Summary
本方法论文的目的是证明一种可靠且可重复的方法，用于从手术切除的胸膜间皮瘤中富集，生成和扩增原发性肿瘤细胞系。
Abstract
目前缺乏从罕见肿瘤类型中扩展原发性肿瘤细胞系的方法。该协议描述了通过提供从消化到富集，扩增，冷冻保存和表型表征的过程的完整概述，从手术切除的恶性胸膜间皮瘤（MPM）中扩展原代肿瘤细胞的方法。此外，该方案引入了肿瘤生成的概念，这些概念可能对多种肿瘤类型有用，例如差异胰蛋白酶消化和解离方法对细胞表面标志物检测的影响，以进行表型表征。这项研究的主要局限性是选择将在二维（2D）培养系统中扩展的肿瘤细胞。该方案的变体，包括三维（3D）培养系统，培养基补充剂，改善附着力的板涂层以及替代的分解方法，可以提高该技术和建立肿瘤谱系的整体成功率。总体而言，该方案为从这种罕见的肿瘤中建立和表征肿瘤细胞提供了一种基础方法。
Introduction
恶性胸膜间皮瘤（MPM）是一种与石棉暴露高度相关的罕见肿瘤。尽管基于免疫疗法的方法显示出令人鼓舞的结果，但发生这种疾病的患者缺乏可用的治疗方案，并且总体5年生存率很低1，2。多个机构正在努力更好地了解这种疾病，并确定可能改善患者预后的新治疗靶点。虽然有多个间皮瘤小鼠模型，但对原发性间皮瘤肿瘤细胞的获取更为有限3.原发性间皮瘤肿瘤细胞的 体外 扩增将提供一个有价值的模型系统，可用于直接研究肿瘤细胞及其与肿瘤浸润淋巴细胞等自体免疫细胞的相互作用。虽然有关于原发性间皮瘤肿瘤细胞系扩增的报道，但这些报道很少，并且没有提供详细的标准操作程序（SOP）。此外，很少有细胞系可以从商业来源获得，如美国型培养物收集（ATCC）。虽然原发性肿瘤系的可用性有限，但已经证明肿瘤细胞可以从胸腔积液中扩展并直接从肿瘤组织中扩展4，5。此外，扩增的肿瘤细胞系已被证明可以保留原始肿瘤4，5，6的分子谱。
我们的实验室正在研究MPM的肿瘤免疫微环境，并开发了一种从手术切除病例中扩增原发性MPM肿瘤细胞系的方法。该方法改编自我们在建立原发性转移性黑色素瘤肿瘤细胞系方面的经验。这项工作的目标是使用2D模型系统和随后的表型分析，为原发性间皮瘤肿瘤谱系扩展提供一种详细，实用的方法。鉴于最近靶向CTLA4和PD-1的检查点阻断策略在一线组2中取得了成功，产生许多原发性肿瘤系的能力可以进一步了解肿瘤的内在耐药机制，并为评估T细胞识别提供重要的模型系统，从而加深我们对MPM中免疫反应的理解。
该方案的主要局限性在于每个肿瘤都含有不同的微环境，并且扩展成功具有高度的可变性。此外，该方法选择可以在2D培养系统中扩展的肿瘤细胞。涉及生产3D球体或类器官培养物的其他方法可以提供一种替代方法，该方法可以实现更高的扩增成功率，或者导致获得无法在传统2D系统中扩增的细胞系的能力。这种3D培养已被证明可用于产生难以扩展的肿瘤类型，例如胰腺癌7。
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Protocol
这里描述的所有方法都已获得德克萨斯大学MD安德森癌症中心的机构审查委员会（IRB）的批准。这涉及在知情同意后切除的标准护理，手术切除的MPM肿瘤。
1.肿瘤消化培养基等相关培养基的制备
- 为了制备肿瘤消化培养基，在层流罩中加入5 mL 100%笔/链球菌（青霉素/链霉素）到500 mL无菌罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基中。
- 将培养基转移到 500 mL、0.22 μm 聚醚砜 （PES） 无菌过滤器中进行真空过滤。
注意：过滤和抽吸步骤应在标准真空压力为75-150托的范围内进行。 - 标记肿瘤消化培养基并注明日期，并将其储存在4°C。
注意：培养基可在4°C下储存1个月。
- 将培养基转移到 500 mL、0.22 μm 聚醚砜 （PES） 无菌过滤器中进行真空过滤。
- 为了制备肿瘤消化酶混合物，在层流罩中的50 mL锥形管中加入2.5 mL 3%胶原酶1，1 mL 1.5mg / mL透明质酸酶，20μL 250，000单位/ mL DNAse 1至16.5 mL消化培养基。
注意：肿瘤消化酶混合物的总体积为20 mL;然而，每个肿瘤样本只需要10 mL。因此，剩余的鸡尾酒可以储存在-20°C，直到需要。不要重新冷冻等分试样。 - 为了制备完整的肿瘤培养基，在层流罩中加入5 mL 100%笔/链球菌和50 mL胎牛血清（FBS）到500 mL无菌RPMI 1640中。
- 将培养基转移到500 mL，0.22μm PES无菌过滤器中进行真空过滤。
- 标记并测定整个肿瘤培养基的日期，并将其储存在4°C。
注意：培养基可在4°C下储存1个月。
- 为了制备用于饥饿的还原血清培养基，在层流罩中加入5 mL 100%笔/链球菌和5 mLFBS至500 mL无菌RPMI 1640中。
- 将培养基转移到500 mL，0.22μm PES无菌过滤器中进行真空过滤。
- 标记并减少血清培养基的日期并将其储存在4°C。
注意：培养基可在4°C下储存1个月。
- 为了制备冷冻培养基，在层流罩中将5 mL二甲基亚砜（DMSO）加入45 mL FBS中。
- 将培养基转移到 50 mL、0.22 μm PES 无菌过滤器中进行真空过滤。
- 标记并注明五个 15 mL 锥形管的日期。
- 将10 mL冷冻培养基转移到每个管中，并将管储存在-20°C。
- 为了制备用于支原体检测的无抗生素培养基，在层流罩中加入50 mLFBS至500 mL无菌RPMI 1640。
- 将培养基转移到 50 mL、0.22 μm PES 无菌过滤器中进行真空过滤。
- 标记无抗生素培养基并注明日期，并将其储存在4°C。
注意：培养基可在4°C下储存1个月。
- 为了制备用于表型分析的荧光活化细胞分选（FACS）缓冲液，在层流罩中加入16.6 mL无菌牛血清白蛋白到500 mL无菌1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
- 标记FACS缓冲液并注明日期，并将其储存在4°C。
注意：只要两种组分都无菌储存，FACS缓冲液就不需要过滤器灭菌。FACS缓冲液可在开放前在4°C下储存6个月。
- 标记FACS缓冲液并注明日期，并将其储存在4°C。
2. 肿瘤组织的消化
- 将10mL肿瘤消化酶混合物从步骤1.2转移到解离管中。
- 使用无菌手术刀将肿瘤组织转移到无菌的6孔板盖上。
注意：与肿瘤组织一起转移的培养基的量足以进行处理。- 使用新的无菌手术刀和镊子去除所有脂肪组织，坏死组织和/或血凝块。
注意：脂肪组织通常外观淡黄色，呈半固体状。坏死组织在外观上比周围组织更暗，非常柔软;脂肪和坏死组织都很容易破裂。血组织呈鲜红色，在操作时可能会将血液释放到培养基中。一旦切除，产生的肿瘤组织应保持形状，并且根据组织类型为苍白或粉红色。 - 将整个肿瘤组织切成1mm3 个小碎片。为确保组织不会变干，向肿瘤组织中加入500μL无菌1x Hank平衡盐溶液（HBSS）。
- 使用新的无菌手术刀和镊子去除所有脂肪组织，坏死组织和/或血凝块。
- 将肿瘤碎片转移到含有10mL肿瘤消化酶混合物的解离管中（步骤2.1）。紧紧关闭管子，将其盖面朝下放在组织解离器上，然后通过将其像套管一样施加在解离管上并按压以将其卡入到位来添加加热器装置。
注意：每个管的最大容量为4g肿瘤和10 mL体积。 - 选择解离器37C_h_TDK_1上的预编程设置。10分钟后检查状态，以确保没有闪烁的红灯指示的堵塞错误。
注意：该程序在1，865 rpm下处理1小时，温度为37°C。
注意：如果发生堵塞，请取下解离管并手动旋转以除去盖子中卡住的任何组织;然后将管子更换到解离器上并恢复程序。 - 1小时消化后，取出解离管并将其置于层流罩中。通过将70μm细胞过滤器放在50mL锥形管的顶部并使用10mL移液管将消化的肿瘤移液到过滤器上来过滤消化的肿瘤。如果过滤器堵塞，请切换到新的过滤器。
- 用10mL新鲜肿瘤消化培养基冲洗解离管，并将洗涤液通过过滤器。
- 取下70μm过滤器并将其丢弃。
- 用肿瘤消化培养基使总体积达到40 mL。
- 在室温下以500× g 离心5分钟。
- 使用连接到真空源的2mL吸液管，在不干扰沉淀的情况下吸出上清液，并使用10mL无菌完全肿瘤培养基重悬细胞。
- 重复步骤 2.6。
- 按照步骤2.7中所述吸出上清液。将细胞重悬于3mL无菌完全肿瘤培养基中，并将细胞悬浮液转移到无菌6孔板的一个孔中。
- 将板保持在37°C和5%CO2的培养箱中。
- 24小时后，将所用培养基从孔1中的消化肿瘤转移到同一6孔板中的新孔（孔2）。向孔 1 中加入 3 mL 无菌完全肿瘤培养基。
- 从孔1和2中转移用过的培养基，并在步骤2.11后24小时在同一6孔板中混合到孔3中。将3 mL无菌完全肿瘤培养基加入孔1和2中。
- 从所有3个孔中吸出培养基，并在步骤2.12后48小时将3mL完全肿瘤培养基移液到每个孔中。
3. 原发性肿瘤细胞系的生成
- 使用倒置相显微镜，确定早期传代培养物中成纤维细胞污染的百分比。
注意：成纤维细胞通常很长且不规则，并且具有不明确的细胞膜。它们在 Z 轴刻度上显得薄或平坦。- 如果成纤维细胞污染大于早期传代培养物中细胞的20%，则在用低量血清培养基替换完整培养基后继续培养。
- 在步骤3.1.1中每周重复一次用还原血清培养基替代，持续3-4周。
- 当培养物达到80%汇合度时，通过将细胞以50：50分裂成6孔板的2个新孔来传代细胞。一旦细胞达到80%汇合度，在还原血清培养基中继续以50：50传递。
- 重复步骤3.1.3长达4周，一旦培养物达到80%汇合度，根据需要在较大的培养瓶中通过50：50分裂来传代。如果成纤维细胞群没有减少到10%或更少，请继续执行步骤3.2以尝试差异胰蛋白酶消化法以去除成纤维细胞污染。否则，请继续执行步骤 3.3。
- 为了富集肿瘤细胞，用1x PBS轻轻冲洗孔以除去含有血清的培养基。
- 按如下方式加入胰蛋白酶：如果在6孔板中，则每孔1 mL，T25烧瓶2mL，T75烧瓶3mL。
- 将6孔板或烧瓶置于37°C的培养箱中1分钟。从培养箱中取出板或烧瓶，并使用倒置显微镜检查细胞的粘附性。如果细胞部分抬起或漂浮，轻轻地除去悬浮的细胞和胰蛋白酶。将细胞置于含有等量或更大体积的完整肿瘤培养基的15 mL锥形管中。
注意：这种基于粘附特性的部分细胞集合是多个级分中的第一个。 - 重复步骤 3.2.1 和 3.2.2，直到所有单元格都抬起，或者删除了 4 个分数。
- 在室温下以500× g 离心所有独立馏分5分钟。
- 按照步骤2.7中所述吸出上清液，并使用5mL无菌的低血清培养基重悬细胞。
- 将每个级分的细胞置于T25烧瓶中，并将烧瓶置于37°C的培养箱中。
- 在48小时后评估培养物，以确定肿瘤细胞与成纤维细胞的富集部分。丢弃富含成纤维细胞的烧瓶。如果成纤维细胞污染<10%，继续在完全肿瘤培养基中扩增并继续步骤4。如果成纤维细胞污染为10-30%，请重复步骤3.1.2-3.1.4。如果成纤维细胞污染大于30%，重复步骤3.2-3.2.7。
- 如果在早期传代培养物中检测到很少或没有成纤维细胞，则一旦细胞在其6孔板或烧瓶中80%汇合，通过50：50分裂，继续在完全肿瘤培养基中传递细胞。
4. 早期传代原发性肿瘤细胞系的扩增
- 一旦原发性肿瘤培养物含有10%或更少的成纤维细胞污染，抽吸培养基并每周两次用无菌完全肿瘤培养基替换它。
注意：T25的最佳培养基体积为5 mL;T75为12毫升;T150 为 25 毫升。- 一旦培养物在板或烧瓶中达到80%汇合度，就根据需要将培养物以50：50的比例进入较大的烧瓶中。
注意：根据其生长情况，可能需要以更高的比例传代培养物。调整，使培养物每3-5天达到80%的汇合度。
- 一旦培养物在板或烧瓶中达到80%汇合度，就根据需要将培养物以50：50的比例进入较大的烧瓶中。
- 通过直到文化处于第4通道或以上。一旦培养物在至少两个T75烧瓶中80%汇合，继续执行步骤5。
5. 已建立的原发性肿瘤细胞系的表征和库
- 冷冻保存一个T75烧瓶作为早期传代冷冻。对于其余T75烧瓶的支原体检测，继续步骤5.2。
- 对于早期传代细胞的冷冻保存，解冻步骤1.5中制备的1管等分试样的冷冻培养基。
- 通过胰蛋白酶消化收集细胞，首先按照步骤3.2中所述用1x PBS洗涤板，并按照步骤3.2.1所述添加胰蛋白酶。
- 将烧瓶置于37°C的培养箱中3分钟。从培养箱中取出烧瓶，并使用倒置显微镜检查细胞的粘附性。如果细胞正在抬起或漂浮，轻轻地去除悬浮的细胞和胰蛋白酶。将细胞置于含有等量或更大体积的完整肿瘤培养基的15 mL锥形管中。
注意：如果细胞在3分钟后保持贴壁，则将烧瓶放回培养箱中再放置2分钟。 - 通过轻轻移液将管充分混合，并取出20μL进行计数。
- 在室温下以500× g 离心管5分钟。
- 当细胞旋转时，使用实验室特异性计数方案进行计数，例如台盼蓝或吖啶橙/碘化丙啶（AO / PI）。
- 离心后的细胞重悬于至少2×106 个细胞/ 1 mL冷冻培养基的冷冻培养基中。
- 将步骤5.1.7中的1mL细胞悬浮液转移到预标记的1.5mL冷冻管中。
- 将冷冻管置于受控速率冷冻室中，并立即将其转移到-80°C。
- 将细胞在-80°C下储存长达1周，然后将其转移到液氮中长期储存。
- 将T75烧瓶分开50：50进行支原体检测。将培养基改为步骤1.6中制备的无抗生素培养基。
- 72小时后，在测试前在室温下解冻支原体检测试剂，底物和对照品15分钟。
- 从要测试的每个培养物中收集1 mL上清液并将其置于15mL锥形管中。
- 通过在室温下将上清液以500× g 离心5分钟来沉淀任何悬浮细胞。
- 将100μL样品上清液和对照品上质加入白色96孔板中。向每个样品中加入100μL支原体检测试剂并进行对照。
- 在室温下孵育5分钟。
- 将板放入读板器中并读取发光（读取A，即第一次读取）。
注意：支原体试剂盒制造商的实验方案表明在多功能读板器上保留默认设置。读取设置在发光端点处，积分时间为1 s，增益为135。读板器使用自动刻度程序来优化每个实验的增益信号。1 s 积分时间是标准默认值。这两种设置都用于调整由读板器解释的发光信号的强度，并且可能需要根据各个读板器进行调整。 - 从读板器中取出板，并向每个样品和对照品中加入100μL支原体检测底物。
- 在室温下孵育10分钟。
- 将印版放入读板器中并读取发光（读数B，即第二次读数）。
- 要确定支原体阳性，请确定读数B与读数A的比率。
注意：支原体阳性率在支原体试剂盒制造商的实验方案中有所描述。读数A和B使用相同的设置获取，并简单地反映读数顺序。- 考虑< 1 的比率为支原体阴性。
- 将 1-1.2 的比率视为不确定，并重复步骤 5.2。
- 考虑>1.2的比率为支原体阳性并监测该培养;如有必要，终止区域性。
- 支原体阴性肿瘤细胞的流式细胞术表征
- 使用细胞解离缓冲液去除肿瘤细胞。
- 从步骤1.7开始，计数细胞并将细胞重悬于FACS缓冲液中的1×106 / mL。
- 将100μL细胞悬浮液取出到单个试管中以进行表面染色。
- 在室温下以500× g 离心5分钟。
- 通过在室温下将细胞在FACS缓冲液中孵育500μL5%山羊血清10分钟来吸出上清液并阻断Fc受体。
- 加入2mL FACS缓冲液，并在室温下以500× g 离心悬浮液5分钟。
- 吸出上清液并加入抗体（表1）和FACS缓冲液的表面染色混合物，使最终体积为100μL。
- 重复步骤 5.3.6。
- 吸出上清液并通过在200μL1%多聚甲醛（PFA）加0.25%EtOH中重悬来固定细胞。在室温下孵育20分钟，样品避光。
- 重复步骤 5.3.6。将细胞重悬于200μLFACS缓冲液中，以使用适当的流式细胞仪进行采集。
注意：间皮瘤肿瘤细胞预计间皮素和N-钙粘蛋白呈阳性。有些人也可能表达CD90。
- 分别如步骤4.1和5.1所述，在完全肿瘤培养基和细胞中展开。
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Representative Results
为了确定早期传代培养物的成纤维细胞污染，使用倒置相显微镜评估细胞，以识别成纤维细胞相对于存在的其他贴壁细胞的频率。 图1 显示了与没有成纤维细胞污染的培养物（图1D）相比，成纤维细胞污染增加80%（图1A），50%（图1B）和30%（图1C）的例子。基于这种视觉评估，如上所述对膨胀条件进行调整。一旦建立了具有<10%成纤维细胞污染的无支原体培养物，流式细胞术用于确定间皮瘤肿瘤谱系的纯度。
图2A，B 显示了两个原发性间皮瘤肿瘤谱系（MESO171和MESO176）的代表性流式细胞术表面染色与ATCC建立的间皮瘤肿瘤谱系（NCI-H2452和MSTO-211H）相比，黑色素瘤肿瘤系（MEL526）作为阴性对照。间皮瘤肿瘤细胞可以表达间皮素（图2A）和N-钙粘蛋白（图2B）。与所使用的流式细胞术面板相关的详细信息如 表1所示。门控策略如图 1 所示。值得注意的是，CD90不能用作成纤维细胞特异性标志物，因为它也可以由间皮瘤肿瘤细胞表达。测试酶分离对表面蛋白标记物表达的影响的重要性也显示了，因为胰蛋白酶和蛋白酶 - 胶原酶混合物都导致N-钙粘蛋白的表面表达损失（图2C），而CD90不受影响（图2D）。
图1：早期传代培养物中成纤维细胞污染频率增加的代表性图像和已建立的肿瘤谱系。（B）含有50%成纤维细胞污染的早期传代培养物的图像。（C）含有30%成纤维细胞污染的早期传代培养物的图像。（D）已建立的原发性间皮瘤肿瘤谱系的图像。比例尺 = 200 μm.请点击此处查看此图的大图。
图2：已建立的间皮瘤肿瘤细胞系的代表性流式细胞术表型 （A 和 B）直方图显示了间皮素和N-钙粘蛋白在ATCC间皮瘤细胞系，对照黑色素瘤肿瘤系和原发性间皮瘤肿瘤系上的表面表达模式。（三 、 四）胰蛋白酶，蛋白酶 - 胶原酶混合物和细胞解离缓冲液对N-钙粘蛋白和CD90的影响。缩写：Comp-X-A = 荧光团X的补偿面积;PE = 藻红素;APC = 同种异体蓝蛋白。 请点击此处查看此图的大图。
| 表面抗体 | 福特萨 X20 频道 | 激光 | 克隆 | 同种型 | 体积/样品（μL） |
| 活/死黄 | BV510 | 紫 | 不适用 | 不适用 | 1 |
| 抗间皮素 APC | 断续器 | 红 | 瑞亚1057 | 断续器 | 2 |
| 抗 CD325 （N-钙粘蛋白） 聚乙烯 | 体育 | 永冠 | 8C12 | 断续器 | 5 |
| 抗镉90聚乙烯-氰7 | 聚醚醚酮羧酸 | 永冠 | 5E10 | 断续器 | 5 |
表1：用于表型肿瘤系的流式细胞术抗体。 缩写：PE = 藻红素;APC = 同种异体蓝蛋白。
补充图S1：肿瘤系表型分析的门控策略。 对于门控策略中的每个步骤，都会显示点图，以评估感兴趣的标记的表达。任何使用前向散射和侧向散射属性的初始门都是为了识别感兴趣的细胞，然后是基于时间特征的QC门。然后将单元格子取出，以使用正向散射和侧向散射属性去除任何双倍体。最终的QC门基于活性，死细胞染色为染料阳性。在可行性门之后，可以根据面板执行子门控。 请按此下载此档案。
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Discussion
虽然该协议很简单，但必须严格遵守一些关键步骤。如果最初不成功，早期传代冷冻对于保持重复肿瘤细胞富集过程的能力非常重要。通过眼睛评估成纤维细胞污染以确定正确的分裂和培养基匮乏技术的能力对于防止成纤维细胞在培养物中过度生长至关重要。此外，差异胰蛋白酶消化方法需要在孵育过程中仔细观察细胞。细胞可能以不同的速率从塑料板上抬起，这将因细胞系而异。在学习此过程并完善此决策步骤的同时，可以使用还原血清饥饿培养基（1%Pen / Strep和1%FBS的RPMI 1640）将原始培养物的一部分保存在6孔板中，直到可以观察到肿瘤细胞富集。
在验证间皮瘤肿瘤系的表型表征中注意到的一个重要因素是胰蛋白酶化和蛋白酶 - 胶原酶混合物对间皮瘤肿瘤细胞表面标志物N-钙粘蛋白8表达的影响。我们观察到，如果使用这些酶分离细胞，表面标志物就会丢失，这在前面已经描述过9。虽然已经表明大多数表面蛋白不会受到胰蛋白酶的负面影响，但在流板设计10期间测试每个表面标记物是很重要的。此外，强烈建议培养或扩增肿瘤细胞，直到细胞达到扩增的对数阶段并有时间重新表达这些标记物。使用细胞解离培养基允许保留N-钙粘蛋白的表达，以便使用流式细胞术进行检测。其他类型的解离介质也可以允许标记保留;然而，在建立流式细胞术小组之前，各个实验室应仔细测试这些培养基。
这项研究的一个主要限制是建立细胞系的成功率仅为50%。这可能是由于肿瘤微环境的异质性。改进这一过程的途径可能包括使用3D培养系统，添加培养基补充剂以促进肿瘤细胞扩增，改进分解方法，使用患者来源的异种移植物或平板涂层以改善肿瘤细胞粘附11。事实上，3D培养已被证明在产生具有挑战性的肿瘤细胞系（如胰腺癌7）方面是成功的。
该方案中未包括的一种选择途径是通过基于间皮瘤肿瘤标志物（如间皮素）的细胞分选进行肿瘤细胞富集。由于间皮瘤肿瘤细胞可以表达标准的成纤维细胞标志物CD90，阳性选择可能是更好的选择。这种方法的注意事项是早期培养物中的细胞化程度低，这需要分选成小体积的多孔板，例如384或96孔板。此外，由于该方案涉及使用胶原酶进行组织消化，因此尚不清楚这是否也会影响N-钙粘蛋白或间皮素的表面表达。虽然间皮素表达的机制相对未知，但N-钙粘蛋白在细胞粘附中起着重要作用，并且这种蛋白质的去除可能对肿瘤谱系12的建立产生负面影响。目前正在对此进行评估。
这种方法很重要，因为它允许生成 体外 模型系统来研究这种罕见的肿瘤类型。这可以包括鉴定间皮瘤的新表面靶点（如具有CAR-T细胞的间皮素）的研究，并揭示对靶向或免疫疗法的耐药性的肿瘤内在特性。此外，如果这些细胞可以在小鼠模型中 在体内 扩增，这也将为测试基于细胞和基于抗体的疗法以及小分子创造一个来源。该协议的未来方向将是测试扩展其他亚型MPM的能力，例如肉瘤样和双相亚型。
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Disclosures
CH是BRIACELL治疗学SAB和间皮瘤应用研究基金会的成员。所有其他作者都没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢拉奎尔·拉扎-布里维埃斯卡为启动该协议所做的贡献，并感谢鲍里斯·塞佩西博士、礼萨·梅赫兰博士和大卫·赖斯博士在组织收集方面的合作。这项工作没有额外的资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
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