Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

חקירה ספקטרומטרית מסה רבת פנים של נוירופפטידים בקלינקטס ספידוס

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/63322
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison
* These authors contributed equally

Summary

אפיון ספקטרומטרי של מסה של נוירופפטידים מספק מידע על רצף, כמות ולוקליזציה. זרימת עבודה אופטימלית זו שימושית לא רק למחקרי נוירופפטידים, אלא גם לפפטידים אנדוגניים אחרים. הפרוטוקולים המובאים כאן מתארים הכנת דגימות, רכישת טרשת נפוצה, ניתוח טרשת נפוצה ויצירת מסדי נתונים של נוירופפטידים באמצעות LC-ESI-MS, איתור MALDI-MS והדמיית MALDI-MS.

Abstract

נוירופפטידים מאותתים על מולקולות המווסתות כמעט את כל התהליכים הפיזיולוגיים וההתנהגותיים, כגון התפתחות, רבייה, צריכת מזון ותגובה לגורמי עקה חיצוניים. עם זאת, המנגנונים הביוכימיים וההשלמה המלאה של הנוירופפטידים והתפקידים התפקודיים שלהם עדיין אינם מובנים היטב. אפיון הפפטידים האנדוגניים האלה נפגע על ידי המגוון העצום בתוך סוג זה של מולקולות איתות. בנוסף, נוירופפטידים הם ביו-אקטיביים בריכוזים נמוכים פי 100 - פי 1000 מזה של נוירוטרנסמיטורים והם נוטים להתפרקות אנזימטית לאחר שחרור סינפטי. ספקטרומטריית מסות (MS) היא כלי אנליטי רגיש ביותר שיכול לזהות, לכמת ולמקם אנליטים ללא ידע א-פריורי מקיף. הוא מתאים היטב ליצירת פרופיל גלובלי של נוירופפטידים ולסיוע בגילוי של פפטידים חדשים. בשל השפע הנמוך והמגוון הכימי הגבוה של סוג זה של פפטידים, מספר שיטות להכנת דגימות, פרמטרים לרכישת טרשת נפוצה ואסטרטגיות ניתוח נתונים הותאמו מטכניקות פרוטאומיקה כדי לאפשר אפיון נוירופפטידי אופטימלי. כאן מתוארות שיטות לבידוד נוירופפטידים מרקמות ביולוגיות מורכבות לצורך אפיון רצף, כמות ולוקליזציה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית (LC)-MS וספיגת/יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI)-MS. פרוטוקול להכנת מסד נתונים נוירופפטידי מהסרטן הכחול, Callinectes sapidus, אורגניזם ללא מידע גנומי מקיף, נכלל. ניתן להתאים זרימות עבודה אלה לחקר סוגים אחרים של פפטידים אנדוגניים במינים שונים באמצעות מגוון מכשירים.

Introduction

מערכת העצבים מורכבת ודורשת רשת של נוירונים כדי להעביר אותות ברחבי האורגניזם. מערכת העצבים מתאמת מידע חושי ותגובה ביולוגית. האינטראקציות המורכבות והמפותלות המעורבות בהעברת אותות דורשות מולקולות איתות רבות ושונות כגון נוירוטרנסמיטורים, סטרואידים ונוירופפטידים. מכיוון שנוירופפטידים הם מולקולות האיתות המגוונות והחזקות ביותר הממלאות תפקידי מפתח בהפעלת תגובות פיזיולוגיות ללחץ ולגירויים אחרים, מעניין לקבוע את תפקידם הספציפי בתהליכים פיזיולוגיים אלה. תפקוד הנוירופפטידים קשור למבנה חומצות האמינו שלהם, הקובע את הניידות, האינטראקציה עם הקולטנים וזיקה1. טכניקות כגון היסטוכימיה, שהיא חשובה משום שניתן לסנתז, לאחסן ולשחרר נוירופפטידים באזורים שונים של הרקמה, ואלקטרופיזיולוגיה שימשה כדי לחקור את המבנה והתפקוד של הנוירופפטידים 2,3,4, אך שיטות אלה מוגבלות על ידי תפוקה וספציפיות כדי לפתור את מגוון הרצף העצום של הנוירופפטידים.

ספקטרומטריית מסות (MS) מאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה של מבנה נוירופפטידים ושפע. ניתן לבצע זאת באמצעות טכניקות שונות של טרשת נפוצה, בדרך כלל כרומטוגרפיה נוזלית-יינון אלקטרוספריי MS (LC-ESI-MS)5 ו-MS ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI-MS)6. באמצעות מדידות מסה ברמת דיוק גבוהה ופיצול טרשת נפוצה, טרשת נפוצה מספקת את היכולת להקצות רצף חומצות אמינו ומצב של שינוי לאחר התרגום (PTM) לנוירופפטידים מתערובות מורכבות ללא ידע א-פריורי כדי לסייע באיתור תפקודם 7,8. בנוסף למידע איכותני, טרשת נפוצה מאפשרת מידע כמותי של נוירופפטידים באמצעות כמות ללא תוויות (LFQ) או שיטות מבוססות תווית כגון תיוג איזוטופי או איזוברי9. היתרונות העיקריים של LFQ כוללים את הפשטות שלו, עלות נמוכה של ניתוח, וירידה בשלבי הכנת הדגימה שיכולים למזער את אובדן הדגימה. עם זאת, החסרונות של LFQ כוללים עלויות זמן מכשיר מוגברות מכיוון שהוא דורש שכפולים טכניים מרובים כדי לטפל בשגיאות כמותיות מהשונות בריצה לריצה. זה גם מוביל לירידה ביכולת לכמת במדויק וריאציות קטנות. שיטות מבוססות תווית נתונות לשונות פחות שיטתית מכיוון שניתן לסמן דגימות מרובות באופן דיפרנציאלי באמצעות מגוון איזוטופים יציבים, לשלב אותן בדגימה אחת ולנתח אותן באמצעות ספקטרומטריית מסות בו זמנית. זה גם מגדיל את התפוקה, אם כי תוויות איזוטופיות יכולות לגזול זמן רב ויקר לסנתז או לרכוש. המורכבות הספקטרלית של ספקטרום מסת סריקה מלאה (MS1) עולה גם היא ככל שהריבוב עולה, מה שמקטין את מספר הנוירופפטידים הייחודיים המסוגלים להיות מפוצלים ולכן, מזוהים. לעומת זאת, תיוג איזוברי אינו מגביר את המורכבות הספקטרלית ברמת MS1, אם כי הוא מציב אתגרים לאנליטים בעלי שפע נמוך כגון נוירופפטידים. מכיוון שהכמות האיזוברית מתבצעת ברמת ספקטרום מסת יון השבר (MS2), ייתכן שלא ניתן יהיה לכמת נוירופפטידים בעלי שפע נמוך מכיוון שניתן לבחור רכיבי מטריצה שופעים יותר לפיצול וייתכן שלמי שנבחר אין שפע גבוה מספיק כדי לכמת אותם. עם תיוג איזוטופי, ניתן לבצע כמות על כל פפטיד מזוהה.

בנוסף לזיהוי וכימות, ניתן לקבל מידע לוקליזציה על ידי MS באמצעות הדמיית MALDI-MS (MALDI-MSI)10. על-ידי רסטר לייזר על פני משטח דגימה, ניתן לקמפל ספקטרה של MS לתמונת מפת חום עבור כל ערך m/z . מיפוי עוצמת האותות הנוירופפטידיים הארעיים באזורים שונים על פני מצבים שונים יכול לספק מידע רב ערך לקביעת תפקוד11. לוקליזציה של נוירופפטידים חשובה במיוחד מכיוון שתפקוד הנוירופפטידים עשוי להשתנות בהתאם למיקום12.

נוירופפטידים נמצאים בשפע נמוך יותר in vivo מאשר מולקולות איתות אחרות, כגון מוליכים עצביים, ולכן דורשים שיטות רגישות לגילוי13. ניתן להשיג זאת באמצעות הסרת רכיבי מטריצת שפע גבוהים יותר, כגון שומנים11,14. שיקולים נוספים לניתוח נוירופפטידים צריכים להיעשות בהשוואה לתהליכי עבודה נפוצים של פרוטאומיקה, בעיקר משום שרוב הניתוחים הנוירו-פפטידומיים משמיטים עיכול אנזימטי. זה מגביל את אפשרויות התוכנה לניתוח נתונים של נוירופפטידים מכיוון שרובם נבנו עם אלגוריתמים המבוססים על נתוני פרוטאומיקה והתאמות חלבונים המבוססות על זיהוי פפטידים. עם זאת, תוכנות רבות כגון PEAKS15 מתאימות יותר לניתוח נוירופפטידים בשל יכולות ריצוף דה נובו שלהן. יש לקחת בחשבון מספר גורמים לניתוח נוירופפטידים החל משיטת החילוץ ועד לניתוח נתוני טרשת נפוצה.

הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים שיטות להכנת דגימות ותיוג איזוטופי של דימתיל, איסוף נתונים וניתוח נתונים של נוירופפטידים על ידי LC-ESI-MS, MALDI-MS ו-MALDI-MSI. באמצעות תוצאות מייצגות ממספר ניסויים, מדגימים את התועלת והיכולת של שיטות אלה לזהות, לכמת ולמקם נוירופפטידים מסרטנים כחולים, Callinectes sapidus. כדי להבין טוב יותר את מערכת העצבים, מערכות מודל משמשות בדרך כלל. לאורגניזמים רבים אין גנום ברצף מלא זמין, מה שמונע גילוי נוירופפטידי מקיף ברמת הפפטיד. על מנת למתן את האתגר הזה, נכלל פרוטוקול לזיהוי נוירופפטידים חדשים וכריית תעתיקים ליצירת מסדי נתונים עבור אורגניזמים ללא מידע גנומי מלא. כל הפרוטוקולים המוצגים כאן יכולים להיות מותאמים לדגימות נוירופפטידים מכל מין, כמו גם ליישם לניתוח של כל פפטידים אנדוגניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל דגימת הרקמות שתוארה בוצעה בהתאם להנחיות של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון.

1. ניתוח LC-ESI-MS של נוירופפטידים

  1. מיצוי והתפלה של נוירופפטידים
    1. לפני רכישת רקמות, הכינו מתנול חומצי (acMeOH) (90:9:1 MeOH:water:acetic acid) כמתוארב-16.
    2. אספו רקמת מוח מהסרטנים17 והשתמשו במלקחיים כדי למקם מיד רקמה אחת כל אחת בצינור של 0.6 מ"ל המכיל 20 μL של acMeOH.
      הערה: פרוטוקולי כריתת רקמות משתנים מאוד עבור בעלי חיים שונים וסוגי רקמות שונים. הקורא מופנה לפרוטוקול17 לתיאור מפורט כיצד לנתח רקמת מוח וסוגי רקמות רבים אחרים מהסרטנים. ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש (באופן אידיאלי תוך 6 חודשים). הכרכים המתוארים משמשים למוח יחיד מ-Callinectes sapidus. יש לשנות את קנה המידה של הנפחים לגודל הרקמה. ניתן להקפיא את הרקמה באופן מיידי ללא ממס, אם כי הדבר אינו מומלץ מכיוון שאנזימים פרוטאוליטיים אנדוגניים לא יעוכבו ויישארו פעילים, אם כי בקצב איטי יותר כאשר הם קרים.
    3. הוסף 150 μL של acMeOH לדוגמה. קבעו את זמן הסאונדציה הכולל ל-24 שניות, את זמן הדופק ל-8 שניות, את זמן ההשהיה ל-15 שניות ואת המשרעת ל-50% על הומוגנייזר על-קולי וליצור הומוגניזציה של הדגימות על קרח.
      הערה: קיימות מערכות הומוגניזציה שונות זמינות. התאם את ההגדרות והתנאים בהתאם לסוג הדגימה ולציוד.
    4. צנטריפוגה הדגימה ב 4 °C ב 20,000 x g במשך 20 דקות. עם פיפטה, מעבירים את הסופרנטנט בצינור ומייבשים אותו ברכז ואקום (266 x גרם, 1 x 10-4 Torr) בערך 35 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לאחסן את הדגימות המיובשות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש (באופן אידיאלי תוך 6 חודשים). חימום רכז הוואקום חייב להתבצע בזהירות. בעוד החום מקצר את זמן היובש, יש להסיר את הדגימה מהרכז מיד לאחר שכל הנוזל התאדה כדי למזער את פירוק הפפטידים. כדי למנוע זאת, ניתן להשמיט את החימום מכך ומכל השלבים הבאים.
    5. לצורך התפלה, שחזרו את דגימת הרקמה המופקת ב-20 μL של 0.1% חומצה פורמית (FA), סובבו היטב את ה-sonicate ו-sonicate באמבט מים בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.
      הערה: ישנם חומרי התפלה שונים זמינים. התאימו את הפתרונות והנפחים בהתאם לזהות השרף ולכמות הנוירופפטידים. ניתן להעריך את הכמות הכוללת של הפפטידים באמצעות בדיקת כמות פפטידים מסחרית (ראו טבלת חומרים).
    6. החל 0.5 μL של דגימה על רצועת pH כדי לאשר כי pH < 4. אם ה-pH גבוה יותר, הוסף 1 μL aliquots של 10% FA עד pH < 4.
    7. עקוב אחר פרוטוקול היצרן להתפלה18. הכינו תמיסת הרטבה המכילה 100 μL של 50% אצטוניטריל (ACN), תמיסת שיווי משקל המכילה 100 μL של 0.1% FA, תמיסת שטיפה המכילה 100 μL של 0.1% FA, ופתרונות אלוטיון המכילים 20 μL של 25% ACN/0.1% FA, 20 μL של 50% ACN/0.1% FA ו-20 μL של 75% ACN/0.1% FA.
    8. קבל קצה התפלה של 10 μL עם שרף C18 (ראה טבלת חומרים).
    9. מניחים את קצה ההתפלה על פיפטה של 20 μL המוגדרת ל-15 μL. לאחר שקצה ההתפלה רטוב, יש למנוע מעבר אוויר על ידי שמירה על הפיפטה מדוכאת כאשר היא מחוץ לתמיסה עד שהיא תושלך.
    10. שאפו את הקצה פי 3 עם תמיסת הרטבה ופי 3 עם תמיסת שיווי משקל. לשאוף במדגם 10x ואחריו לשטוף 3x בתמיסת שטיפה, להשליך כל שטיפה. Elute על ידי שאיפה פי 10 בכל אחד מתמיסות האלוטיון לפי סדר הגדלת ה-ACN.
      הערה: ניתן לשמור על שברים של Elution בנפרד או לשלב אותם לצורך ניתוחים נוספים.
    11. השליכו את קצה ההתפלה המשומש וייבשו את הנוירופפטידים המבוקסמים ברכז ואקום (266 x גרם, 1 x 10-4 Torr) בטמפרטורה של כ-35 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לאחסן זאת בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש (באופן אידיאלי תוך 6 חודשים).
  2. תיוג איזוטופי של נוירופפטידים בתמצית רקמה
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי ומשמש רק כאשר יש צורך בכימות.
    1. הכינו את תמיסת הסימון האיזוטופית של 2-plex דימתיל במכסה אדים: 1% CH2OH2 (13.5 μL של מלאי 37 אחוזי משקל/משקל (wt. %) בתמיסת מים ב-486.5 μL של מים), 1% CH2OD2 (25 μL של מלאי 20 wt. % תמיסה ב-475 μL של מים), ו-0.03 M בוראן פירידין (3.75 μL של תמיסת 8 M במלאי ב-996.25 מיקרול של מים).
      אזהרה: פורמלדהיד הוא רעיל, ולכן כל הפתרונות צריכים להישמר במכסה מנוע מאוורר. לבשו כפפות, מעיל מעבדה, הגנה על העיניים ונעליים אטומות. אין להרכיב עדשות מגע בעת עבודה עם חומר זה.
      הערה: ישנם ריאגנטים איזוטופיים שונים; בחר את המתאימים בהתבסס על סוג לדוגמה ומספר ערוצי התוויות הרצויים.
    2. ממיסים תמצית נוירופפטידית גולמית ב-10 מיקרול' מים וסוניקטים למשך 10 דקות.
    3. הוסיפו 10 μL של תמיסת פורמלדהיד איזוטופית שונה (כלומר, CH2OH2, CH2OD2 וכו') לכל תנאי ניסוי שונה שיימדד באופן כמותי. מערבולת לערבוב טוב וצנטריפוגה קצרה של כל דגימה ב-2,000 x גרם.
    4. הוסף 10 μL של 0.03 M בוראן pyridine לכל צינור דגימה. מערבולת לערבוב טוב וצנטריפוגה קצרה של כל דגימה ב-2,000 x גרם.
    5. דגירה של הדגימות במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
    6. הסר את הדגימות מאמבטיית המים והוסף 10 μL של 100 mM אמוניום ביקרבונט. מערבולת לערבוב טוב וצנטריפוגה קצרה של כל דגימה ב-2,000 x גרם.
    7. שלב את הדגימות המסומנות עבור דגימה אחת של 2-plex וייבש את הנוירופפטידים ברכז ואקום (266 x גרם, 1 x 10-4 Torr) בערך 35 °C (35 °C).08.06.06.
    8. יש להשפיל את הנוירופפטידים המסומנים על ידי ביצוע מחדש של שלבים 1.1.5 - 1.1.10 ולאחסן אותם עד שיהיו מוכנים לאיסוף נתונים.
  3. רכישת נתונים
    1. שחזרו את הנוירופפטידים המותפלים המיובשים ב-12 μL של 3% ACN/0.1% FA, מערבולת היטב, סוניקטס באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, וצנטריפוגה קצרה ב-2,000 x גרם. העבר כל דגימה לבקבוקוני דגימה אוטומטית.
      הערה: התאם את נפח הדגימה לפי כמות הנוירופפטיד לריכוז של ~ 1 מיקרוגרם פפטיד לכל μL. ניתן להעריך את כמות הפפטיד הכוללת באמצעות בדיקת כמות פפטידים מסחרית (ראה טבלת חומרים) .
    2. השתמש בדגימה אוטומטית כדי להזריק 1 μL של דגימה למכשיר nano-LC-MS/MS ברזולוציה גבוהה (ראה טבלת חומרים).
    3. השתמש בעמודת C18 באורך של כ-15 ס"מ עם פאזה הפוכה (RP) (ראה טבלת חומרים) להפעלת הדגימה עם 0.1% FA במים כפאזה A ניידת ו-0.1% FA ב-ACN כשלב נייד B. הפעל את הדגימות עם שיפוע של 3% - 95% מ-B בקצב של 300 nL/min למשך יותר מ-11 דקות.
    4. עבור מכשיר הטרשת הנפוצה המשמש כאן, השתמש בתנאי MS נפוצים של 2.00 קילו-וולט למתח ריסוס ו-275 מעלות צלזיוס לטמפרטורה נימית.
    5. רכוש ספקטרום MS בטווח של 200 - 2,000 m/z עם רזולוציה של 60,000, יעד בקרת רווח אוטומטי (AGC) של 1 x 106, וזמן הזרקת יונים מרבי (IT) של 150 אלפיות השנייה.
    6. בחר את 15 היונים החזקים ביותר (עוצמה מינימלית של 3.2 x 104) עבור פיצול דיסוציאציה של התנגשות באנרגיה גבוהה יותר (HCD) באמצעות אנרגיית התנגשות מנורמלת של 30, חלון בידוד של 2.0 m/z, רזולוציה של 15,000, יעד AGC של 2 x 105, ו- IT מרבי של 250 אלפיות השנייה.
    7. הגדר חלון הרחקה דינמי של 30 שניות. לא לכלול יונים עם חיוב של 1 או ≥ 8 ויונים עם מצבי חיוב לא מוכרים.
  4. זיהוי וכימות נוירופפטידים
    הערה: תוכנות רבות לחיפוש מסדי נתונים וכימות פפטידים (הן בקוד פתוח והן במסחר) זמינות. כאן, PEAKS Studio (תוכנת פרוטאומיקה)15 ישמש.
    1. בצע חיפוש במסד נתונים באמצעות השלבים המתוארים ב- 1.4.2 - 1.4.6.
    2. צור פרויקט חדש והוסף את נתוני LC-MS הבוחרים ללא עבור האנזים, Orbitrap עבור המכשיר, HCD עבור השבר ורכישה תלוית נתונים (DDA) לרכישה.
      הערה: בחר את הפרמטרים המתאימים בהתבסס על פרמטרים של רכישת נתונים.
    3. בחר זיהויים ובחר מבשר נכון [DDA] ומסה בלבד.
    4. בחר חיפוש מסד נתונים והגדר סובלנות שגיאה של 20.0 ppm באמצעות מסה מונואיזוטופית עבור מסה מבשרת ו - 0.02 Da עבור מסת יון שבר, ללא עבור סוג אנזים, לא ספציפי למצב עיכול, 100 עבור מחשוף מקסימלי שהוחמצו, ואת המשתנה הבא PTMs עם המשתנה המרבי המותר PTM לכל פפטיד של 3: אימה, חמצון (M), Pyro-glu מ- E, ופירו-גלו מ-Q.
    5. בחר את מסד הנתונים של נוירופפטידים, הערך את שיעור הגילוי הכוזב (FDR) באמצעות היתוך דמה.
      הערה: יש להתאים את שגיאת עמידות ההמונים כך שתתאים לנתונים שנאספו. השתמש במסד הנתונים המתאים לסוג המדגם. כאשר לא נבחר אנזים, פרמטר הבקעים המקסימלי שהוחמצו אינו משפיע על החיפוש. עם זאת, נדרש מספר רב של מחשוף שהוחמצו אם לתוכנה אין את מצב העיכול שלא צוין כאופציה.
    6. אם רצוי כימות ללא תווית, בחר כימות, בחר Label-Free והגדר סובלנות שגיאה של 20.0 ppm וסובלנות זמן שמירה של 1.0 דקות.
    7. בצע כימות יונים מקדים אם בוצע שלב 1.2 לתיוג איזוטופי.
      1. בחר כימות, בחר כימות יונים מקדים, השתמש בטווח זמן שמירה של 1.0 דקות והשתמש בסף FDR של 1%.
      2. בחר שיטת כימות מוגדרת מראש או מותאמת אישית מהתפריט הנפתח 'בחר שיטה '.
      3. כדי ליצור שיטה מותאמת אישית חדשה, לחץ על > חלון > תצורה > Label Q Method > חדש. תן שם לשיטה החדשה ובחר כימות יונים מבשר עבור סוג השיטה. בחר הוסף שורה ובחר שינוי מהרשימה אפשרויות PTM.
      4. הוסף את נתוני ה- LC-MS ובחר תנאי ייחוס להיות השינוי על נוירופפטידים ממצב הבקרה של הניסוי.
    8. הערך את תוצאות החיפוש כמתואר בשלבים 1.4.9 - 1.4.11.
    9. סנן את התוצאות דרך לשונית הסיכום עבור פפטידים וחלבונים עם -10lgP ≥ 20, בחר ≥ 1 פפטיד ייחודי ובחר תיבה המסומנת בפפטידים משמעותיים.
    10. הערך את תוצאות החיפוש של מסד הנתונים כאשר protein.csv מייצג זיהוי נוירופפטידים ופפטיד.csv מייצג זיהוי שברים נוירופפטידיים.
    11. בדוק את מסד הנתונים בחיפוש אחר ציוני חלבונים ופפטידים, דיוק מסה וכיסוי רצפים.
      הערה: כל תוכנת חיפוש במסד נתונים משתמשת באלגוריתמים ייחודיים לניקוד וייתכן שיהיה צורך להעריך אותה בהתאם. ניתן להעריך זיהויים על ידי בדיקה ידנית של הספקטרום שנצפה עבור פפטידים מזוהים המכילים את סדרת יוני השבר השלמה.

2. ניתוח איתור MALDI-MS של נוירופפטידים

  1. הכנת דוגמאות
    1. בצע את שלב 1.1 או שלבים 1.1 - 1.2 אם יש צורך בכימות, למעט שלב 1.2.8 (התפלה לאחר תיוג איזוטופי אינה נדרשת לפני ניתוח MALDI-MS).
    2. שחזרו את הנוירופפטידים המותפלים המיובשים ב-5 μL של 0.1% FA, באר מערבולת, סוניקאט באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, וצנטריפוגה לזמן קצר ב-2,000 x גרם.
    3. לאיתור נוירופפטידים ברקמות סרטנים, הכינו 150 מ"ג/מ"ל 2,5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית (DHB) ב-50% מתנול (MeOH)/0.1% FA (v/v) כמטריצה.
    4. פיפטה טיפה של 3 μL של דגימה על סרט הידרופובי (ראה טבלת חומרים) ופיפטה 3 μL של המטריצה ישירות על טיפת הדגימה. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.
    5. פיפטה 1 μL של דגימת 1:1: תערובת מטריצה לתוך באר של לוחית המטרה מפלדת אל-חלד MALDI. השתמשו בקצה הפיפטה כדי לפזר כל תערובת החוצה עד לקצות הדגימה היטב. הדגימה חייבת לגעת בשולי חריטת הבאר כדי לאפשר התפלגות אחידה (איור 4A).
    6. ספוט 1 μL של קליברנט 1:1:1:תערובת מטריצה (תערובת כיול מסחרית או מותאמת אישית, חומרים פולימריים (כלומר, זרחן אדום מומס ב- MeOH), או יוני צביר מטריצה נפוצים)12 לבאר ליד הדגימה.
      הערה: אין צורך לערבב זרחן אדום עם מטריצה לפני התצפית.
  2. רכישת נתונים
    1. הכנס לוחית מטרה המכילה כתמי דגימה מיובשים למכשיר MALDI Tandem Time-of-Flight (TOF/TOF) (ראה טבלת חומרים).
    2. עבור מטריצת DHB, הגדר את עוצמת הלייזר ל - 95%, בחר רווח גלאי אופטימלי אוטומטי, ו - Smart - מצב תנועה של מדגם מלא. רכשו ספקטרום טרשת נפוצה בטווח של 200 - 3200 מ"ק/z והוסיפו ספקטרום מרובה מכל נקודה יחד כדי להגדיל את יחס האות לרעש הנוירופפטידי.
      הערה: מטב את אחוז כוח הלייזר, רווח הגלאי ובחר את מצב התנועה המתאים של המוביל לדוגמה, כך שכל רכישה מכסה בערך את כל הנקודה והרכישות הבאות לא יעברו לעמדות הקודמות.
    3. כיול המכשיר.
      הערה: התאם את טווח המסה כך שיכלול את טווח הנוירופפטידים הרצוי.
  3. ניתוח נתונים
    1. פתח את קובץ MALDI-MS בתוכנת ניתוח נתונים (ראה טבלת חומרים) ולחץ על חיסור בסיסי עבור התוכנה המשמשת כאן.
    2. בצע בחירת שיא על-ידי לחיצה על מצא רשימת מסות. אם יש מעט מדי פסגות, ערוך את רשימת המסות באופן ידני על-ידי בחירה באפשרות ערוך רשימת מסות ולחץ על פסגות בספקטרום כדי להוסיף אותן לרשימת המסות.
    3. בצע התאמת מסה מדויקת על-ידי השוואת רשימת מסות עם מסד נתונים נוירופפטידי המכיל ערכי [M+H]+ m/z (± שגיאה של 200 ppm).
      הערה: תוספות מלח נפוצות, כגון [M+K]+, [M+Na]+, ו-[M+NH4]+, צריכות להיכלל גם הן ברשימת המטרות המדויקות להתאמת מסה.
    4. כדי לאמת את הפסגות שזוהו, צור רשימה של m/z של עניין ובצע ניסויי MS/MS.

3. ניתוח הדמיית MALDI-MS של נוירופפטידים

  1. הכנה לדוגמה
    הערה: שלבי ההטבעה והחתך אינם נחוצים לרקמות דקות מכדי שניתן יהיה לחתוך אותן.
    1. מלאו חצי קריוסטאט בג'לטין (37 מעלות צלזיוס, 100 מ"ג/מ"ל במים שעברו דה-יוניזציה) ואפשרו לה להתמצק בטמפרטורת החדר. שמרו על שאריות ג'לטין נוזלי חם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
    2. אספו את הרקמה העצבית הרצויה מבעל החיים והשתמשו במלקחיים כדי לטבול את הרקמה באופן מיידי בצינור 0.6 מ"ל המכיל מים שעברו דה-יוניזציה במשך 1 שניות.
      הערה: עיין בשלב 1.1.2 הערה עבור כריתת רקמות עצביות.
    3. מניחים את הרקמה על גבי הג'לטין המוצק וממלאים את שארית הקריוסטט בג'לטין נוזלי. השתמש במלקחיים כדי למקם את הרקמה.
    4. מניחים את הקריוסטט על משטח שטוח ומקפיאים בקרח יבש.
      הערה: אחסן דוגמאות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש (באופן אידיאלי תוך 6 חודשים).
    5. להכנת חתך, הפרד את הדגימה המשובצת בג'לטין מתבנית הקריוסטט על ידי חיתוך העובש.
    6. הרכיבו את הרקמה המוטבעת על צ'אק קריוסטאט על ידי צנרת טיפה של 1 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה על הצ'אק ומיד לחיצה על הרקמה המוטבעת על הטיפה.
    7. לאחר הקפאה, פיפטה פיפטה יותר עיצבה מים סביב הרקמה כדי להדק אותם עוד יותר לצ'אק. בצע שלבים אלה בתוך תיבת cryostat (ראה טבלת חומרים) שנקבעה בטמפרטורה של -20 °C (75 °F).
    8. חתכו את הרקמה בעובי משוער של תא אחד (8-20 מיקרומטר בהתאם לסוג הדגימה) והפירו כל חלק על מגלשת זכוכית מצופה תחמוצת בדיל אינדיום (ITO) על ידי הצבת צד אחד של המגלשה ליד הקטע והנחת אצבע בצד השני של המגלשה כדי לחמם באיטיות את הזכוכית ולאפשר לקטע להיצמד למגלשה.
      הערה: ניתן גם להפשיר את חלקי הרקמה על ידי הרמת קצה אחד של הג'לטין עם פינצטה (מצוננת עד -20 מעלות צלזיוס), הנחתו על מגלשת הזכוכית המצופה ב-ITO והנחת אצבע בצד השני של המגלשה כדי לחמם באיטיות את הזכוכית ולאפשר לחלק להידבק למגלשה.
    9. זהה את הדגימה כך שתשמש כקליברנט (ראה שלב 2.1.6 לאפשרויות קליברנט) על ידי ציור עיגול קטן ליד קטע הרקמה באמצעות עט הידרופובי ואיתור הקליברנט בתוך המעגל.
    10. סמן כל פינה בשקופית בעט הלבנה עם צורה קטנה המכילה קצוות חדים (כלומר, x) שישמשו כנקודות לימוד.
    11. מקם את שקופית הזכוכית בלוח מתאם השקופיות של MALDI ובצע סריקת תמונה אופטית ברזולוציה גבוהה (≥2400 DPI) באמצעות סורק.
    12. מטריצת ריסוס על חלק הרקמה באמצעות מרסס אוטומטי (ראו טבלת חומרים לפרטים והוראות מרסס).
    13. עבור MSI של נוירופפטידים ברקמות סרטנים להשתמש 40 מ"ג / מ"ל DHB ב 50% מתנול / 0.1% FA (v / v) כמו המטריצה, להגדיר את טמפרטורת הזרבובית ל 80 ° C, מהירות ל 1,250 מ"מ לדקה, קצב זרימה ל 0.1 מ"ל לדקה, מספר מעברים ל 12, ו 30 s בין כל מעבר עבור המרסס האוטומטי.
  2. רכישת נתונים
    1. הכנס את צלחת המטרה המיובשת לחלוטין המכילה קטעי רקמה מופשרים שרוססו במטריצה.
    2. הגדר את הפרמטרים של קובץ רכישת ההדמיה של MS כך שקוטר הלייזר יהיה קטן מגודל שלב הרסטר.
    3. טען את התמונה האופטית הסרוקה וכייל את לוחית הדגימה באמצעות x נקודות לימוד. הגדירו את אזורי העניין של הרקמה כך שיימדדו מעט גדולים יותר מקטע הרקמה בפועל כך שיכללו גם אזורים המכילים מטריצה בלבד.
    4. כיול המכשיר ורכישת ספקטרה בטווח של 200 - 3200 מ '/z. התאם את טווח המסה כך שיכלול את טווח הנוירופפטידים הרצוי.
  3. ניתוח נתונים
    1. כדי לעבד נתונים, יבא ערכת נתונים של הדמיית MS לתוכנה הרצויה, בחר אלגוריתם הסרה בסיסי ונרמל נתונים באמצעות ספירת היונים הכוללת.
      הערה: בחירה של אלגוריתמי נורמליזציה שונים, כגון חציון, ערך ריבוע ממוצע שורש (RMS), או עוצמת ערך m/z הפניה, תשנה ככל הנראה את ההתפלגות המרחבית של ערכי m/z רבים. בחר את אלגוריתם הנורמליזציה המתאים ביותר לאנליטים הרצויים.
    2. כדי ליצור תמונה עבור כל ערך m/z מרשימת שיא תיאורטית, העלה קובץ ערכים מופרדים בפסיקים (CSV) המכיל נוירופפטיד [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+וכו'. השג ערכי m/z על-ידי לחיצה על קובץ > ייבוא רשימת שיא >. תן שם לרשימת השיאים.
    3. כדי להעריך את סף השגיאה המתאים ל-ppm, תחילה זהה באופן ידני שיא נוירופפטידי בספקטרום הטרשת הנפוצה והשווה אותו למסה התיאורטית של הנוירופפטיד. חשב את שגיאת ה- ppm ולחץ על מאפייני קובץ > קובץ > רוחב מרווח ושגיאת קלט ppm.
    4. בחר את רשימת השיא מהתפריט הנפתח ולחץ על צור תמונות m/z עבור כל מרווח של רשימת השיא.
    5. שמור כל תמונה m/z על-ידי לחיצה על שמור צילום מסך של כל תמונה m/z.
      הערה: זיהוי נוירופפטידי פוטטיבי יכול להתבצע על ידי זיהוי תמונות m/z שבהן אות האנליט נמצא רק בתוך הרקמה ולא במטריצה הסובבת אותה.
    6. כדי לאמת את זהות השיא, צור רשימה של m/z של עניין ובצע ניסויי MS/MS.

4. גילוי נוירופפטידים פוטטיביים חדשניים באמצעות ריצוף דה נובו

  1. בצע שלבים 1.4.2 - 1.4.5.
  2. ייצוא פפטידים דה נובו בלבד.csv מתוכנת PEAKS עם ציון ממוצע של ביטחון מקומי (ALC) של ≥ 75.
    הערה: ישנן תוכנות רבות הזמינות לביצוע ריצוף דה נובו , כל אחת עם אלגוריתמי ניקוד משלה ויש להעריך אותה בהתאם.
  3. חפש ברשימת הפפטידים מוטיבים ידועים של רצף המעידים על נוירופפטידים השייכים למשפחות נוירופפטידים ספציפיות19.
    הערה: בעוד שמוטיבים נשמרים בדרך כלל היטב בין מינים, יש לבחור את המוטיבים שחיפשו תוך התחשבות באורגניזם המדגם.

5. כריית תעתיק לרצפי נוירופפטידים חזויים

הערה: שלב זה הוא אופציונלי ומשמש רק להוספה למסד נתונים קיים של נוירופפטידים או לבניית מסד נתונים חדש של נוירופפטידים.

  1. בחר רצף ידוע של חומצות אמינו פרה-פרוהורמון המעניין והשתמש ב- tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
    _LOC=blasthome) כדי לחפש רצף פרה-פרוהורמון של שאילתה כנגד מסדי נתונים הכוללים nr/nt, Refseq_genomes, EST ו-TSA.
    הערה: כדי לחפש רצפי שאילתות כנגד מסד נתונים של חלבונים, השתמש ב- BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
    _SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).
    1. בחר את אורגניזם היעד (מזהה מס) ושנה את הפרמטרים של אלגוריתם הסף של Expect ל - 1000 כדי לכלול יישורים בעלי ניקוד נמוך.
    2. הפעל את תוכנית BLAST ולאחר מכן בדוק את התוצאות לקבלת ציונים הומולוגיים גבוהים בין רצפי שאילתה ונושאים היוצרים יישורים משמעותיים. שמור קובץ FASTA המכיל רצף נוקלאוטידים.
      הערה: אם ישנם מספר רצפי נושאים עם ציוני הומולוגיה דומים, בצע יישור MAFFT כדי לצמצם רצפים פוטטיביים20,21.
  2. תרגם את רצף הנוקלאוטידים הפרה-פרוהורמון לרצפי פפטידים פרה-פרוהורמונים באמצעות הכלי Expasy Translate (https://web.expasy.org/translate/). עבור C. sapidus, בחר מיטוכונדריאלי חסר חוליות עבור קוד גנטי.
  3. בדוק אם יש רצף פפטידי אותות ואתרי ביקוע פרוהורמון ברצפי הפפטידים באמצעות SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
    הערה: הומולוגיה לסכימות עיבוד קדם-פרוהורמון ידועות יכולה לשמש גם לזיהוי אתרי ביקוע פרוהורמון. ניתן לחזות שינויים אפשריים לאחר התרגום עבור פפטידי אותות אם תרצה בכך. ניתן להשתמש בסולפינטור (https://web.expasy.org/sulfinator/) כדי לחזות מצב גופרית של שאריות טירוזין. ניתן להשתמש ב-DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) כדי לחזות קישוריות קשר דיסולפידית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זרימת העבודה להכנת דגימות ולניתוח טרשת נפוצה מתוארת באיור 1. לאחר כריתה של רקמה עצבית, הומוגניזציה, מיצוי והתפלה מבוצעים כדי לטהר דגימות נוירופפטידים. אם רוצים כימות מבוסס תווית איזוטופית, דגימות מסומנות ומתותפלות שוב. הדגימה המתקבלת מנותחת באמצעות LC-MS/MS לצורך זיהוי וכימות נוירופפטידים.

נוירופפטידים שזוהו באמצעות תוכנת הפרוטאומיקה צריכים להיות בעלי כיסוי טוב של רצף פיצול פפטידים, אולם הדבר אינו מוגדר או מתוקנן באופן גלובלי. לצורך זיהוי מוחלט, כל חומצת אמינו אמורה לייצר יון מקטע המספק זיהוי ולוקליזציה חד משמעיים. יש להשוות זאת גם עם פפטיד מסונתז לאישור עוצמתו של כל יון מקטע. מכיוון שהעלות לביצוע זה על כל זיהוי פוטטיבי אינה אפשרית, הזיהוי מתואר בדרך כלל על בסיס ביטחון שבו יותר יוני שבר שנצפו מגבירים את הביטחון בזיהוי פפטידים. בעוד שאיור 2A,B מתאר שני נוירופפטידים ששניהם זוהו עם כיסוי של 100% רצף ושגיאת מסה נמוכה כפי שהוגדרה על ידי המגבלה המקסימלית של 0.02 Da, כיסוי הפיצול הלקוי (משלושה יונים בלבד) שנצפה רק עבור הנוירופפטיד באיור 2B מקטין את הביטחון בזיהוי איזופורם מסוים. איור 2C מתאר את כרומטוגרמות היונים שחולצו (XICs), שהיא חלקה המכילה את עוצמת האות של ערך m/z שנבחר כפונקציה של זמן שימור, של נוירופפטיד שזוהה בשתי דגימות המשמשות ל-LFQ. זמני השמירה של הנוירופפטיד שונים מעט משום שהוא זוהה בשתי ריצות נפרדות ורצופות; עם זאת, ההבדל הוא בתוך ערך הסף האמין של דקה אחת. לפיכך, היחס בין השטח המחושב בתוכנה מתחת לעקומה מה- XIC משמש עבור ה- LFQ של נוירופפטיד זה.

עבור הכמות של נוירופפטידים המסומנים בדימתיל, ספקטרום MS1 צריך להכיל שיא בערך הנוירופפטיד התיאורטי m/z ושיא בערך m/z עם הסטת מסה המתאמת להפרש המסה בין ריאגנטים איזוטופיים שבהם נעשה שימוש. באיור 2D, הסטת המסה של דגימה זו של 2-plex dimethyl המסומנת היא 4.025 Da. השטח שמתחת לעקומת היון המבשר מה- XICs שלו מחושב לאחר מכן על ידי התוכנה ומשמש לחישוב יחסי שפע יחסיים. גרסה פשוטה יותר של טבלת ייצוא התוכנה לפרוטאומיקה המכילה נוירופפטידים מזוהים ויחסי ה-LFQ שלהם מוצגת בטבלה 1. תוצאות דומות מתקבלות עבור נוירופפטידים המסומנים באופן איזוטופי.

אלגוריתמי תוכנה מאפשרים ריצוף דה נובו של ספקטרה כדי לזהות נוירופפטידים פוטטיביים חדשניים. כאשר טוענים לזיהוי של נוירופפטידים חדשניים, זיהויים בביטחון גבוה הם מקרים אידיאליים שבהם כל חומצות האמינו מזוהות ומתמקמות באופן חד משמעי, בהתבסס על תצפית יונים של שברים. איור 3 מתאר את הספקטרום של פפטיד מרוצף דה נובו המכיל את מוטיב ה-RYamide ב-C-terminal, מוטיב רצף שמור המשותף לנוירופפטידים ידועים ממשפחת הסרטנים RYamide22. פפטיד הותאם ממסד הנתונים עם כיסוי רצף של 100%, כל חומצות האמינו היוצרות יוני מקטע נצפו, שגיאת מסת יון מקטעית נמוכה כפי שהוגדרה על ידי הגבול המרבי של 0.02 Da והכילה פרופיל אלוטיון גאוסיאני. תוצאות אלה מצביעות על כך שנצפה פפטיד אנדוגני השייך למשפחת הנוירופפטידים של הסרטנים -RYamide.

מדידות נקודתיות של MALDI-MS יכולות לספק זיהויים נוירופפטידיים המשלימים לזיהוי LC-ESI-MS, כמו גם להציע יכולות תפוקה גבוהות יותר. לאחר חילוץ הומוגנט של רקמה גולמית עבור נוירופפטידים, מותפלים ומסומנים (אם רוצים), ניתן לערבב את הדגימה עם מטריצה ולאתר אותה על לוחית המטרה מפלדת אל-חלד MALDI, כפי שמוצג באיור 4A. צנרת מוצלחת של כתמי דגימה הומוגניים מייצרת פסגות שנפתרו בבירור, במיוחד בתוך ספקטרום הכיול (איור 4B). בעת שימוש במכשיר MALDI-TOF, יש לכייל את המכשיר בתחילת כל ניסוי. ניתן להשתמש בכל אנליטים בעלי מסות ידועות כדי לכייל את המכשיר אם הוא נמצא בטווח המסה הרצוי של הדגימה. כאן, זרחן אדום משמש לכיול מסת היונים החיובית של המכשיר. יש לו יתרונות על פני שימוש בתערובות כיול פפטידיות בשל יציבותו בטמפרטורת החדר, עלות זולה, שיאים שופעים בשל הפילמור שלו, יחס אות לרעש גבוה, והוא אינו דורש מטריצה ליינון.

עבור הדמיית MALDI-MS של נוירופפטידים, מכשיר ה-TOF/TOF של MALDI שבו נעשה שימוש דורש כיול תמונה ידני של השקופית המצופה ב-ITO (שלב 3.1.10) כדי לתאם את התמונה האופטית עם הדגימה. הדיאגרמה באיור 5 מציגה את המיקום הנכון של הכוונת הלבנה שישמשו כנקודות הוראה כדי לאפשר למכשיר לתאם את התמונה האופטית הסרוקה עם לוחית הדגימה בפועל. הוא גם ממחיש אזורים בשקופית המצופה ITO שהמשתמש צריך להימנע מהם (כלומר, אינם מכילים מדגם או מטריצה). עבור כיול מסה, המיקום של נקודת דגימת הכיול ביחס לדגימת הרקמה על השקופית המצופה ITO משפיע ישירות על שגיאת המסה בשל האופי האינהרנטי של מנתחי מסה בזמן טיסה, אם כי גודל הבעיה תלוי בשפע של אנליטי המטרה. פתרון לבעיה זו הוא לבדוק באופן ידני שיאים מספקטרום MS1 מקטעי רקמות שונים כדי למצוא עדות להסטת שיא. אם יש הסטת שיא, שקול להוסיף נקודות כיול מסה נוספות לשקופית המצופה ITO ממש ליד כל מקטע רקמה. משם, המשתמש יכול לממוצע את הספקטרום מנקודות הכיול יחד או לבצע הדמיית טרשת נפוצה על קטע רקמה אחד בכל פעם באמצעות נקודת הכיול הקרובה ביותר למקטע הרקמה בלבד. לאחר איסוף הדגימה, ודא שהאות מערכי m/z המתאימים לנוירופפטידים נמצא רק באזור הרקמה (איור 6) לפני הקצאת זיהוי נוירופפטידי פוטטיבי.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה להכנת דגימות נוירופפטידים לניתוח ספקטרומטריית מסה. לצורך ניתוח תמציות רקמות הומוגנטיות של רקמות גולמיות מותפלות, מסומנות בתוויות איזוטופיות יציבות, מותפלות שוב ומנותחות על ידי טרשת נפוצה. עבור ניתוח הדמיה רקמה שלמה מוטבעת, cryosectioned, מיושם עם מטריצה, מנותח על ידי MALDI-MSI. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: זיהוי וכימות המבוצעים באמצעות תוכנת הפרוטאומיקה. נוירופפטידים מזוהים באמצעות ספקטרום של איכות טווח עם (A) כיסוי פיצול MS2 טוב או (B) לקוי. שגיאת התאמת מסת יון מקוטעת מוצגת מתחת לספקטרום. (C) צורות פרופיל XIC וזמן שמירה (RT) ניתנים לבדיקה ידנית לאיתור נוירופפטידים המכומתים באמצעות LFQ. (D) ספקטרום MS1 משמש לזיהוי וכימות של נוירופפטידים המסומנים בדימתיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: ריצוף דה נובו לזיהוי נוירופפטידים חדשניים. (A) ספקטרום MS2 של רומן פוטטיבי RYamide מדגים כיסוי פיצול טוב עם שגיאת מסה נמוכה עבור כל שבר. (ב) יוני השבר שזוהו רשומים לבדיקה ידנית. (C) ה-XIC של הנוירופפטיד החדש נבדק ידנית לצורת השיא של גאוס. קיצורים: RT = זמן שמירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: כתמי MALDI-MS וספקטרום הכיול. (A) איכות ספקטרה MS מסתמכת על התפלגות מטריצה-פפטידית אחידה בבאר המטרה של MALDI נירוסטה. שלוש הנקודות השמאליות הן דוגמאות לנקודות טובות שנוגעות בקצוות של תחריט הבאר ושלוש הנקודות הימניות הן דוגמאות לכתמים רעים. שני הכתמים מכילים מטריצת α-ציאנו-4-חומצה הידרוקסיצינמית (CHCA) ותערובת סטנדרטית של פפטידים. (B) ספקטרום כיול באמצעות אשכולות זרחן אדום מ 500 - 3200 m/z. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: תיאור של שקופית זכוכית מצופה ITO. (A) סכמטי עם אזורים חשובים שצוינו: מיקומים להצבת מקטעי רקמה (מלבנים כחולים בהירים), מיקומי נקודות הוראה אוטומטיים שיש להימנע מהם (מלבנים אדומים), מיקומים לדוגמה של המקומות שבהם ניתן לצייר נקודות הוראה (על הכוונת הלבנה), והיכן ברגים מתחברים ללוח המתאם ויש להימנע מהם (אליפסות כחולות כהות). (B) תמונה של שקופית זכוכית המכילה שני חלקי רקמה, נקודה המכילה תערובת כיול וסימני כוונת. מיקום חתך הרקמה וכתמי הכיול מתוארים בצד השני של מגלשת הזכוכית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: תמונות טרשת נפוצה של בלוטות סינוס C. sapidus . מוצגות תמונות התפלגות יונים של נוירופפטיד [M+H]+ של (A) HL/IGSL/IYRamide (m/z 844.48), (B) אלטוסטאטין מסוג A מסוג NPYAFGLamide או GGPYAFGLamide (m/z 780.40), (C) אלטוסטאטין מסוג A GQYAFGLamide (m/z 754.39), ו-(D) RFamide GRNFLRFamide (m/z 908.52). התמונות נוצרות באמצעות חלון ± 50 ppm מהערך התיאורטי m/z . סרגל הצבעים מציין את טווח עוצמת האות בין 0 ל-100%. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: חיפוש מסד נתונים ותוצאות LFQ. נוירופפטידים זוהו וכומתו באמצעות תוכנת LC-MS ופרוטאומיקה. PTM מזוהים מפורטים יחד עם העוצמות של פפטידים שזוהו בשתי הדגימות עבור LFQ, יחד עם יחס ה-LFQ שנוצר. המסות הממוצעות ותיאורי הנוירופפטידים שנצפו מקובץ FASTA מפורטים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הזיהוי המדויק, הכימות והלוקליזציה של נוירופפטידים ופפטידים אנדוגניים שנמצאים במערכת העצבים חיוניים להבנת תפקודם23,24. ספקטרומטריית מסות היא טכניקה רבת עוצמה שיכולה לאפשר לכל זה להתבצע, אפילו באורגניזמים ללא גנום בעל רצף מלא. מדגימה היכולת של פרוטוקול זה לזהות, לכמת ולמקם נוירופפטידים מרקמה שנאספה מ-C. sapidus באמצעות שילוב של LC-ESI ו-MALDI-MS.

במהלך הכנת מדגם לניתוח LC-ESI-MS, יש לקחת בחשבון. בעוד ש-MS היא טכניקה רגישה, הריכוז הפפטידי הנמוך של רקמה עצבית (עד לטווח הפמטומולר25) מהווה מגבלה רצינית. נדרשת הכנת דגימה זהירה כדי לא רק להסיר רכיבי מטריצה שופעים ומפריעים יותר, כגון חלבונים ושומנים, אלא גם למזער את אובדן הנוירופפטידים בכל שלב 26,27. לדוגמה, ניתן להפחית את אובדן הדגימה על ידי שימוש בצינורות מיקרוצנטריפוגה המתנגדים לספיחה פפטידית. בהתאם להרכב הרקמה המעניינת, השימוש בממסים שונים (למיצוי או משקעים) או חומרי מיצוי בפאזה מוצקה יכול לשמש להפרדת ביומולקולות בגדלים שונים ותכונות כימיות. כדי להבטיח שפפטידים הידרופיליים או הידרופוביים יהיו נוכחים בתמצית הנוירופפטידית, ניתן להשתמש במערכות ממס מיצוי מרובות כדי להתמקד בנוירופפטידים בעלי תכונות פיסיקוכימיות שונות. אלה, יחד עם השימוש במעכבי פרוטאזות, עשויים להיות נחוצים לשינוי לצורך טיהור אופטימלי כדי לשפר את ההתאוששות הנוירופפטידית28. החסרונות של שימוש במערכות מיצוי מרובות הם שיש לאגד מספר רקמות נוירונים כדי לעמוד בדרישה הכוללת לתכולת פפטידים גבוהה יותר, כמו גם בתפוקה מופחתת. שלבים רבים כגון התפלה, תיוג איזוטופי והזרקת טרשת נפוצה ממליצים על כמויות מסוימות של פפטידים התחלתיים. עבור אפיון של דגימות יקרות, כגון נוירופפטידים, מבחני פפטידים נמנעים בדרך כלל כדי למנוע צריכת פפטידים חיצוניים. בנוסף, פותחו מבחני פפטידים כדי לקבוע ריכוז פפטידים מדויק מתקצירי חלבונים, בעלי תכונות כימיות שונות מאשר פפטידים אנדוגניים. כדי להתגבר על סיבוכים כתוצאה מריכוז נוירופפטידי לא ידוע, ניתן לבצע בדיקה ראשונית של פפטידים באמצעות תמציות רקמה עצבית מאוגדת, שבהן התוצאות משמשות כהערכה לכל הניתוחים הבאים, אם כי יש לזכור כי כל הפפטידים בתמיסה נמדדים, ולא כולם נוירופפטידים29. מגבלות אחרות של שיטה זו כוללות הטיות פוטנציאליות לנוירופפטידים לא קוטביים והידרופוביים והיעדר שימור מבנים מקומיים. ניתן לבצע שינויים בהרכבי הממסים ובחומרים, כגון שימוש בתמיסות הידרופוביות יותר או השמטת השימוש בממסים אורגניים, כדי לטפל בכך.

מדידות MALDI-MS מסתמכות על שלבי הכנת דגימה זהירים לקבלת תוצאות עקביות ויכולות להיות בעלות שיקולי מדגם שונים מאשר עבור מדידות LC-ESI-MS. שלבים כגון שמירה על תמצית נוירופפטידים על קרח לפני ניתוח טרשת נפוצה עדיין מיושמים. שיטות נוספות למניעת פירוק נוירופפטידים כוללות שמירה על שקופיות זכוכית המכילות מקטעי רקמה המותקנים על הפשרה בקופסת ייבוש לאחר הנתיחה כדי למנוע עיבוי לצבור30, אם כי השארת דגימת הרקמה במפרק לאחר שהתייבשה עלולה לגרום גם להתפרקות הדגימה. מומלץ למקם את שקופיות הרקמה במייבש ואקום (לחץ סופי: 1x10-4 Torr בטמפרטורת החדר) למשך 5-10 דקות מיד לפני יישום המטריצה. לאחר שהמטריצה מופקדת על מגלשת הרקמה, ניתן לשמור אותה במקרר או במקפיא למשך הלילה ולייבש אותה במייבש הוואקום לפני מדידת הדמיית MALDI-MS. עבור מדידות נקודתיות של MALDI, המבנה הגבישי של מטריצה-פפטיד אינו מתפלג באופן שווה לאורך המטרה של MALDI גם אם הוא נראה כך. ישנן דרכים למתן וריאציות של ספקטרום מסה משכפולים טכניים עקב תהליך זה. ראשית, רכשו ספקטרום ממוצע מכל באר באמצעות מספר צילומי לייזר (בדרך כלל מאות עד אלפים) שבהן הלייזר נבלע באופן אקראי על פני הבאר (כלומר, בחירה בתנועת נושאת דגימה חכמה או אקראית בפרמטרים של מכשירים). רכוש לפחות חמישה שכפולים טכניים עבור כל סוג דגימה ובחר שלושה שכפולים טכניים שבהם השונות בעוצמת האות עבור פסגות רצויות היא הנמוכה ביותר. הפשרה כאן היא תפוקה ניסיונית. יש צורך לשמור על פרמטרים כגון מספר צילומי לייזר, קוטר לייזר והגדרות מכשיר אחרות עקביות עבור כל הספקטרום שנרכש. באופן אידיאלי, כל השכפולים הטכניים והשכפולים הביולוגיים מנותחים בו זמנית באמצעות אותו פתרון מטריצה וכיול מכשירים. זיהוי נוירופפטידים יכול להתבצע על ידי התאמת מסה מדויקת לרשימת שיא המכילה תיאורטית [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, [M+K]+, ותוספות מלח אחרות המייצרות ערכי יון m/z טעונים ביחידות. נורמליזציה של נתונים היא קריטית למזעור ממצאים שיטתיים מניסויי MALDI-MS. הערכת יכולת השכפול חשובה במיוחד כאשר מדידות ספוט של MALDI-MS משמשות לכימות נוירופפטידים על ידי תיוג איזוטופ יציב (SIL). ניתן להעריך את איכות הכנת הדגימה ואיסוף הנתונים על ידי לקיחת תקן פפטיד או תמצית נוירופפטידית, פיצולה לשני אליקוטים שווים, תיוג דיפרנציאלי של כל דגימה על ידי SIL וניתוח הדגימה כדי להבטיח שהעוצמה היחסית של פסגות זוגיות היא 1:1. ניתן להשתמש בווריאציה המדווחת מיחסים אלה כדי להעריך את רמת השונות בניסוי הכולל המיוחסת לשגיאה של המשתמש.

חשוב לציין כי MALDI-MS מסוגלת גם לספק מידע על רצף וכמותי; עם זאת, היונים הטעונים באופן ייחודי המיוצרים בדרך כלל על ידי MALDI מגבילים את זיהוי מקטעי הפפטידים, מה שמקשה על השגת הרצף המלא ומעכב את שיטות הכמות הנדונות עבור LC-ESI-MS. ללא קשר, MALDI-MS הוא מודל אטרקטיבי בשל יכולתו לתפוקה גבוהה, כמו גם סובלנות גבוהה יותר למלחים וזיהומים בתוך המדגם12,31. בנוסף, להדמיית MALDI-MS יש יתרונות על פני טכניקות הדמיה קונבנציונליות אחרות הדורשות נוגדנים. ברוב שיטות הטרשת הנפוצה, הורדת רזולוציית המסה תגביר את הרגישות, ותאפשר זיהוי משופר של נוירופפטידים בעלי שפע נמוך. אסטרטגיה זו עשויה להיות מעשית יותר עבור מכשירי MALDI-TOF/TOF מאשר מכשירי LC-ESI-MS בשל הקלות של כיול מכשיר ה-MALDI עבור כל ניסוי. דרך נוספת שבה MALDI יכולה להיות יתרון עבור נוירו-פפטידומיקה היא באמצעות ממוצע ספקטרום. בדרך כלל, לא נעשה שימוש בספקטרום ממוצע ממדידות LC-ESI-MS מכיוון שהוא שולל את היתרונות של הפרדת LC; לכן, תוכנת ביואינפורמטיקה מסתמכת במידה רבה על זיהוי נוירופפטידים והזיהויים מאומתים באופן ידני. עם זאת, יש פחות השלכות על ממוצע הספקטרום ממדידות MALDI-MS מכיוון שלא הייתה הפרדה ראשונית; לכן, הנתונים הגולמיים קטנים יותר וקלים יותר למשתמש לסרוק אותם באופן ידני. קלות ניהול הנתונים חשובה מכיוון שהיא משנה את הסדר שבו המשתמש יכול לגשת לאסטרטגיות זיהוי ואימות של נוירופפטידים. בעוד שביטחון בזיהויים של נוירופפטידים מ-LC-ESI-MS עשוי להפיק תועלת מהגדלת רמת ההחמרה בתחום הסף בתוכנות ניתוח נתונים, אסטרטגיה זו נוטה פחות להועיל לזיהויי MALDI-MS. בדוגמה של נוירופפטידים סרטנים, העובדה שיש פחות מ-1,000 ערכים ממסד הנתונים שנבנה במעבדה (כלומר, מקסימום של <1000 פסגות ספקטרליות או תמונות MS לסריקה ידנית), מאפשרת תחילה לסנן את נתוני MALDI-MS עם סף שגיאת מסה נדיב, ולאחר מכן לאמת באופן ידני את הזיהויים הללו על ידי בחינת המעטפות האיזוטופיות ברמת MS1, וכן שיטות אימות אחרות שנדונו בסעיף תוצאות מייצגות. תוכנה פופולרית לניתוח נתוני הדמיה של MS יכולה לבצע התאמת מסה מדויקת למסד נתונים של מסה נוירופפטידית ולחלץ את תמונות הטרשת הנפוצות המתאימות. עבור שאלות מחקר מבוססות קליניות, כגון גילוי סמנים ביולוגיים, תוכנות אלה מסוגלות לחלץ ערכי m/z ייחודיים לאזור עניין ברקמה (הנקרא בדרך כלל ניתוח אזור עניין (ROI)32 ולבצע בדיקות סטטיסטיות כדי לכמת עד כמה שני אזורי רקמה שונים זה מזה. ראוי גם לציין שיש גם פחות אפשרויות תוכנה לניתוח נתונים להדמיית MS מאשר עבור LC-ESI-MS.

ביצוע חיפושי מסד נתונים של LC-ESI-MS אחר נוירופפטידים כרוך בדרך כלל בשימוש באלגוריתמים של תוכנה שנבנו לניתוח פפטידים מעוכלים. ככזה, יש מגבלות על כך שתוכנה מסוגלת לבצע חיפושים במסדי נתונים של אנזימים שאינם ספציפיים או על משך הזמן שלוקח להשלים את החיפוש. נכון לעכשיו, חיפושי פפטידים אנדוגניים מבוצעים עם המספר המרבי של מבקיעים שהוחמצו, אך מספר זה עדיין מוגבל, מה שמוביל לזיהויים שעלולים להחמיץ. כאשר הגנום של מין מסוים אינו מרוצף במלואו, כמו במקרה של C. sapidus, ניתן לבצע ריצוף דה נובו כדי לזהות נוירופפטידים לא ידועים/חדשניים באמצעות מוטיבים ידועים של רצף נוירופפטידים משומרים, אם כי שיטה זו אינה מצליחה לזהות נוירופפטידים שיש להם מוטיבים לא ידועים או שאינם מכילים את המוטיבים המשמשים כמזהי משפחת נוירופפטידים19. לדוגמה, WSSMRGAWamide הוא מוטיב למשפחת הנוירופפטידים מסוג אלטוסטאטין מסוג B19. כאן טמונה המשמעות של כריית תעתיק עבור רצפי נוירופפטידים חזויים עבור מינים ללא רצף גנום מפוענח לחלוטין33. זיהויים נוירופפטידיים מאושרים לאחר מכן על ידי סינתזה של רצף הפפטידים הפוטטיביים והשוואת ספקטרום MS/MS מפפטיד סינתטי ורקמה ביולוגית34. גם לאחר אימות רצף, לעיתים לא ידוע אם זהו רצף הנוירופפטידים המלא או תוצר השפלה. ראוי לציין כי הבדלים בין מקורות יינון MALDI ו- ESI-MS (ESI היא שיטת יינון רכה יותר מ- MALDI) עשויים לגרום לשיעורים שונים של השפלה מלאכותית (כלומר, פיצול במקור). כדי להבחין בין גרסה חתוכה של פפטיד לבין מוצר פירוק המושרה באופן מלאכותי (כלומר, לא in vivo), יש לדעת את מסלול העיבוד הקדם-פרוהורמוני של אותו נוירופפטיד. מכיוון שלעתים קרובות זה לא המקרה, יש להשתמש בצורה סינתטית של הפפטיד במבחנים פיזיולוגיים ולאמת אותה לפעילות ביולוגית.

באופן כללי, זרימת העבודה המודגמת כאן לניתוח נוירופפטידים יכולה להועיל למגוון תחומים שונים. הוא ממלא פער טכני בתוך ניתוח טרשת נפוצה באמצע-למטה של פפטידים מכיוון שהוא מותאם לפפטידים אנדוגניים שהם קטנים יותר מחלבונים שבדרך כלל מנותחים על-ידי ניתוחי טרשת נפוצה מלמטה למעלה או מלמעלה למטה. לכן, שיטות הכנת הדגימה המשמשות את הנוירו-פפטידומיקה צריכות להיות ניתנות לתרגום במידה רבה לפפטידים אנדוגניים ביו-אקטיביים אחרים, כגון אלה המיועדים על ידי כימאים רפואיים לתכונות אנטי-בקטריאליות35. יתרון של פרוטוקול זה הוא שהוא משתמש בכלים נפוצים של ספקים פופולריים המציעים גם מידה נוספת של יכולת תרגום. בדרך זו, ניתן להשתמש בזרימת העבודה במסגרות אקדמיות ומסחריות, כגון סינון עבור מועמדים לתרופות או מטרות לתרופות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (CHE-1710140 ו- CHE-2108223) ומכוני הבריאות הלאומיים (NIH) באמצעות מענק R01DK071801. A.P. נתמך בחלקו על ידי מענק ההדרכה לממשק כימיה-ביולוגיה של NIH (T32 GM008505). N.V.Q. נתמך בחלקו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, תחת פרס שירות המחקר הלאומי של רות ל. קירששטיין מהמכון הלאומי לריאות ודם ללב למרכז לחקר הלב וכלי הדם של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון (T32 HL007936). L.L. רוצה להכיר במענקי NIH R56 MH110215, S10RR029531 ו- S10OD025084, כמו גם תמיכה במימון של פרופסורה להישגים מצטיינים של וילאס ופרופסור צ'ארלס מלבורן ג'ונסון במימון הקרן לחקר בוגרי ויסקונסין ובית הספר לרוקחות של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents, and Consumables
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix Supelco 39319
Acetic acid Fisher Chemical A38S-500
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A955-500
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
Borane pyridine Sigma-Aldrich 179752
Bruker peptide calibration mix Bruker Daltonics NC9846988
Capillary Polymicro 1068150019 to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter)
Cryostat cup Sigma-Aldrich E6032 any cup or mold should work
 Microcentrifuge Tubes Eppendorf 30108434
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549
Formaldehyde - D2 Sigma-Aldrich 492620
Formic acid Optima LC/MS grade Fisher Chemical A117-50
Gelatin Difco 214340 place in 37 °C water bath to melt
Hydrophobic barrier pen Vector Labs 15553953
Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides Delta Technologies CB-90IN-S107 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)
LC-MS vials Thermo TFMSCERT5000-30LVW
Methanol Optima LC/MS Grade Fisher Chemical A456-500
Parafilm Sigma-Aldrich P7793 Hydrophobic film
pH-Indicator strips Supelco 109450
Red phosphorus clusters Sigma-Aldrich 343242
Reversed phase C18 material Waters 186002350 manually packed into nanoflow column
Wite-out pen BIC 150810
ZipTip Millipore Z720070
Instruments and Tools
Automatic matrix sprayer system- M5 HTX Technologies, LLC
Centrifuge - 5424 R Eppendorf 05-401-205
Cryostat- HM 550 Thermo Fisher Scientific 956564A
Desiccant Drierite 2088701
Forceps WPI 501764
MALDI stainless steel target plate Bruker Daltonics 8280781
Pipet-Lite XLS Rainin 17014391 200 µL
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOF Bruker Daltonics
SpeedVac - SVC100 Savant SVC-100D
Ultrasonic Cleaner Bransonic 2510R-MTH for sonication
Ultrasonic homogenizer Fisher Scientific FB120110 FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe
Vaccum pump- Alcatel 2008 A Ideal Vacuum Products P10976 ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr
Vortex Mixer Corning 6775
Water bath (37C) - Isotemp 110 Fisher Scientific 15-460-10
Data Analysis Software
Expasy https://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysis Bruker Daltonics
FlexControl Bruker Daltonics
FlexImaging Bruker Daltonics
PEAKS Studio Bioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Lab https://scils.de/
SignalP 5.0 https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTn http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_
PROGRAMS=tblastn&PAGE_
TYPE=BlastSearch&SHOW_
DEFAULTS=on&LINK_LOC
=blasthome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hökfelt, T., et al. Neuropeptides - an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
  2. Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
  3. Nässel, D. R., Ekström, P. Detection of neuropeptides by immunocytochemistry. Methods in Molecular Biology. 72, clifton, N.J. 71-101 (1997).
  4. Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).
  5. Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
  6. Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60 (2013).
  7. Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
  8. Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
  9. Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
  10. Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
  11. Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
  12. Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
  13. Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
  14. Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
  15. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
  16. Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
  17. Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207 (2009).
  18. Sample Preparation for Mass Spectrometry. Merck. , Available from: http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737 (2021).
  19. DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
  20. Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
  21. Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
  22. Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. Crustacean neuropeptides. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).
  23. DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 3 (2018).
  24. Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
  25. Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
  26. Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).
  27. Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).
  28. Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
  29. Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , Springer Protocols. New York,NY. 41-49 (2018).
  30. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  31. Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).
  32. Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).
  33. Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
  34. Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
  35. Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).

Tags

כימיה גיליון 183 נוירופפטיד ספקטרומטריית מסות טיהור פפטידים תיוג איזוטופי ריצוף דה נובו כמות LC MALDI הדמיית ספקטרומטריית מסות חיפוש במסדי נתונים כריית תמלול
חקירה ספקטרומטרית מסה רבת פנים של נוירופפטידים <em>בקלינקטס ספידוס</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L.… More

Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus. J. Vis. Exp. (183), e63322, doi:10.3791/63322 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter