Summary
该方案描述了通过切割神经将荧光钙染料加载到小鼠运动神经末梢的方法。此外，还提出了一种使用共聚焦显微镜记录周围神经末梢快速钙瞬变的独特方法。
Abstract
突触前钙水平的估计是研究突触传递的关键任务，因为钙进入突触前细胞会触发导致神经递质释放的级联事件。此外，突触前钙水平的变化介导了许多细胞内蛋白的活性，并在突触可塑性中起重要作用。研究钙信号传导对于寻找治疗神经退行性疾病的方法也很重要。神经肌肉接头是研究突触可塑性的合适模型，因为它只有一种类型的神经递质。本文描述了通过切割的神经束将钙敏感染料加载到小鼠运动神经末梢的方法。该方法允许估计与细胞内钙变化相关的所有参数，例如基础钙水平和钙瞬变。由于钙从细胞外部流入神经末梢及其与钙敏感染料的结合/解除结合发生在几毫秒的范围内，因此需要一个快速的成像系统来记录这些事件。事实上，高速相机通常用于记录快速钙变化，但它们的图像分辨率参数较低。这里介绍的用于记录钙瞬态的方案允许共聚焦显微镜提供极好的时空分辨率。
Introduction
在可兴奋细胞中测量快速钙波的问题是研究中枢和周围神经系统信号传输的最重要和最具挑战性的方面之一。钙离子在触发神经递质释放、突触可塑性和调节各种细胞内蛋白的活性方面起着重要作用1，2，3，4，5。研究钙信号传导对于寻找治疗神经退行性疾病的方法也很重要6。为了测量钙水平的变化，通常使用荧光钙敏感染料，并分析其荧光水平的变化7，8，9。
钙染料加载到细胞中可以通过不同的方式实现。主要使用细胞渗透性染料10，11。然而，在这种情况下，不仅难以控制细胞内染料的浓度，而且也很难选择目标细胞进行上样。该方法不适用于研究周围神经末梢，因为染料进入突触后细胞。相反，细胞不透透的染料更适合这种制剂。在这种情况下，染料通过显微注射或通过贴片移液管12，13，14递送到细胞。还有一种通过神经残端加载的方法。后一种方法最适合于神经肌肉接头制剂15，16，17，18，19，20。它允许仅对感兴趣的细胞进行染色。尽管该方法不能准确评估靶细胞中染料的浓度，但可以通过比较溶液中静止细胞的荧光水平与已知浓度的钙21来近似估计浓度。在这项研究中，提出了应用于哺乳动物突触的该方法的修改。
在动作电位的去极化阶段钙进入是一个快速的过程，特别是在神经肌肉接头;因此，对于其注册，需要适当的设备1.最近使用电压敏感荧光染料的一项研究表明，小鼠外周突触中动作电位的持续时间约为300μs22。在青蛙的外围突触中使用钙敏感染料评估钙瞬变的持续时间更长：上升时间约为2-6毫秒，衰减时间约为30-90毫秒，具体取决于使用的钙染料23，24。为了在荧光染料的帮助下测量快速过程，通常使用CCD或CMOS相机，以及快速灵敏的CCD矩阵。然而，这些相机具有低分辨率的缺点，受限于矩阵25、26、27、28的敏感元件的大小。最快的相机具有足够的灵敏度来记录响应细胞低频刺激的动作电位和钙瞬变，扫描频率为2，000 Hz，矩阵尺寸为80 x 8029。为了获得具有更高空间分辨率的信号，使用共聚焦显微镜，特别是当需要评估信号中的一些体积变化时30，31，32。但应该记住，共聚焦显微镜在线扫描模式下具有很高的扫描速度，但在构建空间图像时，记录快速过程的速度仍然存在显着限制33。有基于旋转Nipkow盘（狭缝扫描显微镜）的共聚焦显微镜和具有更高扫描速度的多点阵列扫描仪。同时，它们在共聚焦图像滤波（带有Nipkow盘的显微镜的针孔串扰）方面不如经典共聚焦显微镜32，34，35。具有共振扫描的共聚焦成像还可以提供高时间测量所需的高时空分辨率36。然而，考虑到当使用共振扫描仪时，以高扫描速度配准弱荧光响应需要高灵敏度的检测器，例如混合检测器36。
本文提出了一种提高激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）记录的信号的时间分辨率，同时保持空间分辨率37的方法。目前的方法是前面描述的方法的进一步发展，并转移到LSCM平台38，39，40。这种方法不需要改变显微镜硬件，并且基于一种算法的应用，用于记录周期性诱发的荧光信号，具有相对于刺激时刻的时间偏移。
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Protocol
对来自小鼠BALB / C（20-23g，2-3个月大）的分离神经肌肉制剂进行实验41。 实验程序按照喀山联邦大学和喀山医科大学的实验动物使用指南进行，符合NIH实验动物护理和使用指南。实验方案符合欧洲共同体理事会指令86/609/EEC的要求，并得到喀山医科大学伦理委员会的批准。
1. 林格氏和归档解决方案的准备
- 通过混合以下成分来制备哺乳动物肌肉的林格氏溶液：NaCl（137 mM），KCl（5 mM），CaCl 2（2 mM），MgCl 2（1 mM），NaH2PO4（1 mM），NaHCO3（11.9 mM）和葡萄糖（11 mM）。用 95% O 2 和 5% CO 2 在溶液中起泡，必要时通过添加 HCl/NaOH 将其 pH 值调节至 7.2-7.4。
- 准备染料加载溶液。
- 制备pH值在7.2-7.4范围内的HEPES（10mM）溶液。500 μg 商业染料装在 500 μL 小瓶中。将染料溶解在 14 μL HEPES 溶液中以获得 30 mM 的染料浓度。摇匀并离心直至完全溶解。
- 用HEPES溶液将C2 + 指示剂的溶液稀释至1mM浓度。将其保存在冰箱（-20°C）中，避免暴露在光线下。
2. 上色程序
注意：染料上样程序是根据通过神经残端上样的方案执行的，该方案改编自先前发布的方案19，42，43，44，45，46。
- 根据先前发表的方案47，48中所述的该制剂的解剖程序解剖LAL肌肉。
- 用细不锈钢销将略微拉伸的组织固定在弹性体涂层的培养皿中（不超过初始长度的30%），并加入林格氏溶液，直到肌肉完全覆盖。
注意：根据制造商的说明，培养皿预先填充了弹性体（见 材料表）。
- 用细不锈钢销将略微拉伸的组织固定在弹性体涂层的培养皿中（不超过初始长度的30%），并加入林格氏溶液，直到肌肉完全覆盖。
- 准备进样移液器
- 使用微量移液器拉拔器（参见 材料表），制备具有细尖端的微量移液器，该吸头尽可能锋利，用于细胞内记录。使用没有内丝的毛细管（外径 1.5 毫米，内径 0.86 或 1.10 毫米）。
- 用研磨剂划破锥度后，折断微量移液器吸头，使吸头的直径打开约100μm。当内径从 >80 μm 收缩到 12-13 μm 时，将尖端向下进行火抛光以限制。将硅胶管连接到移液器的一侧，将注射器（无针头）连接到另一侧。
- 在体视显微镜下，找到神经干变成独立神经分支的地方。使用蜡将带有安装管和注射器的填充移液器放在培养皿上。移动移液器吸头，直到它站在神经上方。
- 用细剪刀，切开靠近肌肉纤维的神经，留下一小块长约1毫米的神经残端。轻轻地将神经残端与一些林格氏溶液一起吸入，不要捏住它，进入灌装移液器的尖端。从进样移液器上取下硅胶管。
- 使用带有长丝的注射器抽取一定量的染料负载溶液（~0.3μL）。该体积相当于大约 3 厘米的细丝。
注意：最初，有必要通过使用酒精灯或燃气燃烧器拉火，从体积为10μL的移液器吸头制作细丝。 - 将装有装载溶液的灯丝吸头轻轻插入灌装移液器中。将混合物直接释放到神经残端上。将制剂在室温下在黑暗中孵育30分钟。
- 之后，用新鲜的林格氏溶液冲洗制剂，并在25°C下在装有50mL（或更多）林格氏溶液的玻璃烧杯中孵育长达2小时（制剂必须用溶液覆盖）。在此期间，染料将到达突触。
3. 使用共聚焦显微镜捕获视频
注意：钙瞬变的记录是用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）进行的（见 材料表）。为了记录快速钙瞬变，使用了允许以足够的空间和时间分辨率记录信号的原始协议。该方法已在Arkhipov等人的出版物中进行了详尽的描述37。显微镜配备了20倍水浸物镜（1.00 NA）。将488 nm激光线衰减至10%强度，并从503至558 nm收集发射荧光。
- 将制剂安装到硅弹性体涂层的实验室中，并用一组钢微针将其稍微拉伸。用林格氏溶液充分冲洗制剂。
注意：使用由有机玻璃制成的简单定制灌注实验室，其底部覆盖有弹性体（根据制造商的说明制备;见 材料表）。腔室有一个溶液供应管。溶液通过安装在磁性支架上的注射器针 头泵 出（见 材料表）。作为实验室，可以使用培养皿（如用于孵育制剂的培养皿），但附有供应管和抽吸管。 - 安装用于刺激神经的吸力电极。
注意：电极的结构类似于Kazakov等人49在2015年发表的论文中发表的内容。通过在浴槽旁边打蜡来放置并固定电极。将尖端靠近神经残端并将其吸入电极中。 - 将制备室安装到显微镜载物台上，然后将入口和出口配件放入室中。
- 要灌注制剂，请使用简单的重力流驱动系统。打开灌注抽吸泵以去除多余的溶液。
- 将刺激吸力电极插入电刺激器，并确保刺激后发生肌肉收缩。有关刺激条件和记录，请参见第3.9-3.12节。
- 用d-管尿素（10μM）填充林格溶液填充灌注系统。
注意：此解决方案有助于防止肌肉收缩。突触后膜上烟碱乙酰胆碱受体的D-管尿素或α-邦加罗毒素特异性阻断剂将完全或部分阻断肌肉收缩50。此外，为了防止肌肉收缩，可以使用突触后钠通道的特异性阻断剂，例如μ-芥头毒素GIIIB51。 - 打开灌注抽吸泵，开始用含有d-管波库林的林格氏溶液灌注制剂。
- 在LSCM软件中设定成像参数，如下所示。
- 在LSCM软件（LAS AF;请参阅 材料表）中，选择 电生理学。
注意：在此模式下，当在时间点捕获图像时，在触发盒的帮助下将同步脉冲发送到刺激器。这在制备中引起动作电位的产生（图1;刺激器单元）。 - 选择 采集模式。要使用显微镜同步脉冲触发刺激器，请在 作业 菜单设置中选择 触发 设置。将 “帧触发输出 ”字段设置为 out1 通道。
- 使用以下设置：扫描 模式：XYT， 扫描频率：1400 Hz， 变焦系数：6.1， 针孔：完全打开。确保顺序交叉双向 X 模式处于打开状态。
- 将形成帧的最短时间设置为 52 毫秒，将原始视频中收集的帧设置为 20 帧。
注意：这些设置允许以 128 x 128 像素的分辨率捕获图像，同时每 52 毫秒拍摄一帧。 - 将氩激光的激发波长设置为 488 nm，输出功率为 8%。
- 在LSCM软件（LAS AF;请参阅 材料表）中，选择 电生理学。
图 1：实验设置示意图。 1. 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）。2. LSCM同步模块（触发盒）。3.刺激器。4.隔离单元。5.生物样本。6.用于电刺激神经的吸力电极。7.灌注系统（7a：灌注液槽，7b：滴管，7c：流量调节器，7d：保温瓶）。箭头指向同步脉冲的传播方向。 请点击此处查看此图的大图。
- 按实时模式按钮切换到 实时模式 ，这有助于预览装有染料的神经末梢。
图 2：装有 Ca2+ 指示器的小鼠神经和终端。 请点击此处查看此图的大图。
- 刺激单元
注意：在这项工作中，使用了Land等人52 文章中描述的刺激器。该设备允许通过 MatLab 软件 设置 刺激的时间参数。- 创建一个新文件，将上述文章中的代码粘贴到 MatLab 代码窗口中，然后保存该文件。单击 “运行”，将出现一个包含刺激参数的窗口。设置刺激的延迟时间和持续时间。
注意：延迟决定了重构荧光信号的时间分辨率。持续时间为0.2 ms的电脉冲被延迟，然后发送到隔离单元。后者形成刺激脉冲的振幅和极性，并将生物对象与记录设备电隔离。 - 为了刺激神经，选择刺激脉冲的超最大振幅（比激活所有神经纤维所需的最大刺激强度大25%-50%）。
注意：所提出的方法基于一种特殊算法，用于使用LSCM和最小化扫描记录单个快速荧光信号。在所开发算法的每一步，记录的荧光信号与前一个信号偏移的时间间隔比显微镜扫描短。时移值决定了所需信号的时间分辨率。算法中的步数（偏移）取决于所需的时间分辨率和原始时间分辨率。使用这种配准方法，以0.25Hz的频率进行制剂的刺激。
- 创建一个新文件，将上述文章中的代码粘贴到 MatLab 代码窗口中，然后保存该文件。单击 “运行”，将出现一个包含刺激参数的窗口。设置刺激的延迟时间和持续时间。
- 在实时模式下，搜索ROI并获得最佳焦点。运行数据采集软件。
- 将刺激器上的延迟相对于先前的值少移动2 ms，然后运行数据采集软件。
- 重复步骤3.11 26次以获取26个序列，每个序列比前一个序列偏移2 ms。
4. 视频处理
注意：共聚焦显微镜采集的一系列视频图像使用免费软件LAS X以TIFF格式导出（见 材料表）。此系列被划分为多个帧并导出到一个文件夹中。为了生成具有更高时间分辨率的图像序列，使用了ImageJ软件，该软件具有用于分析和处理数据的开放初始代码。信号处理算法如图 3所示。
图 3：从具有低时间分辨率（帧 52 毫秒）的原始视频文件编译高分辨率视频文件（帧上 2 毫秒）的方案。 原始视频文件和相应的信号以黑色、洋红色和绿色着色。编译的视频文件和生成的信号为红色。右图逐行显示了用共聚焦显微镜获得的视频图像。在左侧，相应的荧光信号从所选的ROI变化。最上面的线是根据方案从接收到的帧中逐帧形成的。结果是由整个帧数组组成的视频图像，因此帧之间的延迟时间为 2 毫秒，而不是 52 毫秒。每条线对应于刺激信号的偏移量 （n - 1） * t，其中 t 是时移 （2 ms），n 是移位迭代次数。k 表示原始视频文件中的帧数（第 2-4 行），取决于录制信号的持续时间。在这种情况下，要注册持续时间为 1 秒的信号，必须选择 k = 20 （52 ms * 20 = 1040 ms）。t0 是刺激前所需的延迟。要计算移位迭代次数 n，帧之间的初始时间分辨率 （52 ms） 必须除以所需的时间分辨率 （2 ms）。在本例中，n = 26，对应于 26 次注册扫描。作为执行操作的结果，获得由n * k = 520帧组成的视频图像。 请点击此处查看此图的大图。
- 运行 LAS X 软件。打开在执行实验期间创建的项目。单击“ 导出”，然后单击“ 另存为 ”以.tiff格式将帧保存在目标文件夹中。
- 运行 ImageJ 软件。单击文件 >导入>图像序列。
- 在“打开 图像序列 ”窗口中，选择目标文件夹并打开第一帧。
- 在“序列选项”窗口的“起始图像”字段中，将第一帧的帧编号设置为 1。在增量字段中，设置等于初始信号记录中的帧数的值（本例为 20），然后单击确定。
- 要将拼接的第一帧的生成文件保存在单独的文件夹中，请单击文件 >保存>文件夹。
- 对接下来的 19 帧重复步骤 4.3-4.5。在“ 序列选项 ”窗口中，在“ 起始图像 ”字段中设置相应的帧编号。
- 要生成完整的高时间分辨率视频，请将所有帧拼接在一起。为此，请单击“ 文件>导入>图像序列 ”，然后在 “起始图像 ”和 “增量 ”字段中选择 1。结果将是具有更高时间分辨率的最终视频。以.tiff或任何其他合适的格式保存文件。
5. 视频分析
注意：在 ImageJ 中，选择“ROI 和背景”。从投资回报率中减去背景。数据表示为比率（ΔF / F 0 - 1）* 100%，其中F0是静止时的荧光强度，ΔF是刺激期间的荧光强度。
- 单击图像 >堆栈>工具>堆栈排序器。然后，单击“ 分析>工具”>“ROI 管理器”。
- 将步骤 4.7 中保存的.tiff文件拖放到 ImageJ 窗口中。展开图像以获得更好的视图。要改善图像可视化，请单击 图像>自动调整>亮度/对比度>。此步骤不会影响数据。
- 通过绘制ROI将背景设置在神经末梢附近。将其添加到投资回报率管理器。通过单击更多 >多测量来计算背景。复制平均值，粘贴到电子表格程序，然后计算平均值。
- 通过单击“过程”从堆栈中减去计算的平均值 >“主”>“减去”。输入值。
- 通过多边形线 在 神经末梢周围绘制投资回报率。将其添加到投资回报率管理器。
- 测量神经末梢的强度：点击 更多>多测量。复制平均值并将其粘贴到电子表格程序中。
- 计算信号的平均偏移量。
注意：根据刺激前的延迟时间使用相应的点。此步骤建立将在后续计算中使用的 F0 值。 - 将信号值除以平均偏移值。
注意：在此步骤之后，信号不包含背景和原始荧光对所选ROI的幅度值的贡献。 - 从步骤 5.8 中获得的值中减去 1，然后乘以 100%。
- 绘制Ca2+-瞬态图并计算幅度。
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Representative Results
根据所提出的技术用染料加载制剂后，位于神经残端附近的大多数突触具有足够的荧光水平（见 图2）。用染料加载制剂并应用所述配准和图像处理方法后，获得具有所需空间和时间分辨率的钙瞬变（见 图4）。钙瞬时已通过所提出的方法回收（见 图3）。
还分析了恢复信号的幅度和时间参数。平均数据如 表1所示。
图4：来自一个实验的钙信号的代表性迹线。 指示信号的一些重要参数，例如平均幅度（MA），上升时间（RT）和衰减时间（DecT）及其在轴上的投影。MA是通过峰值处的平均点计算的，以绿色着色。RT 是振幅从 20% 上升到 80% 所需的时间，计算为 x 轴上以蓝色着色的投影之间的差异。DecT 是振幅减小 e 倍的时间，计算为 x 轴上以红色着色的投影之间的差异。 请点击此处查看此图的大图。
| 峰值 ΔF/F （%） | 上升时间 20%-80% （毫秒） | τ （毫秒） |
| 27.0±4.6 （n=5） | 6.8±0.48 （n=5） | 456±53（n=5） |
表1：Ca2+ 瞬变的平均值参数。 数据以平均 ± s.e.m. 表示，n 是不同神经-肌肉接头的测量次数。峰值 ΔF/F 是 ΔF/F 的平均振幅。
钙瞬态分析可以评估动作电位期间神经末梢突触前钙水平变化的振幅 - 动力学特征11。钙瞬态振幅的变化与定量含量的变化密切相关53。钙瞬态振幅分析通常用于研究与突触前钙水平调节相关的生理活性化合物对突触传递的影响54，55。钙瞬态的时间过程反映了钙与染料结合及其解离的动力学23，56。当使用对钙23，56具有不同亲和力的染料时，这是显而易见的。虽然钙瞬态的时间参数反映了钙敏感染料的动力学，并不代表神经末梢游离钙的动力学，但基于实验数据的数学建模方法可以恢复细胞中游离钙的行为并计算钙缓冲液的浓度23。
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Discussion
本文介绍了通过神经残端将Ca2+敏感染料加载到小鼠神经末梢以及使用共聚焦显微镜记录快速钙瞬变的方法。由于实施了这种加载方法，位于神经残端附近的大多数突触具有足够的荧光水平，以记录钙进入神经末梢以响应运动神经的低频刺激。
与之前提出的通过残肢加载钙染料的方案不同，该协议设计用于哺乳动物突触。以前用于冷血动物制剂的方案需要过夜孵育43。在该协议中，所需的与染料孵育仅为2小时。根据切割后剩余的神经节段的长度，染料加载的速度和加载端子的数量可能会有所不同。可以进一步缩短染料溶液中的孵育时间，以缩短神经残端。描述了用于加载苍蝇突触18，19的类似方法。此外，肌肉的孵育是在高于室温的温度略有升高的情况下进行的，这改善了染料沿神经的扩散。因此，它有助于减少孵育时间，因此，目前的染料上样方法可用于加载不耐受长时间孵育的哺乳动物的突触。为研究选择合适的准备工作很重要。LAL肌肉非常适合这种方法，因为可以切割足够靠近突触末端的神经残端。其它薄肌肉也可以适合于这样的应用57。该方案中最重要的步骤之一是，必须在切割神经后的最初几分钟内将神经残端放入含染料的溶液中。由于神经的长度较短，因此必须使用特定设计的吸力电极进行刺激。在这项研究中，使用了玻璃和塑料电极，其直径与神经节段的直径相当。
钙瞬变的获取应使用特殊设备进行。记录钙水平响应运动神经频率刺激的长期变化需要常规相机或共聚焦显微镜。虽然钙瞬变的记录是对神经低频刺激的响应，但当来自染料的信号具有低强度和高速时，需要灵敏的相机11。由光电二极管组成的高灵敏度CCD相机或矩阵主要用于记录这些快速过程。但是，具有高灵敏度和速度的相机往往具有低分辨率。如果需要高分辨率配准，共聚焦显微镜方法更合适。在共聚焦显微镜中，光电倍增管用于记录荧光，最近，混合检测器开始使用。与CCD相机相比，它们具有非常高的灵敏度，非常适合检测弱荧光。但LSCM的主要缺点是构建空间图像时的扫描速度低。在这项研究中，为了记录钙瞬变，通过 LSCM使用了 原始的注册方法，这在Arkhipov等人关于青蛙37突触的文章中进行了详尽的描述。使用这种方法，可以估计细长青蛙突触中钙瞬时的近端 - 远端梯度37。这种配准方法可用于评估可兴奋细胞中的亚细胞钙动力学，例如，脑切片制剂中的树突和棘。在本研究中，它被应用于哺乳动物突触。它允许获得具有2 ms信号采样的共聚焦视频图像，以分析钙瞬变的参数。
所描述的方法处理由外部刺激触发的荧光信号，并且在刺激到来之前具有固定的延迟。通过改变刺激器上的延迟，可以改变信号开始点，并通过LSCM记录移位信号。然后，根据前面描述的算法使用逆卷积恢复具有高时间分辨率的原始信号。当前方法的局限性之一是原始信号的参数变化很小，并且具有良好的再现性。要应用该方法，需要执行多次扫描才能获得足够的卷积数据。在所考虑的案例中，记录了26项试验，每项试验20帧，即总共520帧。成像的持续时间和试验次数取决于所需的时间分辨率和信号持续时间。因此，需要成像过程中制剂的焦点位置稳定性。所提方法的信号恢复精度主要取决于ROI的大小。ROI 大小越小，扫描所需的时间就越少，并且在以所需的时间分辨率37 进行信号恢复期间发生的错误就越少。
本研究提出了一种将荧光染料加载到哺乳动物外周突触中的方法，以及一种通过共聚焦荧光显微镜 记录 快速荧光钙信号的方法。使用所描述的方法，可以注册具有良好空间和时间分辨率的信号。钙瞬变的记录是研究细胞过程的有力工具，例如神经递质释放和突触可塑性的调节54，55。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作的荧光研究在俄罗斯科学基金会赠款（项目编号19-15-00329）的资助下进行。该方法是在政府为RAS АААААА-А18-118022790083-9的喀山科学中心分配的资助下开发的。该研究是使用联邦研究中心“RAS喀山科学中心”的设备开发的。作者要感谢Victor I. Ilyin博士对这份手稿的批判性阅读。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary Glass | Clark Electromedical instruments, UK | GC150-10 | |
| Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP | Leica Microsystems , Heidelberg, Germany | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller P 97 | Sutter Instrument, USA | P-97 | |
| Flow regulator | KD Medical GmbH Hospital Products, Germany | KD REG | Disposable infusion set with Flow regulator |
| HEPES | Sigma-Aldrich, USA | H0887 | 100mL |
| Illumination system Leica CLS 150X | Leica Microsystems, Germany | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
| Las AF software | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | ||
| Las X software | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Magnetic Holder with Suction Tubing | BIOSCIENCE TOOLS, USA | MTH-S | |
| Microspin FV 2400 | Biosan, Latvia | BS-010201-AAA | |
| Minutien Pins | Fine science tools, Canada | 26002-20 | |
| Multi-spin MSC 3000 | Biosan, Latvia | BS-010205-AAN | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt | Molecular Probes, USA | O6806 | 500 μg |
| Pipette | Biohit, Russia | 720210 | 0.5-10 µL |
| Pipette tip | Biohit, Russia | 781349 | 10 µL |
| Plasticine | local producer | ||
| Single-use hypodermic needles | Bbraun | 100 Sterican | 0.4×40 mm |
| Spreadsheet program | Microsoft, USA | Microsoft Office Excel | |
| Stereomicroscope, Leica M80 | Leica Microsystems , Germany | ||
| Suction electrode | Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal. - 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/ | |
| Sylgard 184 elastomer | Dow Corning, USA | ||
| Syringe | local producer | 0.5 mL | |
| Syringe | local producer | 60 mL |
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