Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering af mitokondrier fra museskeletmuskulatur til respirometriske assays

Published: February 10, 2022 doi: 10.3791/63336
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1, 1,2
1Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, CSIC-UPO-JA, Universidad Pablo de Olavide, 2CIBERER, Instituto de Salud Carlos III

Summary

Her beskriver vi en detaljeret metode til mitokondrier isolering fra musens skeletmuskulatur og den efterfølgende analyse af åndedræt ved Oxygen Consumption Rate (OCR) ved hjælp af mikropladebaserede respirometriske assays. Denne rørledning kan anvendes til at studere virkningerne af flere miljømæssige eller genetiske indgreb på mitokondriemetabolisme.

Abstract

Det meste af cellens energi opnås ved nedbrydning af glucose, fedtsyrer og aminosyrer ved forskellige veje, der konvergerer på mitokondrieoxidativ phosphorylering (OXPHOS) -systemet, som reguleres som reaktion på cellulære krav. Lipidmolekylet Coenzym Q (CoQ) er afgørende i denne proces ved at overføre elektroner til kompleks III i elektrontransportkæden (ETC) gennem konstante oxidations- / reduktionscyklusser. Mitokondrier status og i sidste ende cellulær sundhed kan vurderes ved at måle ETC iltforbrug ved hjælp af respirometriske assays. Disse undersøgelser udføres typisk i etablerede eller primære cellelinjer, der er blevet dyrket i flere dage. I begge tilfælde kan de opnåede respirationsparametre have afveget fra normale fysiologiske forhold i et givet organ eller væv.

Derudover hindrer de iboende egenskaber ved dyrkede enkeltfibre isoleret fra skeletmuskulatur denne type analyse. Dette papir præsenterer en opdateret og detaljeret protokol til analyse af åndedræt i friskisolerede mitokondrier fra museskeletmuskulatur. Vi leverer også løsninger på potentielle problemer, der kan opstå på ethvert trin i processen. Den metode, der præsenteres her, kan anvendes til at sammenligne iltforbrugshastigheder i forskellige transgene musemodeller og studere mitokondrieresponset på lægemiddelbehandlinger eller andre faktorer såsom aldring eller køn. Dette er en gennemførlig metode til at svare på afgørende spørgsmål om mitokondriel bioenergetik metabolisme og regulering.

Introduction

Mitokondrier er de primære metaboliske organeller i cellen1. Disse specialiserede membranlukkede organeller bruger næringsmolekyler til at producere energi i form af adenosintrifosfat (ATP) af OXPHOS. Denne proces er afhængig af overførsel af elektroner fra donormolekyler i en række redoxreaktioner i ETC2. CoQ er det eneste redoxaktive lipid, der produceres endogent i alle cellemembraner og cirkulerende lipoproteiner, der viser antioxidantfunktion3. Det er en væsentlig bestanddel af ETC, der overfører elektroner fra NADH-afhængigt kompleks I og FADH2-afhængigt kompleks II til kompleks III, selvom mange andre reduktaser kan drive reduktionen af mitokondriel CoQ til ubiquinol som et obligatorisk trin i flere cellulære metaboliske veje4,5.

Gennem hele processen skabes en elektrokemisk protongradient på tværs af den mitokondrielle indre membran, som omdannes til biologisk aktiv energi af ATP-syntasekomplekset V2. Derfor fører mitokondriel dysfunktion til et utal af patologiske tilstande, der hovedsageligt påvirker væv med høje energibehov - hjernen, hjertet og skeletmuskulaturen6,7. Derfor er det grundlæggende at udvikle metoder til nøjagtigt at analysere mitokondriel bioenergetik for at undersøge dens rolle i sundhed og sygdom, især i meget energiske væv som skeletmuskler.

Oxygenelektroden af Clark-typen er klassisk blevet anvendt i studiet af mitokondriel respiration8. Dette system er imidlertid gradvist blevet fortrængt af teknologier med højere opløsning, hvor mikropladebaserede iltforbrugsteknologier som Agilent Seahorse XF-analysatorer er særligt populære9. På skeletmuskelområdet udføres disse undersøgelser typisk i dyrkede celler, hovedsageligt i C2C12 udødeliggjort muse myoblast cellelinje eller primære kulturer afledt af satellitceller10,11. Disse undersøgelser rekapitulerer imidlertid ikke fuldt ud situationen in vivo, især når man undersøger mitokondriebiologi og funktion på vævsniveau ved specifikke fornærmelser, ikke-genetiske indgreb eller genetiske manipulationer.

Desuden er respirationsassays i celler mere komplekse på grund af yderligere faktorer, herunder ekstra mitokondriel efterspørgsel efter ATP- og assaysubstrater eller signalhændelser, hvilket kan vildlede fortolkningen af resultaterne. Alternativt er det også muligt at bruge enkelt eller bundter af friskisolerede myofibre fra musklerne. Isolationsmetoden er dog teknisk udfordrende og kun mulig for nogle få muskeltyper. I dette tilfælde anvendes flexor digitorum brevis (FDB) og extensor digitorum longus (EDL) muskler hovedsageligt10,12,13, selvom nogle få rapporter også beskriver brugen af andre muskeltyper14,15.

Bioenergetisk profilering af skeletmuskelsektioner er også blevet rapporteret16. Den største fordel ved denne metode er, at intakte muskler kan studeres (forfatterne viser, at udskæring gennem fibre ikke forstyrrer resultaterne sammenlignet med isolerede myofibre). Mitokondrieadgangen til substrater og analysehæmmere er dog begrænset, og dermed kan kun få parametre måles16. Endelig kan isolerede mitokondrier ligeledes anvendes9,17,18,19. I dette tilfælde mister mitokondrier deres cytosoliske miljø, hvilket kan påvirke deres funktion. I modsætning hertil garanterer denne metode adgang til substrater og hæmmere, muliggør analyse af en overflod af prøvetyper og kræver typisk mindre materiale.

Dette papir beskriver en metode til at udføre bioenergetisk profilering af isolerede mitokondrier fra museskeletmuskulatur ved hjælp af mikropladebaserede respirometriske assays (figur 1). Der er navnlig tre protokoller detaljeret: koblingsassayet, CA til vurdering af graden af kobling mellem etc og OXPHOS-maskinen; Elektronstrømsassayet, EFA til måling af aktiviteten af de enkelte ETC-komplekser; og BOX-analysen til bestemmelse af mitokondrie- β oxidationskapacitet. Især kræves der kun små mængder prøver sammenlignet med konventionelle respirometrimetoder. Den isolationsprotokol, der anvendes her, er blevet ændret fra den metode, der er offentliggjort andetsteds18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Indsamling af mus og væv blev udført ved hjælp af protokoller godkendt af Universidad Pablo de Olavide Ethics Committee (Sevilla, Spanien; protokoller 24/04/2018/056 og 12/03/2021/033) i overensstemmelse med det spanske kongelige dekret 53/2013, det europæiske direktiv 2010/63/EU og andre relevante retningslinjer.

