Chemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
חקירה ספקטרומטרית מסה רבת פנים של נוירופפטידים בקלינקטס ספידוס
Chapters
Summary May 31st, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
אפיון ספקטרומטרי של מסה של נוירופפטידים מספק מידע על רצף, כמות ולוקליזציה. זרימת עבודה אופטימלית זו שימושית לא רק למחקרי נוירופפטידים, אלא גם לפפטידים אנדוגניים אחרים. הפרוטוקולים המובאים כאן מתארים הכנת דגימות, רכישת טרשת נפוצה, ניתוח טרשת נפוצה ויצירת מסדי נתונים של נוירופפטידים באמצעות LC-ESI-MS, איתור MALDI-MS והדמיית MALDI-MS.
Transcript
הניתוח של פפטידים אנדוגניים, שהם קטנים יותר מרוב החלבונים, אך גדולים יותר מפפטידים מעוכלים רבים, הוא תחום שנבדק. פרוטוקול זה מטפל ב- scap בתהליכי עבודה מבוססי ספקטרומטריית מסות. ספקטרומטריית מסה היא רגישה מאוד וניתן להשתמש בה כדי להתמקד בנוירופפטידים ספציפיים בעלי עניין או ללכוד ולזהות מגוון של נוירופפטידים בתוך דגימה.
הכמות והלוקליזציה של ביטוי נוירופפטידי על ידי ספקטרומטריית מסה יכולה להוביל לפיתוח טיפולים פפטידיים ולגילוי סמנים ביולוגיים נוירופפטידיים למחלות שונות. כדי להתחיל את מיצוי הנוירופפטידים לאסוף רקמת מוח מן הסרטנים באמצעות מלקחיים מיד למקם רקמה אחת כל אחד בצינור 0.6 מיליליטר המכיל 20 microliters של מתנול חומצי. הוסף 150 מיקרוליטרים של מתנול חומצי לדגימה.
הגדר את הזמן הכולל של המטופל סוניק ל-24 שניות, זמן הדופק לשמונה שניות. השהה את הזמן ל-15 שניות משרעת עד 50% על הומוגנייזר קולי והומוגניזציה של הדגימות על הקרח. צנטריפוגה הדגימה בארבע מעלות צלזיוס ב 20, 000 GS במשך 20 דקות.
עם פיפטה העביר את הסופרנטנט לצינור וייבש אותו ברכז ואקום בערך 35 מעלות צלזיוס. עבור התפלה לשחזר את דגימת הרקמה המופקת ב 20 microliters של 0.1% חומצה פורמית. מערבולת את התמיסה וקוניקים באמבט מים בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.
החל 0.5 מיקרוליטרים של דגימה על רצועת pH כדי לוודא שה- pH הוא פחות מארבעה. צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ו-20, 000 GS למשך 30 שניות. הכינו שטיפת שיווי משקל הרטבה בתמיסות אשליה.
השג קצה התפלה של 10 מיקרוליטר עם שרף C18. מניחים את קצה ההתפלה על פיפטה של 20 מיקרוליטר המוגדרת ל-15 מיקרוליטרים. שאפו את הקצה שלוש פעמים עם תמיסת הרטבה ושלוש פעמים עם פתרון שיתוף פעולה שווה.
לשאוף במדגם 10 פעמים ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים בתמיסת שטיפה להשליך כל שטיפה. אלוט על ידי שאיפה 10 פעמים בכל אחד מפתרונות האשליה לפי סדר הגדלת האצטוניטריל. מייבשים את הנוירופפטידים הנרמזים ברכז ואקום.
שחזרו את הנוירופפטידים המותפלים המיובשים בחמישה מיקרוליטרים של 0.1% חומצה פורמית. מערבולת את התמיסה וצליל אותה באמבט מים בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. בקצרה צנטריפוגה ב 2000 GS. לצורך איתור נוירופפטידים ורקמות קרום, פיפטה של דגימה בעלת שלוש טיפות מיקרוליטר על סרט הידרופובי.
פיפטה שלושה מיקרוליטרים של מטריצת DHB ישירות על טיפת הדגימה. מערבבים את הפתרונות על ידי צנרת למעלה ולמטה. פיפטה מיקרוליטר אחד של תערובת הדגימה והמטריקס לתוך באר של צלחת המטרה מפלדת אל-חלד MALDI והשתמשה בקצה הפיפטה כדי לפזר כל תערובת החוצה לשולי המדגם היטב.
זהה מיקרוליטר אחד של תערובת קליבר ומטריצה של אחד לאחד לתוך באר ליד הדגימה. הכנס לוחית מטרה המכילה כתמי דגימה מיובשים למכשיר זמן הטיסה של MALDI. עם מטריצת DHB להגדיר כוח לייזר ל 95% בחר רווח גלאי אופטימלי אוטומטי ומצב תנועה חכם של ספק דגימה מלאה.
רכשו את MS Spectra בטווח של 200 עד 3, 200 M מעל Z והוסיפו ספקטרום מרובה מכל נקודה יחד כדי להגדיל את יחס האות הנוירופפטיד לרעש. ממלאים חצי קריוסטאט בג'לטין ומאפשרים לה להתמצק בטמפרטורת החדר. שמרו על שאריות ג'לטין נוזלי חם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
אספו את הרקמה העצבית הרצויה מבעל החיים והשתמשו במלקחיים כדי לטבול את הרקמה באופן מיידי בצינור 0.6 מיליליטר המכיל מים שעברו דה-יוניזציה למשך שנייה אחת. מניחים את הרקמה על גבי הג'לטין המוצק וממלאים את שארית הקריוסטט בג'לטין נוזלי. השתמש במלקחיים כדי למקם את הרקמה.
מניחים את הקריוסטט על משטח שטוח ומקפיאים בקרח יבש. להכנת חתך הפרד את הדגימה המשובצת בג'לטין מתבנית הקריוסטט על ידי חיתוך התבנית. הרכיבו את הרקמה המוטבעת על צ'אק קריוסטאט על ידי צנרת טיפת מיליליטר אחת של מים שעברו דה-יוניזציה על הצ'אק ומיד לחיצה על הרקמה המוטבעת על הטיפה.
לאחר הפיפטה הקפואה, יותר מים מתפרקים סביב הרקמה כדי להדק אותה עוד יותר לצ'אק. חתכו את הרקמה בעובי משוער של תא אחד. אגודל מרכיב כל מקטע על מגלשת זכוכית מצופה תחמוצת בדיל אינדיום על ידי הצבת צד אחד של המגלשה ליד החלקה והנחת אצבע בצד השני של המגלשה כדי לחמם באיטיות את הזכוכית ולאפשר לקטע להידבק למגלשה.
ייצוא דה נובו רק פפטידים. CSV משיא עם ציון ביטחון מקומי ממוצע של גדול או שווה ל-75. חפש ברשימת הפפטידים מוטיבים ידועים של רצף המעידים על נוירופפטידים השייכים למשפחות נוירופפטידים ספציפיות.
בחר רצף ידוע של חומצות אמינו הורמון טרום-פרו של עניין והשתמש בשחפת פיצוץ N כדי לחפש שאילתת רצף הורמונים טרום-פרו כנגד מסד נתונים. בחר את אורגניזם היעד ושנה מצפה שפרמטרים של אלגוריתם סף ל- 1000 יכללו יישורים בעלי ניקוד נמוך. הפעל את תוכנית blast ולאחר מכן בדוק את התוצאות עבור ציוני הומולוגיה גבוהים בין רצפי שאילתה ונושאים היוצרים יישורים משמעותיים.
שמור את קובץ FASTA המכיל רצף נוקלאוטידים. תרגם את רצף הנוקלאוטידים של הורמון טרום-פרו לרצפי פפטידים של הורמון טרום-פרו באמצעות כלי התרגום של Expasy. עבור callinectes sapidus בחר מיטוכונדריאלי חסר חוליות עבור קוד גנטי והפעל את הכלי.
בדוק אם יש רצף פפטידי אות ואתרי ביקוע פרו-הורמון ברצפי הפפטידים באמצעות האות P.זהו ספקטרום פיצול של נוירופפטיד המזוהה עם כיסוי רצף של 100% בשגיאת מסת שבר נמוכה עם גבול מקסימלי של 0.02 דלטון. הנה ספקטרום של נוירופפטיד המזוהה גם עם כיסוי רצף של 100%, אך עם מספר נמוך של יוני שבר, ולכן הביטחון של הזיהוי נמוך. אלה הם כרומטוגרמות היונים המופקות עבור נוירופפטיד יחיד שזוהה בשתי ריצות נפרדות ורצופות.
למרות שזמן השמירה שונה מעט, עדיין ניתן להשתמש בו לכימות ללא תווית מכיוון שהזזת הזמן היא פחות מדקה אחת. זוהי דוגמה לספקטרום מסת סריקה מלא המכיל נוירופפטיד שכותרתו דימתיל והתוצאה היא תזוזת מסה של 4.025 דלטון בין הצורות הקלות והכבדות של הנוירופפטיד. ספקטרום מסת יון השבר של פפטיד ברצף דה נובו מדגים כיסוי פיצול טוב, כאשר יון שבר B ו-Y נצפה עבור כל חומצת אמינו עם שגיאת מסה נמוכה של 0.02 דלטון.
זה מצביע על כך שנצפה פפטיד אנדוגני השייך למשפחת הנוירופפטידים RYMI של הסרטנים. דוגמאות לנקודות טובות שנוגעות בכל הקצוות של תחריט הבאר מוצגות בצד שמאל. ודוגמאות של כתמים רעים מוצגים בצד ימין.
לאחר הדמיית MALDI MS של נוירופפטידים מרקמות קלינקטים סאפידוס, התקבלו תמונות התפלגות יונים של ערכי M over Z שונים המתאימים לנוירופפטידים שונים. אופטימיזציה של ממס חילוץ עבור סוג אנאלי מסוים היא חיונית. כמו כן ודא שמתרחשת הומוגניזציה מלאה והתאם את השיטה לפי הצורך.
שום דבר לא יזוהה במורד הזרם אם הוא לא יחולץ. טכניקה זו יכולה לספק רשימה בסיסית של נוירופפטידים חשובים שניתן לחקור עוד יותר כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים, כמו גם לספק מידע לוקליזציה לא ממוקד ללא צורך בנוגדנים.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
