴더에 .tiff 형식으로 프레임을 저장합니다.
- ImageJ 소프트웨어를 실행합니다. 파일 > 이미지 시퀀스 가져오기> 클릭합니다.
- 이미지 시퀀스 열기 창에서 대상 폴더를 선택하고 첫 번째 프레임을 엽니다.
- 시퀀스 옵션 창의 시작 이미지 필드에서 첫 번째 프레임의 프레임 번호를 1로 설정합니다. Increment 필드에서 초기 신호 기록의 프레임 수와 동일한 값(현재 경우 20)을 설정하고 확인을 클릭합니다.
- 스티칭된 첫 번째 프레임의 생성된 파일을 별도의 폴더에 저장하려면 파일 > > 폴더 저장을 클릭합니다.
- 다음 19프레임에 대해 4.3-4.5단계를 반복합니다. 시퀀스 옵션 창에서 시작 이미지 필드에 해당 프레임 번호를 설정합니다.
- 전체 고해상도 비디오를 생성하려면 모든 프레임을 함께 연결합니다. 이렇게 하려면 파일 > > 이미지 시퀀스 가져오기 를 클릭하고 시작 이미지 및 증분 필드에서 1을 선택합니다. 결과는 시간 해상도가 향상된 최종 비디오가됩니다. 파일을 .tiff 또는 다른 적절한 형식으로 저장하십시오.
5. 비디오 분석
참고: ImageJ에서 ROI 및 배경을 선택합니다. ROI에서 배경을 뺍니다. 데이터는 비율, (ΔF/F0 - 1)*100%로 표시되며, 여기서F0는 휴지시 형광의 강도이고 ΔF는 자극 동안의 형광의 강도이다.
- 이미지 > 스택 > 도구 > 스택 분류기를 클릭합니다. 그런 다음 ROI 관리자에서 분석 > 도구 > 클릭합니다.
- 4.7단계에서 저장한 .tiff 파일을 ImageJ 창으로 끌어다 놓습니다. 더 잘 볼 수 있도록 이미지를 확장합니다. 이미지 시각화를 개선하려면 이미지 > > 밝기/대비 > 자동 조정을 클릭합니다. 이 단계는 데이터에 영향을 주지 않습니다.
- ROI를 그려 신경 말단에 가까운 배경을 설정합니다. ROI 관리자에 추가하십시오. 다중 측정 > 더보기를 클릭하여 배경을 계산합니다. 평균값을 복사하여 스프레드시트 프로그램에 붙여넣고 평균을 계산합니다.
- 계산된 평균값을 스택에서 빼려면 처리 > Main > 빼기를 클릭합니다. 값을 입력합니다.
- 다각형 선을 통해 신경 말단 주위에 ROI를 그립니다. ROI 관리자에 추가하십시오.
- 신경 말단의 강도 측정: 다중 측정을 더 > 클릭하십시오. 평균값을 복사하여 스프레드시트 프로그램에 붙여넣습니다.
- 신호의 평균 오프셋을 계산합니다.
알림: 자극 전 지연 시간에 따라 해당 지점을 사용하십시오. 이 단계에서는 후속 계산에 사용될 F0 값을 설정합니다. - 신호 값을 평균 오프셋 값으로 나눕니다.
참고: 이 단계 후에 신호에는 선택한 ROI의 진폭 값에 대한 배경 및 원시 형광의 기여도가 포함되지 않습니다. - 5.8단계에서 얻은 값에서 1을 뺀 다음 100%를 곱합니다.
- Ca2+- 과도 상태의 그래프를 플로팅하고 진폭을 계산합니다.
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Representative Results
제시된 기술에 따라 염료로 제제를 로딩 한 후, 신경 그루터기에 가깝게 위치한 대부분의 시냅스는 충분한 수준의 형광을 가졌다 ( 도 2 참조). 염료로 준비하고, 기재된 등록 및 이미지 처리 방법을 적용한 후, 원하는 공간적 및 시간적 해상도를 갖는 칼슘 과도 현상이 얻어졌다( 도 4 참조). 칼슘 과도 현상은 제안 된 방법으로 회수되었습니다 ( 그림 3 참조).
회수된 신호의 진폭 및 시간 파라미터도 분석하였다. 평균 데이터는 표 1에 나타내었다.
그림 4: 한 실험에서 나온 칼슘 신호의 대표적인 흔적. 평균 진폭 (MA), 상승 시간 (RT) 및 감쇠 시간 (DecT) 및 축에 대한 투영과 같은 신호의 몇 가지 중요한 매개 변수가 표시됩니다. MA는 녹색으로 표시된 피크의 평균 포인트로 계산됩니다. RT는 진폭이 20%에서 80%로 상승하는 데 걸리는 시간으로, 파란색으로 표시된 x축의 투영 간의 차이로 계산됩니다. DecT는 진폭이 e 배 감소하는 시간으로, 빨간색으로 표시된 x 축의 투영 간의 차이로 계산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 피크 ΔF / F (%) | 상승 시간 20 % -80 % (밀리 초) | τ (밀리초) |
| 27.0±4.6 (n=5) | 6.8±0.48 (n=5) | 456±53(n=5) |
표 1:Ca2+ 과도 상태의 평균 파라미터. 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 표시되며 n은 별개의 신경-근육 접합부에서의 측정 횟수입니다. 피크 ΔF / F는 ΔF / F의 평균 진폭입니다.
칼슘 과도 분석은 활동 전위11 동안 끝나는 신경에서 시냅스 전 칼슘 수준의 변화의 진폭 - 동적 특성을 평가하는 것을 가능하게한다. 칼슘 과도 진폭의 변화는 양자 함량의 변화와 잘 관련된다53. 칼슘 과도 진폭 분석은 일반적으로 시냅스 전달54,55에 대한 시냅스 전 칼슘 수준의 조절과 관련된 생리 활성 화합물의 효과를 연구하는 데 사용됩니다. 칼슘 과도 현상의 시간 경과는 염료와의 칼슘 결합 및 해리23,56의 동역학을 반영합니다. 칼슘23,56에 대해 친화력이 다른 염료를 사용할 때 분명합니다. 칼슘 과도기의 시간적 파라미터는 칼슘 민감성 염료의 동역학을 반영하고, 신경 말단에서 유리 칼슘의 동역학을 나타내지 않지만, 실험 데이터에 기초한 수학적 모델링 방법은 세포 내의 유리 칼슘의 거동을 복원하고 칼슘 완충액(23)의 농도를 계산할 수 있다.
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Discussion
신경 그루터기를 통해 Ca2+ 민감성 염료를 마우스 신경 종말에 넣고 컨포칼 현미경을 사용하여 빠른 칼슘 과도 상태를 등록하는 방법이이 기사에 나와 있습니다. 이 로딩 방법의 구현 결과, 신경 그루터기에 가깝게 위치한 대부분의 시냅스는 운동 신경의 저주파 자극에 반응하여 신경 종말에 칼슘이 들어가는 것을 등록 할 수있는 충분한 수준의 형광을 가졌습니다.
그루터기를 통해 칼슘 염료를 로딩하기 위해 이전에 제시된 프로토콜과 달리이 프로토콜은 포유류 시냅스에 사용하도록 설계되었습니다. 냉혈 동물 제제에 사용 된 이전 프로토콜은 하룻밤 배양이 필요했습니다43. 이 프로토콜에서 염료와 함께 필요한 배양은 불과 2 시간입니다. 절단 후 남아있는 신경 분절의 길이에 따라 염료 로딩 속도 및로드 된 단자의 수가 다를 수 있습니다. 더 짧은 신경 그루터기를 위해 염료 용액에서 배양 시간을 더욱 줄일 수있었습니다. 유사한 방법이 파리 시냅스18,19의 로딩에 대해 설명된다. 또한, 근육의 배양은 실온보다 약간 온도가 상승하여 수행되었으며, 이는 신경을 따라 염료의 확산을 향상시킵니다. 따라서 배양 시간을 줄이는 데 도움이 되었고, 따라서 현재의 염료 로딩 방법은 장기간 배양을 용납하지 않는 포유류의 로딩 시냅스에 사용될 수 있습니다. 연구를위한 적절한 준비를 선택하는 것이 중요합니다. LAL 근육은 시냅스 말단에 충분히 가까운 신경 그루터기를자를 수 있기 때문에이 방법에 적합합니다. 다른 얇은 근육도 이러한 적용(57)에 적합할 수 있다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 신경을 절단 한 후 처음 몇 분 동안 신경 그루터기를 염료 함유 용액에 넣어야한다는 것입니다. 신경의 길이가 짧기 때문에 자극을 위해 흡입 전극의 특정 디자인을 사용해야합니다. 이 연구에서는 유리 전극과 플라스틱 전극을 모두 사용했으며 직경은 신경 부분의 직경과 비슷합니다.
칼슘 과도 현상 획득은 특수 장비를 사용하여 수행해야합니다. 운동 신경의 주파수 자극에 대한 반응으로 칼슘 수준의 오래 지속되는 변화를 기록하려면 일반 카메라 또는 컨포칼 현미경이 필요합니다. 칼슘 과도 상태의 등록은 신경의 저주파 자극에 대한 반응이지만, 염료의 신호가 낮은 강도와 고속11을 가질 때 민감한 카메라가 필요합니다. 고감도 CCD 카메라 또는 포토 다이오드로 구성된 매트릭스는 주로 이러한 빠른 프로세스를 등록하는 데 사용됩니다. 그러나 감도와 속도가 빠른 카메라는 해상도가 낮은 경향이 있습니다. 고해상도 등록이 필요한 경우 컨포칼 현미경 방법이 더 적합합니다. 컨포칼 현미경에서는 형광을 등록하기 위해 광전자 증배관이 사용되며, 최근에는 하이브리드 검출기가 사용되었습니다. CCD 카메라에 비해 감도가 매우 높으며 약한 형광을 감지하는 데 적합합니다. 그러나 LSCM의 주요 단점은 공간 이미지를 구축 할 때 스캔 속도가 느리다는 것입니다. 이 연구에서, 칼슘 일시적 현상을 기록하기 위해, 원래의 등록 방법이 LSCM을 통해 사용되었으며, 이는 개구리37의 시냅스와 관련된 Arkhipov et al.의 논문에 철저하게 기술되어 있다. 이 방법을 사용하여, 길쭉한 개구리 시냅스(37)에서 칼슘 과도 상태의 근위 - 원위 구배를 추정 할 수 있었다. 이 등록 방법은 흥분성 세포, 예를 들어 뇌 슬라이스 제제의 수상 돌기 및 등뼈에서 세포 내 칼슘 역학을 평가하는 데 유용 할 수 있습니다. 본 연구에서, 포유동물 시냅스에 적용하였다. 2ms 신호 샘플링으로 컨포칼 비디오 이미지를 획득하여 과도 칼슘의 파라미터를 분석할 수 있었습니다.
설명 된 방법은 외부 자극에 의해 유발되는 형광 신호를 처리하고 자극이 오기 전에 고정 된 지연을 갖습니다. 자극기의 지연을 변경하면 신호 시작 지점을 변경하고 LSCM으로 시프트 신호를 등록 할 수 있습니다. 그런 다음 이전에 설명한 알고리즘에 따라 역 컨볼 루션을 사용하여 높은 시간 분해능을 가진 원래 신호가 복원됩니다. 현재 방법의 한계 중 하나는 원래 신호가 매개 변수의 변동성이 거의없고 재현성이 양호해야한다는 것입니다. 이 방법을 적용하려면 컨볼루션에 충분한 데이터를 얻기 위해 여러 스캔을 수행해야 합니다. 고려 된 경우, 각각 20 프레임의 26 시험, 즉 총 520 프레임이 기록되었다. 이미징 기간과 시행 횟수는 필요한 시간 분해능과 신호 지속 시간에 따라 다릅니다. 따라서 이미징 중 준비의 초점 위치 안정성이 필요합니다. 제안 된 방법에 의한 신호 복구의 정확도는 대부분 ROI의 크기에 의해 결정됩니다. ROI 크기가 작을수록 스캔하는 데 걸리는 시간이 줄어들고 필요한 시간 분해능(37)으로 신호 복구 중에 발생하는 오류가 줄어듭니다.
본 연구는 포유류의 말초 시냅스에 형광염료를 로딩하는 방법과 공초점 형광현미경을 통해 빠른 형광 칼슘 신호를 기록하는 방법을 제시했다. 설명 된 방법을 사용하여 우수한 공간 및 시간 해상도로 신호를 등록 할 수있었습니다. 칼슘 과도 상태의 등록은 신경 전달 물질 방출 및 시냅스 가소성조절 54,55와 같은 세포 과정을 연구하는 강력한 도구입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구에 대한 형광 연구는 러시아 과학 재단 보조금 (프로젝트 번호 19-15-00329)의 재정 지원으로 수행되었습니다. 이 방법은 RAS АААА-А18-118022790083-9의 FRC 카잔 과학 센터에 대한 정부 할당의 자금 조달로 개발되었습니다. 이 연구는 연방 연구 센터 "RAS의 카잔 과학 센터"의 장비를 사용하여 개발되었습니다. 저자는이 원고를 비판적으로 읽어 주신 Victor I. Ilyin 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary Glass | Clark Electromedical instruments, UK | GC150-10 | |
| Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP | Leica Microsystems , Heidelberg, Germany | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller P 97 | Sutter Instrument, USA | P-97 | |
| Flow regulator | KD Medical GmbH Hospital Products, Germany | KD REG | Disposable infusion set with Flow regulator |
| HEPES | Sigma-Aldrich, USA | H0887 | 100mL |
| Illumination system Leica CLS 150X | Leica Microsystems, Germany | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
| Las AF software | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | ||
| Las X software | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Magnetic Holder with Suction Tubing | BIOSCIENCE TOOLS, USA | MTH-S | |
| Microspin FV 2400 | Biosan, Latvia | BS-010201-AAA | |
| Minutien Pins | Fine science tools, Canada | 26002-20 | |
| Multi-spin MSC 3000 | Biosan, Latvia | BS-010205-AAN | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt | Molecular Probes, USA | O6806 | 500 μg |
| Pipette | Biohit, Russia | 720210 | 0.5-10 µL |
| Pipette tip | Biohit, Russia | 781349 | 10 µL |
| Plasticine | local producer | ||
| Single-use hypodermic needles | Bbraun | 100 Sterican | 0.4×40 mm |
| Spreadsheet program | Microsoft, USA | Microsoft Office Excel | |
| Stereomicroscope, Leica M80 | Leica Microsystems , Germany | ||
| Suction electrode | Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal. - 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/ | |
| Sylgard 184 elastomer | Dow Corning, USA | ||
| Syringe | local producer | 0.5 mL | |
| Syringe | local producer | 60 mL |
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