1. Forberedelse af lagre, buffere og reagenser til respirationsanalyser

  1. Forbered følgende stamopløsninger, som kan opbevares ved den angivne temperatur i flere måneder. Brug ultrarent H2O i alle tilfælde.
    1. Phosphatbufret saltvand (PBS) tabletter opløses i H2O (1 tablet pr. 200 ml H2O) for at fremstille 1x PBS. Autoklave opløsningen og opbevar den ved stuetemperatur (RT).
    2. 2 g NaOH-pellets opløses i 50 ml H2O for at forberede 1 M NaOH.
    3. Forbered 0,1 M, 1 M, 5 M og 10 M KOH lagre til pH-kalibrering.
    4. Tilsæt 14,612 g EDTA til 70 ml H2O. Tilsæt NaOH-pellets, indtil pH når 8,0, så EDTA opløses helt. Tilføj H2O quantum satis (QS) til 100 ml. Autoklave den resulterende 0,5 M EDTA (pH 8) opløsning og opbevar den på RT.
    5. Tilsæt 19 g EGTA til 70 ml H2O. Tilsæt NaOH-pellets, indtil pH når 8,0, så EGTA kan opløses fuldt ud. Tilføj H2O QS til 100 ml. Autoklave den resulterende 0,5 M EGTA (pH 8) opløsning og opbevar den ved RT.
    6. Tilsæt 2 ml 0,5 M EDTA til 98 ml PBS. Opbevar den resulterende 10 mM EDTA/PBS-opløsning på RT.
    7. Opløs 5,958 g HEPES i 40 ml H2O. Juster pH til 7,2 med KOH og QS til 50 ml med H2O. Filtrer den resulterende 0,5 M HEPES-buffer gennem et 0,45 μm mesh og opbevar den på RT.
    8. 3,402 g KH2PO4 opløses i op til 50 ml H2O. Filtrer den resulterende 0,5 M KH2PO4-opløsning gennem et 0,45 μm net og opbevar det ved RT.
    9. 9,521 g vandfri MgCl2 opløses i op til 100 ml H2O. Autoklaver den resulterende 1 M MgCl2-opløsning og opbevares ved RT.
      BEMÆRK: Da dette er en eksoterm reaktion, skal du fortsætte med forsigtighed og opløse MgCl2 på is.
  2. Der fremstilles substrat- og inhibitoropløsninger (se tabel 1). Aliquot og opbevar dem ved -20 °C. Undgå fryse-optøningscyklusser. Som en undtagelse skal du altid forberede pyruvinsyre umiddelbart før brug.
    1. Der fremstilles i ultrarent H2O: 0,5 M succinat, 0,5 M pyruvinsyre, 0,5 M æblesyre, 100 mM ADP, 1 M ascorbinsyre og 50 mM N,N,N′,N′-tetramethylpara-phenylen-diamin (TMPD) (beskyt mod lys).
    2. Forbered i 100% dimethylsulfoxid (DMSO): 50 mM palmitoyl-L-carnitin, 4 mM rotenon, 20 mM carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP), 4 mM oligomycin og 5 mM Antimycin A.
      BEMÆRK: Overskrid ikke 0,1% endelig DMSO-koncentration i mikropladebrøndene. Forbered derfor stærkt koncentrerede stamopløsninger for at holde dig under denne grænse.
  3. Forbered bufferne til mitokondrier isolering og proteinkvantificering frisk på forsøgsdagen. Brug ultrarene H2O i alle tilfælde og opbevar alle buffere på is, medmindre andet er angivet.
    BEMÆRK: For at spare tid kan alle reagenser vejes og opbevares i de relevante beholdere (f.eks. 15 ml rør) ved den rigtige temperatur den foregående dag.
    1. For at forberede 10% frie fedtsyrer (FFA) BSA opløses 150 mg FFA BSA grundigt i 1,5 ml H2O ved inversion/roterende hjul. Hvirvel ikke for at undgå skumdannelse.
    2. For at forberede 1x Bradford-reagens skal du fortynde den 5x kommercielle stamopløsning med H2O og opbevare den i mørke ved RT.
    3. For at forberede 8x mitokondrier buffer (MB) opløses 4,112 g saccharose og 763 mg HEPES i 15 ml H2O. Juster pH til 7,2, tilsæt 1,6 ml 10% FFA BSA og QS til 20 ml med H2O.
    4. For at fremstille 20 ml isolationsbuffer 1 (IB1) (4 ml anvendt pr. prøve) opløses 400 μL 0,5 M EDTA, 784 mg D-mannitol og 2,5 ml 8x MB i 15 ml H2O. Juster pH til 7,2 og QS med H2O.
    5. For at fremstille 5 ml isolationsbuffer 2 (IB2) (500 μL anvendt pr. prøve) opløses 30 μL 0,5 M EGTA, 196 mg D-mannitol og 625 μL 8x MB i 4 ml H2O. Juster pH til 7,2 og QS med H2O.
    6. For at fremstille 5 ml Resuspension Buffer (RB) (200 μL anvendt pr. prøve) opløses 120 mg saccharose, 191,3 mg D-mannitol, 50 μL 0,5 M HEPES og 10 μL 0,5 M EGTA i 4 ml H2O.
    7. For at forberede 2x mitokondriel assayopløsning-1 (MAS-1) opløses 1,199 g saccharose, 2,8 g mannitol, 1 ml 0,5 M KH2PO4, 250 μL 1 M MgCl2, 200 μL 0,5 M HEPES og 100 μL 0,5 M EGTA i 20 ml H2O. Juster pH til 7,2 og QS til 25 ml med H2O. Opbevares i is i korte perioder. I længere perioder skal du holde den ved 4 °C for at undgå nedbør.
    8. For at forberede 1x koblingsanalysemedium (CAM) skal du forberede to forskellige MAS-1-baserede buffere: 1) CAM + BSA til selve CA-analysen og 2) CAM-BSA til fremstilling af assayhæmmere. Hold altid forholdet pyruvat:malat på 10:1.
      BEMÆRK: Da BSA kan tilstoppe injektionsportene, fortyndes hæmmerne i BSA-fri CAM.
      1. For at fremstille CAM + BSA fortyndes 300 μL 0,5 M pyruvinsyre, 30 μL 0,5 M æblesyre og 7,5 ml 2x MAS-1 i 6 ml H2O. Juster pH til 7,2. Tilsæt 300 μL 10% FFA BSA og QS til 15 ml med H2O.
      2. For at fremstille CAM-BSA fortyndes 120 μL 0,5 M pyruvinsyre, 12 μL 0,5 M æblesyre og 3 ml 2x MAS-1 i 2 ml H2O. Juster pH til 7,2 og QS til 6 ml med H2O.
    9. For at forberede 1x Electron Flow Assay medium (EFAM) skal du forberede både BSA-holdige og BSA-fri EFAM-buffere.
      1. Til fremstilling af EFAM+BSA fortyndes 300 μL 0,5 M pyruvinsyre, 60 μL 0,5 M æblesyre, 3 μL 20 mM FCCP og 7,5 ml 2x MAS-1 i 6 ml H2O. PH justeres til 7,2. Tilsæt 300 μL 10% FFA BSA og QS til 15 ml med H2O.
      2. For at fremstille EFAM-BSA fortyndes 120 μL 0,5 M pyruvinsyre, 24 μL 0,5 M æblesyre, 1,2 μL 20 mM FCCP og 3 ml 2x MAS-1 i 2 ml H2O. Juster pH til 7,2 og QS til 6 ml med H2O.
    10. For at fremstille 1x β-oxidationsmedium (BOXM) skal du forberede BSA-holdige og BSA-fri BOXM-opløsninger.
      1. For at fremstille BOXM+BSA fortyndes 12 μL 50 mM palmitoyl-L-carnitin, 30 μL 0,5 M æblesyre og 7,5 ml 2x MAS-1 i 7 ml H2O. PH justeres til 7,2. Tilsæt 300 μL 10% FFA BSA og QS til 15 ml med H2O.
      2. For at fremstille BOXM-BSA fortyndes 4,8 μL 50 mM palmitoyl-L-carnitin, 12 μL 0,5 M æblesyre og 3 ml 2x MAS-1 i 2 ml H2O. Juster pH til 7,2 og QS til 6 ml med H2O.

2. Muskeldissektion, homogenisering og mitokondriel isolering

  1. Placer alle materialer og buffere på is. Sørg for, at alle materialer er iskolde under hele proceduren for at beskytte mitokondrier mod skader.
  2. Tre bægerglas på 50 ml pr. prøve anbringes på is, og følgende opløsninger tilsættes: 10 ml PBS i bægerglas 1, 10 ml 10 mM EDTA/PBS i bægerglas 2 og 4 ml IB1 i bægerglas 3.
  3. Afliv musen ved cervikal dislokation. Undgå CO2-aktiv dødshjælp, da skeletmusklerne kan blive hypoxiske og forstyrre respirationsanalyser.
  4. Sprøjt højre bagben med 70% ethanol for at forhindre pels i at kaste, og tape lem til kork dissektionspladen. Tape også venstre forben.
  5. Lav et snit med en steril engangsskalpel gennem huden fra knæ til tå.
  6. Tag fat i huden med tandede tang i ankelhøjde og klip den med en fin saks omkring anklen.
  7. Lette huden væk fra den underliggende muskulatur med en pincet med fin spids i den ene hånd, mens du trækker den op med tandede tang i den anden hånd.
  8. Dissekere alle skeletmuskler fra ankel til knæ (figur 2).
    1. Fjern alt bindevæv over tibialis forreste (TA) muskel for at lette muskelekstraktion ved hjælp af fin pincet og saks.
    2. Find de fire distale sener i EDL-musklen og sektioner dem tæt på deres indsættelser i tæerne. Find TA distal senen og skær den tæt på dens indsættelse, altid under anklen.
    3. Træk forsigtigt TA- og EDL-senerne over anklen for at frigøre de løse ender.
    4. Tag fat i senernes løse ender og lette musklerne væk fra resten af muskulaturen og knoglerne ved at trække dem op. Brug fin pincet eller saks til at lette processen. Fortsæt med omhu for at undgå myofiberkontraktion.
    5. Skær den proksimale sene af EDL og TA-musklen så tæt som muligt på knæskallen.
    6. Vend musen på hovedet for at fortsætte med gastrocnemius (GA) og soleus muskelekstraktion.
    7. Tag fat i lommen dannet mellem biceps femoris og GA med tandede tang. Brug en fin saks til at adskille disse muskler og visualisere den proksimale GA-sene.
    8. Tag fat i akillessenen med fine tang og skær den forsigtigt med en fin saks. Frigør GA- og soleusmusklerne fra den underliggende knogle ved at trække dem op gennem deres sener. Skær den proksimale GA-sene, der frigør den sammen med den underliggende soleus.
    9. Disseker forsigtigt de resterende muskler fra sene til sene efter samme procedure, indtil kun knogler er tilbage.
    10. Fastgør musen igen i startpositionen for at dissekere quadriceps-musklen.
    11. Kassér fedtvævet over quadriceps på den proksimale side ved hjælp af tandede tang og fin saks.
    12. Indsæt fin pincet mellem quadriceps og lårbenet og bevæg dem i begge retninger langs lårbensaksen for at adskille musklen fra knoglen.
    13. Tag fat i de distale quadriceps muskelsener med tandede tang og klip senen med en fin saks så tæt som muligt på knæskallen.
    14. Træk quadriceps op og frigør det ved den proksimale indsættelse med en fin saks.
  9. Gentag trin 4-8 fra dette afsnit med venstre bagben.
  10. Skyl først alle muskler i bægerglas 1 og derefter i bægerglas 2.
  11. Overfør alle muskler til Bægerglas 3 og finhaks alle muskler med skarp saks på is.
  12. Overfør suspensionen til et C-rør (lilla låg), og hold det altid i is.
  13. Luk C-røret tæt, og fastgør det på hovedet på homogenisatorens bøsning. Sørg for, at prøvematerialet er i rotatorens/statorens område. Vælg 1-minutters programmet kaldet m_mito_tissue_01.
  14. Homogenatet opdeles i to 2 ml forkølede mikrocentrifugerør og centrifugen ved 700 × g i 10 minutter ved 4 °C i en bordpladecentrifuge.
  15. Overfør supernatanterne til nye 2 ml forkølede rør, og undgå omhyggeligt fedt og ikke-homogeniseret væv. Pellets opbevares ved -80 °C til bestemmelse af fragmenteringsrenhed (fraktion N) (figur 3).
  16. Centrifugering af supernatanterne ved 10.500 × g i 10 minutter ved 4 °C.
  17. Overfør supernatanterne til nye 2 ml forkølede rør og mærk dem som Supernatant Nummer 1 (SN1). Opbevar dem ved -80 °C til bestemmelse af fragmenteringsrenhed (figur 3).
  18. Resuspend og kombiner begge pellets i et samlet volumen på 500 μL IB2 i is.
  19. Centrifuge ved 10.500 × g i 10 minutter ved 4 °C.
  20. Overfør supernatanten til et nyt 2 ml forkølet rør og mærk det som Supernatant nummer 2 (SN2). Den opbevares ved -80 °C med henblik på bestemmelse af fragmenteringens renhed (figur 3).
  21. Resuspend den endelige mitokondriepellets i 200 μL RB. Sæt hurtigt 10 μL til proteinkvantificering til side, og tilsæt straks 10 μL 10% FFA BSA til den resterende mitokondriesuspension for at forhindre skade.
  22. Bestem proteinkoncentrationen ved hjælp af Bradford-analysen.
    1. For standardkurven fremstilles 30 μL serielle fortyndinger af kendt koncentration af et protein i RB-buffer. Brug f.eks. 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,0625 mg/ml og 0 mg/ml BSA.
    2. 1:3 og 1:6 serielle fortyndinger af mitokondrieprøverne fremstilles i RB-buffer.
    3. I en flad bundplade med 96 brønde skal du først lægge 2,5 μL prøve/standard pr. brønd. Derefter tilsættes 10 μL 1 M NaOH til hver prøve og til sidst 200 μL 1x Bradford-reagens. Bland godt, undgå luftbobler. Kontroller visuelt, at prøvernes farve er inden for kalibreringslinjen. Udfør altid analysen i tre eksemplarer.
    4. Inkuber pladerne i 5 minutter ved RT i mørke, og aflæs absorbansen ved 595 nm i et mikropladespektrofotometer.
    5. Standardkurven beregnes ved at afbilde absorbansværdierne (y-aksen) i forhold til den tilsvarende proteinkoncentration af fortyndingerne fremstillet i trin 22.1 i dette afsnit (x-aksen).
    6. Beregn den samlede mængde protein i mitokondrieprøverne ved ekstrapolering med standardkurven.

3. Fremstilling af mikropladebaserede respirometriske assays

  1. Hydratiser den respirometriske assaysensor mindst 12 timer før forsøget med 1 ml kalibreringsbuffer pr. brønd. Inkuber ved 37 °C (ingen CO2).
    BEMÆRK: Hydrerede sensorer kan bruges i op til 72 timer. Patronen skal håndteres omhyggeligt under dette trin: Hvis noget berører sensorerne, kan målefølsomheden blive påvirket.
  2. Forkør den præparativcentrifuge med den svingende skovlmikropladeroter og de tilsvarende mikropladeadaptere ved 4 °C.
  3. Tænd computeren, åbn analysesoftwaren, og vælg den ønskede protokol.
    BEMÆRK: Der høres et klik, når softwaren opretter forbindelse til iltforbrugsmåleinstrumentet. Varmesensoren skal være grøn og ved 37 °C, før forsøget starter.
  4. Inhibitoropløsningerne fremstilles ud fra de lagre, der er angivet i punkt 1, trin 2, i overensstemmelse med det assay, der skal udføres. Forbered nok volumen til hver opløsning. Se tabel 1 og tabel 2 for reference.
  5. Tilsæt det passende volumen af hver hæmmer i hver port, indsæt patronen i iltforbrugsmåleinstrumentet, og start kalibreringen.
    BEMÆRK: Det tager 15-20 minutter at tilføje inhibitor til patronen og sætte patronen i instrumentet. Sørg for, at de korrekte patronkomponenter introduceres. Patronlåget og hydroboosteren kan kasseres, mens der er behov for sensorpatron og brugsplads.
  6. Centrifugering af den koncentrerede mitokondriesuspension i punkt 2, trin 21 ved 10.500 × g i 10 minutter ved 4 °C.
  7. Resuspend mitokondriepillen i 100 μL af 1x CAM + BSA, 1x EFAM + BSA eller 1x BOXM + BSA, afhængigt af den protokol, der skal udføres.
  8. Yderligere fortyndes den koncentrerede mitokondrieprøve til en endelig koncentration på 0,2 μg/μL i det tilsvarende assaymedium.
  9. Frø 50 μL af suspensionen (i alt 10 μg protein) pr. brønd i en forkølet mikroplade med 24 brønde på is. Tilsæt ikke mitokondrier i baggrundskorrektionsbrøndene; Tilføj kun det tilsvarende analysemedium. Den resterende mitokondriesuspension opbevares ved -80 °C med til bestemmelse af fragmenteringsrenhed (figur 3).
  10. Mikropladen drejes i den forkølede præparatative centrifuge ved 2.000 × g i 20 minutter ved 4 °C. Modvægt til balance i overensstemmelse hermed.
  11. Det resterende analysemedium opvarmes ved 37 °C under mikropladecentrifugering.
  12. Efter centrifugering skal du lade mikropladen stå på bænken i 5 minutter for at udligne. Tilsæt 450 μL varmt analysemedium til et endeligt volumen på 500 μL pr. brønd ved RT. Gør dette langsomt og omhyggeligt, tilsæt mediet til brøndens væg for at undgå at løsne mitokondrier.
  13. Anbring straks mikropladen i iltforbrugsmåleinstrumentet uden låg, og start protokollen (tabel 3). Sørg for, at det første trin er en 10 minutters inkubation for at lade mikropladen varme.
  14. Når eksperimentet er afsluttet, skal du fjerne patronen og mikropladen, slukke for instrumentet og starte analysen.

4. Analyse af resultaterne

  1. I tilfælde af CA- og BOX-assays skal du udføre følgende analyser:
    1. Registrer ikke-mitokondrielt O2-forbrug , hvilket svarer til gennemsnittet af de værdier, der opnås efter Antimycin A og rotenoninjektion.
      BEMÆRK: Antimycin A og rotenon er henholdsvis komplekse III- og I-hæmmere.
    2. Beregn basal respiration ved at trække ikke-mitokondrielt O2-forbrug fra basale værdier (målepunkt 1 og 2).
    3. Træk ikke-mitokondrielt O2-forbrug fra værdierne efter injektionen af det komplekse V-substrat ADP (injektion A) for at bestemme mitokondrietilstand III.
    4. Træk ikke-mitokondrielt O2-forbrug fra respirationsværdierne efter injektion af den komplekse V-hæmmer oligomycin (injektion B) for at opnå mitokondrietilstand IVo.
    5. Beregn mitokondrietilstand IIIu ved at trække ikke-mitokondrielt O2-forbrug fra åndedræt efter FCCP-injektion (injektion C).
      BEMÆRK: FCCP er en potent mitokondriel oxidativ phosphorylering uncoupler. ATP-syntese omgås i sin tilstedeværelse, og ETC opnår maksimal aktivitet.
    6. Træk basale respirationsværdier fra mitokondrietilstanden IIIu-værdier for at opnå mitokondriel ledig kapacitet, hvilket er kapaciteten til at generere ekstra ATP i tilfælde af øget energibehov.
    7. Opdel mitokondrietilstand IIIu efter tilstand IVo-værdier for at opnå Respiratory Control Ratio (RCR).
      BEMÆRK: Negative eller null RCR-værdier indikerer, at mitokondriekobling påvirkes.
  2. Med hensyn til miljømæssige fokusområder skal du foretage følgende beregninger:
    1. Der opnås restaktivitet ved at beregne middelværdien efter rotenon og Antimycin A-injektion (injektion A og C).
    2. Beregn kompleks I til IV (CI-CIV) aktivitet ved at trække restaktivitet fra basalværdierne (målepunkt 1 og 2).
    3. Træk restaktivitet fra værdierne efter injektion af CII-substratet succinat (injektion B) for at opnå CII-CIII-CIV-aktivitet.
    4. CIV-aktiviteten beregnes ved at trække restaktiviteten fra de værdier, der opnås efter injektion af cytokrom c-reduktionsmidlerne, ascorbinsyre og TMPD (injektion D).
  3. Repræsenter alle resultater ved hjælp af søjlediagramter, som i figur 4, for at udtrække passende konklusioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen, der præsenteres her, tillader in vivo-analyse af mitokondriel respiration gennem isolering af mitokondrier fra museskeletmuskulatur. En oversigt over metoden er vist i figur 1. Efter dissekering af skeletmuskler fra bagbenene (figur 2) homogeniseres væv og mitokondrier renses under isotoniske forhold gennem serielle centrifugeringer. Renheden af de forskellige fraktioner opnået under isolationsprocessen kan analyseres ved western blot ved anvendelse af antistoffer mod forskellige organellemarkører. Figur 3A viser den generelle proteinprofil fra de forskellige fraktioner, der viser forskellige proteinpopulationer i de isolerede fraktioner.

Figur 3B viser, at alt mitokondrieindhold er i mitokondriefraktionen, som det fremgår af de stærke signaler for markører for de ydre (VDAC og TOMM20) og indre (TIMM23) mitokondriemembraner og endda for nukleoidassocierede proteiner (mtTFA). Alle kerner og cytoskelet (β-actin) er til stede i fraktion N, som repræsenterer kerner og uforstyrret materiale (figur 3C). Desuden forbliver de fleste af de endoplasmatiske retikulum (ER) (Calnexin), plasmamembran (Na + / K + -ATPaseα1) eller cytoplasmamarkører (LDHA, HSP70 eller AKT) i SN1- eller SN2-fraktionerne, hvilket fremhæver den høje renhed opnået under isolering (figur 3C). Der er dog et par spor af ER-forurening i mitokondriefraktionen, muligvis på grund af nærheden af disse organeller. I betragtning af de resultater, der opnås i efterfølgende respiratoriske assays, giver isolationsproceduren beskrevet her meget rene, levedygtige mitokondrielle præparater.

Både CA- og BOX-assays tillader beregning af forskellige mitokondrielle tilstande i nærvær af flere substrater, der stimulerer specifikke metaboliske veje. Specifikt udføres disse assays i nærvær af pyruvinsyre eller palmitoyl-L-carnitinchlorid. Pyruvinsyre er et substrat af Krebs-cyklussen; æblesyre er en Krebs-cyklusformidler og en NADH-induktor, mens palmitoyl-L-carnitin er et substrat af fedtsyren β-oxidationsvejen. (Figur 4A,B). I begge assays er den første tilstand, der kan måles, den basale respirationshastighed, som repræsenterer mitokondriel respiration i nærvær af substraterne, der oprindeligt blev tilsat til analysemediet. Derefter opnås mitokondrietilstand III, som repræsenterer ATP-produktion fra ADP og uorganisk fosfat, der viser den maksimale respiration i en koblet tilstand. Der er således en stigning i iltforbruget efter ADP-tilsætning, som observeret i figur 4A,B.

Endvidere angiver tilstand IVo protonlækagen forbundet med hæmningen af ATP-syntase af oligomycin, hvilket fører til et fald i åndedrættet, som observeret i CA- og BOX-graferne (figur 4A,B). Tilføjelsen af FCCP fører til stat IIIu, som viser den maksimale åndedrætskapacitet, som mitokondrier kan vise i en afkoblet tilstand, når iltforbruget når sit højeste niveau i disse assays. For at beregne alle disse tilstande er det grundlæggende først at bestemme ikke-mitokondriel respiration, som opnås ved afslutningen af assayet, når Antimycin A og rotenon injiceres for at hæmme oxidativ respiration. Som vist i figur 4A,B skal disse værdier altid være under basal respiration og meget tæt på nul i tilfælde af assays med isolerede mitokondrier som disse assays beskrevet her. Endelig skal RCR-parameteren beregnes for at vurdere mitokondrieintegriteten. Det afspejler, om mitokondrier kan reagere på ADP ved at producere ATP i høj hastighed med en lav protonlækage. De gennemsnitlige RCR-værdier, der blev fundet i CA- og BOX-assays, var henholdsvis 5,78 ± 1,03 og 3,47 ± 0,42 (figur 4A,B), som er i overensstemmelse med optimale RCR'er, der tidligere er rapporteret21,22,23,24.

Derudover undersøger EFA aktiviteten af ETC-komplekserne individuelt eller i kombination gennem injektion af specifikke substrater og hæmmere (figur 4C). CI-CIV-aktivitet repræsenterer mitokondriel respiration baseret på pyruvat- og malatsubstrater, når ingen komplekser hæmmes; i dette tilfælde går de fleste elektroner gennem CI. Da rotenon er en specifik hæmmer af CI, blokeres CI efter dets tilsætning, hvilket resulterer i nedsat iltforbrug (figur 4C). CII-CIII-CIV-aktivitet viser åndedræt, når kun CI er blokeret, og CII aktiveres: succinat, injiceret gennem port B, er et specifikt substrat af kompleks II (succinatdehydrogenase). Således reduceres CII, hvilket initierer elektronstrømmen fra CII til CIV, mens CI stadig hæmmes af den tidligere rotenoninjektion, hvilket giver en stigning i iltforbruget (figur 4C). Antimycin En tilsætning hæmmer CIII, blokerer elektronstrømmen gennem ETC og reducerer iltforbruget. Endvidere bestemmes CIV-aktivitet, når den stimuleres af cytokrom C-oxidation efter at være reduceret ved tilsætning af ascorbinsyre / TMPD; Figur 4C viser, at CIV-aktivering giver en stigning i iltforbruget. Endelig refererer restaktivitet til iltforbrug, når den oxidative fosforyleringskæde inaktiveres efter rotenon og Antimycin A-tilsætning. Denne værdi fastlægger baggrunden for beregningen af kompleksernes aktivitet som angivet i protokoltrin 2.2-2.4 i afsnit 4.

Figure 1
Figur 1: Skematisk visualisering af metoden. Forkortelser: OCR = iltforbrugshastighed; ADP = adenosindiphosphat; OL = oligomycin; FCCP = carbonylcyanid-p-trifluormetoxyphenylhydrazon; AntA = Antimycin A; Rot = rotenon. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Dissektion og isolering af murine skeletmuskler fra bagben til mitokondrielle respirationsanalyser. (A) Højre bagben blev strakt og immobiliseret med tape. (B) Et snit blev foretaget gennem huden fra ved siden af anklen, hvilket stoppede proksimalt til knæet. Bindevæv, der lå over TA' indre, blev forsigtigt fjernet. EDL (C) og TA (D) sener blev snittet tæt på deres indsættelser. TA-senen blev trukket op for at lette musklen væk fra den underliggende muskulatur og knogle. Derefter blev TA skåret i nærheden tæt på den ventrale kam til skinnebenet. På samme måde blev EDL-musklen lettet væk, og den proksimale sene blev omhyggeligt skåret på siden af knæet. (F) Højre bagben efter TA- og EDL-dissektion. (G) I den bageste bagben blev akillessenen snittet for at dissekere GA- og soleusmuskler. (H) GA og soleus blev omhyggeligt befriet fra tibialbenet. (I) De resterende muskler blev opsamlet fra ankel til knæ, indtil kun fibula og tibiale knogler var tilbage. (J) Hindlimb efter dissektion. (K) Quadriceps blev dissekeret. (L) Alle skeletmuskler indsamlet til bageste mitokondrieisolering. Processen blev udført for begge bagben. Forkortelser: TA = tibialis anterior; EDL = extensor digitorum longus; GA = gastrocnemius. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Fragmenteringsprocessens renhed. (A) Generel proteinprofil farvet med Coomassie blå. (B) Mitokondriel proteinrenhedsprofil. (C) Ikke-mitokondrielle markører. De forskellige fraktioner opnået under mitokondrieisolering blev indlæst og inkuberet med antistoffer mod forskellige proteiner i specifikke subcellulære fraktioner. Forkortelser: fraktion N = ikke-homogeniseret væv og kerner; SN1 = supernatant nummer 1: cytoplasma + organeller; SN2 = supernatant nummer 2: cytoplasma + organeller; VDAC = spændingsafhængig anionkanal; TOMM20 = translocase af ydre mitokondriemembran 20; mtTFA = mitokondriel transkriptionsfaktor A; TIMM23 = translocase af indre mitokondriemembran 23; LDHA = laktatdehydrogenase A; HSP70 = varmechokprotein 70; ER = endoplasmatisk retikulum. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative resultater. Bioenergetisk profilering af mitokondrier isoleret fra bagbensmuskler af en 13 måneder gammel mandlig vildtype C57BL/6N mus. Injektionspunkterne for de forskellige substrater og hæmmere er angivet i hvert assay. ETC- og OXPHOS-maskineriets ydeevne kan analyseres ved hjælp af pyruvat og malat eller palmitoyl-L-carnitin og malat som substrater i henholdsvis koblingsassayet (A) eller β-oxidation af FA-assays (B). (C) Elektronstrømsassayet tillader undersøgelse af individuelle mitokondrielle komplekser i nærvær af pyruvat, malat og FCCP; 10 μg mitokondrier blev belagt pr. Brønd. Resultaterne vises efter indstillingen midtpunktsrepræsentation for at visualisere resultater i aggregeret form. Dette er i modsætning til punkt-til-punkt-indstillingen, som ville muliggøre visualisering af de 9 på hinanden følgende målinger, der normalt udføres under hvert måletrin. Visualiseringstypen kan ændres efter afslutning af analysen under de kinetiske linjediagramindstillinger i analysesoftwaren. Forkortelser: FA = fedtsyrer; OCR = iltforbrugshastighed; ADP = adenosindiphosphat; FCCP = carbonylcyanid-p-trifluormetoxyphenylhydrazon; RCR = respiratorisk kontrolforhold; EFA = Elektronstrømsassay; BOX = β-oxidation af FA. Klik her for at se en større version af denne figur.

Kobling af assay
Havn Hæmmer [Lager] [Injektionsport] [Endelig] Opskrift
Inhib CAM-BSA
En ADP 100 mM 50 mM 5 mM 650 μL 650 μL
B Oligomycin 4 mM 31,6 μM 3,16 μM 11,3 μL 1418,7 μL
C FCCP 20 mM 60 μM 6 μM 4,68 μL 1555,32 μL
D Antimycin A // Rotenon 5 mM // 4 mM 40 μM // 50 μM 4 μM // 5 μM 13,52 μL // 21,12 μL 1655,36 μL
Elektron flow assay
Havn Hæmmer [Lager] [Injektionsport] [Endelig] Opskrift
Inhib EFAM-BSA
En Rotenone 4 mM 50 μM 5 μM 16,25 μL 1283,7 μL
B Succinat 500 mM 100 mM 10 mM 286 μL 1144 μL
C Antimycin A 5mM 4 μM 4 μM 12,48 μL 1547,5 μL
D Ascorbat // TMPD 1 M // 50 mM 100 mM // 1 mM 10 mM // 100 μM 169 μL // 33,8 μL 1487,2 μL
β oxidationsanalyse
Havn Hæmmer [Lager] [Injektionsport] [Endelig] Opskrift
Inhib BOKS-BSA
En ADP 100 mM 40 mM 4 mM 520 μL 780 μL
B Oligomycin 4 mM 31,6 μM 3,16 μM 11,3 μL 1418,7 μL
C FCCP 20 mM 60 μM 6 μM 4,68 μL 1555,32 μL
D Antimycin A // Rotenon 5 mM // 4 mM 40 μM // 20 μM 4 μM // 2 μM 13,52 μL // 8,45 μL 1668 μL

Tabel 1: Fremstilling af inhibitoropløsninger til de forskellige assays. Kolonnen [Lager] viser koncentrationerne af stamopløsningerne af den forbindelse, der er angivet i kolonnen Inhibitor . [Injektionsport] henviser til koncentrationen af de inhibitoropløsninger, der skal lastes i patronens forskellige porte, mens kolonnen [Endelig] angiver den endelige koncentration af hæmmerne i brøndene. Endelig angiver kolonnerne Opskrift de mængder lagerhæmmere og BSA-frie medier, der skal blandes for at forberede de opløsninger, der skal indlæses i injektionsportene. Forkortelser: ADP = adenosindiphosphat; FCCP = carbonylcyanid-p-trifluormetoxyphenylhydrazon; TMPD = N,N,N′,N′-tetramethyl-para-phenylen-diamin; Inhib = hæmmer; BSA = bovin serumalbumin; CAM-BSA = BSA-frit koblingsassaymedium; EFAM-BSA = BSA-frit elektronstrømsanalysemedium; BOX-BSA = BSA-fri β-oxidation af fedtsyreassaymedium.

Havn Volumen injiceret Tilberedt lager (26 brønde)
En 50 μL 1300 μL
B 55 μL 1430 μL
C 60 μL 1560 μL
D 65 μL 1690 μL

Tabel 2: Beregning af injektionsvolumener.

Handling Tidspunkt (minutter) Gentagelse Havn
Kalibrere 15-20
Vent 10
Bland + Vent 1 + 3 × 2
Blande 1
Mål + Bland 3 + 1 × 2
Injicere En
Blande 1
Måle 3
Blande 1
Injicere B
Blande 1
Måle 3
Blande 1
Injicere C
Blande 1
Måle 3
Blande 1
Injicere D
Mix + Mål 1 + 3 × 2

Tabel 3: Protokolindstillinger for de forskellige analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alle metoder, der anvendes til at studere mitokondriel respiration, har deres begrænsninger; Derfor er det afgørende at vælge den metode, der bedst passer til et specifikt eksperimentelt spørgsmål. Dette arbejde giver en opdateret og detaljeret protokol til at isolere mitokondrier fra musens skeletmuskulatur for at udføre forskellige respiratoriske assays for at undersøge mitokondriefunktionen. Faktisk er undersøgelsen af mitokondriel bioenergetik i isolerede mitokondrier ved hjælp af mikropladebaserede teknologier værdifuld til at studere vævsspecifik respiration med hensyn til reproducerbarhed, pålidelighed og kompleksitet. Endvidere giver brugen af isolerede mitokondrier kontrol over substratets tilgængelighed, hvilket letter forståelsen af de underliggende biologiske processer. Et andet positivt aspekt ved at bruge isolerede mitokondrier er, at det er muligt at studere tilstand III, fordi ATP genereret efter ADP-injektion ikke omdannes igen til ny ADP, da de fleste transmembrane ATPaser går tabt. Desuden tilsættes oligomycin i de her beskrevne assays for at blokere potentiel uspecifik ATP-syntese20.

Flere vigtige overvejelser skal fremhæves i forbindelse med denne protokol. For det første er isolerede mitokondrier ekstremt følsomme og bør håndteres med omhu. Det høje indhold af saccharose og mannitol i de anvendte buffere sikrer de optimale osmotiske betingelser for at beskytte de isolerede mitokondrier mod skader. Ikke desto mindre bør assayvarigheden holdes på et minimum for at bevare mitokondriemæssig levedygtighed og forhindre løsrivelse fra mikropladen, når den er podet. I betragtning af at protokoltrin, såsom fremstilling af assaymedier og substrat- og inhibitoropløsninger eller belastning af hæmmerne i den respirometriske assaypatron, er tidskrævende, bør hvert trin således koordineres perfekt. I modsætning til andre metoder baseret på enzymatisk fordøjelse21,24 og mørtel- og pestlehomogenisering17,19,21,23,24 er den her beskrevne metode desuden afhængig af anvendelsen af en automatiseret homogenisator, der muliggør hurtig og effektiv prøvehomogenisering. Det er vigtigt, at mitokondrielle suspensioner er mindre følsomme, hvis de er stærkt koncentrerede. Forbered således kun fortyndinger umiddelbart før brug af dem. Endelig er det vigtigt at arbejde hurtigt under det respirometriske assay korrekt. Normalt, når man analyserer celler i kultur i disse assays, udføres tre på hinanden følgende måletrin efter injektion af substrater eller hæmmere, hvilket resulterer i protokoller, der strækker sig mellem 40 og 50 min., For at sikre levedygtigheden af de isolerede mitokondrier gennem hele proceduren holdes antallet af måletrin ofte på et minimum på grund af deres sårbarhed19, 23,25, hvilket reducerer den tid, det tager at gennemføre den respirometriske analyse til ~ 20 minutter. De protokoller, der er beskrevet i dette arbejde (tabel 3), følger denne tendens, selv om andre tidligere offentliggjorte metoder rapporterer effektive OCR-profiler med længere og mere standardmåletrin26.

For eksempel, hvis to på hinanden følgende assays skal køres med det samme sæt prøver på samme dag, skal du forberede alle reagenser til det andet assay under det første undtagen mitokondrielle fortyndinger: fortynd kun, frø og spin mitokondrier umiddelbart før start af det andet assay, mens instrumentet kalibreres. Når forsøget er afsluttet, skal RCR-parameteren (punkt 4, trin 1.7) beregnes for at vurdere kvaliteten af de anvendte mitokondriepræparater. Normalt angiver RCR-værdier mellem 3,5 og 5, at mitokondrieintegritet er optimal og viser funktionel koblet oxidativ respiration25. Assays med lavere RCR-værdier skal kasseres, fordi mitokondrieintegriteten blev kompromitteret under isolation. I disse tilfælde skal du overveje at vaske mitokondriepillen to gange (afsnit 2, trin 19-21)22, som tidligere rapporteret.

For det andet er opretholdelse af den korrekte pH under hele proceduren afgørende for at opnå vellykkede resultater. Sørg for, at pH-værdien i alle opløsninger indstilles som angivet, dvs. pH 7,2, og at pH-værdien altid justeres med KOH, medmindre andet er angivet. Især bør pH-værdien i BSA-holdige buffere ikke måles direkte med pH-måleren, da BSA kan beskadige sonden. Juster således pH i de tilsvarende buffere, før du tilføjer BSA. For at undgå ændringer i pH på grund af BSA-tilføjelse skal du altid bruge FFA BSA. Endvidere kan nogle ultrarene H2O-batcher være sure, så brugen af kommercielt renset pH 7 H2O anbefales. Det er desuden nødvendigt at sikre, at pH-måleren er korrekt kalibreret, og at det er den rette model til måling af pH-værdien af de kemikalier, der skal fremstilles.

For det tredje er det afgørende at udføre prøveopsamlingstrinnet korrekt til proteinmåling af den endelige mitokondriesuspension (afsnit 2, trin 21) for at forhindre mitokondriel destruktion. Resuspend pelleten hurtigt, men grundigt, saml en alikvote, og tilsæt FFA BSA til den resterende suspension for at bevare den osmotiske balance og beskytte mitokondrierne mod skader. Hvis FFA BSA allerede var til stede i resuspensionbufferen, og dermed under proteinkvantificeringen ville det høje proteinindhold forvirre kvantificeringsresultaterne. Dette er grunden til, at FFA BSA skal tilføjes efter at have sat en alikvote til side til kvantificering.

For det fjerde er denne metode meget alsidig og kan tilpasses eksperimentatorens behov. For eksempel, hvis den undersøgte dyremodel er kendetegnet ved reduceret muskelmasse (f.eks. Sarkopeniske mus), kan yderligere muskler øge mitokondrieudbyttet. Selvom en voksen vildtype han C57BL / 6N mus blev brugt i dette arbejde, kan dyr af ethvert køn, alder eller genetisk baggrund samt specifikke muskeltyper anvendes i stedet.

For det femte kan respirationsværdier variere mellem eksperimenter på grund af små variationer i sammensætningen af buffere og reagenser, som skal fremstilles friske hver gang. Alder, køn, genetisk baggrund eller miljøforhold kan også have en dybtgående indvirkning på resultaterne. Et vellykket forsøg bør imidlertid præsentere stigninger i iltforbruget efter injektion af komplekse substrater såsom ADP og succinat, falder efter injektion af hæmmere såsom oligomycin eller rotenon og markante stigninger, når den potente uncoupler FCCP tilsættes. For at forhindre høj teknisk variabilitet skal du desuden sikre grundig resuspension af mitokondriepiller for at opnå homogene suspensioner, inden de sås i mikropladen.

For det sjette, hvis basale respirationsværdier er lave, kan du overveje at udføre et titreringseksperiment for at justere mængden af protein til såning. Endelig, fordi dette arbejde giver en metode til at opnå rå mitokondrielle ekstrakter, forventes en vis grad af urenhed forbundet med andre organeller, hovedsageligt ER. En mere aggressiv fragmenteringsproces for at fjerne disse urenheder ville være skadelig for mitokondriemæssig levedygtighed og hindre udførelsen af respiratoriske assays. Hvis renhed er et problem, især hvis det ikke er konsistent mellem prøver, kan analyseresultaterne normaliseres i forhold til mitokondrierenhed efter at have kørt vestlige blots mod forskellige organellemarkører (figur 3). Så vidt vi ved, er dette den første metode, der fremhæver bekymringer om mitokondriel renhed i råekstrakter. Normalt podes den samme mængde proteinekstrakt i brøndene i andre protokoller for respirometriske assays med isolerede mitokondrier i brøndene for at sammenligne prøver, forudsat at den samme mængde mitokondrier anvendes i alle tilfælde. Dette er en rimelig antagelse i betragtning af, at isolering udføres parallelt i alle prøver. Den genetiske eller miljømæssige baggrund for de undersøgte prøver kan imidlertid føre til betydelige forskelle i renheden af mitokondrieekstrakterne. For eksempel, hvis en given genetisk mutation forårsager øget udvikling af cytoplasmatisk ER, kan rå mitokondrielle ekstrakter fra disse dyr indeholde større end forventet ER-indhold og følgelig lavere end forventet mitokondrieprotein. Selv hvis den samme mængde totalt protein fra kontrol- og mutantprøver sås i mikropladen, vil mutanternes iltforbrug således blive undervurderet. Det anbefales derfor, at renheden af ekstrakterne af alle de undersøgte betingelser skal bestemmes. Hvis værdierne er sammenlignelige, er der ikke behov for normalisering. Men hvis renhedsværdierne blandt prøverne afviger betydeligt ud over den statistiske fejl, som eksperimentatoren er villig til at acceptere, bør de bruges til at normalisere iltforbrugsresultaterne.

Den nuværende protokol har nogle begrænsninger. Bemærk, at denne metode er optimeret til skeletmuskelvæv isoleret fra mus. Det kan være nødvendigt at foretage justeringer, hvis der anvendes forskellige væv eller skeletmuskler fra forskellige arter. Derudover, når analyser udføres på isolerede mitokondrier, går det normale cellulære mikromiljø tabt på grund af fraværet af cellulær kontekst og de andre organeller, der kan interagere med mitokondrier. Dette kan føre til resultater, der afviger lidt fra fysiologiske forhold. Endelig, da mitokondrierne centrifugeres, klæber de til bunden af brøndene. Selvom det er helt nødvendigt, er de potentielle virkninger af centrifugering på deres normale tilstand ukendte.

Det er vigtigt at tage højde for, at en reduktion i iltforbruget forbundet med ATP-bundet eller FCCP-stimuleret respiration i isolerede mitokondrier efter udførelse af de respirometriske assayanalyser kan indikere potentielle mitokondrielle ændringer, der kan forklares ved20: 1) begrænset transport af substrater over den indre mitokondriemembran, 2) nedsat aktivitet af enzymerne involveret i de hastighedsbegrænsende reaktioner af specifikke metaboliske veje såsom ETC, Krebs-cyklus eller β-oxidation eller 3) nedsat ETC-funktion, blandt andre mulige forklaringer.

Sammenfattende repræsenterer den opdaterede metode, der er beskrevet her, en passende og pålidelig måde at vurdere ETC og OXPHOS-funktionen fra skeletmuskelvæv på. Det har flere anvendelser til at evaluere, hvordan genetiske modifikationer eller miljøet kan påvirke mitokondriel respiration, der bidrager til en bestemt fænotype. Bemærkelsesværdigt nok kunne den nuværende protokol tilpasses andre modelorganismer eller anvendes sammen med humane prøver til at evaluere potentielle mitokondrielle dysfunktioner forbundet med sygdom hos mennesker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Juan J. Tena for brugen af homogenisatoren og CABD Proteomics and Animal Husbandry-faciliteterne til teknisk support. Dette arbejde blev støttet af det spanske ministerium for uddannelse, kultur og sport gennem stipendium FPU16/03264 til J.D.H.C., Association Française contre les Myopathies (AFM) gennem stipendietilskud #22450 til C.V.-G., et institutionelt tilskud MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Department of Gene Regulation and Morphogenesis at CABD) og BFU2017-83150-P til J.J.C. Junta de Andalucía-bevillingen P18-RT-4572, FEDER-finansieringsprogrammet fra Den Europæiske Union og det spanske ministerium for videnskab, innovation og universiteter giver RED2018-102576-T til P.N.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma A5285 Stock at -20 °C
AKT antibody Cell Signaling Technology C67E7 Rabbit (Host species)
anti-Goat HRP Sigma 401504 Rabbit (Host species)
anti-Mouse HRP Cell Signaling #7076 Horse (Host species)
Antimycin A Sigma A8674 Stock at -20 °C
anti-Rabbit HRP Cell Signaling #7074 Goat (Host species)
Ascorbic acid Sigma A5960 Stock at RT
Bactin antibody Sigma MBS4-48085 Goat (Host species)
Bio-Rad Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000002 It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve
BSA, fraction V, Fatty Acid-Free Calbiochem 126575 Stock at 4 °C
C tube Miltenyi Biotec 130-093-237 Purple lid
Calnexin antibody ThermoFisher MA3-027 Mouse (Host species)
D-mannitol Sigma M4125 Stock at RT
EDTA BDH 280254D Stock at 4 °C
EGTA Sigma E-4378 Stock at RT
FCCP Sigma C2920 Stock at -20 °C
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 Homogenizer
HEPES Sigma H3375 Stock at RT
HSP70 antibody Proteintech 10995-1-AP Rabbit (Host species)
LDH-A antibody Santa Cruz Biotechnology SC27230 Goat (Host species)
Magnesium chloride ChemCruz sc-255260A Stock at RT
Malic acid Sigma P1645 Stock at RT
Microplate spectrophotometer BMG LABTECH GmbH POLARstar OMEGA S/N 415-0292 Stock at RT
Milli-Q water Millipore system F7HA17757A Ultrapure water
mtTFA antibody Santa Cruz Biotechnology SC23588 Goat (Host species)
Na+/K+-ATPase α1 antibody Novus Biologicals NB300-14755 Mouse (Host species)
Oligomycin Sigma O4876 Stock at -20 °C
Palmitoyl-L-carnitine Sigma P1645 Stock at -20 °C
PBS tablets Sigma P4417-100TAB 1x stock at RT
Potassium dihydrogen phosphate ChemCruz sc-203211 Stock at RT
Potassium hydroxide Sigma 60377 Stock at RT
Pyruvic acid Sigma 107360 Stock at 4 °C
Rotenone Sigma R8875 Stock at -20 °C
Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer Agilent Technologies 420179 XFe24 model
Seahorse XFe24 FluxPak mini Agilent Technologies 102342-100 The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution
Succinate Sigma S7626 Stock at RT
Sucrose Sigma S9378 Stock at RT
TIMM23 antibody Abcam ab230253 Rabbit (Host species)
TMPD Sigma T7394 Stock at -20 °C
TOMM20 antibody Abcam ab56783 Mouse (Host species)
VDAC antibody Abcam ab15895 Rabbit (Host species)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
  3. Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
  4. Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
  5. Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
  6. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).
  7. Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
  8. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
  9. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746 (2011).
  10. Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).
  11. Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
  12. Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
  13. Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
  14. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
  15. Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
  16. Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
  17. Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).
  18. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
  19. Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
  20. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
  21. Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
  22. Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).
  23. Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
  24. Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
  25. Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
  26. Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).

Tags

Biologi udgave 180
Isolering af mitokondrier fra museskeletmuskulatur til respirometriske assays
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hernández-Camacho, J. D.,… More

Hernández-Camacho, J. D., Vicente-García, C., Sánchez-Cuesta, A., Fernandez-Ayala, D. J. M., Carvajal, J. J., Navas, P. Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays. J. Vis. Exp. (180), e63336, doi:10.3791/63336 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter