Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Registrering af calciumtransienter i musens neuromuskulære krydsning med høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af konfokal mikroskopi

Published: December 1, 2021 doi: 10.3791/63308
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2
1Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, FRC Kazan Scientific Center of RAS, 2Department of Radiophotonics and Microwave Technologies, Kazan National Research Technical University named after A.N. Tupolev, 3Department of Normal Physiology, Kazan State Medical University

Summary

Protokollen beskriver metoden til at indlæse et fluorescerende calciumfarvestof gennem den afskårne nerve i musemotoriske nerveterminaler. Derudover præsenteres en unik metode til registrering af hurtige calciumtransienter i de perifere nerveender ved hjælp af konfokal mikroskopi.

Abstract

Estimering af det præsynaptiske calciumniveau er en nøgleopgave i at studere synaptisk transmission, da calciumindgang i den presynaptiske celle udløser en kaskade af begivenheder, der fører til frigivelse af neurotransmitter. Desuden formidler ændringer i præsynaptiske calciumniveauer aktiviteten af mange intracellulære proteiner og spiller en vigtig rolle i synaptisk plasticitet. At studere calciumsignalering er også vigtigt for at finde måder at behandle neurodegenerative sygdomme på. Det neuromuskulære kryds er en passende model til undersøgelse af synaptisk plasticitet, da den kun har en type neurotransmitter. Denne artikel beskriver metoden til at lægge et calciumfølsomt farvestof gennem det afskårne nervebundt i musenes motoriske nerveender. Denne metode gør det muligt at estimere alle parametre relateret til intracellulære calciumændringer, såsom basalkalciumniveau og calciumtransient. Da tilstrømningen af calcium fra cellens ydre til nerveterminalerne og dets binding / binding til det calciumfølsomme farvestof forekommer inden for et par millisekunder, kræves der et hurtigt billeddannelsessystem for at registrere disse hændelser. Faktisk bruges højhastighedskameraer ofte til registrering af hurtige calciumændringer, men de har parametre for lav billedopløsning. Protokollen, der præsenteres her til registrering af calciumtransient, tillader ekstremt god rumlig-tidsmæssig opløsning tilvejebragt ved konfokal mikroskopi.

Introduction

Problemet med at måle hurtige calciumbølger i excitable celler er et af de vigtigste og mest udfordrende aspekter ved at studere signaloverførsel i det centrale og perifere nervesystem. Calciumioner spiller en vigtig rolle i udløsning af frigivelse af neurotransmitter, synaptisk plasticitet og modulering af aktiviteten af forskellige intracellulære proteiner 1,2,3,4,5. At studere calciumsignalering er også vigtigt for at finde måder at behandle neurodegenerative sygdomme6. For at måle ændringer i calciumniveauerne anvendes fluorescerende calciumfølsomme farvestoffer almindeligvis, og ændringer i deres fluorescensniveau analyseres 7,8,9.

Påfyldning af calciumfarvestoffer i celler kan opnås på forskellige måder. Overvejende anvendes celle-permeant farvestoffer10,11. I et sådant tilfælde er det imidlertid ikke kun svært at kontrollere koncentrationen af et farvestof inde i cellen, men det er også svært at vælge målceller til belastning. Denne metode kan ikke anvendes til at studere perifere nerveender, da farvestoffet kommer ind i postsynaptiske celler. I stedet er celle impermeant farvestoffer mere egnede til sådanne præparater. I dette tilfælde leveres farvestofferne til cellerne ved mikroinjektion eller gennem en patchpipette12,13,14. Der er også en metode til lastning gennem en nervestub. Sidstnævnte metode er bedst egnet til neuromuskulære junction præparater 15,16,17,18,19,20. Det tillader kun at udføre farvning for celler af interesse. Selvom denne metode ikke giver en nøjagtig evaluering af koncentrationen af farvestoffet i målcellen, kan koncentrationen estimeres omtrent ved at sammenligne niveauet af fluorescens af cellerne i hvile i opløsninger med en kendt koncentration af calcium21. I denne undersøgelse præsenteres en ændring af denne metode anvendt på synapser af pattedyr.

Calciumindgang under den depolariserende fase af handlingspotentialet er en hurtig proces, især i det neuromuskulære kryds; Derfor kræves passende udstyr til registrering1. En nylig undersøgelse ved hjælp af et spændingsfølsomt fluorescerende farvestof viste, at varigheden af handlingspotentialet i en mus' perifere synapse er ca. 300 μs22. Calcium forbigående, evalueret ved hjælp af calciumfølsomme farvestoffer i frøens perifere synapser, har en længere varighed: stigningstiden er ca. 2-6 ms og henfaldstiden er ca. 30-90 ms, afhængigt af det anvendte calciumfarvestof23,24. For at måle hurtige processer ved hjælp af fluorescerende farvestoffer anvendes CCD- eller CMOS-kameraer generelt med hurtige og følsomme CCD-matricer. Disse kameraer har imidlertid ulempen ved lav opløsning, begrænset af størrelsen af de følsomme elementer i matrixen25,26,27,28. De hurtigste kameraer med tilstrækkelig følsomhed til at registrere både handlingspotentialer og calciumtransienter som reaktion på lavfrekvent stimulering af celler har en scanningsfrekvens på 2.000 Hz og en matrix med en dimension på 80 x 8029. For at opnå signaler med en højere rumlig opløsning anvendes konfokal mikroskopi, især hvis det er nødvendigt at vurdere nogle volumetriske ændringer i signalet30,31,32. Men det skal huskes, at konfokal mikroskopi har en høj scanningshastighed i linjescanningstilstand, men der er stadig betydelige begrænsninger på hastigheden af optagelser af hurtige processer, når man bygger et rumligt billede33. Der er konfokale mikroskoper baseret på roterende Nipkow-diske (spalte-scanningsmikroskopi) og Multipoint-Array Scannere, som har en højere scanningshastighed. Samtidig er de ringere end de klassiske konfokale mikroskoper i konfokal billedfiltrering (pinholes krydstale for mikroskoper med en Nipkow-disk)32,34,35. Konfokal billeddannelse med resonansscanning kan også give en høj spatio-temporal opløsning, der kræves til høje tidsmæssige målinger36. Vær dog opmærksom på, at registrering af svage fluorescerende responser ved høj scanningshastighed ved brug af resonansscannere kræver meget følsomme detektorer såsom hybriddetektorer36.

Denne artikel præsenterer en metode til at øge den tidsmæssige opløsning af signaler, der er optaget med laserscanning konfokal mikroskopi (LSCM), samtidig med at denrumlige opløsning opretholdes. Den nuværende metode er en videreudvikling af de metoder, der er beskrevet tidligere og overført til LSCM-platformen38,39,40. Denne tilgang kræver ikke ændringer i mikroskophardwaren og er baseret på anvendelse af en algoritme til optagelse af periodisk fremkaldte fluorescerende signaler med et tidsskift i forhold til stimuleringsøjeblikket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsøg blev udført på isolerede nervemuskelpræparater af levator auris longus (m. LAL) fra musene BALB/C (20-23 g, 2-3 måneder gamle)41. De eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for brug af forsøgsdyr fra Kazan Federal University og Kazan Medical University i overensstemmelse med NIH Guide for pleje og brug af laboratoriedyr. Forsøgsprotokollen opfyldte kravene i De Europæiske Fællesskabers rådsdirektiv 86/609/EØF og blev godkendt af det etiske udvalg ved Kazan Medical University.

1. Udarbejdelse af ringer- og arkiveringsløsninger

  1. Derved fremstilles Ringers opløsning til pattedyrsmuskel ved at blande følgende ingredienser: NaCl (137 mM), KCl (5 mM), CaCl 2 (2 mM), MgCl 2 (1 mM), NaH2PO4 (1 mM), NaHCO3 (11,9 mM) og glucose (11 mM). Boble gennem opløsningen med 95%O2 og 5% CO 2 og juster dens pH til 7,2-7,4 ved at tilsætte HCl/NaOH, hvis det er nødvendigt.
  2. Forbered farvestofpåfyldningsopløsningen.
    1. Forbered HEPES (10 mM) opløsning med pH i området 7,2-7,4. 500 μg kommercielt farvestof kommer i et 500 μL hætteglas. Farvestoffet opløses i 14 μL af HEPES-opløsningen for at opnå en farvestofkoncentration på 30 mM. Ryst godt og centrifuger, indtil den er helt opløst.
    2. Opløsningen af Ca2+ indikatoren fortyndes med HEPES-opløsning ned til 1 mM koncentration. Opbevar det i en fryser (-20 °C) og undgå udsættelse for lys.

2. Procedure for påfyldning af farvestoffer

BEMÆRK: Farveindlæsningsproceduren udføres i henhold til protokollen for lastning gennem nervestubben, tilpasset fra de tidligere offentliggjorte protokoller 19,42,43,44,45,46.

  1. Dissekere MAL-muskel i henhold til dissektionsproceduren for dette præparat som beskrevet i de tidligere offentliggjorte protokoller47,48.
    1. Fastgør vævet let strakt (højst 30% fra den oprindelige længde) i den elastomerbelagte petriskål med fine nåle i rustfrit stål, og tilsæt Ringers opløsning, indtil musklen er helt dækket.
      BEMÆRK: Petriskålen var fyldt med elastomer i henhold til producentens anvisninger (se Materialetabel).
  2. Forbered påfyldningspipetten
    1. Brug en mikropipettetrækker (se Materialetabel) til at forberede en mikropipette med en fin spids, der er så skarp som muligt til de intracellulære optagelser. Brug kapillærer uden indvendige filamenter (1,5 mm i ydre diameter og 0,86 eller 1,10 mm i indvendig diameter).
    2. Afbryd mikropipettespidsen efter at have scoret konusen med et slibemiddel, så spidsen er åben til ca. 100 μm i diameter. Brandpoler spidsen ned for at begrænse, når den indvendige diameter krymper fra >80 μm til 12-13 μm. Fastgør et silikonerør til den ene side af påfyldningspipetten og en sprøjte (uden nål) til den anden side.
  3. Under et stereomikroskop finder du det sted, hvor nervestammen bliver til separate nervegrene. Placer påfyldningspipetten med det monterede rør og sprøjten på petriskålen ved hjælp af voks. Flyt pipettespidsen, indtil den står over nerven.
  4. Med en fin saks skæres nerven tæt på muskelfiberen og efterlader et lille stykke af nervestubben ca. 1 mm lang. Sug forsigtigt nervestubben sammen med en eller anden Ringers opløsning, uden at klemme den, ind i spidsen af påfyldningspipetten. Fjern silikonerøret fra påfyldningspipetten.
  5. Træk en vis mængde af farvestofbelastningsopløsningen (~ 0,3 μL) ved hjælp af en sprøjte med et langt filament. Dette volumen svarer til ca. 3 cm af filamentet.
    BEMÆRK: I første omgang er det nødvendigt at fremstille et filament fra en pipettespids med et volumen på 10 μL ved at trække i ilden ved hjælp af en alkohollampe eller en gasbrænder.
  6. Indsæt forsigtigt glødetrådsspidsen med påfyldningsopløsning i påfyldningspipetten. Slip blandingen direkte på nervestubben. Inkuber præparatet ved stuetemperatur i mørke i 30 min.
  7. Skyl derefter præparatet med frisk Ringer-opløsning og inkuberes ved 25 °C i op til 2 timer i et glasbæger med 50 ml (eller mere) Ringer's opløsning (præparatet skal dækkes med opløsningen). I løbet af denne tid når farvestoffet synapserne.

3. Videooptagelse med konfokal mikroskopi

BEMÆRK: Registrering af calciumtransienter udføres med et laserscanningskonfokalmikroskop (LSCM) (se Materialetabel). For at registrere hurtige calciumtransienter blev der anvendt en original protokol, der tillod optagelser af signaler med en tilstrækkelig rumlig og tidsmæssig opløsning. Metoden er beskrevet grundigt i publikationen af Arkhipov et al37. Mikroskopet var udstyret med et 20x vandnedsænkningsmål (1,00 NA). 488 nm laserlinjen blev dæmpet til 10% intensitet, og emissionsfluorescens blev opsamlet fra 503 til 558 nm.

  1. Monter præparatet i det siliciumelastomerbelagte eksperimentelle kammer, og fastgør det, let strakt, med et sæt stålmikronåle. Skyl præparatet grundigt med Ringers opløsning.
    BEMÆRK: Der blev anvendt et simpelt specialfremstillet perfusionseksperimentelt kammer lavet af organisk glas med bunden af kammeret dækket af en elastomer (fremstillet i overensstemmelse med producentens anvisninger; se Materialetabel). Kammeret har et opløsningsforsyningsrør. Opløsningen pumpes ud via en sprøjtenål, monteret på en magnetisk holder (se Materialetabel). Som forsøgskammer kunne en petriskål anvendes (som den, der blev brugt til inkubation af præparatet), men med vedhæftede forsynings- og sugerør.
  2. Installer sugeelektrode, som vil blive brugt til at stimulere nerven.
    BEMÆRK: Konstruktion af elektroden ligner det, der blev offentliggjort i 2015-papiret af Kazakov et al49. Placer og fastgør elektroden ved at vokse ved siden af badet. Flyt spidsen tæt på nervestubben og opsæt den i elektroden.
  3. Monter forberedelseskammeret på mikroskoptrinnet, og anbring indløbs- og udløbsarmaturerne i kammeret.
  4. For at gennemgå præparatet skal du bruge et simpelt tyngdekraftstrømsdrevet system. Tænd for perfusionssugepumpen for at fjerne overskydende opløsning.
  5. Sæt den stimulerende sugeelektrode i en elektrisk stimulator, og sørg for, at muskelsammentrækninger opstår efter stimuli. Se pkt. 3.9-3.12 for stimuleringsbetingelser og optagelse.
  6. Fyld perfusionssystemet op med Ringer's opløsning med d-tubocurarine (10 μM).
    BEMÆRK: Denne løsning hjælper med at forhindre muskelsammentrækninger. D-tubocurarine eller alfa-bungarotoxin-specifikke blokkere af nikotinacetylcholinreceptorer på den postsynaptiske membran ville helt eller delvist blokere muskelkontraktioner50. Til forebyggelse af muskelsammentrækninger kunne specifikke blokkere af postsynaptiske natriumkanaler såsom μ-conotoxin GIIIB også anvendes51.
  7. Tænd for perfusionssugepumpen, og start perfusion af præparatet med Ringers opløsning indeholdende d-tubocurarin.
  8. Indstil billedparametre i LSCM-softwaren som følger.
    1. I LSCM-softwaren (LAS AF; se Materialetabel) skal du vælge Elektrofysiologi.
      BEMÆRK: I denne tilstand, når et billede er taget på tidspunktet, sendes en synkroniserende puls til stimulatoren ved hjælp af udløserboksen. Dette fremkalder generering af handlingspotentiale i præparatet (figur 1; stimulatorenhed).
    2. Vælg Anskaffelsestilstand. For at udløse stimulatoren ved hjælp af mikroskopsynkroniseringspulsen skal du vælge udløserindstillingerne i menuindstillingerne for Job. Indstil feltet Udløs på ramme til out1-kanalen.
    3. Brug følgende indstillinger: Scanningstilstand: XYT, Scanningsfrekvens: 1400 Hz, Zoomfaktor: 6.1, Pinhole: helt åben. Sørg for, at sekventiel trans-passerende Tovejs X-tilstand er slået til.
    4. Indstil minimumstid for at danne en ramme på 52 ms og rammer, der skal indsamles i en rå video ved 20 billeder.
      BEMÆRK: Disse indstillinger tillader billedoptagelse med en opløsning på 128 x 128 pixels, mens du tager en enkelt ramme hver 52 ms.
    5. Indstil excitationsbølgelængden af argonlaseren til 488 nm med 8% af udgangseffekten.

Figure 1
Figur 1: Skemaet for forsøgsopstillingen. 1. Laserscanning af konfokalmikroskop (LSCM). 2. Synkroniseringsmodul af LSCM (udløserboks). 3. Stimulator. 4. Isolering enhed. 5. Den biologiske prøve. 6. Sugeelektrode til elektrisk stimulering af nerve. 7. Perfusionssystemer (7a: perfusatbeholder, 7b: dropper, 7c: flowregulator, 7d: vakuumkolbe). Pile peger på udbredelsesretningen af synkroniseringspuls. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Tryk på Live Mode-knappen for at skifte til Live-tilstand, som hjælper med at få en forhåndsvisning af nerveterminaler fyldt med farvestoffet.

Figure 2
Figur 2: Musenerve og terminaler fyldt med Ca2+ indikatoren. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Stimulering enhed
    BEMÆRK: I dette arbejde blev stimulatoren beskrevet i artiklen af Land et al.52 brugt. Denne enhed giver mulighed for at indstille tidsmæssige parametre for stimulering via MatLab-softwaren.
    1. Opret en ny fil, indsæt koden fra ovennævnte artikel i MatLab-kodevinduet, og gem filen. Klik på Kør, så et vindue med stimuleringsparametre vises. Indstil forsinkelsestiden og varigheden af stimulus.
      BEMÆRK: Forsinkelsen bestemmer den tidsmæssige opløsning af det rekonstituerede fluorescerende signal. Den elektriske puls på 0,2 ms varighed forsinkes og sendes derefter til isolationsenheden. Sidstnævnte danner amplituden og polariteten af den stimulerende puls og isolerer elektrisk det biologiske objekt fra kontrolapparatet.
    2. For at stimulere nerven skal du vælge supramaksimal amplitude af den stimulerende impuls (25% -50% større end den maksimale stimuleringsintensitet, der er nødvendig for at aktivere alle nervefibrene).
      BEMÆRK: Den præsenterede metode er baseret på en speciel algoritme til optagelse af enkelte hurtige fluorescerende signaler ved hjælp af LSCM med den minimerede fejning. På hvert trin i den udviklede algoritme forskydes det registrerede fluorescerende signal fra det foregående med et tidsinterval, der er kortere end mikroskopet. Værdien af tidsskift bestemmer den tidsmæssige opløsning af det krævede signal. Antallet af trin (skift) i algoritmen afhænger af den krævede tidsmæssige opløsning og oprindelige tidsmæssige opløsning. Med denne registreringsmetode udføres stimuleringen af præparatet med en frekvens på 0, 25 Hz.
  2. I Live-tilstand skal du søge efter ROI og opnå det bedste fokus. Kør dataindsamlingssoftwaren.
  3. Forskydning af forsinkelsen på stimulatoren med 2 ms mindre i forhold til den tidligere værdi, og kør dataindsamlingssoftwaren.
  4. Gentag trin 3.11 26 gange for at erhverve 26 sekvenser, hvor hver sekvens forskydes med 2 ms fra den forrige.

4. Videobehandling

BEMÆRK: En række videobilleder erhvervet af det konfokale mikroskop eksporteres i TIFF-format med den gratis software LAS X (se Materialetabel). Denne serie blev opdelt i rammer og eksporteret til en mappe. Til generering af billedsekvensen med højere tidsopløsning blev ImageJ-softwaren, som har en åben indledende kode til analyse og behandling af dataene, brugt. Algoritmen for signalbehandling er skematisk repræsenteret i figur 3.

Figure 3
Figur 3: Skema til kompilering af en videofil i høj opløsning (2 ms på ramme) fra originale videofiler med lav tidsmæssig opløsning (52 ms på ramme). De originale videofiler og de tilsvarende signaler er farvet i sort, magenta og grøn. Den kompilerede videofil og det resulterende signal er farvet rødt. Skemaet til højre, linje for linje, viser videobillederne opnået med et konfokalmikroskop. Til venstre ændres de tilsvarende signaler om fluorescens fra det valgte ROI. Den øverste linje er dannet ramme for ramme fra de modtagne rammer i henhold til ordningen. Resultatet er et videobillede bestående af hele rækken af rammer, så der er en forsinkelsestid på 2 ms mellem rammer i stedet for 52 ms. Hver linje svarer til en forskydning af stimuleringssignalet med (n - 1) * t, hvor t er tidsskift (2 ms), og n er antallet af skift iterationer. k angiver antallet af rammer i de originale videofiler (linje 2-4) og afhænger af varigheden af det optagede signal. I dette tilfælde er det nødvendigt at vælge k = 20 (52 ms * 20 = 1040 ms) for at registrere et signal med en varighed på 1 s). t0 er den krævede forsinkelse før stimulering. For at beregne antallet af skift iterationer n skal den indledende tidsmæssige opløsning mellem rammer (52 ms) divideres med den krævede tidsmæssige opløsning (2 ms). I dette tilfælde er n = 26, hvilket svarer til 26 registrerede sweeps. Som et resultat af de udførte manipulationer opnås et videobillede bestående af n * k = 520 rammer. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Kør LAS X-software. Åbn det projekt, der blev oprettet under udførelse af eksperiment. Klik på Eksporter, og derefter på Gem som for at gemme rammer i .tiff format i destinationsmappen.
  2. Kør ImageJ-softwaren. Klik på Filer > importere > billedsekvens.
  3. I vinduet Åbn billedsekvens skal du vælge destinationsmappen og åbne den første ramme.
  4. I vinduet Sekvensindstillinger i feltet Startbillede skal du angive rammenummeret til 1 for den første ramme. I feltet Forøgelse skal du indstille værdien svarende til antallet af rammer i den oprindelige signaloptagelse (20 i det foreliggende tilfælde) og klikke på OK.
  5. For at gemme den genererede fil med syede første rammer i en separat mappe skal du klikke på Filer > Gem > mappe.
  6. Gentag trin 4.3-4.5 for de næste 19 billeder. I vinduet Sekvensindstillinger skal du angive det tilsvarende rammenummer i feltet Startbillede .
  7. For at generere den fulde video i høj opløsning skal du sy alle rammerne sammen. For at gøre dette skal du klikke på File > Import > Image Sequence og vælge 1 i felterne Start af billede og stigning . Resultatet bliver den endelige video med øget tidsmæssig opløsning. Gem filen i .tiff eller et andet passende format.

5. Videoanalyse

BEMÆRK: I ImageJ skal du vælge ROI og baggrund. Træk baggrund fra ROI. Data er repræsenteret som forholdet, (ΔF / F 0 - 1) * 100%, hvor F0 er intensiteten af fluorescens i hvile og ΔF er intensiteten af fluorescens under stimulering.

  1. Klik på Billede > Stakke > værktøjer > Stack Sorter. Klik derefter på Analyse > værktøjer > ROI Manager.
  2. Træk og slip den .tiff fil, der blev gemt i trin 4.7, i ImageJ-vinduet. Udvid billedet for at få et bedre billede. For at forbedre billedvisualiseringen skal du klikke på Billede > justere > lysstyrke / kontrast > automatisk. Dette trin påvirker ikke dataene.
  3. Indstil baggrunden tæt på nerveterminalen ved at tegne ROI. Føj det til ROI-manageren. Beregn baggrunden ved at klikke på Mere > multimål. Kopier middelværdier, indsæt i regnearksprogrammet, og beregn gennemsnittet.
  4. Træk den beregnede gennemsnitsværdi fra stablerne ved at klikke på Process > Main > Subtrahere. Indtast værdien.
  5. Tegn ROI omkring en nerveterminal via en polygonlinje. Føj det til ROI-manageren.
  6. Mål intensiteten af nerveterminalen: Klik på Mere > multimål. Kopier middelværdier, og indsæt dem i regnearksprogrammet.
  7. Beregn den gennemsnitlige forskydning af signaler.
    BEMÆRK: Brug de tilsvarende punkter afhængigt af forsinkelsestiden før stimulering. Dette trin fastlægger F0-værdien , der skal bruges i efterfølgende beregninger.
  8. Divider signalværdierne med den gennemsnitlige forskydningsværdi.
    BEMÆRK: Efter dette trin indeholder signalet ikke bidraget fra baggrunden og rå fluorescens til amplitudeværdierne for det valgte ROI.
  9. Træk 1 fra værdier opnået i trin 5.8, og multiplicer derefter med 100%.
  10. Afbild en graf over Ca2+- forbigående og beregn amplituden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter at præparatet var fyldt med farvestof i henhold til den præsenterede teknik, havde de fleste synapser placeret tæt på nervestubben et tilstrækkeligt fluorescensniveau (se figur 2). Efter påfyldning af præparatet med farvestoffet og anvendelse af den beskrevne metode til registrering og billedbehandling blev der opnået calciumtransienter med den ønskede rumlige og tidsmæssige opløsning (se figur 4). Calciumtransienten er blevet genvundet ved den foreslåede metode (se figur 3).

Amplitude og tidsparametre for de gendannede signaler blev også analyseret. Gennemsnitsdata fremgår af tabel 1.

Figure 4
Figur 4: Repræsentativt spor af calciumsignal fra et forsøg. Nogle vigtige signalparametre, såsom gennemsnitlig amplitude (MA), stigningstid (RT) og henfaldstid (DecT) og dens fremskrivninger på akser er angivet. MA beregnes ved hjælp af gennemsnitspunkter på toppen, farvet i grønt. RT er den tid, det tager for amplituden at stige fra 20% til 80%, hvilket beregnes som forskellen mellem fremskrivninger på x-aksen farvet i blåt. DecT er den tid, hvor amplituden falder med e-tider, hvilket beregnes som forskellen mellem fremskrivninger på x-aksen farvet i rødt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Spidsbelastning ΔF/F (%) Stigningstid 20%-80% (ms) τ (ms)
27,0±4,6 (n=5) 6,8±0,48 (n=5) 456±53(n=5)

Tabel 1: De gennemsnitlige parametre for Ca2+ transient. Data præsenteres som middel ± s.e.m., og n er antallet af målinger i de forskellige nerve-muskelkryds. Peak ΔF/F er den gennemsnitlige amplitude af ΔF/F.

Calciumtransient analyse gør det muligt at vurdere amplitude-dynamiske egenskaber ved ændringer i det præsynaptiske calciumniveau i nerveenden under handlingspotentialet11. Ændringen i amplituden af calciumtransienten korrelerer godt med ændringen i det kvantitative indhold53. Calciumtransient amplitudeanalyse anvendes almindeligvis til at studere effekten af fysiologisk aktive forbindelser forbundet med modulering af præsynaptiske calciumniveauer på synaptisk transmission54,55. Calciumtransientens tidsforløb afspejler kinetikken af calciumbinding med farvestoffet og dets dissociation23,56. Det er indlysende, når du bruger farvestoffer med forskellig affinitet for calcium23,56. Selvom de tidsmæssige parametre for calciumtransienten afspejler kinetikken af det calciumfølsomme farvestof og ikke repræsenterer kinetikken af frit calcium i nerveterminalen, kan matematiske modelleringsmetoder baseret på eksperimentelle data genoprette opførelsen af frit calcium i cellen og beregne koncentrationen af calciumbuffere23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden til at indlæse Ca2+-følsomt farvestof i musenerveender gennem nervestubben og til registrering af en hurtig calciumtransient ved hjælp af et konfokalmikroskop er præsenteret i denne artikel. Som et resultat af implementeringen af denne belastningsmetode havde de fleste synapser placeret tæt på nervestubben et tilstrækkeligt fluorescensniveau til at muliggøre registrering af calciumindtræden i nerveenderne som reaktion på lavfrekvent stimulering af motornerven.

I modsætning til de tidligere præsenterede protokoller til indlæsning af calciumfarvestoffer gennem stubben er denne protokol designet til brug på pattedyrsynapser. Tidligere protokoller, der blev anvendt i koldblodede dyrepræparater, krævede en inkubation natten over43. I denne protokol er den krævede inkubation med farvestoffet kun 2 timer. Afhængigt af længden af nervesegmentet, der forblev efter skæringen, kan farvestofbelastningshastigheden og antallet af indlæste terminaler variere. Det var muligt at reducere inkubationstiden yderligere i farveopløsning til kortere nervestubbe. En lignende metode er beskrevet til lastning af fluesynapser18,19. Inkubationen af musklen blev også udført med en lille stigning i temperaturen over stuetemperaturen, hvilket forbedrer diffusionen af farvestof langs nerven. Det bidrog således til at reducere inkubationstiden, og derfor kan den nuværende farvestofbelastningsmetode bruges til at indlæse synapser af pattedyr, der ikke tåler langvarige inkubationer. Det er vigtigt at vælge de passende forberedelser til undersøgelsen. LAL-musklen er velegnet til denne metode, da det er muligt at skære en nervestub tæt nok på de synaptiske terminaler. Andre tynde muskler kan også være egnede til en sådan anvendelse57. Et af de vigtigste trin i denne protokol er, at nervestubben skal placeres i den farvestofholdige opløsning i de første par minutter efter at have skåret nerven. Da nervens længde er kort, skal et specifikt design af sugeelektroden anvendes til stimulering. I denne forskning blev både glas- og plastelektroder anvendt, med diameteren sammenlignelig med nervesegmentet.

Erhvervelse af calciumtransienter skal udføres ved hjælp af specielt udstyr. Optagelser af langvarige ændringer i calciumniveauet som reaktion på frekvensstimulering af motornerven kræver regelmæssige kameraer eller et konfokalmikroskop. Mens registrering af calciumtransienter er som reaktion på lavfrekvent stimulering af nerven, er følsomme kameraer nødvendige, når signalet fra farvestoffet har lav intensitet og høj hastighed11. Meget følsomme CCD-kameraer eller matricer bestående af fotodioder bruges hovedsageligt til at registrere disse hurtige processer. Kameraer med høj følsomhed og hastighed har dog en tendens til at have lav opløsning. Hvis der kræves registrering i høj opløsning, er konfokale mikroskopimetoder mere egnede. I konfokale mikroskoper bruges fotomultiplierer til at registrere fluorescens, og for nylig kom hybriddetektorer til brug. De har en meget høj følsomhed sammenlignet med CCD-kameraer og er velegnede til at detektere svag fluorescens. Men den største ulempe ved LSCM er lav scanningshastighed, når man bygger et rumligt billede. I denne undersøgelse, for at registrere calciumtransientet, blev den oprindelige registreringsmetode anvendt via LSCM, som er beskrevet grundigt i artiklen af Arkhipov et al. relateret til frøens synapser37. Ved hjælp af denne metode var det muligt at estimere den proximal-distale gradient af calciumtransient i de aflange frøsynapser37. Denne registreringsmetode kan være nyttig til vurdering af subcellulær calciumdynamik i excitable celler, for eksempel i dendritter og rygsøjler i hjerneskivepræparater. I denne undersøgelse blev det anvendt på pattedyrsynapser. Det gjorde det muligt at opnå konfokale videobilleder med 2 ms prøveudtagning af signaler for at analysere parametrene for calciumtransienten.

Den beskrevne metode omhandler fluorescerende signaler, udløst af en ekstern stimulus og har en fast forsinkelse, før stimulus er kommet. Varierende forsinkelse på stimulatoren gør det muligt at ændre signalstartspunktet og registrere det skiftede signal ved LSCM. Derefter gendannes det originale signal med en høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af omvendt konvolution i henhold til algoritmen beskrevet tidligere. En af begrænsningerne ved den nuværende metode er, at de oprindelige signaler skal have ringe variation i parametre og have god reproducerbarhed. For at anvende metoden skal man udføre flere scanninger for at få nok data til konvolution. I den overvejede sag blev der registreret 26 forsøg med 20 billeder hver, dvs. 520 billeder i alt. Varigheden af billeddannelsen og antallet af forsøg afhænger af den krævede tidsopløsning og signalvarighed. Så fokuspositionsstabilitet af præparatet under billeddannelse er påkrævet. Nøjagtigheden af signalgendannelsen ved den foreslåede metode bestemmes for det meste af størrelsen af ROI. Jo mindre ROI-størrelsen er, jo mindre tid tager det at scanne, og jo færre fejl opstår der under signalgendannelse med den krævede tidsmæssige opløsning37.

Denne undersøgelse præsenterede en metode til at indlæse fluorescerende farvestoffer i perifere synapser hos pattedyr og en metode til registrering af hurtige fluorescerende calciumsignaler via et konfokalt fluorescensmikroskop. Ved hjælp af den beskrevne metode var det muligt at registrere et signal med god rumlig og tidsmæssig opløsning. Registrering af calciumtransienter er et kraftfuldt værktøj til at studere cellulære processer, såsom regulering af neurotransmitterfrigivelse og synaptisk plasticitet54,55.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Fluorescensundersøgelser af dette arbejde blev udført med økonomisk støtte fra Russian Science Foundation Grant (projekt nr. 19-15-00329). Metoden blev udviklet under finansiering fra regeringsopgaven for FRC Kazan Scientific Center of RAS АААА-А18-118022790083-9. Forskningen blev udviklet ved hjælp af udstyret fra Federal Research Center "Kazan Scientific Center of RAS". Forfatterne vil gerne takke Dr. Victor I. Ilyin for kritisk læsning af dette manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capillary Glass Clark Electromedical instruments, UK GC150-10
Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP Leica Microsystems , Heidelberg, Germany
Flaming/Brown Micropipette Puller P 97 Sutter Instrument, USA P-97
Flow regulator KD Medical GmbH Hospital Products, Germany KD REG Disposable infusion set with Flow regulator
HEPES Sigma-Aldrich, USA H0887 100mL
Illumination system Leica CLS 150X Leica Microsystems, Germany
ImageJ National Institutes of Health, USA http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Las AF software Leica Microsystems, Heidelberg, Germany
Las X software Leica Microsystems, Heidelberg, Germany https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Magnetic Holder with Suction Tubing BIOSCIENCE TOOLS, USA MTH-S
Microspin FV 2400 Biosan, Latvia BS-010201-AAA
Minutien Pins Fine science tools, Canada 26002-20
Multi-spin MSC 3000 Biosan, Latvia BS-010205-AAN
Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt Molecular Probes, USA O6806 500 μg
Pipette Biohit, Russia 720210 0.5-10 µL
Pipette tip Biohit, Russia 781349 10 µL
Plasticine local producer
Single-use hypodermic needles Bbraun 100 Sterican 0.4×40 mm
Spreadsheet program Microsoft, USA Microsoft Office Excel
Stereomicroscope, Leica M80 Leica Microsystems , Germany
Suction electrode Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal. - 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16. http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/
Sylgard 184 elastomer Dow Corning, USA
Syringe local producer 0.5 mL
Syringe local producer 60 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Llinas, R., Steinberg, I. Z., Walton, K. Presynaptic calcium currents and their relation to synaptic transmission: voltage clamp study in squid giant synapse and theoretical model for the calcium gate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (8), 2918-2922 (1976).
  2. Augustine, G. J. How does calcium trigger neurotransmitter release. Current Opinion in Neurobiology. 11 (3), 320-326 (2001).
  3. Burnashev, N., Rozov, A. Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy. Cell Calcium. 37 (5), 489-495 (2005).
  4. Schneggenburger, R., Neher, E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion. Current Opinion in Neurobiology. 15 (3), 266-274 (2005).
  5. Pang, Z. P., Südhof, T. C. Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 496-505 (2010).
  6. Leal, S. S., Gomes, C. M. Calcium dysregulation links ALS defective proteins and motor neuron selective vulnerability. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 225 (2015).
  7. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  8. Tsien, R. Y. Fluorescent indicators of ion concentrations. Methods in Cell Biology. 30, 127-156 (1989).
  9. Adams, S. R. How calcium indicators work. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
  10. Macleod, G. T. Topical application of indicators for calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 786-790 (2012).
  11. Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 307-314 (2005).
  12. Eilers, J., Konnerth, A. Dye loading with patch pipettes. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (4), 5201 (2009).
  13. Coleman, W. L., et al. Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals. Journal of Physiology. 586 (19), 4649-4673 (2008).
  14. Macleod, G. T. Direct injection of indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 797-801 (2012).
  15. Peng, Y. Y., Zucker, R. S. Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia. Neuron. 10 (3), 465-473 (1993).
  16. Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. α-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals. The Journal of Neuroscience. 20 (23), 8685-8692 (2000).
  17. Newman, Z., et al. Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction. The European Journal of Neuroscience. 25 (6), 1619-1630 (2007).
  18. Macleod, G. T. Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 791-796 (2012).
  19. Rossano, A. J., Macleod, G. T. Loading drosophila nerve terminals with calcium indicators. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e250 (2007).
  20. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  21. Suzuki, S., et al. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 440 (3), 351-365 (2000).
  22. Ojala, K. S., et al. A high-affinity, partial antagonist effect of 3,4-diaminopyridine mediates action potential broadening and enhancement of transmitter release at NMJs. Journal of Biological Chemistry. 296, 100302 (2021).
  23. Samigullin, D., et al. Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 29 (2015).
  24. DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 505, 585-592 (1997).
  25. Bullen, A., Patel, S. S., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: I. High-resolution optical recording with voltage-sensitive dyes and ion indicators. Biophysical Journal. 73 (1), 477-491 (1997).
  26. Bullen, A., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: II. Fast quantitative measurements with voltage-sensitive dyes. Biophysical Journal. 76 (4), 2272-2287 (1999).
  27. Bullen, A., Saggau, P. Optical recording from individual neurons in culture. Modern Techniques in Neuroscience Research. (4), 89-126 (1999).
  28. Bullen, A., Saggau, P. Indicators and optical configuration for simultaneous high-resolution recording of membrane potential and intracellular calcium using laser scanning microscopy. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 436 (5), 788-796 (1998).
  29. Redshirt Imaging. , Available from: http://www.redshirtimaging.com/redshirt_neuro/hardware_overview.htm (2021).
  30. Wilson, T. Optical aspects of confocal microscopy. Confocal Microscopy. , 93-141 (1990).
  31. Cox, G. Biological confocal microscopy. Materials Today. 5 (3), 34-41 (2002).
  32. Mukhitov, A., Arkhipova, S., Nikolsky, E. Modern Light Microscopy in Biological and Medical Research. Nauka. , Moscow. (2011).
  33. Mertz, J. Optical sectioning microscopy with planar or structured illumination. Nature Methods. 8 (10), 811-819 (2011).
  34. Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427-471 (1996).
  35. Toomre, D., Pawley, J. B. Disk-scanning confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , 221-238 (2006).
  36. Venkateswarlu, K., et al. Three-dimensional imaging and quantification of real-time cytosolic calcium oscillations in microglial cells cultured on electrospun matrices using laser scanning confocal microscopy. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3108-3123 (2020).
  37. Arkhipov, A. Y., Khaziev, E. F., Skorinkin, A. I., Bukharaeva, E. A., Samigullin, D. V. Enhancement of the temporal resolution of fluorescent signals acquired by the confocal microscope. Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 204-210 (2020).
  38. Rama, S. Shift and mean algorithm for functional imaging with high spatio-temporal resolution. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  39. Chan, K. G., Streichan, S. J., Trinh, L. A., Liebling, M. Simultaneous temporal superresolution and denoising for cardiac fluorescence microscopy. IEEE Transactions on Computational Imaging. 2 (3), 348-358 (2016).
  40. Veeraraghavan, A., Reddy, D., Raskar, R. Coded strobing photography: compressive sensing of high speed periodic videos. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 33 (4), 671-686 (2011).
  41. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neuroscience Letters. 82 (1), 83-88 (1987).
  42. Macleod, G. T. Calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (7), 758-766 (2012).
  43. Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Loading a calcium dye into frog nerve endings through the nerve stump: calcium transient registration in the frog neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e55122 (2017).
  44. Samigullin, D. V., et al. Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction. BioNanoScience. 7 (1), 162-166 (2017).
  45. Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 31 (31), 11268-11281 (2011).
  46. Luo, F., Dittrich, M., Cho, S., Stiles, J. R., Meriney, S. D. Transmitter release is evoked with low probability predominately by calcium flux through single channel openings at the frog neuromuscular junction. Journal of Neurophysiology. 113 (7), 2480-2489 (2015).
  47. Wright, M., Kim, A., Son, Y. -J. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e3124 (2011).
  48. Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator Auris Longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57482 (2018).
  49. Kazakov, A., Alexandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects. Meždunarodnyj naučno-issledovatel'skij žurnal (International Research Journal). 9 (40), 13-16 (2015).
  50. Bowman, W. C. Neuromuscular block. British Journal of Pharmacology. 147, 277-286 (2006).
  51. Hill, J. M., Alewood, P. F., Craik, D. J. Three-dimensional solution structure of µ-conotoxin GIIIB, a specific blocker of skeletal muscle sodium channels. Biochemistry. 35 (27), 8824-8835 (1996).
  52. Land, B. R., Johnson, B. R., Wyttenbach, R. A., Hoy, R. R. Tools for physiology labs: Inexpensive equipment for physiological stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 3 (1), 30-35 (2004).
  53. Samigullin, D. V., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Calcium transient and quantal release in mouse neuromuscular junction under extracellular calcium concentration change. BioNanoScience. 8 (4), 984-987 (2018).
  54. Khaziev, E., et al. acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction. Frontiers in Physiology. 7, 621 (2016).
  55. Zhilyakov, N., Arkhipov, A., Malomouzh, A., Samigullin, D. Activation of neuronal nicotinic receptors inhibits acetylcholine release in the neuromuscular junction by increasing ca2+ flux through cav1 channels. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 9031 (2021).
  56. Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Optical measurement of presynaptic calcium currents. Biophysical Journal. 74 (3), 1549-1563 (1998).
  57. McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. Journal of Neuroscience Methods. 4 (2), 109-115 (1981).

Tags

Neurovidenskab udgave 178
Registrering af calciumtransienter i musens neuromuskulære krydsning med høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af konfokal mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhilyakov, N. V., Arkhipov, A. Y.,… More

Zhilyakov, N. V., Arkhipov, A. Y., Khaziev, E. F., Mukhamedyarov, M. A., Samigullin, D. V. Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63308, doi:10.3791/63308 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter