Summary
在这里，我们描述了从小鼠骨骼肌中分离线粒体的详细方法，以及随后使用基于微孔板的呼吸测定通过耗氧率（OCR）分析呼吸。该管道可用于研究多种环境或遗传干预措施对线粒体代谢的影响。
Abstract
细胞的大部分能量是通过葡萄糖，脂肪酸和氨基酸的降解获得的，这些途径通过收敛于线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）系统的不同途径获得，该系统响应细胞需求而调节。脂质分子辅酶Q（CoQ）通过恒定的氧化/还原循环将电子转移到电子传递链（ETC）中的复合物III，在此过程中是必不可少的。线粒体状态以及最终的细胞健康可以通过使用呼吸测定法测量ETC耗氧量来评估。这些研究通常在已培养数天的已建立或原代细胞系中进行。在这两种情况下，获得的呼吸参数可能偏离了任何给定器官或组织中的正常生理条件。
此外，从骨骼肌分离的培养单纤维的内在特性阻碍了这种类型的分析。本文提出了一种更新和详细的方案，用于分析从小鼠骨骼肌中新鲜分离的线粒体中的呼吸。我们还为流程任何阶段可能出现的潜在问题提供解决方案。这里介绍的方法可用于比较不同转基因小鼠模型中的耗氧率，并研究线粒体对药物治疗或其他因素（如衰老或性别）的反应。这是一种可行的方法来回答有关线粒体生物能量代谢和调节的关键问题。
Introduction
线粒体是细胞中的主要代谢细胞器1。这些专门的膜封闭细胞器使用营养分子通过OXPHOS以三磷酸腺苷（ATP）的形式产生能量。该过程依赖于ETC2中一系列氧化还原反应中供体分子的电子转移。辅酶Q是唯一一种在所有细胞膜和循环脂蛋白中内源性产生的氧化还原活性脂质，具有抗氧化功能3。它是ETC的重要组成部分，将电子从NADH依赖性复合物I和FADH2依赖性复合物II转移到复合物III，尽管许多其他还原酶可以驱动线粒体CoQ还原为泛醇，作为多个细胞代谢途径中的强制性步骤4，5。
在整个过程中，在线粒体内膜上产生电化学质子梯度，由ATP合酶复合物V2转化为生物活性能量。因此，线粒体功能障碍导致无数的病理状况，主要影响具有高能量需求的组织 - 大脑，心脏和骨骼肌6，7。因此，开发准确分析线粒体生物能量学的方法以研究其在健康和疾病中的作用至关重要，特别是在骨骼肌等高能组织中。
克拉克型氧电极已被经典地用于线粒体呼吸的研究8。然而，该系统已逐渐被更高分辨率的技术所取代，基于微孔板的耗氧技术（如安捷伦海马 XF 分析仪）尤其受欢迎9。在骨骼肌领域，这些研究通常在培养细胞中进行，主要在C2C12永生化小鼠肌母细胞系或来自卫星细胞的原代培养物中进行10，11。然而，这些研究并不能完全概括 体内的情况，特别是在研究线粒体生物学和特定损伤，非遗传干预或遗传操作的组织水平功能时。
此外，由于其他因素，细胞中的呼吸测定更加复杂，包括ATP的线粒体外需求和测定底物或信号传导事件，这可能会误导对结果的解释。或者，也可以使用从肌肉中新鲜分离的单个或一束肌。然而，分离方法在技术上具有挑战性，仅适用于少数肌肉类型。在这种情况下，主要使用短指屈肌（FDB）和长指伸肌（EDL）10，12，13，尽管一些报告也描述了其他肌肉类型的使用14，15。
还报道了骨骼肌切片的生物能量分析16。这种方法的主要优点是可以研究完整的肌肉（作者表明，与分离的肌纤维相比，通过纤维切片不会干扰结果）。然而，线粒体对底物和测定抑制剂的访问是有限的，因此，只能测量几个参数16。最后，分离的线粒体也可以同样使用9，17，18，19。在这种情况下，线粒体会失去其胞质环境，这可能会影响其功能。相比之下，这种方法保证了对底物和抑制剂的访问，能够分析过多的样品类型，并且通常需要更少的材料。
本文描述了一种使用基于微孔板的呼吸测定对小鼠骨骼肌分离的线粒体进行生物能量分析的方法（图1）。特别是，详细列出了三种方案：偶联测定，CA，用于评估ETC和OXPHOS机器之间的偶联程度;电子流测定，EFA测量单个ETC配合物的活性;和BOX测定法测定线粒体β氧化能力。值得注意的是，与传统的呼吸法相比，只需要少量的样品。此处使用的隔离协议已从其他地方发布的方法进行了修改18。
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Protocol
根据西班牙皇家法令53/2013，欧洲指令2010/63 / EU和其他相关指南，使用巴勃罗·德·奥拉维德大学伦理委员会（西班牙塞维利亚;协议24/04/2018/056和12/03/2021/033）批准的协议进行小鼠外壳和组织收集。
1. 为呼吸测定制备储备液、缓冲液和试剂
- 准备以下储备溶液，可以在指定温度下储存数月。在所有情况下使用超纯 H2O。
- 将磷酸盐缓冲盐水（PBS）片剂溶解在H2 O中（每200毫升H2O 1片）以制备1x PBS。高压灭菌溶液并将其储存在室温（RT）下。
- 将2克NaOH颗粒溶解在50 mL H 2 O中，以制备1 M NaOH。
- 准备 0.1 M、1 M、5 M 和 10 M KOH 储液以进行 pH 校准。
- 向70毫升H 2 O中加入14.612克EDTA，加入NaOH沉淀，直到pH值达到8.0，使EDTA完全溶解。将 H2O 量子饱和 度 （QS） 加入 100 mL。高压灭菌所得的0.5M EDTA（pH 8）溶液并将其储存在室温下。
- 加入19 g EGTA至70 mL H 2 O中，加入NaOH沉淀至pH值达到8.0，使EGTA完全溶解。将 H2O QS 加入 100 mL 中。高压灭菌所得的0.5M EGTA（pH 8）溶液并将其储存在室温下。
- 加入 2 mL 0.5 M EDTA 到 98 mL PBS 中。将得到的 10 mM EDTA/PBS 溶液储存在 RT 中。
- 将 5.958 g HEPES 溶解在 40 mL H2O 中。用 KOH 将 pH 调节至 7.2，用 H2O 将 QS 调节至 50 mL。通过 0.45 μm 目玻片过滤生成的 0.5 M HEPES 缓冲液，并将其储存在室温下。
- 将3.402 g KH2PO4溶解在高达50 mL的H 2 O中，通过0.45μm的目过滤得到的0.5 M KH2PO4溶液并将其储存在室温下。
- 将9.521克无水MgCl2 溶解在高达100毫升的H 2O中，高压灭菌所得的1 M MgCl2 溶液并将其储存在室温下。
注意：由于这是一种放热反应，因此请谨慎行事并将MgCl2 溶解在冰上。
- 制备底物和抑制剂储备溶液（见 表1）。等分试样并储存在-20°C。 避免冻融循环。作为例外，在使用前始终立即准备丙酮酸。
- 在超纯H2O中制备：0.5M琥珀酸盐，0.5M丙酮酸，0.5M苹果酸，100mM ADP，1M抗坏血酸和50mM N，N，N′，N′-四甲基对苯二胺（TMPD）（避光）。
- 在100%二甲基亚砜（DMSO）中制备：50mM棕榈酰-L-肉碱，4mM鱼藤酮，20mM羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙（FCCP），4mM寡霉素和5mM抗霉素A。
注意：微孔板孔中的最终DMSO浓度不超过0.1%。因此，准备高度浓缩的储备溶液以保持在此限制以下。
- 在实验当天新鲜制备用于线粒体分离和蛋白质定量的缓冲液。除非另有说明，否则在所有情况下均使用超纯H2O，并将所有缓冲液保持在冰上。
注意：为了节省时间，所有试剂都可以称量并保存在前一天的适当温度下放在适当的容器（例如，15 mL管）中。- 为了制备10%游离脂肪酸（FFA）BSA，通过反转/旋转轮将150mg FFA BSA彻底溶解在1.5mL H2O中。不要涡旋以避免起泡。
- 要制备1x Bradford试剂，请用H 2 O稀释5x商业储备溶液，并将其置于室温的黑暗中。
- 要制备8x线粒体缓冲液（MB），将4.112g蔗糖和763mgHEPES溶解在15mL H2O中。将pH值调节至7.2，加入1.6mL的10%FFA BSA和QS至20 mL与H2O。
- 为了制备20 mL分离缓冲液1（IB1）（每个样品使用4 mL），在15 mL H 2 O中溶解400μL0.5 M EDTA，784mgD-甘露醇和2.5mL8x MB。
- 为了制备5 mL分离缓冲液2（IB2）（每个样品使用500μL），将30μL0.5M EGTA，196mgD-甘露醇和625μL8x MB溶解在4mL H2 O中。
- 为了制备5mL重悬缓冲液（RB）（每个样品使用200μL），溶解120mg蔗糖，191.3mgD-甘露醇，50μL0.5M HEPES和10μL0.5M EGTA在4mL H2O中。
- 为了制备2x线粒体测定溶液-1（MAS-1），将1.199克蔗糖，2.8克甘露醇，1毫升0.5M KH2PO4，250μL1 M MgCl2，200μL0.5M HEPES和100μL0.5M EGTA溶解在20 mL H2O中。用H2O调节pH值至7.2，QS至25 mL。保持短时间在冰中。对于较长时间，将其保持在4°C以避免沉淀。
- 要制备1x偶联测定培养基（CAM），请制备两种不同的基于MAS-1的缓冲液：1）CAM + BSA用于CA测定，以及2）CAM-BSA用于制备测定抑制剂。始终将丙酮酸：苹果酸盐的比例保持在10：1。
注意：由于BSA会堵塞注射口，因此请稀释不含BSA的CAM中的抑制剂。- 要制备CAM + BSA，将300μL丙酮酸，30μL0.5M苹果酸和7.5m2x MAS-1稀释在6mL H2O中。调节pH值至7.2。加入 300 μL 10% FFA BSA 和 QS 至 15 mL 含 H2O。
- 要制备CAM-BSA，在2 mL H2O中稀释120μL0.5M丙酮酸，12μL0.5M苹果酸和3mL2x MAS-1。
- 要制备1x电子流测定培养基（EFAM），请制备含BSA和不含BSA的EFAM缓冲液。
- 为了制备EFAM + BSA，在6 mL H 2O中稀释300μL0.5M丙酮酸，60μL0.5M苹果酸，3μL20mM FCCP和7.5mL 2x MAS-1。加入 300 μL 10% FFA BSA 和 QS 至 15 mL 含 H2O。
- 要制备EFAM-BSA，在2 mL H2O中稀释120μL0.5M丙酮酸，24μL0.5M苹果酸，1.2μL20mM FCCP和3mL 2x MAS-1。
- 要制备1x β氧化培养基（BOXM），请制备含BSA和不含BSA的BOXM溶液。
- 要制备BOXM + BSA，在7 mL H2O中稀释12μL50mM棕榈酰-L-肉碱，30μL0.5M苹果酸和7.5mL2x MAS-1。加入 300 μL 10% FFA BSA 和 QS 至 15 mL 含 H2O。
- 要制备BOXM-BSA，将4.8μL50mM棕榈酰左旋肉碱，12μL0.5M苹果酸和3mL2x MAS-1稀释在2mL H2O中。
2. 肌肉解剖、均质化和线粒体分离
- 将所有材料和缓冲液放在冰上。确保所有材料在整个过程中都是冰冷的，以保护线粒体免受损坏。
- 将每个样品三个50 mL烧杯放在冰上，并加入以下溶液：10 mL PBS在烧杯1中，10 mL 10 mM EDTA / PBS在烧杯2中，4 mL IB1在烧杯3中。
- 通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。避免CO2 安乐死，因为骨骼肌可能会变得缺氧，干扰呼吸分析。
- 用70%乙醇喷洒右后肢以防止皮毛脱落，并用胶带将肢体绑在软木塞解剖板上。用胶带粘住左前肢。
- 用无菌的一次性手术刀从膝盖到脚趾穿过皮肤做一个切口。
- 用齿镊子在脚踝水平夹住皮肤，并在脚踝周围用细剪刀剪开。
- 用细尖镊子一手将皮肤从下面的肌肉组织中移开，另一只手用齿镊子将其拉起。
- 从脚踝到膝盖解剖所有骨骼肌（图2）。
- 去除胫骨前肌（TA）上的所有结缔组织，以使用细镊子和剪刀促进肌肉提取。
- 找到EDL肌肉的四个远端肌腱，并将它们切除在靠近脚趾插入处的地方。找到TA远端肌腱并将其切入靠近其插入处，始终在脚踝下方。
- 小心地将TA和EDL肌腱拉到脚踝上方，以释放松动的末端。
- 抓住肌腱松弛的末端，通过向上拉动肌肉和骨骼来缓解肌肉远离其他部位和骨骼。使用精细的镊子或剪刀来促进这个过程。小心行事，避免肌纤维收缩。
- 切除EDL的近端肌腱和TA肌，使其尽可能靠近膝盖骨。
- 将鼠标倒置以继续进行腓肠肌（GA）和比目鱼肌肉提取。
- 用齿镊子抓住股二头肌和GA之间形成的口袋。使用细剪刀分离这些肌肉，并可视化近端GA肌腱。
- 用细镊子抓住跟腱，并用细剪刀小心地切割。通过将GA和比目鱼肌肉从下面的骨骼中释放出来，将它们拉到肌腱上。切开近端GA肌腱，将其与下面的比目镜一起释放。
- 按照相同的程序，小心地将剩余的肌肉从肌腱解剖到肌腱，直到只剩下骨骼。
- 将鼠标重新固定在初始位置以解剖股四头肌。
- 用齿镊子和细剪刀将脂肪组织丢弃在近端侧的股四头肌上。
- 在股四头肌和股骨之间插入细镊子，并沿股骨轴向两个方向移动，以将肌肉与骨骼分开。
- 用齿镊子抓住股四头肌远端肌腱，并用细剪刀尽可能靠近膝盖骨切割肌腱。
- 将股四头肌向上拉，用细剪刀将其释放在近端插入处。
- 用左后肢重复此部分的步骤4-8。
- 首先冲洗烧杯1中的所有肌肉，然后冲洗烧杯2中的所有肌肉。
- 将所有肌肉转移到烧杯3上，并在冰上用锋利的剪刀将所有肌肉切碎。
- 将悬浮液转移到C管（紫色盖子）中，始终将其保持在冰中。
- 紧紧关闭C管并将其倒置到均质机的套筒上。确保样品材料位于旋转器/定子区域。选择名为 “m_mito_tissue_01”的 1 分钟程序。
- 将匀浆分成两个2mL预冷微量离心管，并在台式离心机中以700× g 在4°C下离心10分钟。
- 将上清液转移到新的2 mL预冷管中，小心避免脂肪和非匀浆组织。将颗粒储存在-80°C下以测定碎裂纯度（馏分N）（图3）。
- 在4°C下以10，500× g 离心上清液10分钟。
- 将上清液转移到新的2 mL预冷管中，并将其标记为1号上清液（SN1）。将它们储存在-80°C下以测定碎裂纯度（图3）。
- 在冰中以总体积为500μL的IB2重悬并混合两种沉淀。
- 在4°C下以10，500× g 离心10分钟。
- 将上清液转移到新的2 mL预冷管中，并将其标记为2号上清液（SN2）。将其储存在-80°C下以测定碎裂纯度（图3）。
- 将最终的线粒体沉淀重悬于200μLRB中。快速留出10μL用于蛋白质定量，并立即向剩余的线粒体悬浮液中加入10μL10%FFA BSA以防止损伤。
- 使用布拉德福德测定法测定蛋白质浓度。
- 对于标准曲线，在RB缓冲液中制备30μL已知浓度蛋白质的连续稀释液。例如，使用 1 毫克/毫升、0.5 毫克/毫升、0.25 毫克/毫升、0.125 毫克/毫升、0.0625 毫克/毫升和 0 毫克/毫升的生物安全脂蛋白。
- 在RB缓冲液中制备线粒体样品的1：3和1：6连续稀释液。
- 在96孔平底板中，首先每孔上样2.5μL样品/标准品。接下来，向每个样品中加入10μL1 M NaOH，最后向200μL1x Bradford试剂中加入。混合均匀，避免气泡。目视检查样品的颜色是否在校准线内。始终一式三份执行分析。
- 在黑暗中的室温下孵育板5分钟，并在微孔板分光光度计中读取595nm处的吸光度。
- 通过绘制本节（x轴）中步骤22.1中制备的稀释液的吸光度值（y轴）与相应的蛋白质浓度来计算标准曲线。
- 通过用标准曲线外推计算线粒体样品中蛋白质的总量。
3. 基于微孔板的呼吸测定法的制备
- 在实验前至少12小时用每孔1mL校准缓冲液水合呼吸测定传感器。在37°C（无CO2）下孵育。
注：水合传感器最长可使用72小时。在此步骤中，应小心处理墨盒：如果有任何东西接触到传感器，则可能会影响测量灵敏度。 - 在4°C下用摆动桶微孔板转子和相应的微孔板适配器预冷制备离心机。
- 打开计算机，打开分析软件，然后选择所需的协议。
注：当软件连接到耗氧量测量仪时，会听到咔嗒声。在实验开始之前，加热传感器应为绿色且温度为37°C。 - 根据要进行的测定，从第1节，步骤2中指示的储备中制备抑制剂溶液。为每个解决方案准备足够的卷。参考 见表1 和 表2 。
- 在每个端口中加入每个抑制剂的适当体积，将滤芯插入耗氧量测量仪器，然后开始校准。
注：将抑制剂添加到墨盒中并将卡夹插入仪器需要15-20分钟。确保引入了正确的墨盒组件。当需要传感器盒和实用程序时，可以丢弃墨盒盖和水力助推器。 - 在4°C下以10，500× g 离心步骤2，步骤21的浓缩线粒体悬浮液10分钟。
- 将线粒体沉淀重悬于100μL1x CAM + BSA，1x EFAM + BSA或1x BOXM + BSA中，具体取决于要执行的方案。
- 在相应的测定培养基中进一步稀释浓缩的线粒体样品至最终的0.2μg/ μL浓度。
- 将50μL悬浮液（总10μg蛋白质）接种在冰上的预冷24孔微孔板中。不要在背景校正孔中添加线粒体;仅加入相应的测定培养基。将剩余的线粒体悬浮液储存在-80°C下以测定碎裂纯度（图3）。
- 在预冷的制备离心机中以2，000× g 在4°C下旋转微孔板20分钟。 配重以相应地平衡。
- 在微孔板离心过程中将剩余的测定介质在37°C下加热。
- 离心后，将微孔板放在工作台上5分钟以平衡。在室温下加入450μL温测定培养基，最终体积为每孔500μL。缓慢而小心地这样做，将培养基添加到孔壁上以避免线粒体分离。
- 立即将微孔板放入不带盖子的耗氧量测量仪中，然后开始实验方案（表3）。确保第一步是孵育10分钟，以使微孔板变暖。
- 实验完成后，取出墨盒和微孔板，关闭仪器，然后开始分析。
4. 结果分析
- 对于 CA 和 BOX 检测，请执行以下分析：
- 记录非线粒体O2 消耗量，其对应于抗霉素A和鱼藤酮注射后获得的值的平均值。
注意：抗霉素A和鱼藤酮分别是复合物III和I抑制剂。 - 通过从基础值（测量点 1 和 2）中减去非线粒体 O2 消耗量来计算基础呼吸。
- 从注射复合物V底物ADP（注射液A）后的值中减去非线粒体O2 消耗量，以确定线粒体状态III。
- 从复合物V抑制剂寡霉素（注射液B）注射后的呼吸值中减去非线粒体O2 消耗量，以获得线粒体状态IVo。
- 通过从FCCP注射（注射C）后的呼吸中扣除非线粒体O2 消耗量来计算线粒体状态IIIu。
注：FCCP是一种有效的线粒体氧化磷酸化解奕剂。ATP合成在其存在下被绕过，ETC达到最大活性。 - 从线粒体状态IIIu值中减去基础呼吸值以获得线粒体备用容量，这是在能量需求增加的情况下产生额外ATP的能力。
- 将线粒体状态IIIu除以状态IVo值，得到呼吸控制比（RCR）。
注意：负或零 RCR 值表示线粒体耦合受到影响。
- 记录非线粒体O2 消耗量，其对应于抗霉素A和鱼藤酮注射后获得的值的平均值。
- 参照 EFA，请执行以下计算：
- 通过计算鱼藤酮和抗霉素A注射（注射液A和C）后的平均值获得残留活性。
- 通过从基础值（测量点 1 和 2）中减去残差活性来计算复合物 I 至 IV （CI-CIV） 活性。
- 从注射CII底物琥珀酸盐（注射液B）后的值中减去残余活性，得到CII-CIII-CIV活性。
- 通过从注射细胞色素c还原剂，抗坏血酸和TMPD（注射剂D）后获得的值中扣除残留活性来计算CIV活性。
- 使用条形图表示所有结果，如图 4 所示，以提取适当的结论。
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Representative Results
这里提出的方案允许通过从小鼠骨骼肌中分离线粒体来对线粒体呼吸进行 体内 分析。该方法的概述如图 1 所示。从后肢解剖骨骼肌后（图2），在等渗条件下，通过连续离心使组织均质化和线粒体纯化。分离过程中获得的不同级分的纯度可以通过使用针对不同细胞器标记物的抗体进行蛋白质印迹分析。 图3A 显示了来自不同组分的一般蛋白质谱，显示了分离的组分中的不同蛋白质群体。
图3B 显示所有线粒体含量都在线粒体部分，外部（VDAC和TOMM20）和内部（TIMM23）线粒体膜标记物的强烈信号，甚至核样相关蛋白（mtTFA）的强烈信号证明了这一点。所有细胞核和细胞骨架（β肌动蛋白）都存在于N级分中，它代表细胞核和未破裂的材料（图3C）。此外，大多数内质网（ER）（Calnexin），质膜（Na + / K + -ATPaseα1）或细胞质标志物（LDHA，HSP70或AKT）仍保留在SN1或SN2级分中，突出了分离过程中获得的高纯度（图3C）。然而，线粒体部分有一些ER污染的痕迹，可能是由于这些细胞器的接近。鉴于在随后的呼吸测定中获得的结果，这里描述的分离程序产生高纯度，可行的线粒体制剂。
CA和BOX测定都允许在存在刺激特定代谢途径的几种底物的情况下计算不同的线粒体状态。具体而言，这些测定是在丙酮酸或棕榈酰-L-肉碱氯化物存在下进行的。丙酮酸是克雷布斯循环的底物;苹果酸是克雷布斯循环中间体和NADH电感，而棕榈酰-L-肉碱是脂肪酸β氧化途径的底物。（图4A，B）。在这两种测定中，可以测量的第一个状态是基础呼吸速率，它表示在最初添加到测定介质的底物存在下的线粒体呼吸。然后，实现线粒体状态III，其代表ADP和无机磷酸盐的ATP产生，显示出耦合状态下的最大呼吸。因此，添加ADP后耗氧量增加，如图 4A，B所示。
此外，状态IVo表明质子泄漏与寡霉素抑制ATP合酶有关，这导致呼吸减少，如CA和BOX图中观察到的那样（图4A，B）。FCCP的添加导致状态IIIu，它显示了当氧气消耗量达到这些测定中的最高水平时，线粒体可以在非耦合状态下显示的最大呼吸能力。为了计算所有这些状态，首先确定非线粒体呼吸是基本的，这是在测定结束时注射抗霉素A和鱼藤酮以抑制氧化呼吸时获得的。如图 4A，B所示，这些值需要始终低于基础呼吸，并且在使用分离线粒体的测定（如此处描述的这些测定）的情况下非常接近于零。最后，必须计算RCR参数以评估线粒体完整性。它反映了线粒体是否可以通过以高速率产生ATP和低质子泄漏来对ADP做出反应。在CA和BOX测定中发现的平均RCR值分别为5.78±1.03和3.47±0.42（图4A，B），这与之前报告的最佳RCR一致21，22，23，24。
此外，EFA通过注射特定的底物和抑制剂单独或组合检查ETC复合物的活性（图4C）。CI-CIV活性代表基于丙酮酸盐和苹果酸盐底物的线粒体呼吸，当没有复合物被抑制时;在这种情况下，大多数电子通过CI。由于鱼藤酮是CI的特异性抑制剂，CI在添加后被阻断，导致耗氧量降低（图4C）。CII-CIII-CIV活性在仅CI被阻断时显示呼吸，CII被激活：通过端口B注射的琥珀酸盐是复合物II（琥珀酸脱氢酶）的特定底物。因此，CII降低，启动从CII到CIV的电子流，而CI仍然受到先前的鱼藤酮注射的抑制，产生氧气消耗的增加（图4C）。抗霉素A的添加抑制CIII，阻断通过ETC的电子流并减少氧气消耗。此外，当CIV活性在通过添加抗坏血酸/ TMPD降低后被细胞色素C氧化刺激时确定; 图4C 显示CIV激活导致氧气消耗增加。最后，残留活性是指在加入鱼藤酮和抗霉素A后氧化磷酸化链失活时的氧气消耗量。该值为计算第4节中协议步骤2.2-2.4中所示的复合物活性建立了背景。
图 1：该方法的示意图可视化。 缩写：OCR = 氧气消耗率;ADP = 二磷酸腺苷;OL =寡霉素;FCCP = 羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙;AntA = 抗霉素 A;腐烂=鱼藤酮。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：从后肢中解剖和分离小鼠骨骼肌以进行线粒体呼吸分析。（B）从脚踝旁边穿过皮肤切口，停止膝盖近端。小心地切除覆盖TA的结缔组织。EDL（C）和TA（D）肌腱在靠近其插入物的地方被切开。将TA肌腱向上拉，以使肌肉远离下面的肌肉组织和骨骼。然后，TA被切近端，靠近腹嵴到胫骨。同样，EDL肌肉被放松，近端肌腱在膝盖侧面被细致地切开。（F）TA和EDL解剖后的右后肢。（G）在后肢，切开跟腱以解剖GA和比目鱼肌。（H）GA和比目鱼小心翼翼地从胫骨中解放出来。（I）剩余的肌肉从脚踝到膝盖收集，直到只剩下腓骨和胫骨。（J）解剖后的后肢。（K）解剖股四头肌。（L）收集所有骨骼肌用于后线粒体分离。该过程对两个后肢进行。缩写： TA = 胫骨前部;EDL = 长指伸肌;GA = 腓肠肌。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：碎裂过程的纯度。 （A）用考马斯蓝染色的一般蛋白质谱。（B）线粒体蛋白纯度谱。（C）非线粒体标志物。将线粒体分离过程中获得的不同组分加载并孵育特定亚细胞组分中针对不同蛋白质的抗体。缩写：部分N =非均质组织和细胞核;SN1 = 上清液编号1：细胞质+细胞器;SN2 = 上清液编号2：细胞质+细胞器;VDAC = 电压依赖型阴离子通道;TOMM20 =外线粒体膜20的转座酶;mtTFA = 线粒体转录因子A;TIMM23 =线粒体内膜23的转座酶;LDHA = 乳酸脱氢酶A;HSP70 = 热休克蛋白 70;ER = 内质网。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：具有代表性的结果。 从13个月大雄性野生型C57BL / 6N小鼠的后肢肌肉中分离出的线粒体的生物能量分析。不同底物和抑制剂的注射点在每次测定中都指示。ETC和OXPHOS机械的性能可以分别使用丙酮酸和苹果酸盐，或棕榈酰-L-肉碱和苹果酸盐作为偶联测定（A）或FA测定（B）β氧化的底物进行分析。（C）电子流动测定允许在丙酮酸盐，苹果酸盐和FCCP存在下研究单个线粒体复合物;每孔接种10μg线粒体。结果显示在中点表示选项之后，以聚合形式可视化结果。这与点对点选项形成鲜明对比，点对点选项可以可视化通常在每个测量步骤中执行的9个连续测量。完成分析后，可以在分析软件的 动力学折线图 选项下更改可视化类型。缩写： FA = 脂肪酸;OCR = 耗氧率;ADP = 二磷酸腺苷;FCCP = 羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙;RCR = 呼吸控制比;EFA = 电子流测定;BOX = FA 的β氧化。 请单击此处查看此图的放大版本。
| 偶联测定 | ||||||
| 港口 | 抑制剂 | [库存] | [注射口] | [决赛] | 食谱 | |
| 因赛拜 | 断续器 | |||||
| 一个 | 断续器 | 100 平方米 | 50 毫米 | 5 毫米 | 650 μL | 650 μL |
| B | 寡霉素 | 4 毫米 | 31.6 微米 | 3.16 微米 | 11.3 μL | 1418.7 μL |
| C | 断续器 | 20 毫米 | 60 微米 | 6 微米 | 4.68 μL | 1555.32 μL |
| D | 抗霉素 A // 鱼藤酮 | 5 毫米 // 4 毫米 | 40 微米 // 50 微米 | 4 微米 // 5 微米 | 13.52 μL // 21.12 μL | 1655.36 μL |
| 电子流测定 | ||||||
| 港口 | 抑制剂 | [库存] | [注射口] | [决赛] | 食谱 | |
| 因赛拜 | EFAM-BSA | |||||
| 一个 | 鱼藤酮 | 4 毫米 | 50 微米 | 5 微米 | 16.25 μL | 1283.7 μL |
| B | 琥珀酸 | 500 平方米 | 100 平方米 | 10 毫米 | 286 μL | 1144 μL |
| C | 抗霉素 A | 5米 | 4 微米 | 4 微米 | 12.48 μL | 1547.5 μL |
| D | 抗坏血酸 // TMPD | 1 米 // 50 米 | 100 毫米 // 1 毫米 | 10 毫米 // 100 微米 | 169 μL // 33.8 μL | 1487.2 μL |
| β氧化测定 | ||||||
| 港口 | 抑制剂 | [库存] | [注射口] | [决赛] | 食谱 | |
| 因赛拜 | 箱-生物蓝蛋白 | |||||
| 一个 | 断续器 | 100 平方米 | 40 毫米 | 4 毫米 | 520 μL | 780 μL |
| B | 寡霉素 | 4 毫米 | 31.6 微米 | 3.16 微米 | 11.3 μL | 1418.7 μL |
| C | 断续器 | 20 毫米 | 60 微米 | 6 微米 | 4.68 μL | 1555.32 μL |
| D | 抗霉素 A // 鱼藤酮 | 5 毫米 // 4 毫米 | 40 微米 // 20 微米 | 4 微米 // 2 微米 | 13.52 μL // 8.45 μL | 1668 μL |
表1：用于不同测定的抑制剂溶液的制备。 [Stock] 列显示抑制剂列中指示的化合物的储备溶液的浓度。[注射口]是指要加载到卡式瓶不同端口中的抑制剂溶液的浓度，而[最终]列表示孔中抑制剂的最终浓度。最后，“配方”列指定了必须混合以准备要加载到注射口中的溶液的储备抑制剂溶液和不含BSA的培养基的体积。缩写： ADP = 二磷酸腺苷;FCCP = 羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙;TMPD = N，N，N′，N′-四甲基对苯二胺;抑制=抑制剂;BSA = 牛血清白蛋白;CAM-BSA = 不含 BSA 的偶联测定培养基;EFAM-BSA = 无BSA电子流测定培养基;BOX-BSA = 不含 BSA 的脂肪酸测定培养基的β氧化。
| 港口 | 注入的体积 | 准备的库存（26孔） |
| 一个 | 50 μL | 1300 μL |
| B | 55 μL | 1430 μL |
| C | 60 μL | 1560 μL |
| D | 65 μL | 1690 μL |
表2：注射量的计算。
| 行动 | 时间（分钟） | 重复 | 港口 |
| 校准 | 15-20 | ||
| 等 | 10 | ||
| 混合 + 等待 | 1 + 3 | × 2 | |
| 混合 | 1 | ||
| 测量 + 混合 | 3 + 1 | × 2 | |
| 注入 | 一个 | ||
| 混合 | 1 | ||
| 量 | 3 | ||
| 混合 | 1 | ||
| 注入 | B | ||
| 混合 | 1 | ||
| 量 | 3 | ||
| 混合 | 1 | ||
| 注入 | C | ||
| 混合 | 1 | ||
| 量 | 3 | ||
| 混合 | 1 | ||
| 注入 | D | ||
| 混合 + 测量 | 1 + 3 | × 2 |
表3：不同测定的实验方案设置。
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Discussion
用于研究线粒体呼吸的所有方法都有其局限性;因此，选择最适合特定实验问题的方法至关重要。这项工作提供了一个更新和详细的方案，从小鼠骨骼肌中分离线粒体，以执行不同的呼吸测定以研究线粒体功能。事实上，使用基于微孔板的技术研究孤立线粒体中的线粒体生物能量对于研究组织特异性呼吸的可重复性，可靠性和复杂性是有价值的。此外，使用分离的线粒体可以控制底物的可用性，从而促进对潜在生物学过程的理解。使用分离线粒体的另一个积极方面是，可以研究状态III，因为ADP注射后产生的ATP不会再次转化为新的ADP，因为大多数跨膜ATP酶丢失。此外，在这里描述的测定中，添加寡霉素以阻断潜在的非特异性ATP合成20。
对于此协议，需要强调几个重要的考虑因素。首先，孤立的线粒体非常敏感，应小心处理。所用缓冲液中蔗糖和甘露醇的高含量确保了最佳渗透条件，以保护分离的线粒体免受损害。然而，测定持续时间应保持在最低限度，以保持线粒体活力并防止接种后与微孔板分离。因此，鉴于方案步骤，例如制备测定培养基和底物和抑制剂溶液，或在呼吸测定盒中加载抑制剂，非常耗时，因此每个步骤都应完美协调。此外，与其他基于酶消化21，24 以及研钵和研杵均质的方法17，19，21，23，24不同，这里描述的方法依赖于使用自动均质机，从而实现快速有效的样品均质化。重要的是，如果高度浓缩，线粒体悬浮液的敏感性较低。因此，只有在使用它们之前立即准备稀释液。最后，在适当的螺旋测定过程中快速工作至关重要。通常，当在这些测定中分析培养物中的细胞时，在注射底物或抑制剂后进行三个连续的测量步骤，这导致方案在40到50分钟之间延长，为了确保分离的线粒体在整个过程中的活力，由于其脆弱性，测量步骤的数量通常保持在最低限度19，23，25，将完成呼吸分析所需的时间减少到~20分钟。这项工作中描述的协议（表3）遵循这一趋势，即使以前发表的其他方法报告了具有更长和更标准测量步骤的高效OCR配置文件26。
例如，如果在同一天使用同一组样品进行两次连续测定，则在第一次测定期间为第二次测定准备除线粒体稀释液之外的所有试剂：在开始第二次测定之前，在仪器校准之前，仅稀释，种子和自旋线粒体。实验完成后，必须计算RCR参数（第4节，步骤1.7）以评估所用线粒体制剂的质量。通常，RCR值介于3.5和5之间表示线粒体完整性是最佳的，并显示出功能耦合氧化呼吸25。必须放弃RCR值较低的测定，因为线粒体完整性在分离过程中受到损害。在这些情况下，考虑洗涤线粒体沉淀两次（第2节，步骤19-21）22，如前所述。
其次，在整个过程中保持正确的pH值对于获得成功的结果至关重要。确保所有溶液的pH值均按指示设置，即pH 7.2，并且除非另有说明，否则始终用KOH调节pH值。值得注意的是，含BSA缓冲液的pH值不应直接用pH计测量，因为BSA会损坏探头。因此，在加入BSA之前，调整相应缓冲液中的pH值。为避免由于添加 BSA 而导致 pH 值发生变化，请始终使用 FFA BSA。此外，一些超纯H2O批次可能是酸性的，因此建议使用商业纯化，pH 7 H2O。此外，有必要确保pH计正确校准，并且是测量要制备的化学品的pH值的适当模型。
第三，正确执行样品收集步骤以测量最终线粒体悬浮液的蛋白质至关重要（第2节，步骤21），以防止线粒体破坏。快速但彻底地重悬沉沉淀，收集等分试样，并将FFA BSA添加到剩余的悬浮液中，以保持渗透平衡并保护线粒体免受损害。如果FFA BSA已经存在于重悬缓冲液中，因此，在蛋白质定量过程中，高蛋白质含量会混淆定量结果。这就是为什么在设置等分试样进行定量后需要添加FFA BSA的原因。
第四，这种方法用途广泛，可以根据实验者的需求进行调整。例如，如果所研究的动物模型的特征在于肌肉质量减少（例如，肌肉减少小鼠），则额外的肌肉可以增加线粒体产量。虽然在这项工作中使用了成年野生型雄性C57BL / 6N小鼠，但可以使用任何性别，年龄或遗传背景以及特定肌肉类型的动物。
第五，由于缓冲液和试剂的组成略有不同，实验之间的呼吸值可能会有所不同，每次都需要新鲜制备。年龄，性别，遗传背景或环境条件也会对结果产生深远的影响。然而，成功的实验应显示注射复合底物（如ADP和琥珀酸盐）后耗氧量增加，注射抑制剂（如寡霉素或鱼藤酮）后耗氧量增加，并且当添加强效解耦剂FCCP时明显增加。此外，为了防止高技术变异性，请确保在接种微孔板之前彻底重悬线粒体颗粒以获得均匀的悬浮液。
第六，如果基础呼吸值较低，请考虑进行滴定实验以调整用于接种的蛋白质量。最后，由于这项工作提供了一种获得粗线粒体提取物的方法，因此预计会具有与其他细胞器（主要是ER）相关的一定等级的杂质。更积极的碎裂过程去除这些杂质将不利于线粒体的活力，阻碍呼吸测定的性能。如果纯度是一个问题，特别是如果样品之间不一致，则在对不同的细胞器标记物进行蛋白质印迹后，可以相对于线粒体纯度对测定结果进行归一化（图3）。据我们所知，这是第一种突出对粗提取物中线粒体纯度的担忧的方法。通常，在使用分离线粒体进行呼吸测定的其他方案中，假设在所有情况下都使用相同量的线粒体，则在孔中接种相同量的蛋白质提取物以比较样品。考虑到隔离在所有样本中都是并行执行的，这是一个合理的假设。然而，所研究样品的遗传或环境背景可能导致线粒体提取物纯度的显着差异。例如，如果给定的基因突变导致细胞质ER的发展增加，则来自这些动物的粗线粒体提取物可能含有大于预期的ER含量，因此低于预期的线粒体蛋白。因此，即使将来自对照和突变样品的相同量的总蛋白质接种在微孔板中，突变体的氧气消耗也会被低估。因此，建议必须确定所研究条件下所有条件下提取物的纯度。如果值相当，则不需要规范化。但是，如果样品之间的纯度值差异大大超出实验者愿意接受的统计误差，则应使用它们来规范化耗氧结果。
目前的协议有一些局限性。值得注意的是，这种方法已经针对从小鼠中分离的骨骼肌组织进行了优化。如果使用来自不同物种的不同组织或骨骼肌，则可能需要进行调整。此外，当对分离的线粒体进行分析时，由于缺乏细胞环境和其他可能与线粒体相互作用的细胞器，正常的细胞微环境会丢失。这可能导致结果与生理条件略有不同。最后，当线粒体离心时，它们会粘附在孔的底部。虽然完全必要，但离心对其正常状态的潜在影响是未知的。
重要的是要考虑到，在进行呼吸测定分析后，与孤立线粒体中ATP连接或FCCP刺激的呼吸相关的氧气消耗量的减少可能表明潜在的线粒体改变，可以通过以下方式解释：1）底物通过线粒体内膜的运输受到限制，2）参与特定代谢途径的限速反应的酶的活性降低，例如 ETC，克雷布斯循环，或β氧化，或3）ETC功能受损，以及其他可能的解释。
总之，这里描述的更新方法代表了评估骨骼肌组织ETC和OXPHOS功能的充分和可靠的方法。它具有多种应用，可以评估遗传修饰或环境如何影响导致特定表型的线粒体呼吸。值得注意的是，本方案可以适应其他模式生物或与人类样本一起使用，以评估与人类疾病相关的潜在线粒体功能障碍。
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Disclosures
作者声明他们没有利益冲突要披露。
Acknowledgments
我们要感谢Juan J. Tena使用均质机和CABD蛋白质组学和畜牧业设施提供技术支持。这项工作得到了西班牙教育，文化和体育部通过奖学金FPU16 / 03264到J.D.H.C，法国协会通过奖学金#22450向C.V.-G.，机构资助MDM-2016-0687（Maria de Maeztu卓越单位，CABD基因调节和形态发生系）和BFU2017-83150-P到J.J.C。Junta de Andalucía拨款P18-RT-4572，欧盟的FEDER资助计划以及西班牙科学，创新和大学部向P.N.授予RED2018-102576-T。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
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