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Neuroscience

कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उच्च अस्थायी संकल्प के साथ माउस न्यूरोमस्कुलर जंक्शन में कैल्शियम ट्रांजिएंट्स का पंजीकरण

Published: December 1, 2021 doi: 10.3791/63308
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2
1Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, FRC Kazan Scientific Center of RAS, 2Department of Radiophotonics and Microwave Technologies, Kazan National Research Technical University named after A.N. Tupolev, 3Department of Normal Physiology, Kazan State Medical University

Summary

प्रोटोकॉल माउस मोटर तंत्रिका टर्मिनलों में कट तंत्रिका के माध्यम से फ्लोरोसेंट कैल्शियम डाई लोड करने की विधि का वर्णन करता है। इसके अलावा, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके परिधीय तंत्रिका अंत में तेजी से कैल्शियम क्षणिकों को रिकॉर्ड करने के लिए एक अनूठी विधि प्रस्तुत की जाती है।

Abstract

प्रीसिनेप्टिक कैल्शियम स्तर का अनुमान सिनैप्टिक ट्रांसमिशन का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण कार्य है क्योंकि प्रीसिनेप्टिक सेल में कैल्शियम प्रवेश न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के लिए अग्रणी घटनाओं के झरना को ट्रिगर करता है। इसके अलावा, प्रीसिनेप्टिक कैल्शियम के स्तर में परिवर्तन कई इंट्रासेल्युलर प्रोटीन की गतिविधि की मध्यस्थता करते हैं और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के इलाज के तरीके खोजने के लिए कैल्शियम सिग्नलिंग का अध्ययन करना भी महत्वपूर्ण है। न्यूरोमस्कुलर जंक्शन सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल है, क्योंकि इसमें केवल एक प्रकार का न्यूरोट्रांसमीटर है। यह लेख चूहों के मोटर तंत्रिका अंत में कट तंत्रिका बंडल के माध्यम से कैल्शियम-संवेदनशील डाई लोड करने की विधि का वर्णन करता है। यह विधि इंट्रासेल्युलर कैल्शियम परिवर्तनों से संबंधित सभी मापदंडों के अनुमान की अनुमति देती है, जैसे बेसल कैल्शियम स्तर और कैल्शियम क्षणिक। चूंकि कोशिका के बाहरी हिस्से से तंत्रिका टर्मिनलों में कैल्शियम की आमद और कैल्शियम-संवेदनशील डाई के लिए इसके बंधन / अनबाध्यकारी कुछ मिलीसेकंड की सीमा के भीतर होते हैं, इसलिए इन घटनाओं को रिकॉर्ड करने के लिए एक त्वरित इमेजिंग सिस्टम की आवश्यकता होती है। दरअसल, हाई-स्पीड कैमरों का उपयोग आमतौर पर तेजी से कैल्शियम परिवर्तनों के पंजीकरण के लिए किया जाता है, लेकिन उनके पास कम छवि रिज़ॉल्यूशन पैरामीटर होते हैं। कैल्शियम क्षणिक रिकॉर्डिंग के लिए यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदान किए गए बेहद अच्छे स्थानिक-अस्थायी संकल्प की अनुमति देता है।

Introduction

उत्तेजक कोशिकाओं में तेजी से कैल्शियम तरंगों को मापने की समस्या केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र में सिग्नल ट्रांसमिशन का अध्ययन करने के सबसे महत्वपूर्ण और चुनौतीपूर्ण पहलुओं में से एक है। कैल्शियम आयन न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज, सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी और विभिन्न इंट्रासेल्युलर प्रोटीन 1,2,3,4,5 की गतिविधि के मॉड्यूलेशन को ट्रिगर करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के इलाज के तरीके खोजने के लिए कैल्शियम सिग्नलिंग का अध्ययन करना भी महत्वपूर्ण है6. कैल्शियम के स्तर में परिवर्तन को मापने के लिए, फ्लोरोसेंट कैल्शियम-संवेदनशील रंगों का आमतौर पर उपयोग किया जाता है, और उनके प्रतिदीप्ति स्तर में परिवर्तनका विश्लेषण 7,8,9 किया जाता है।

कोशिकाओं में कैल्शियम रंगों की लोडिंग को विभिन्न तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है। मुख्य रूप से, सेल-परमेंट रंगों का उपयोग10,11 किया जाता है। हालांकि, ऐसे मामले में, सेल के अंदर डाई की एकाग्रता को नियंत्रित करना न केवल मुश्किल है, बल्कि लोडिंग के लिए लक्ष्य कोशिकाओं का चयन करना भी मुश्किल है। यह विधि परिधीय तंत्रिका अंत का अध्ययन करने के लिए लागू नहीं है क्योंकि डाई पोस्टसिनेप्टिक कोशिकाओं में प्रवेश करती है। इसके बजाय, सेल अभेद्य रंग ऐसी तैयारी के लिए अधिक उपयुक्त हैं। इस मामले में, रंगों को माइक्रोइंजेक्शन द्वारा या पैच पिपेट12,13,14 के माध्यम से कोशिकाओं तक पहुंचाया जाता है। तंत्रिका स्टंप के माध्यम से लोड करने की एक विधि भी है। बाद की विधि न्यूरोमस्कुलर जंक्शन तैयारी 15,16,17,18,19,20 के लिए सबसे उपयुक्त है। यह केवल ब्याज की कोशिकाओं के लिए धुंधला प्रदर्शन करने की अनुमति देता है। यद्यपि यह विधि लक्ष्य सेल में डाई की एकाग्रता का सटीक मूल्यांकन प्रदान नहीं करती है, लेकिन कैल्शियम21 की ज्ञात एकाग्रता के साथ समाधान में आराम से कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति के स्तर की तुलना करके एकाग्रता का अनुमान लगाया जा सकता है। इस अध्ययन में, स्तनधारियों के सिनैप्स पर लागू इस पद्धति का एक संशोधन प्रस्तुत किया गया है।

एक्शन पोटेंशिअल के विध्रुवण चरण के दौरान कैल्शियम प्रविष्टि एक तेज़ प्रक्रिया है, खासकर न्यूरोमस्कुलर जंक्शन में; इसलिए, इसके पंजीकरण के लिए, उपयुक्त उपकरण की आवश्यकता होती है1. वोल्टेज-संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि माउस के परिधीय अन्तर्ग्रथन में एक्शन पोटेंशिअल की अवधि लगभग 300 μs22 है। कैल्शियम क्षणिक, मेंढक के परिधीय सिनैप्स में कैल्शियम-संवेदनशील रंगों का उपयोग करके मूल्यांकन किया जाता है, इसकी लंबी अवधि होती है: वृद्धि का समय लगभग 2-6 एमएस होता है और क्षय का समय लगभग 30-90 एमएस होता है, जो कैल्शियम डाई के आधार पर23,24 होता है। फ्लोरोसेंट रंगों की मदद से तेज प्रक्रियाओं को मापने के लिए, सीसीडी या सीएमओएस कैमरों का उपयोग आमतौर पर तेज और संवेदनशील सीसीडी मैट्रिक्स के साथ किया जाता है। हालांकि, इन कैमरों में कम रिज़ॉल्यूशन का नुकसान होता है, जो मैट्रिक्स25,26,27,28 के संवेदनशील तत्वों के आकार से सीमित होता है। कोशिकाओं की कम आवृत्ति उत्तेजना के जवाब में एक्शन पोटेंशिअल और कैल्शियम ट्रांजिएंट दोनों को रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता वाले सबसे तेज़ कैमरों में 2,000 हर्ट्ज की स्कैनिंग आवृत्ति होती है, और 80 x 8029 के आयाम के साथ एक मैट्रिक्स होता है। उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ सिग्नल प्राप्त करने के लिए, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाता है, खासकर यदि सिग्नल30,31,32 में कुछ वॉल्यूमेट्रिक परिवर्तनों का आकलन करना आवश्यक है। लेकिन यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी में लाइन स्कैन मोड में उच्च स्कैनिंग गति है, लेकिन स्थानिक छवि33 का निर्माण करते समय तेज प्रक्रियाओं की रिकॉर्डिंग की गति पर अभी भी महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। घूर्णन निप्पको डिस्क (स्लिट-स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी) और मल्टीपॉइंट-ऐरे स्कैनर के आधार पर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप हैं, जिनमें उच्च स्कैनिंग गति है। इसी समय, वे कॉन्फोकल इमेज फ़िल्टरिंग में शास्त्रीय कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप से नीच हैं (एक निपको डिस्क के साथ माइक्रोस्कोप के लिए पिनहोल क्रॉसस्टॉक) 32,34,35। अनुनाद स्कैनिंग के साथ कॉन्फोकल इमेजिंग भी उच्च अस्थायी माप36 के लिए आवश्यक एक उच्च स्थानिक-अस्थायी संकल्प प्रदान कर सकता है। हालांकि, ध्यान रखें कि अनुनाद स्कैनर का उपयोग करते समय उच्च स्कैनिंग गति पर कमजोर फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाओं के पंजीकरण के लिए हाइब्रिड डिटेक्टरों जैसे अत्यधिक संवेदनशील डिटेक्टरों की आवश्यकता होती है36.

यह आलेख स्थानिक रिज़ॉल्यूशन37 को बनाए रखते हुए लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (एलएससीएम) के साथ दर्ज संकेतों के अस्थायी रिज़ॉल्यूशन को बढ़ाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। वर्तमान विधि पहले वर्णित विधियों का एक और विकास है और एलएससीएम प्लेटफॉर्म 38,39,40 में स्थानांतरित कर दिया गया है। इस दृष्टिकोण को माइक्रोस्कोप हार्डवेयर में परिवर्तन की आवश्यकता नहीं होती है और उत्तेजना के क्षण के सापेक्ष समय-समय पर फ्लोरोसेंट संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए एक एल्गोरिथ्म के आवेदन पर आधारित होता है।

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Protocol

सी (20-23 ग्राम, 2-3 महीने पुराना) 41 से लेवेटर ऑरिस लॉन्गस (एम एलएएल) की पृथक तंत्रिका-मांसपेशियों की तैयारी पर प्रयोग किए गए थे। प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड के अनुपालन में कज़ान फेडरल यूनिवर्सिटी और कज़ान मेडिकल यूनिवर्सिटी के प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए दिशानिर्देशों के अनुसार प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया था। प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देश 86/609 / ईईसी की आवश्यकताओं को पूरा किया और कज़ान मेडिकल यूनिवर्सिटी की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. रिंगर और फाइलिंग समाधान की तैयारी

  1. निम्नलिखित अवयवों को मिलाकर स्तनधारी मांसपेशियों के लिए रिंगर का समाधान तैयार करें: एनएसीएल (137 एमएम), केसीएल (5 एमएम), सीएसीएल2 (2 एमएम), एमजीसीएल2 (1 एमएम), एनएएच2पीओ4 (1 एमएम), एनएएचसीओ3 (11.9 एमएम), और ग्लूकोज (11 एमएम)। 95% ओ 2 और 5% सीओ 2 के साथ समाधान के माध्यम से बुलबुला और यदि आवश्यक हो तो एचसीएल / एनएओएच जोड़कर इसके पीएच को 7.2-7.4 में समायोजित करें।
  2. डाई लोडिंग समाधान तैयार करें।
    1. 7.2-7.4 रेंज में पीएच के साथ एचईपीईएस (10 एमएम) समाधान तैयार करें। वाणिज्यिक डाई के 500 μg एक 500 μL शीशी में आता है। 30 एमएम की डाई एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एचईपीईएस समाधान के 14 μL में डाई को भंग करें। अच्छी तरह से हिलाएं और पूरी तरह से भंग होने तक अपकेंद्रित्र।
    2. 1 एमएम एकाग्रता के लिए नीचे एचईपीईएस समाधान के साथ सीए2 + संकेतक के समाधान को पतला करें। इसे फ्रीजर (-20 डिग्री सेल्सियस) में रखें और प्रकाश के संपर्क में आने से बचें।

2. डाई लोड हो रहा है प्रक्रिया

नोट: डाई लोडिंग प्रक्रिया तंत्रिका स्टंप के माध्यम से लोड करने के लिए प्रोटोकॉल के अनुसार किया जाता है, जो पहलेप्रकाशित प्रोटोकॉल से अनुकूलित 19,42,43,44,45,46।

  1. पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल47,48 में वर्णित के रूप में इस तैयारी के लिए विच्छेदन प्रक्रिया के अनुसार लाल मांसपेशियों विच्छेदन।
    1. ठीक स्टेनलेस स्टील पिन के साथ इलास्टोमर-लेपित पेट्री डिश में ऊतक को थोड़ा फैलाएं (प्रारंभिक लंबाई से 30% से अधिक नहीं) और रिंगर के समाधान को तब तक जोड़ें जब तक कि मांसपेशी पूरी तरह से कवर न हो जाए।
      नोट: पेट्री डिश निर्माता के निर्देशों के अनुसार इलास्टोमर से पहले से भरा हुआ था ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. भरने विंदुक तैयार करें
    1. एक माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करना ( सामग्री की तालिका देखें), एक ठीक टिप के साथ एक माइक्रोपिपेट तैयार करें जो इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग के लिए जितना संभव हो उतना तेज है। आंतरिक फिलामेंट्स (बाहरी व्यास में 1.5 मिमी और आंतरिक व्यास में 0.86 या 1.10 मिमी) के बिना केशिकाओं का उपयोग करें।
    2. स्कोरिंग के बाद माइक्रोपिपेट टिप को तोड़ देंएक अपघर्षक के साथ टेपर, टिप को व्यास में लगभग 100 μm तक खुला छोड़ दें। आंतरिक व्यास >80 μm से 12-13 μm तक सिकुड़ने पर टिप को सीमित करने के लिए फायर-पॉलिश करें। भरने विंदुक के एक तरफ एक सिलिकॉन ट्यूब और दूसरी तरफ एक सिरिंज (एक सुई के बिना) संलग्न करें।
  3. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, उस स्थान को ढूंढें जहां तंत्रिका ट्रंक अलग-अलग तंत्रिका शाखाओं में बदल जाता है। मोम का उपयोग पेट्री डिश पर घुड़सवार ट्यूब और सिरिंज के साथ भरने विंदुक रखें। विंदुक टिप ले जाएँ जब तक यह तंत्रिका के ऊपर खड़ा है।
  4. ठीक कैंची के साथ, तंत्रिका को मांसपेशी फाइबर के करीब काट लें, जिससे तंत्रिका स्टंप का एक छोटा टुकड़ा लगभग 1 मिमी लंबा हो। धीरे से कुछ रिंगर के समाधान के साथ तंत्रिका स्टंप की आकांक्षा, इसे चुटकी के बिना, भरने विंदुक की नोक में। भरने विंदुक से सिलिकॉन ट्यूब निकालें।
  5. एक लंबे फिलामेंट के साथ एक सिरिंज का उपयोग करके डाई लोडिंग समाधान (~ 0.3 μL) की कुछ मात्रा ड्रा करें। यह आयतन फिलामेंट के लगभग 3 सेमी से मेल खाती है।
    नोट: प्रारंभ में, शराब दीपक या गैस बर्नर का उपयोग करके आग पर खींचकर 10 μL की मात्रा के साथ एक विंदुक टिप से एक फिलामेंट बनाना आवश्यक है।
  6. धीरे भरने विंदुक में लोडिंग समाधान के साथ फिलामेंट टिप डालें। मिश्रण को सीधे तंत्रिका स्टंप पर छोड़ दें। 30 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर तैयारी सेते हैं।
  7. उसके बाद, ताजा रिंगर के समाधान के साथ तैयारी को कुल्ला और 50 एमएल (या अधिक) रिंगर के समाधान के साथ ग्लास बीकर में 2 घंटे तक 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं (तैयारी समाधान के साथ कवर की जानी चाहिए)। इस समय के दौरान, डाई सिनैप्स तक पहुंच जाएगी।

3. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ वीडियो कैप्चर

नोट: कैल्शियम ट्रांजिएंट्स का पंजीकरण लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (एलएससीएम) के साथ किया जाता है (सामग्री की तालिका देखें)। तेजी से कैल्शियम ट्रांजिएंट्स को पंजीकृत करने के लिए, एक मूल प्रोटोकॉल जो पर्याप्त स्थानिक और लौकिक रिज़ॉल्यूशन के साथ संकेतों की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता था, का उपयोग किया गया था। विधि को अर्किपोव एट अल37 द्वारा प्रकाशन में अच्छी तरह से वर्णित किया गया है। माइक्रोस्कोप 20x पानी विसर्जन उद्देश्य (1.00 एनए) से सुसज्जित था। 488 एनएम लेजर लाइन को 10% तीव्रता तक क्षीण किया गया था और उत्सर्जन प्रतिदीप्ति 503 से 558 एनएम तक एकत्र की गई थी।

  1. सिलिकॉन इलास्टोमर-लेपित प्रयोगात्मक कक्ष में तैयारी को माउंट करें और स्टील माइक्रो-सुइयों के एक सेट के साथ थोड़ा फैला हुआ इसे ठीक करें। रिंगर के समाधान के साथ तैयारी को बड़े पैमाने पर कुल्ला।
    नोट: एक इलास्टोमर के साथ कवर किए गए कक्ष के नीचे कार्बनिक ग्लास से बना एक सरल कस्टम-निर्मित छिड़काव प्रयोगात्मक कक्ष (निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार; सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग किया गया था। कक्ष में एक समाधान आपूर्ति ट्यूब है। समाधान को एक सिरिंज सुई के माध्यम से पंप किया जाता है, जो चुंबकीय धारक पर घुड़सवार होता है ( सामग्री की तालिका देखें)। एक प्रयोगात्मक कक्ष के रूप में, एक पेट्री डिश का उपयोग किया जा सकता है (जैसे तैयारी के इनक्यूबेशन के लिए उपयोग किया जाता है) लेकिन संलग्न आपूर्ति और चूषण ट्यूबों के साथ।
  2. सक्शन इलेक्ट्रोड स्थापित करें जिसका उपयोग तंत्रिका को उत्तेजित करने के लिए किया जाएगा।
    नोट: इलेक्ट्रोड का निर्माण काज़ाकोव एट अल49 द्वारा 2015 के पेपर में प्रकाशित किया गया था। स्नान के बगल में वैक्सिंग करके इलेक्ट्रोड को रखें और ठीक करें। टिप को तंत्रिका स्टंप के करीब ले जाएं और इलेक्ट्रोड में इसकी आकांक्षा करें।
  3. माइक्रोस्कोप चरण पर तैयारी कक्ष माउंट और कक्ष में इनलेट और आउटलेट फिटिंग जगह।
  4. तैयारी को बढ़ावा देने के लिए, एक सरल गुरुत्वाकर्षण-प्रवाह-चालित प्रणाली का उपयोग करें। अतिरिक्त समाधान को हटाने के लिए छिड़काव चूषण पंप चालू करें।
  5. उत्तेजक चूषण इलेक्ट्रोड को एक विद्युत उत्तेजक में प्लग करें और सुनिश्चित करें कि उत्तेजनाओं के बाद मांसपेशियों के संकुचन होते हैं। उत्तेजना की स्थिति और रिकॉर्डिंग के लिए अनुभाग 3.9-3.12 देखें।
  6. डी-ट्यूबोकुरिन (10 μM) के साथ रिंगर के समाधान के साथ छिड़काव प्रणाली भरें।
    नोट: यह समाधान मांसपेशियों के संकुचन को रोकने में मदद करता है। पोस्टसिनेप्टिक झिल्ली पर निकोटिनिक एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर्स के डी-ट्यूबोकुरिन या अल्फा-बंगरोटॉक्सिन-विशिष्ट ब्लॉकर्स मांसपेशियों के संकुचनको पूरी तरह से या आंशिक रूप से अवरुद्ध कर देंगे। इसके अलावा, मांसपेशियों के संकुचन को रोकने के लिए, पोस्टसिनेप्टिक सोडियम चैनलों जैसे μ-कोनोटॉक्सिन जीआईआईआईबी के विशिष्ट ब्लॉकर्स का उपयोग किया जा सकताहै।
  7. छिड़काव चूषण पंप पर स्विच करें और डी-ट्यूबोकुरिन युक्त रिंगर के समाधान के साथ तैयारी का छिड़काव शुरू करें।
  8. निम्नानुसार एलएससीएम सॉफ्टवेयर में इमेजिंग पैरामीटर सेट करें।
    1. एलएससीएम सॉफ्टवेयर (एलएएस एएफ; सामग्री की तालिका देखें) में, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी चुनें।
      नोट: इस मोड में, जब एक छवि समय बिंदु पर कब्जा कर लिया है, ट्रिगर बॉक्स की मदद से उत्तेजक करने के लिए एक सिंक्रनाइज़ पल्स भेजा जाता है। यह तैयारी में कार्रवाई क्षमता पीढ़ी (चित्रा 1; उत्तेजक इकाई) प्राप्त करता है।
    2. अधिग्रहण मोड का चयन करें। माइक्रोस्कोप सिंक पल्स का उपयोग करके उत्तेजक को ट्रिगर करने के लिए, जॉब मेनू सेटिंग्स में, ट्रिगर सेटिंग्स का चयन करें। ट्रिगर आउट ऑन फ़्रेम फ़ील्ड को आउट1 चैनल पर सेट करें।
    3. निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें: स्कैनिंग मोड: XYT, स्कैनिंग की आवृत्ति: 1400 हर्ट्ज, ज़ूम फैक्टर: 6.1, पिनहोल: पूरी तरह से खुला। सुनिश्चित करें कि अनुक्रमिक ट्रांस-पासिंग द्विदिश एक्स मोड चालू है।
    4. 52 एमएस पर एक फ्रेम बनाने के लिए न्यूनतम समय निर्धारित करें और 20 फ्रेम पर कच्चे वीडियो में एकत्र किए जाने वाले फ्रेम।
      नोट: ये सेटिंग्स हर 52 एमएस में एक फ्रेम लेते समय 128 x 128 पिक्सेल के रिज़ॉल्यूशन के साथ छवि कैप्चरिंग की अनुमति देती हैं।
    5. आउटपुट पावर के 8% के साथ 488 एनएम पर आर्गन लेजर की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य सेट करें।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक सेटअप की योजनाबद्ध। 1. लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (एलएससीएम)। 2. एलएससीएम (ट्रिगर बॉक्स) का सिंक्रनाइज़ेशन मॉड्यूल। 3. उत्तेजक। 4. आइसोलेशन यूनिट। 5. जैविक नमूना। 6. तंत्रिका की विद्युत उत्तेजना के लिए चूषण इलेक्ट्रोड। 7. छिड़काव प्रणाली (7 ए: इत्र जलाशय, 7 बी: ड्रॉपर, 7 सी: प्रवाह नियामक, 7 डी: वैक्यूम फ्लास्क)। तीर सिंक्रनाइज़िंग पल्स के प्रसार की दिशा को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. लाइव मोड पर स्विच करने के लिए लाइव मोड बटन दबाएं, जो डाई से भरे तंत्रिका टर्मिनलों का पूर्वावलोकन प्राप्त करने में मदद करता है।

Figure 2
चित्र 2: माउस तंत्रिका और सीए2+ सूचक के साथ लोड टर्मिनल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. उत्तेजना इकाई
    नोट: इस काम में, भूमि एट अल 52 द्वारा लेख में वर्णित उत्तेजक का उपयोग किया गया था। यह डिवाइस मैटलैब सॉफ्टवेयर के माध्यम से उत्तेजना के अस्थायी मापदंडों को स्थापित करने की अनुमति देता है।
    1. एक नई फ़ाइल बनाएं, उपर्युक्त लेख से मैटलैब कोड विंडो में कोड पेस्ट करें, और फ़ाइल को सहेजें। रन पर क्लिक करें, इसलिए उत्तेजना मापदंडों के साथ एक विंडो दिखाई देती है। उत्तेजना की देरी समय और अवधि निर्धारित करें।
      नोट: देरी पुनर्गठित फ्लोरोसेंट सिग्नल के अस्थायी संकल्प को निर्धारित करती है। 0.2 एमएस अवधि की विद्युत नाड़ी में देरी होती है, और फिर अलगाव इकाई में भेजा जाता है। उत्तरार्द्ध उत्तेजक नाड़ी के आयाम और ध्रुवीयता का निर्माण करता है और रिकॉर्डिंग उपकरण से जैविक वस्तु को विद्युत रूप से अलग करता है।
    2. तंत्रिका को उत्तेजित करने के लिए, उत्तेजक आवेग के सुपरमैक्सिमल आयाम का चयन करें (सभी तंत्रिका तंतुओं को सक्रिय करने के लिए आवश्यक अधिकतम उत्तेजना तीव्रता से 25% -50% अधिक)।
      नोट: प्रस्तुत विधि कम से कम स्वीप के साथ एलएससीएम का उपयोग करके एकल तेज फ्लोरोसेंट संकेतों की रिकॉर्डिंग के लिए एक विशेष एल्गोरिथ्म पर आधारित है। विकसित एल्गोरिथ्म के प्रत्येक चरण में, रिकॉर्ड किए गए फ्लोरोसेंट सिग्नल को पिछले एक से एक समय अंतराल से स्थानांतरित कर दिया जाता है जो माइक्रोस्कोप स्वीप से छोटा होता है। समय शिफ्ट का मूल्य आवश्यक सिग्नल के अस्थायी रिज़ॉल्यूशन को निर्धारित करता है। एल्गोरिथ्म में चरणों (बदलाव) की संख्या आवश्यक अस्थायी रिज़ॉल्यूशन और मूल लौकिक रिज़ॉल्यूशन पर निर्भर करती है। पंजीकरण की इस पद्धति के साथ, तैयारी की उत्तेजना 0.25 हर्ट्ज की आवृत्ति के साथ की जाती है।
  2. लाइव मोड में, आरओआई की खोज करें और सबसे अच्छा फोकस प्राप्त करें। डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर चलाएँ।
  3. उत्तेजक पर देरी को पिछले मूल्य के सापेक्ष 2 एमएस कम करें और डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर चलाएं।
  4. 26 अनुक्रमों को प्राप्त करने के लिए चरण 3.11 26 बार दोहराएं, प्रत्येक अनुक्रम को पिछले एक से 2 एमएस द्वारा स्थानांतरित कर दिया गया है।

4. वीडियो प्रोसेसिंग

नोट: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा अधिग्रहित वीडियो छवियों की एक श्रृंखला मुफ्त सॉफ्टवेयर एलएएस एक्स ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ टीआईएफएफ प्रारूप में निर्यात की जाती है। इस श्रृंखला को फ्रेम में विभाजित किया गया था और एक फ़ोल्डर में निर्यात किया गया था। उच्च समय रिज़ॉल्यूशन के साथ छवि अनुक्रम उत्पन्न करने के लिए, इमेजजे सॉफ्टवेयर, जिसमें डेटा के विश्लेषण और प्रसंस्करण के लिए एक खुला प्रारंभिक कोड है, का उपयोग किया गया था। सिग्नल प्रोसेसिंग के एल्गोरिथ्म को चित्रा 3 में योजनाबद्ध रूप से दर्शाया गया है।

Figure 3
चित्रा 3: कम अस्थायी रिज़ॉल्यूशन (फ्रेम पर 52 एमएस) के साथ मूल वीडियो फ़ाइलों से एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन वीडियो फ़ाइल (फ्रेम पर 2 एमएस) संकलित करने की योजना। मूल वीडियो फ़ाइलें और संबंधित सिग्नल काले, मैजेंटा और हरे रंग में रंगे हुए हैं। संकलित वीडियो फ़ाइल और परिणामी सिग्नल लाल रंग के होते हैं। दाईं ओर की योजना, लाइन द्वारा लाइन, एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त वीडियो छवियों को दिखाती है। बाईं ओर, चयनित आरओआई से प्रतिदीप्ति के संबंधित संकेत बदलते हैं। सबसे ऊपरी रेखा योजना के अनुसार प्राप्त फ्रेम से फ्रेम दर फ्रेम बनती है। परिणाम एक वीडियो छवि है जिसमें फ्रेम की पूरी सरणी होती है ताकि 52 एमएस के बजाय फ्रेम के बीच 2 एमएस की देरी का समय हो। प्रत्येक पंक्ति (एन - 1) * टी द्वारा उत्तेजना संकेत के ऑफसेट से मेल खाती है, जहां टी समय शिफ्ट (2 एमएस) है, और एन शिफ्ट पुनरावृत्तियों की संख्या है। कश्मीर मूल वीडियो फ़ाइलों (लाइनों 2-4) में फ्रेम की संख्या को दर्शाता है और रिकॉर्ड किए गए सिग्नल की अवधि पर निर्भर करता है। इस मामले में, 1 एस की अवधि के साथ एक सिग्नल पंजीकृत करने के लिए, के = 20 (52 एमएस * 20 = 1040 एमएस) का चयन करना आवश्यक है। टी0 उत्तेजना से पहले आवश्यक देरी है। शिफ्ट पुनरावृत्तियों की संख्या की गणना करने के लिए एन, फ्रेम (52 एमएस) के बीच प्रारंभिक अस्थायी रिज़ॉल्यूशन को आवश्यक अस्थायी रिज़ॉल्यूशन (2 एमएस) से विभाजित किया जाना चाहिए। इस मामले में, एन = 26, जो 26 पंजीकृत स्वीप से मेल खाती है। प्रदर्शन किए गए जोड़तोड़ के परिणामस्वरूप, एन * के = 520 फ्रेम से युक्त एक वीडियो छवि प्राप्त की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. एलएएस एक्स सॉफ़्टवेयर चलाएँ। उस परियोजना को खोलें जो प्रयोग करने के दौरान बनाई गई थी। निर्यात पर क्लिक करें, और फिर गंतव्य फ़ोल्डर में .tiff प्रारूप में फ्रेम को सहेजने के लिए इस रूप में सहेजें पर क्लिक करें।
  2. छविजे सॉफ़्टवेयर चलाएँ। फ़ाइल > आयात > छवि अनुक्रम पर क्लिक करें।
  3. छवि अनुक्रम खोलें विंडो में, गंतव्य फ़ोल्डर चुनें और पहला फ्रेम खोलें।
  4. अनुक्रम विकल्प विंडो में, छवि प्रारंभ करना फ़ील्ड में, पहले फ़्रेम के लिए फ़्रेम संख्या 1 पर सेट करें. वेतन वृद्धि फ़ील्ड में, प्रारंभिक सिग्नल रिकॉर्डिंग (वर्तमान मामले के लिए 20) में फ्रेम की संख्या के बराबर मान सेट करें और ओके पर क्लिक करें।
  5. एक अलग फ़ोल्डर में सिले हुए पहले फ्रेम की उत्पन्न फ़ाइल को सहेजने के लिए, फ़ाइल > सहेजें > फ़ोल्डर पर क्लिक करें।
  6. अगले 19 फ्रेम के लिए चरण 4.3-4.5 दोहराएँ। अनुक्रम विकल्प विंडो में, प्रारंभ छवि फ़ील्ड में संगत फ़्रेम संख्या सेट करें।
  7. पूर्ण उच्च-समय-रिज़ॉल्यूशन वीडियो उत्पन्न करने के लिए, सभी फ्रेम को एक साथ सिलाई करें। ऐसा करने के लिए, फ़ाइल > आयात > छवि अनुक्रम पर क्लिक करें और छवि और वृद्धि प्रारंभ फ़ील्ड में 1 का चयन करें। परिणाम बढ़े हुए अस्थायी संकल्प के साथ अंतिम वीडियो होगा। फ़ाइल को .tiff या किसी अन्य उपयुक्त प्रारूप में सहेजें।

5. वीडियो विश्लेषण

नोट: इमेजजे में, आरओआई और पृष्ठभूमि का चयन करें। आरओआई से पृष्ठभूमि घटाएं। डेटा को अनुपात के रूप में दर्शाया गया है, (ΔF / F0 - 1) *100 %, जहां F 0 आराम से प्रतिदीप्ति की तीव्रता है और ΔF उत्तेजना के दौरान प्रतिदीप्ति की तीव्रता है।

  1. स्टैक सॉर्टर > इमेज > स्टैक्स > टूल्स पर क्लिक करें। फिर, आरओआई प्रबंधक > विश्लेषण > उपकरण पर क्लिक करें।
  2. छविजे विंडो में चरण 4.7 में सहेजी गई .tiff फ़ाइल खींचें और छोड़ें। बेहतर दृश्य के लिए छवि का विस्तार करें। इमेज विज़ुअलाइज़ेशन को बेहतर बनाने के लिए इमेज > एडजस्ट > ब्राइटनेस/कंट्रास्ट > ऑटो पर क्लिक करें। यह चरण डेटा को प्रभावित नहीं करेगा।
  3. आरओआई ड्राइंग द्वारा तंत्रिका टर्मिनल के करीब पृष्ठभूमि सेट करें। इसे आरओआई प्रबंधक में जोड़ें। अधिक > मल्टी माप पर क्लिक करके पृष्ठभूमि की गणना करें। माध्य मानों की प्रतिलिपि बनाएँ, स्प्रेडशीट प्रोग्राम पर चिपकाएँ, और औसत की गणना करें.
  4. प्रक्रिया > मुख्य > घटाओ पर क्लिक करके स्टैक से गणना औसत मान घटाएं। मान दर्ज करें.
  5. बहुभुज रेखा के माध्यम से एक तंत्रिका टर्मिनल के चारों ओर आरओआई ड्रा करें। इसे आरओआई प्रबंधक में जोड़ें।
  6. तंत्रिका टर्मिनल की तीव्रता को मापें: अधिक > मल्टी माप पर क्लिक करें। माध्य मानों की प्रतिलिपि बनाएँ और उन्हें स्प्रेडशीट प्रोग्राम में चिपकाएँ.
  7. संकेतों के औसत ऑफसेट की गणना करें।
    नोट: उत्तेजना से पहले देरी समय के आधार पर संबंधित बिंदुओं का उपयोग करें। यह चरण F0 मान स्थापित करता है जिसका उपयोग बाद की गणनाओं में किया जाएगा।
  8. सिग्नल मानों को औसत ऑफसेट मान से विभाजित करें।
    नोट: इस चरण के बाद, सिग्नल चयनित रॉय के लिए आयाम मूल्यों के लिए पृष्ठभूमि और कच्चे प्रतिदीप्ति का योगदान शामिल नहीं है।
  9. चरण 5.8 में प्राप्त मानों से 1 घटाएँ, और उसके बाद 100% से गुणा करें।
  10. सीए2 + - क्षणिक का एक ग्राफ प्लॉट करें और आयाम की गणना करें।

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Representative Results

प्रस्तुत तकनीक के अनुसार डाई के साथ तैयारी लोड करने के बाद, तंत्रिका स्टंप के करीब स्थित अधिकांश सिनैप्स में प्रतिदीप्ति का पर्याप्त स्तर था ( चित्रा 2 देखें)। डाई के साथ तैयारी लोड करने के बाद औरपंजीकरण और छवि प्रसंस्करण की वर्णित विधि लागू करने के बाद, वांछित स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ कैल्शियम क्षणिक प्राप्त किए गए थे ( चित्रा 4 देखें)। कैल्शियम क्षणिक प्रस्तावित विधि द्वारा बरामद किया गया है ( चित्रा 3 देखें)।

बरामद संकेतों के आयाम और समय मापदंडों का भी विश्लेषण किया गया था। औसत डेटा तालिका 1 में प्रस्तुत किए गए हैं।

Figure 4
चित्रा 4: एक प्रयोग से कैल्शियम संकेत के प्रतिनिधि ट्रेस। सिग्नल के कुछ महत्वपूर्ण पैरामीटर, जैसे कि माध्य आयाम (एमए), वृद्धि समय (आरटी), और क्षय समय (डीईसीटी) और कुल्हाड़ियों पर इसके अनुमानों को इंगित किया गया है। एमए की गणना चोटी पर औसत अंक द्वारा की जाती है, हरे रंग में रंगी होती है। आरटी आयाम को 20% से 80% तक बढ़ने में लगने वाला समय है, जिसकी गणना नीले रंग के एक्स-अक्ष पर अनुमानों के बीच अंतर के रूप में की जाती है। डेकटी वह समय है जिस पर आयाम ई समय से कम हो जाता है, जिसकी गणना लाल रंग के एक्स-अक्ष पर अनुमानों के बीच अंतर के रूप में की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पीक ΔF/F (%) वृद्धि का समय 20% -80% (एमएस) ω (एमएस)
27.0±4.6 (एन = 5) 6.8±0.48 (एन = 5) 456±53(एन = 5)

तालिका 1: सीए2 + क्षणिक के औसत पैरामीटर। डेटा को एसईएम ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, और एन अलग-अलग तंत्रिका-मांसपेशी जंक्शनों में माप की संख्या है। शिखर ΔF/F ΔF/F का माध्य आयाम है।

कैल्शियम क्षणिक विश्लेषण एक्शन पोटेंशिअल11 के दौरान तंत्रिका समाप्त होने वाले प्रीसिनेप्टिक कैल्शियम स्तर में परिवर्तन की आयाम-गतिशील विशेषताओं का आकलन करना संभव बनाता है। कैल्शियम क्षणिक के आयाम में परिवर्तन क्वांटल सामग्री53 में परिवर्तन के साथ अच्छी तरह से संबंधित है। कैल्शियम क्षणिक आयाम विश्लेषण आमतौर पर अन्तर्ग्रथनी संचरण54,55 पर प्रीसिनेप्टिक कैल्शियम के स्तर के मॉडुलन से जुड़े शारीरिक रूप से सक्रिय यौगिकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। कैल्शियम क्षणिक का समय पाठ्यक्रम डाई के साथ कैल्शियम बाध्यकारी के कैनेटीक्स और इसके पृथक्करण23,56 को दर्शाता है। कैल्शियम 23,56 के लिए अलग-अलग आत्मीयता वालेरंगों का उपयोग करते समय यह स्पष्ट है। यद्यपि कैल्शियम क्षणिक के अस्थायी पैरामीटर कैल्शियम संवेदनशील डाई के कैनेटीक्स को प्रतिबिंबित करते हैं, और तंत्रिका टर्मिनल में मुक्त कैल्शियम के कैनेटीक्स का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, प्रयोगात्मक डेटा के आधार पर गणितीय मॉडलिंग विधियां सेल में मुक्त कैल्शियम के व्यवहार को बहाल कर सकती हैं और कैल्शियम बफर23 की एकाग्रता की गणना कर सकती हैं।

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Discussion

सीए2 + संवेदनशील डाई को तंत्रिका स्टंप के माध्यम से माउस तंत्रिका अंत में लोड करने और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके तेजी से कैल्शियम क्षणिक पंजीकृत करने की विधि इस लेख में प्रस्तुत की गई है। इस लोडिंग विधि के कार्यान्वयन के परिणामस्वरूप, तंत्रिका स्टंप के करीब स्थित अधिकांश सिनैप्स में मोटर तंत्रिका की कम आवृत्ति उत्तेजना के जवाब में तंत्रिका अंत में कैल्शियम के प्रवेश के पंजीकरण को सक्षम करने के लिए प्रतिदीप्ति का पर्याप्त स्तर था।

स्टंप के माध्यम से कैल्शियम रंगों को लोड करने के लिए पहले प्रस्तुत प्रोटोकॉल के विपरीत, यह प्रोटोकॉल स्तनधारी सिनैप्स पर उपयोग के लिए डिज़ाइन किया गया है। ठंडे खून वाले जानवरों की तैयारी में उपयोग किए जाने वाले पिछले प्रोटोकॉल को रात भर इनक्यूबेशन43 की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में, डाई के साथ आवश्यक इनक्यूबेशन केवल 2 घंटे है। काटने के बाद बने तंत्रिका खंड की लंबाई के आधार पर, डाई लोडिंग की गति, और लोड किए गए टर्मिनलों की संख्या भिन्न हो सकती है। छोटे तंत्रिका स्टंप के लिए डाई समाधान में इनक्यूबेशन समय को और भी कम करना संभव था। फ्लाई सिनैप्स18,19 के लोडिंग के लिए एक समान विधि का वर्णन किया गया है। इसके अलावा, मांसपेशियों का इनक्यूबेशन कमरे के तापमान से ऊपर तापमान में मामूली वृद्धि के साथ किया गया था, जो तंत्रिका के साथ डाई के प्रसार में सुधार करता है। इस प्रकार इसने इनक्यूबेशन समय को कम करने में मदद की और इसलिए, वर्तमान डाई लोडिंग विधि का उपयोग स्तनधारियों के सिनैप्स लोड करने के लिए किया जा सकता है जो लंबे समय तक ऊष्मायन को सहन नहीं करते हैं। अध्ययन के लिए उचित तैयारी चुनना महत्वपूर्ण है। लाल मांसपेशी इस विधि के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, क्योंकि सिनैप्टिक टर्मिनलों के करीब एक तंत्रिका स्टंप को काटना संभव है। अन्य पतली मांसपेशियां भी इस तरह के आवेदन के लिए उपयुक्त हो सकती हैं57. इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक यह है कि तंत्रिका स्टंप को तंत्रिका काटने के बाद पहले कुछ मिनटों में डाई युक्त समाधान में रखा जाना चाहिए। चूंकि तंत्रिका की लंबाई कम है, इसलिए उत्तेजना के लिए चूषण इलेक्ट्रोड के एक विशिष्ट डिजाइन का उपयोग किया जाना चाहिए। इस शोध में, ग्लास और प्लास्टिक इलेक्ट्रोड दोनों का उपयोग किया गया था, जिसका व्यास तंत्रिका खंड के साथ तुलनीय था।

कैल्शियम ट्रांजिएंट प्राप्त करना विशेष उपकरणों का उपयोग करके किया जाना चाहिए। मोटर तंत्रिका की आवृत्ति उत्तेजना के जवाब में कैल्शियम के स्तर में लंबे समय तक चलने वाले परिवर्तनों की रिकॉर्डिंग के लिए नियमित कैमरों या एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है। जबकि कैल्शियम ट्रांजिएंट्स का पंजीकरण तंत्रिका की कम आवृत्ति उत्तेजना के जवाब में है, संवेदनशील कैमरों की आवश्यकता होती है जब डाई से सिग्नल कम तीव्रता और उच्च गति11 होता है। फोटोडायोड से युक्त अत्यधिक संवेदनशील सीसीडी कैमरे या मैट्रिक्स मुख्य रूप से इन तेज प्रक्रियाओं को पंजीकृत करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। हालांकि, उच्च संवेदनशीलता और गति वाले कैमरों में कम रिज़ॉल्यूशन होता है। यदि उच्च-रिज़ॉल्यूशन पंजीकरण की आवश्यकता होती है, तो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी विधियां अधिक उपयुक्त हैं। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में, फोटोमल्टीप्लायर का उपयोग प्रतिदीप्ति को पंजीकृत करने के लिए किया जाता है, और हाल ही में, हाइब्रिड डिटेक्टरों का उपयोग किया गया था। सीसीडी कैमरों की तुलना में उनके पास बहुत अधिक संवेदनशीलता है और कमजोर प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं। लेकिन एलएससीएम का मुख्य नुकसान स्थानिक छवि बनाते समय कम स्कैनिंग गति है। इस अध्ययन में, कैल्शियम क्षणिक को रिकॉर्ड करने के लिए, मूल पंजीकरण विधि का उपयोग एलएससीएम के माध्यम से किया गया था, जिसे मेंढक37 के सिनैप्स से संबंधित अर्खिपोव एट अल द्वारा लेख में अच्छी तरह से वर्णित किया गया है। इस पद्धति का उपयोग करके, लम्बी मेंढक सिनैप्स37 में कैल्शियम क्षणिक के समीपस्थ-डिस्टल ढाल का अनुमान लगाना संभव था। पंजीकरण की यह विधि उत्तेजनीय कोशिकाओं में उपकोशिकीय कैल्शियम गतिशीलता का आकलन करने के लिए उपयोगी हो सकती है, उदाहरण के लिए, मस्तिष्क स्लाइस तैयारी में डेंड्राइट्स और रीढ़ की हड्डी में। वर्तमान अध्ययन में, इसे स्तनधारी सिनैप्स पर लागू किया गया था। इसने कैल्शियम क्षणिक के मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए संकेतों के 2 एमएस नमूने के साथ कॉन्फोकल वीडियो छवियों को प्राप्त करने की अनुमति दी।

वर्णित विधि फ्लोरोसेंट संकेतों से संबंधित है, जो बाहरी उत्तेजना से ट्रिगर होती है और उत्तेजना आने से पहले एक निश्चित देरी होती है। उत्तेजक पर देरी को अलग करने से सिग्नल स्टार्ट के बिंदु को बदलना और एलएससीएम द्वारा स्थानांतरित सिग्नल को पंजीकृत करना संभव हो जाता है। फिर, पहले वर्णित एल्गोरिथ्म के अनुसार व्युत्क्रम कन्वोल्यूशन का उपयोग करके, एक उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन के साथ मूल सिग्नल बहाल किया जाता है। वर्तमान विधि की सीमाओं में से एक यह है कि मूल संकेतों में मापदंडों में थोड़ी परिवर्तनशीलता होनी चाहिए और अच्छी प्रजनन क्षमता होनी चाहिए। विधि को लागू करने के लिए, कन्वोल्यूशन के लिए पर्याप्त डेटा प्राप्त करने के लिए कई स्कैन करने की आवश्यकता होती है। विचार किए गए मामले में, प्रत्येक 20 फ्रेम के साथ 26 परीक्षण, अर्थात, कुल 520 फ्रेम दर्ज किए गए थे। इमेजिंग की अवधि और परीक्षणों की संख्या आवश्यक समय संकल्प और सिग्नल अवधि पर निर्भर करती है। इसलिए, इमेजिंग के दौरान तैयारी की फोकस स्थिति स्थिरता की आवश्यकता होती है। प्रस्तावित विधि द्वारा सिग्नल रिकवरी की सटीकता ज्यादातर आरओआई के आकार से निर्धारित होती है। आरओआई आकार जितना छोटा होता है, स्कैन करने में उतना ही कम समय लगता है और आवश्यक अस्थायी रिज़ॉल्यूशन37 के साथ सिग्नल रिकवरी के दौरान कम त्रुटियां होती हैं।

इस अध्ययन ने स्तनधारियों के परिधीय सिनैप्स में फ्लोरोसेंट रंगों को लोड करने के लिए एक विधि और एक कॉन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के माध्यम से तेजी से फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए एक विधि प्रस्तुत की। वर्णित विधि का उपयोग करके, अच्छे स्थानिक और लौकिक रिज़ॉल्यूशन के साथ एक संकेत पंजीकृत करना संभव था। कैल्शियम ट्रांजिएंट्स का पंजीकरण सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने में एक शक्तिशाली उपकरण है, जैसे न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी54,55 का विनियमन।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम का प्रतिदीप्ति अध्ययन रूसी विज्ञान फाउंडेशन अनुदान (परियोजना संख्या 19-15-00329) की वित्तीय सहायता के साथ किया गया था। विधि को एफआरसी कज़ान वैज्ञानिक केंद्र के लिए सरकारी असाइनमेंट से वित्तपोषण के तहत विकसित किया गया था आरएएस-ओ 18-118022790083-9। अनुसंधान को संघीय अनुसंधान केंद्र "आरएएस के कज़ान वैज्ञानिक केंद्र" के उपकरणों के उपयोग के साथ विकसित किया गया था। लेखक इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ विक्टर आई इलिन को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capillary Glass Clark Electromedical instruments, UK GC150-10
Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP Leica Microsystems , Heidelberg, Germany
Flaming/Brown Micropipette Puller P 97 Sutter Instrument, USA P-97
Flow regulator KD Medical GmbH Hospital Products, Germany KD REG Disposable infusion set with Flow regulator
HEPES Sigma-Aldrich, USA H0887 100mL
Illumination system Leica CLS 150X Leica Microsystems, Germany
ImageJ National Institutes of Health, USA http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Las AF software Leica Microsystems, Heidelberg, Germany
Las X software Leica Microsystems, Heidelberg, Germany https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Magnetic Holder with Suction Tubing BIOSCIENCE TOOLS, USA MTH-S
Microspin FV 2400 Biosan, Latvia BS-010201-AAA
Minutien Pins Fine science tools, Canada 26002-20
Multi-spin MSC 3000 Biosan, Latvia BS-010205-AAN
Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt Molecular Probes, USA O6806 500 μg
Pipette Biohit, Russia 720210 0.5-10 µL
Pipette tip Biohit, Russia 781349 10 µL
Plasticine local producer
Single-use hypodermic needles Bbraun 100 Sterican 0.4×40 mm
Spreadsheet program Microsoft, USA Microsoft Office Excel
Stereomicroscope, Leica M80 Leica Microsystems , Germany
Suction electrode Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal. - 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16. http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/
Sylgard 184 elastomer Dow Corning, USA
Syringe local producer 0.5 mL
Syringe local producer 60 mL

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तंत्रिका विज्ञान अंक 178
कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उच्च अस्थायी संकल्प के साथ माउस न्यूरोमस्कुलर जंक्शन में कैल्शियम ट्रांजिएंट्स का पंजीकरण
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Zhilyakov, N. V., Arkhipov, A. Y.,… More

Zhilyakov, N. V., Arkhipov, A. Y., Khaziev, E. F., Mukhamedyarov, M. A., Samigullin, D. V. Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63308, doi:10.3791/63308 (2021).

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