Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Enregistrement des transitoires calciques dans la jonction neuromusculaire de souris à haute résolution temporelle par microscopie confocale

Published: December 1, 2021 doi: 10.3791/63308
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2
1Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, FRC Kazan Scientific Center of RAS, 2Department of Radiophotonics and Microwave Technologies, Kazan National Research Technical University named after A.N. Tupolev, 3Department of Normal Physiology, Kazan State Medical University

Summary

Le protocole décrit la méthode de chargement d’un colorant calcique fluorescent à travers le nerf coupé dans les terminaisons nerveuses motrices de souris. En outre, une méthode unique d’enregistrement rapide des transitoires de calcium dans les terminaisons nerveuses périphériques à l’aide de la microscopie confocale est présentée.

Abstract

L’estimation du taux de calcium présynaptique est une tâche clé dans l’étude de la transmission synaptique, car l’entrée de calcium dans la cellule présynaptique déclenche une cascade d’événements conduisant à la libération de neurotransmetteurs. De plus, les changements dans les niveaux de calcium présynaptique médient l’activité de nombreuses protéines intracellulaires et jouent un rôle important dans la plasticité synaptique. L’étude de la signalisation du calcium est également importante pour trouver des moyens de traiter les maladies neurodégénératives. La jonction neuromusculaire est un modèle approprié pour étudier la plasticité synaptique, car elle n’a qu’un seul type de neurotransmetteur. Cet article décrit la méthode de chargement d’un colorant sensible au calcium à travers le faisceau nerveux coupé dans les terminaisons nerveuses motrices des souris. Cette méthode permet l’estimation de tous les paramètres liés aux changements intracellulaires du calcium, tels que le taux de calcium basal et le calcium transitoire. Étant donné que l’afflux de calcium de l’extérieur de la cellule dans les terminaisons nerveuses et sa liaison / déliaison au colorant sensible au calcium se produisent dans un délai de quelques millisecondes, un système d’imagerie rapide est nécessaire pour enregistrer ces événements. En effet, les caméras à haute vitesse sont couramment utilisées pour l’enregistrement des changements rapides du calcium, mais elles ont des paramètres de faible résolution d’image. Le protocole présenté ici pour l’enregistrement transitoire du calcium permet une très bonne résolution spatio-temporelle fournie par la microscopie confocale.

Introduction

Le problème de la mesure des ondes de calcium rapides dans les cellules excitables est l’un des aspects les plus importants et les plus difficiles de l’étude de la transmission du signal dans les systèmes nerveux central et périphérique. Les ions calcium jouent un rôle important dans le déclenchement de la libération de neurotransmetteurs, la plasticité synaptique et la modulation de l’activité de diverses protéines intracellulaires 1,2,3,4,5. L’étude de la signalisation du calcium est également importante pour trouver des moyens de traiter les maladies neurodégénératives6. Pour mesurer les changements dans les niveaux de calcium, des colorants fluorescents sensibles au calcium sont couramment utilisés, et les changements dans leur niveau de fluorescence sont analysés 7,8,9.

Le chargement des colorants calciques dans les cellules peut être réalisé de différentes manières. Principalement, les colorants perméables aux cellules sont utilisés10,11. Cependant, dans un tel cas, il est non seulement difficile de contrôler la concentration d’un colorant à l’intérieur de la cellule, mais il est également difficile de sélectionner les cellules cibles pour le chargement. Cette méthode n’est pas applicable à l’étude des terminaisons nerveuses périphériques puisque le colorant pénètre dans les cellules postsynaptiques. Au lieu de cela, les colorants imperméables cellulaires conviennent mieux à de telles préparations. Dans ce cas, les colorants sont délivrés aux cellules par micro-injection ou par une pipette patch12,13,14. Il existe également une méthode de chargement à travers un moignon nerveux. Cette dernière méthode est la plus appropriée pour les préparations de jonction neuromusculaire 15,16,17,18,19,20. Il permet d’effectuer des colorations uniquement pour les cellules d’intérêt. Bien que cette méthode ne fournisse pas une évaluation précise de la concentration du colorant dans la cellule cible, la concentration peut être estimée approximativement en comparant le niveau de fluorescence des cellules au repos dans des solutions avec une concentration connue de calcium21. Dans cette étude, une modification de cette méthode appliquée aux synapses des mammifères est présentée.

L’entrée du calcium pendant la phase dépolarisante du potentiel d’action est un processus rapide, en particulier dans la jonction neuromusculaire; Par conséquent, pour son enregistrement, un équipement approprié est nécessaire1. Une étude récente utilisant un colorant fluorescent sensible à la tension a démontré que la durée du potentiel d’action dans la synapse périphérique d’une souris est d’environ 300 μs22. Le calcium transitoire, évalué à l’aide de colorants sensibles au calcium dans les synapses périphériques de la grenouille, a une durée plus longue: le temps de montée est d’environ 2-6 ms et le temps de désintégration est d’environ 30-90 ms, selon le colorant calcique utilisé23,24. Pour mesurer des processus rapides à l’aide de colorants fluorescents, des caméras CCD ou CMOS sont généralement utilisées, avec des matrices CCD rapides et sensibles. Cependant, ces caméras présentent l’inconvénient d’une faible résolution, limitée par la taille des éléments sensibles de la matrice25,26,27,28. Les caméras les plus rapides avec une sensibilité suffisante pour enregistrer à la fois les potentiels d’action et les transitoires de calcium en réponse à la stimulation à basse fréquence des cellules ont une fréquence de balayage de 2 000 Hz et une matrice d’une dimension de 80 x 8029. Pour obtenir des signaux avec une résolution spatiale plus élevée, la microscopie confocale est utilisée, surtout s’il est nécessaire d’évaluer certains changements volumétriques dans le signal30,31,32. Mais il faut garder à l’esprit que la microscopie confocale a une vitesse de balayage élevée en mode balayage linéaire, mais il existe encore des limitations importantes à la vitesse d’enregistrement des processus rapides lors de la construction d’une image spatiale33. Il existe des microscopes confocaux basés sur des disques de Nipkow rotatifs (microscopie à balayage à fente) et des scanners multipoints, qui ont une vitesse de balayage plus élevée. En même temps, ils sont inférieurs aux microscopes confocaux classiques dans le filtrage d’images confocales (diaphonie de trous d’épingle pour les microscopes avec un disque de Nipkow)32,34,35. L’imagerie confocale avec balayage par résonance peut également fournir une résolution spatio-temporelle élevée requise pour des mesures temporelles élevées36. Toutefois, il faut tenir compte du fait que l’enregistrement de faibles réponses fluorescentes à une vitesse de balayage élevée lors de l’utilisation de scanners à résonance nécessite des détecteurs très sensibles tels que les détecteurs hybrides36.

Cet article présente une méthode permettant d’augmenter la résolution temporelle des signaux enregistrés avec la microscopie confocale à balayage laser (LSCM) tout en maintenant la résolution spatiale37. La méthode actuelle est un développement ultérieur des méthodes décrites précédemment et transférées à la plate-forme LSCM38,39,40. Cette approche ne nécessite pas de modifications du matériel du microscope et est basée sur l’application d’un algorithme pour enregistrer des signaux fluorescents évoqués périodiquement avec un décalage temporel par rapport au moment de la stimulation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Des expériences ont été réalisées sur des préparations isolées de muscles nerveux de releveur auris longus (m. LAL) provenant de souris BALB/C (20-23 g, 2-3 mois)41. Les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux directives pour l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université fédérale de Kazan et de l’Université médicale de Kazan, conformément au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le protocole expérimental répondait aux exigences de la directive 86/609/CEE du Conseil des Communautés européennes et a été approuvé par le Comité d’éthique de l’Université médicale de Kazan.

1. Préparation des solutions Ringer’s et Filing

  1. Préparer la solution de Ringer pour le muscle de mammifère en mélangeant les ingrédients suivants: NaCl (137 mM), KCl (5 mM), CaCl 2 (2 mM), MgCl 2 (1 mM), NaH2 PO4 (1 mM), NaHCO3 (11,9 mM) et glucose (11 mM). Faire des bulles à travers la solution avec 95%d’O2 et 5% de CO 2 et ajuster son pH à 7,2-7,4 en ajoutant HCl/NaOH si nécessaire.
  2. Préparez la solution de chargement du colorant.
    1. Préparer la solution HEPES (10 mM) avec un pH compris entre 7,2 et 7,4. 500 μg de colorant commercial sont fournis dans un flacon de 500 μL. Dissoudre le colorant dans 14 μL de la solution HEPES pour obtenir une concentration de colorant de 30 mM. Bien agiter et centrifuger jusqu’à dissolution totale.
    2. Diluer la solution de l’indicateur Ca2+ avec la solution HEPES jusqu’à 1 mM de concentration. Conserver au congélateur (-20 °C) et éviter l’exposition à la lumière.

2. Procédure de chargement du colorant

NOTE: La procédure de chargement du colorant est effectuée conformément au protocole de chargement à travers le moignon nerveux, adapté des protocoles précédemment publiés 19,42,43,44,45,46.

  1. Disséquer le muscle LAL selon la procédure de dissection pour cette préparation telle que décrite dans les protocoles précédemment publiés47,48.
    1. Fixez le tissu légèrement étiré (pas plus de 30% de la longueur initiale) dans la boîte de Petri recouverte d’élastomère avec de fines broches en acier inoxydable et ajoutez la solution de Ringer jusqu’à ce que le muscle soit complètement couvert.
      REMARQUE : La boîte de Petri a été préremplie d’élastomère conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
  2. Préparer la pipette de remplissage
    1. À l’aide d’un extracteur de micropipette (voir le tableau des matériaux), préparez une micropipette avec une pointe fine qui est aussi tranchante que possible pour les enregistrements intracellulaires. Utilisez des capillaires sans filaments internes (1,5 mm de diamètre extérieur et 0,86 ou 1,10 mm de diamètre intérieur).
    2. Détacher l’embout de la micropipette après avoir entaillé la conicité avec un abrasif, en laissant l’embout ouvert à environ 100 μm de diamètre. Polir la pointe vers le bas pour limiter le moment où le diamètre intérieur passe de >80 μm à 12-13 μm. Fixez un tube en silicone d’un côté de la pipette de remplissage et une seringue (sans aiguille) de l’autre côté.
  3. Sous un stéréomicroscope, trouvez l’endroit où le tronc nerveux se transforme en branches nerveuses séparées. Placez la pipette de remplissage avec le tube monté et la seringue sur la boîte de Petri à l’aide de cire. Déplacez l’embout de la pipette jusqu’à ce qu’il se trouve au-dessus du nerf.
  4. Avec de fins ciseaux, coupez le nerf près de la fibre musculaire, en laissant un petit morceau du moignon nerveux d’environ 1 mm de long. Aspirez doucement le moignon nerveux avec une solution de Ringer, sans le pincer, dans l’extrémité de la pipette de remplissage. Retirez le tube en silicone de la pipette de remplissage.
  5. Prélever une certaine quantité de la solution de chargement de colorant (~0,3 μL) à l’aide d’une seringue avec un long filament. Ce volume correspond à environ 3 cm du filament.
    REMARQUE: Dans un premier temps, il est nécessaire de fabriquer un filament à partir d’une pointe de pipette d’un volume de 10 μL en tirant sur le feu à l’aide d’une lampe à alcool ou d’un brûleur à gaz.
  6. Insérez délicatement l’embout du filament avec la solution de chargement dans la pipette de remplissage. Relâchez le mélange directement sur le moignon nerveux. Incuber la préparation à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 min.
  7. Après cela, rincer la préparation avec la solution fraîche de Ringer et incuber à 25 °C jusqu’à 2 heures dans un bécher en verre avec 50 ml (ou plus) de solution de Ringer (la préparation doit être recouverte de la solution). Pendant ce temps, le colorant atteindra les synapses.

3. Capture vidéo avec microscopie confocale

REMARQUE : L’enregistrement des transitoires calciques est effectué à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (LSCM) (voir le tableau des matériaux). Pour enregistrer les transitoires rapides de calcium, un protocole original permettant d’enregistrer des signaux avec une résolution spatiale et temporelle suffisante a été utilisé. La méthode a été décrite en détail dans la publication d’Arkhipov et al37. Le microscope était équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau 20x (1,00 NA). La raie laser de 488 nm a été atténuée à une intensité de 10% et la fluorescence d’émission a été recueillie de 503 à 558 nm.

  1. Montez la préparation dans la chambre expérimentale revêtue d’élastomère de silicium et fixez-la, légèrement étirée, avec un jeu de micro-aiguilles en acier. Rincer abondamment la préparation avec la solution de Ringer.
    REMARQUE : Une simple chambre expérimentale de perfusion sur mesure en verre organique avec le fond de la chambre recouvert d’un élastomère (préparé conformément aux instructions du fabricant; voir le tableau des matériaux) a été utilisée. La chambre dispose d’un tube d’alimentation en solution. La solution est pompée à l’aide d’une aiguille de seringue, montée sur un support magnétique (voir le tableau des matériaux). En tant que chambre expérimentale, une boîte de Petri pourrait être utilisée (comme celle utilisée pour l’incubation de la préparation) mais avec des tubes d’alimentation et d’aspiration attachés.
  2. Installez une électrode d’aspiration qui sera utilisée pour stimuler le nerf.
    REMARQUE: La construction de l’électrode est similaire à ce qui a été publié dans l’article de 2015 par Kazakov et al49. Placez et fixez l’électrode en l’épilant à côté du bain. Déplacez l’embout près du moignon nerveux et aspirez-le dans l’électrode.
  3. Montez la chambre de préparation sur l’étage du microscope et placez les raccords d’entrée et de sortie dans la chambre.
  4. Pour effectuer la préparation, utilisez un système simple entraîné par gravité. Allumez la pompe d’aspiration de perfusion pour retirer l’excès de solution.
  5. Branchez l’électrode d’aspiration stimulante dans un stimulateur électrique et assurez-vous que les contractions musculaires se produisent après les stimuli. Voir rubrique 3.9-3.12 pour les conditions de stimulation et l’enregistrement.
  6. Remplissez le système de perfusion avec la solution de Ringer avec de la d-tubocurarine (10 μM).
    REMARQUE: Cette solution aide à prévenir les contractions musculaires. Des inhibiteurs spécifiques de la D-tubocurarine ou de l’alpha-bungarotoxine des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine sur la membrane postsynaptique bloqueraient complètement ou partiellement les contractions musculaires50. En outre, pour prévenir les contractions musculaires, des bloqueurs spécifiques des canaux sodiques postsynaptiques tels que la μ-conotoxine GIIIB pourraient être utilisés51.
  7. Allumez la pompe d’aspiration de perfusion et démarrez la perfusion de la préparation avec la solution de Ringer contenant de la d-tubocurarine.
  8. Définissez les paramètres d’imagerie dans le logiciel LSCM comme suit.
    1. Dans le logiciel LSCM (LAS AF; voir Tableau des matériaux), choisissez Électrophysiologie.
      REMARQUE: Dans ce mode, lorsqu’une image est capturée au point temporel, une impulsion de synchronisation est envoyée au stimulateur à l’aide de la boîte de déclenchement. Cela permet de générer un potentiel d’action dans la préparation (Figure 1; unité de stimulation).
    2. Sélectionnez Mode d’acquisition. Pour déclencher le stimulateur à l’aide de l’impulsion de synchronisation du microscope, dans les paramètres du menu Tâche , sélectionnez les paramètres de déclenchement . Définissez le champ Trigger Out On Frame sur le canal out1 .
    3. Utilisez les paramètres suivants: Mode de numérisation: XYT, Fréquence de balayage: 1400 Hz, Facteur de zoom: 6.1, Trou d’épingle: complètement ouvert. Assurez-vous que le mode X bidirectionnel transdirectionnel séquentiel est activé.
    4. Définissez le temps minimum pour former une image à 52 ms et les images à collecter dans une vidéo brute à 20 images.
      REMARQUE: Ces paramètres permettent la capture d’image avec une résolution de 128 x 128 pixels tout en prenant une seule image toutes les 52 ms.
    5. Réglez la longueur d’onde d’excitation du laser argon à 488 nm avec 8% de puissance de sortie.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de la configuration expérimentale. 1. Microscope confocal à balayage laser (LSCM). 2. Module de synchronisation de LSCM (boîte de déclenchement). 3. Stimulateur. 4. Unité d’isolement. 5. L’échantillon biologique. 6. Électrode d’aspiration pour la stimulation électrique du nerf. 7. Systèmes de perfusion (7a: réservoir de perfusat, 7b: compte-gouttes, 7c: régulateur de débit, 7d: flacon à vide). Les flèches pointent vers la direction de propagation de l’impulsion de synchronisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Appuyez sur le bouton Mode Live pour passer en mode Live , ce qui permet d’obtenir un aperçu des bornes nerveuses chargées avec le colorant.

Figure 2
Figure 2 : Nerf et bornes de souris chargés avec l’indicateur Ca2+. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Unité de stimulation
    NOTE: Dans ce travail, le stimulateur décrit dans l’article de Land et al.52 a été utilisé. Cet appareil permet de régler les paramètres temporels de stimulation via le logiciel MatLab.
    1. Créez un nouveau fichier, collez le code de l’article mentionné ci-dessus dans la fenêtre de code MatLab et enregistrez le fichier. Cliquez sur Exécuter, de sorte qu’une fenêtre avec les paramètres de stimulation apparaît. Définissez le délai et la durée du stimulus.
      NOTE: Le délai détermine la résolution temporelle du signal fluorescent reconstitué. L’impulsion électrique d’une durée de 0,2 ms est retardée, puis envoyée à l’unité d’isolement. Ce dernier forme l’amplitude et la polarité de l’impulsion stimulante et isole électriquement l’objet biologique de l’appareil d’enregistrement.
    2. Pour stimuler le nerf, sélectionnez l’amplitude supramaximale de l’impulsion stimulante (25% à 50% supérieure à l’intensité de stimulation maximale nécessaire pour activer toutes les fibres nerveuses).
      REMARQUE: La méthode présentée est basée sur un algorithme spécial pour les enregistrements de signaux fluorescents rapides uniques utilisant LSCM avec le balayage minimisé. À chaque étape de l’algorithme développé, le signal fluorescent enregistré est décalé par rapport au précédent par un intervalle de temps plus court que le balayage du microscope. La valeur des décalages temporels détermine la résolution temporelle du signal requis. Le nombre d’étapes (décalages) dans l’algorithme dépend de la résolution temporelle requise et de la résolution temporelle d’origine. Avec cette méthode d’enregistrement, la stimulation de la préparation est effectuée avec une fréquence de 0,25 Hz.
  2. En mode Live, recherchez le retour sur investissement et obtenez la meilleure mise au point. Exécutez le logiciel d’acquisition de données.
  3. Déplacez le délai sur le stimulateur de 2 ms de moins par rapport à la valeur précédente et exécutez le logiciel d’acquisition de données.
  4. Répétez l’étape 3.11 26 fois pour acquérir 26 séquences, chaque séquence étant décalée de 2 ms par rapport à la précédente.

4. Traitement vidéo

NOTE: Une série d’images vidéo acquises par le microscope confocal est exportée au format TIFF avec le logiciel libre LAS X (voir Tableau des matériaux). Cette série a été divisée en cadres et exportée dans un dossier. Pour générer la séquence d’images avec une résolution temporelle plus élevée, le logiciel ImageJ, qui dispose d’un code initial ouvert pour l’analyse et le traitement des données, a été utilisé. L’algorithme de traitement des signaux est représenté schématiquement à la figure 3.

Figure 3
Figure 3 : Schéma de compilation d’un fichier vidéo haute résolution (2 ms sur image) à partir de fichiers vidéo originaux avec une faible résolution temporelle (52 ms sur image). Les fichiers vidéo originaux et les signaux correspondants sont colorés en noir, magenta et vert. Le fichier vidéo compilé et le signal résultant sont colorés en rouge. Le schéma de droite, ligne par ligne, montre les images vidéo obtenues avec un microscope confocal. À gauche, les signaux de fluorescence correspondants changent par rapport au retour sur investissement sélectionné. La ligne supérieure est formée image par image à partir des images reçues selon le schéma. Le résultat est une image vidéo composée de l’ensemble du tableau d’images de sorte qu’il y a un délai de 2 ms entre les images au lieu de 52 ms. Chaque ligne correspond à un décalage du signal de stimulation par (n - 1) * t, où t est le décalage temporel (2 ms) et n est le nombre d’itérations de décalage. k indique le nombre d’images dans les fichiers vidéo originaux (lignes 2-4) et dépend de la durée du signal enregistré. Dans ce cas, pour enregistrer un signal d’une durée de 1 s, il est nécessaire de sélectionner k = 20 (52 ms * 20 = 1040 ms). t0 est le délai requis avant la stimulation. Pour calculer le nombre d’itérations de décalage n, la résolution temporelle initiale entre les images (52 ms) doit être divisée par la résolution temporelle requise (2 ms). Dans ce cas, n = 26, ce qui correspond à 26 balayages enregistrés. À la suite des manipulations effectuées, une image vidéo composée de n * k = 520 images est obtenue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Exécutez le logiciel LAS X. Ouvrez le projet qui a été créé lors de l’exécution de l’expérience. Cliquez sur Exporter, puis sur Enregistrer sous pour enregistrer les images au format .tiff dans le dossier de destination.
  2. Exécutez le logiciel ImageJ. Cliquez sur Fichier > Importer > séquence d’images.
  3. Dans la fenêtre Ouvrir la séquence d’images , choisissez le dossier de destination et ouvrez la première image.
  4. Dans la fenêtre Options de séquence, dans le champ Image de départ, définissez le numéro d’image sur 1 pour la première image. Dans le champ Incrément, définissez la valeur égale au nombre d’images dans l’enregistrement initial du signal (20 pour le cas présent) et cliquez sur OK.
  5. Pour enregistrer le fichier généré des premières images assemblées dans un dossier séparé, cliquez sur Fichier > Enregistrer > dossier.
  6. Répétez les étapes 4.3 à 4.5 pour les 19 images suivantes. Dans la fenêtre Options de séquence , définissez le numéro d’image correspondant dans le champ Image de départ .
  7. Pour générer la vidéo haute résolution complète, assemblez toutes les images. Pour ce faire, cliquez sur Fichier > Importer > séquence d’images et sélectionnez 1 dans les champs Image de départ et Incrément . Le résultat sera la vidéo finale avec une résolution temporelle accrue. Enregistrez le fichier dans .tiff ou tout autre format approprié.

5. Analyse vidéo

REMARQUE: Dans ImageJ, sélectionnez ROI et arrière-plan. Soustrayez l’arrière-plan du retour sur investissement. Les données sont représentées par le rapport, (ΔF / F 0 - 1) * 100%, où F0 est l’intensité de la fluorescence au repos et ΔF est l’intensité de la fluorescence pendant la stimulation.

  1. Cliquez sur Image > Stacks > Tools > Stack Sorter. Ensuite, cliquez sur Outils d’analyse > > Gestionnaire de retour sur investissement.
  2. Faites glisser et déposez le fichier .tiff enregistré à l’étape 4.7 dans la fenêtre ImageJ. Agrandissez l’image pour une meilleure vue. Pour améliorer la visualisation de l’image, cliquez sur Image > Ajuster > Luminosité/Contraste > Auto. Cette étape n’affectera pas les données.
  3. Placez l’arrière-plan près de la terminaison nerveuse en dessinant le retour sur investissement. Ajoutez-le au gestionnaire de retour sur investissement. Calculez l’arrière-plan en cliquant sur Plus > Multi Mesure. Copiez les valeurs moyennes, collez-les dans le tableur et calculez la moyenne.
  4. Soustrayez la valeur moyenne calculée des piles en cliquant sur Traiter > Principal > Soustraire. Entrez la valeur.
  5. Dessinez le ROI autour d’une terminaison nerveuse via une ligne polygonale. Ajoutez-le au gestionnaire de retour sur investissement.
  6. Mesurer l’intensité de la terminaison nerveuse : Cliquez sur Plus > Multi Mesure. Copiez les valeurs moyennes et collez-les dans le tableur.
  7. Calculez le décalage moyen des signaux.
    REMARQUE: Utilisez les points correspondants en fonction du délai avant la stimulation. Cette étape établit la valeur F0 qui sera utilisée dans les calculs ultérieurs.
  8. Divisez les valeurs du signal par la valeur de décalage moyenne.
    REMARQUE: Après cette étape, le signal ne contient pas la contribution du fond et de la fluorescence brute aux valeurs d’amplitude pour le retour sur investissement sélectionné.
  9. Soustrayez 1 des valeurs obtenues à l’étape 5.8, puis multipliez par 100 %.
  10. Tracez un graphique de Ca2+- transitoire et calculez l’amplitude.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Après chargement de la préparation avec un colorant selon la technique présentée, la plupart des synapses situées à proximité du moignon nerveux présentaient un niveau de fluorescence suffisant (voir Figure 2). Après chargement de la préparation avec le colorant et application de la méthode décrite d’enregistrement et de traitement de l’image, on a obtenu des transitoires calciques avec la résolution spatiale et temporelle souhaitée (voir figure 4). Le calcium transitoire a été récupéré par la méthode proposée (voir la figure 3).

Les paramètres d’amplitude et de temps des signaux récupérés ont également été analysés. Les données moyennes sont présentées au tableau 1.

Figure 4
Figure 4 : Trace représentative du signal calcique d’une expérience. Certains paramètres importants du signal, tels que l’amplitude moyenne (MA), le temps de montée (RT) et le temps de désintégration (DecT) et ses projections sur les axes sont indiqués. L’AM est calculée en faisant la moyenne des points au sommet, colorés en vert. RT est le temps nécessaire pour que l’amplitude passe de 20% à 80%, ce qui est calculé comme la différence entre les projections sur l’axe des x colorées en bleu. DecT est le temps sur lequel l’amplitude diminue de e fois, qui est calculé comme la différence entre les projections sur l’axe des x colorées en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Crête ΔF/F (%) Temps de montée 20%-80% (ms) τ (ms)
27,0±4,6 (n=5) 6,8±0,48 (n=5) 456±53(n=5)

Tableau 1 : Les paramètres moyens du transitoire Ca2+ . Les données sont présentées sous forme de moyenne ± s.e.m., et n est le nombre de mesures dans les différentes jonctions nerf-muscle. Crête ΔF/F est l’amplitude moyenne de ΔF/F.

L’analyse transitoire calcique permet d’évaluer les caractéristiques amplitude-dynamique des modifications du taux de calcium présynaptique dans la terminaison nerveuse au cours du potentiel d’action11. La variation de l’amplitude du calcium transitoire est bien corrélée à la modification de la teneur quantique53. L’analyse de l’amplitude transitoire calcique est couramment utilisée pour étudier l’effet des composés physiologiquement actifs associés à la modulation des taux de calcium présynaptique sur la transmission synaptique54,55. L’évolution temporelle du calcium transitoire reflète la cinétique de liaison du calcium avec le colorant et sa dissociation23,56. Il est évident lors de l’utilisation de colorants ayant une affinité différente pour le calcium23,56. Bien que les paramètres temporels du calcium transitoire reflètent la cinétique du colorant sensible au calcium, et ne représentent pas la cinétique du calcium libre dans le terminal nerveux, les méthodes de modélisation mathématique basées sur des données expérimentales permettent de restaurer le comportement du calcium libre dans la cellule et de calculer la concentration des tampons calciques23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La méthode de chargement d’un colorant sensible au Ca2+ dans les terminaisons nerveuses de souris à travers le moignon nerveux et d’enregistrement d’un transitoire calcique rapide à l’aide d’un microscope confocal est présentée dans cet article. À la suite de la mise en œuvre de cette méthode de charge, la plupart des synapses situées près du moignon nerveux avaient un niveau de fluorescence suffisant pour permettre l’enregistrement de l’entrée du calcium dans les terminaisons nerveuses en réponse à la stimulation à basse fréquence du nerf moteur.

Contrairement aux protocoles présentés précédemment pour le chargement des colorants calciques à travers la souche, ce protocole est conçu pour être utilisé sur les synapses des mammifères. Les protocoles antérieurs utilisés dans les préparations animales à sang froid nécessitaient une incubation de nuit43. Dans ce protocole, l’incubation requise avec le colorant n’est que de 2 h. Selon la longueur du segment nerveux qui est resté après la coupe, la vitesse de chargement du colorant et le nombre de bornes chargées peuvent varier. Il a été possible de réduire encore plus le temps d’incubation en solution de colorant pour des souches nerveuses plus courtes. Une méthode similaire est décrite pour le chargement des synapses de mouches18,19. En outre, l’incubation du muscle a été réalisée avec une légère augmentation de la température au-dessus de la température ambiante, ce qui améliore la diffusion du colorant le long du nerf. Il a ainsi contribué à réduire le temps d’incubation et, par conséquent, la méthode actuelle de chargement de colorant peut être utilisée pour charger les synapses de mammifères qui ne tolèrent pas les incubations prolongées. Il est important de choisir les préparations appropriées pour l’étude. Le muscle LAL est bien adapté à cette méthode, car il est possible de couper un moignon nerveux assez près des terminaisons synaptiques. D’autres muscles fins peuvent également convenir à une telle application57. L’une des étapes les plus importantes de ce protocole est que le moignon nerveux doit être placé dans la solution contenant du colorant dans les premières minutes après la coupe du nerf. Étant donné que la longueur du nerf est courte, une conception spécifique de l’électrode d’aspiration doit être utilisée pour la stimulation. Dans cette recherche, des électrodes en verre et en plastique ont été utilisées, avec un diamètre comparable à celui du segment nerveux.

L’acquisition de transitoires de calcium doit être effectuée à l’aide d’un équipement spécial. Les enregistrements de changements durables du taux de calcium en réponse à la stimulation fréquentielle du nerf moteur nécessitent des caméras régulières ou un microscope confocal. Alors que l’enregistrement des transitoires de calcium est en réponse à la stimulation à basse fréquence du nerf, des caméras sensibles sont nécessaires lorsque le signal du colorant a une faible intensité et une vitesseélevée 11. Les caméras CCD très sensibles ou les matrices constituées de photodiodes sont principalement utilisées pour enregistrer ces processus rapides. Cependant, les caméras à sensibilité et vitesse élevées ont tendance à avoir une faible résolution. Si un enregistrement à haute résolution est requis, les méthodes de microscopie confocale sont plus appropriées. Dans les microscopes confocaux, les photomultiplicateurs sont utilisés pour enregistrer la fluorescence, et plus récemment, les détecteurs hybrides sont apparus. Ils ont une sensibilité très élevée par rapport aux caméras CCD et sont bien adaptés pour détecter une fluorescence faible. Mais le principal inconvénient de LSCM est la faible vitesse de numérisation lors de la construction d’une image spatiale. Dans cette étude, pour enregistrer le calcium transitoire, la méthode d’enregistrement originale a été utilisée via LSCM, qui est décrite en détail dans l’article d’Arkhipov et al. relatif aux synapses de la grenouille37. En utilisant cette méthode, il a été possible d’estimer le gradient proximal-distal du calcium transitoire dans les synapses allongées de grenouille37. Cette méthode d’enregistrement peut être utile pour évaluer la dynamique calcique subcellulaire dans les cellules excitables, par exemple, dans les dendrites et les épines dans les préparations de tranches de cerveau. Dans la présente étude, il a été appliqué aux synapses de mammifères. Il a permis d’obtenir des images vidéo confocales avec un échantillonnage de signaux de 2 ms pour analyser les paramètres du transitoire calcique.

La méthode décrite traite des signaux fluorescents, déclenchés par un stimulus externe et a un délai fixe avant que le stimulus ne soit venu. Faire varier le retard sur le stimulateur permet de changer le point de départ du signal et d’enregistrer le signal décalé par LSCM. Ensuite, le signal d’origine avec une résolution temporelle élevée est restauré, en utilisant la convolution inverse selon l’algorithme décrit précédemment. L’une des limites de la méthode actuelle est que les signaux originaux doivent avoir peu de variabilité dans les paramètres et avoir une bonne reproductibilité. Pour appliquer la méthode, il faut effectuer plusieurs analyses pour obtenir suffisamment de données pour la convolution. Dans le cas considéré, 26 essais de 20 trames chacun, soit 520 trames au total ont été enregistrées. La durée de l’imagerie et le nombre d’essais dépendent de la résolution temporelle et de la durée du signal requises. Ainsi, la stabilité de la position de mise au point de la préparation pendant l’imagerie est nécessaire. La précision de la récupération du signal par la méthode proposée est principalement déterminée par la taille du retour sur investissement. Plus la taille du retour sur investissement est petite, moins il faut de temps pour analyser et moins d’erreurs se produisent lors de la récupération du signal avec la résolution temporelle requise37.

Cette étude a présenté une méthode pour charger des colorants fluorescents dans les synapses périphériques de mammifères et une méthode pour enregistrer des signaux de calcium fluorescents rapides au moyen d’un microscope confocale à fluorescence. En utilisant la méthode décrite, il a été possible d’enregistrer un signal avec une bonne résolution spatiale et temporelle. L’enregistrement des transitoires calciques est un outil puissant dans l’étude des processus cellulaires, tels que la régulation de la libération de neurotransmetteurs et la plasticité synaptique54,55.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les études de fluorescence de ces travaux ont été réalisées avec le soutien financier de la subvention de la Fondation scientifique russe (projet n ° 19-15-00329). La méthode a été développée grâce au financement de la mission gouvernementale pour le FRC Kazan Scientific Center de RAS АААА-А18-118022790083-9. La recherche a été développée avec l’utilisation de l’équipement du Centre fédéral de recherche « Kazan Scientific Center of RAS ». Les auteurs tiennent à remercier le Dr Victor I. Ilyin pour la lecture critique de ce manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capillary Glass Clark Electromedical instruments, UK GC150-10
Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP Leica Microsystems , Heidelberg, Germany
Flaming/Brown Micropipette Puller P 97 Sutter Instrument, USA P-97
Flow regulator KD Medical GmbH Hospital Products, Germany KD REG Disposable infusion set with Flow regulator
HEPES Sigma-Aldrich, USA H0887 100mL
Illumination system Leica CLS 150X Leica Microsystems, Germany
ImageJ National Institutes of Health, USA http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Las AF software Leica Microsystems, Heidelberg, Germany
Las X software Leica Microsystems, Heidelberg, Germany https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Magnetic Holder with Suction Tubing BIOSCIENCE TOOLS, USA MTH-S
Microspin FV 2400 Biosan, Latvia BS-010201-AAA
Minutien Pins Fine science tools, Canada 26002-20
Multi-spin MSC 3000 Biosan, Latvia BS-010205-AAN
Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt Molecular Probes, USA O6806 500 μg
Pipette Biohit, Russia 720210 0.5-10 µL
Pipette tip Biohit, Russia 781349 10 µL
Plasticine local producer
Single-use hypodermic needles Bbraun 100 Sterican 0.4×40 mm
Spreadsheet program Microsoft, USA Microsoft Office Excel
Stereomicroscope, Leica M80 Leica Microsystems , Germany
Suction electrode Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal. - 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16. http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/
Sylgard 184 elastomer Dow Corning, USA
Syringe local producer 0.5 mL
Syringe local producer 60 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Llinas, R., Steinberg, I. Z., Walton, K. Presynaptic calcium currents and their relation to synaptic transmission: voltage clamp study in squid giant synapse and theoretical model for the calcium gate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (8), 2918-2922 (1976).
  2. Augustine, G. J. How does calcium trigger neurotransmitter release. Current Opinion in Neurobiology. 11 (3), 320-326 (2001).
  3. Burnashev, N., Rozov, A. Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy. Cell Calcium. 37 (5), 489-495 (2005).
  4. Schneggenburger, R., Neher, E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion. Current Opinion in Neurobiology. 15 (3), 266-274 (2005).
  5. Pang, Z. P., Südhof, T. C. Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 496-505 (2010).
  6. Leal, S. S., Gomes, C. M. Calcium dysregulation links ALS defective proteins and motor neuron selective vulnerability. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 225 (2015).
  7. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  8. Tsien, R. Y. Fluorescent indicators of ion concentrations. Methods in Cell Biology. 30, 127-156 (1989).
  9. Adams, S. R. How calcium indicators work. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
  10. Macleod, G. T. Topical application of indicators for calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 786-790 (2012).
  11. Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 307-314 (2005).
  12. Eilers, J., Konnerth, A. Dye loading with patch pipettes. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (4), 5201 (2009).
  13. Coleman, W. L., et al. Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals. Journal of Physiology. 586 (19), 4649-4673 (2008).
  14. Macleod, G. T. Direct injection of indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 797-801 (2012).
  15. Peng, Y. Y., Zucker, R. S. Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia. Neuron. 10 (3), 465-473 (1993).
  16. Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. α-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals. The Journal of Neuroscience. 20 (23), 8685-8692 (2000).
  17. Newman, Z., et al. Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction. The European Journal of Neuroscience. 25 (6), 1619-1630 (2007).
  18. Macleod, G. T. Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 791-796 (2012).
  19. Rossano, A. J., Macleod, G. T. Loading drosophila nerve terminals with calcium indicators. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e250 (2007).
  20. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  21. Suzuki, S., et al. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 440 (3), 351-365 (2000).
  22. Ojala, K. S., et al. A high-affinity, partial antagonist effect of 3,4-diaminopyridine mediates action potential broadening and enhancement of transmitter release at NMJs. Journal of Biological Chemistry. 296, 100302 (2021).
  23. Samigullin, D., et al. Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 29 (2015).
  24. DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 505, 585-592 (1997).
  25. Bullen, A., Patel, S. S., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: I. High-resolution optical recording with voltage-sensitive dyes and ion indicators. Biophysical Journal. 73 (1), 477-491 (1997).
  26. Bullen, A., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: II. Fast quantitative measurements with voltage-sensitive dyes. Biophysical Journal. 76 (4), 2272-2287 (1999).
  27. Bullen, A., Saggau, P. Optical recording from individual neurons in culture. Modern Techniques in Neuroscience Research. (4), 89-126 (1999).
  28. Bullen, A., Saggau, P. Indicators and optical configuration for simultaneous high-resolution recording of membrane potential and intracellular calcium using laser scanning microscopy. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 436 (5), 788-796 (1998).
  29. Redshirt Imaging. , Available from: http://www.redshirtimaging.com/redshirt_neuro/hardware_overview.htm (2021).
  30. Wilson, T. Optical aspects of confocal microscopy. Confocal Microscopy. , 93-141 (1990).
  31. Cox, G. Biological confocal microscopy. Materials Today. 5 (3), 34-41 (2002).
  32. Mukhitov, A., Arkhipova, S., Nikolsky, E. Modern Light Microscopy in Biological and Medical Research. Nauka. , Moscow. (2011).
  33. Mertz, J. Optical sectioning microscopy with planar or structured illumination. Nature Methods. 8 (10), 811-819 (2011).
  34. Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427-471 (1996).
  35. Toomre, D., Pawley, J. B. Disk-scanning confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , 221-238 (2006).
  36. Venkateswarlu, K., et al. Three-dimensional imaging and quantification of real-time cytosolic calcium oscillations in microglial cells cultured on electrospun matrices using laser scanning confocal microscopy. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3108-3123 (2020).
  37. Arkhipov, A. Y., Khaziev, E. F., Skorinkin, A. I., Bukharaeva, E. A., Samigullin, D. V. Enhancement of the temporal resolution of fluorescent signals acquired by the confocal microscope. Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 204-210 (2020).
  38. Rama, S. Shift and mean algorithm for functional imaging with high spatio-temporal resolution. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  39. Chan, K. G., Streichan, S. J., Trinh, L. A., Liebling, M. Simultaneous temporal superresolution and denoising for cardiac fluorescence microscopy. IEEE Transactions on Computational Imaging. 2 (3), 348-358 (2016).
  40. Veeraraghavan, A., Reddy, D., Raskar, R. Coded strobing photography: compressive sensing of high speed periodic videos. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 33 (4), 671-686 (2011).
  41. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neuroscience Letters. 82 (1), 83-88 (1987).
  42. Macleod, G. T. Calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (7), 758-766 (2012).
  43. Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Loading a calcium dye into frog nerve endings through the nerve stump: calcium transient registration in the frog neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e55122 (2017).
  44. Samigullin, D. V., et al. Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction. BioNanoScience. 7 (1), 162-166 (2017).
  45. Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 31 (31), 11268-11281 (2011).
  46. Luo, F., Dittrich, M., Cho, S., Stiles, J. R., Meriney, S. D. Transmitter release is evoked with low probability predominately by calcium flux through single channel openings at the frog neuromuscular junction. Journal of Neurophysiology. 113 (7), 2480-2489 (2015).
  47. Wright, M., Kim, A., Son, Y. -J. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e3124 (2011).
  48. Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator Auris Longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57482 (2018).
  49. Kazakov, A., Alexandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects. Meždunarodnyj naučno-issledovatel'skij žurnal (International Research Journal). 9 (40), 13-16 (2015).
  50. Bowman, W. C. Neuromuscular block. British Journal of Pharmacology. 147, 277-286 (2006).
  51. Hill, J. M., Alewood, P. F., Craik, D. J. Three-dimensional solution structure of µ-conotoxin GIIIB, a specific blocker of skeletal muscle sodium channels. Biochemistry. 35 (27), 8824-8835 (1996).
  52. Land, B. R., Johnson, B. R., Wyttenbach, R. A., Hoy, R. R. Tools for physiology labs: Inexpensive equipment for physiological stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 3 (1), 30-35 (2004).
  53. Samigullin, D. V., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Calcium transient and quantal release in mouse neuromuscular junction under extracellular calcium concentration change. BioNanoScience. 8 (4), 984-987 (2018).
  54. Khaziev, E., et al. acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction. Frontiers in Physiology. 7, 621 (2016).
  55. Zhilyakov, N., Arkhipov, A., Malomouzh, A., Samigullin, D. Activation of neuronal nicotinic receptors inhibits acetylcholine release in the neuromuscular junction by increasing ca2+ flux through cav1 channels. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 9031 (2021).
  56. Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Optical measurement of presynaptic calcium currents. Biophysical Journal. 74 (3), 1549-1563 (1998).
  57. McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. Journal of Neuroscience Methods. 4 (2), 109-115 (1981).

Tags

Neurosciences numéro 178
Enregistrement des transitoires calciques dans la jonction neuromusculaire de souris à haute résolution temporelle par microscopie confocale
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhilyakov, N. V., Arkhipov, A. Y.,… More

Zhilyakov, N. V., Arkhipov, A. Y., Khaziev, E. F., Mukhamedyarov, M. A., Samigullin, D. V. Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63308, doi:10.3791/63308 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter