Summary
מטרת מאמר שיטה זה היא להדגים מתודולוגיה חזקה וניתנת לשחזור להעשרה, יצירה והרחבה של קווי תאי הגידול הראשוניים ממזותליומה של pleural שנכרתה בניתוח.
Abstract
חסרות מתודולוגיות עדכניות להרחבת קווי תאי הגידול הראשוניים מסוגי גידולים נדירים. פרוטוקול זה מתאר שיטות להרחבת תאי הגידול הראשוניים ממזותליומה של pleural (MPM) שעברה כריתה כירורגית וממאירה על ידי מתן סקירה מלאה של התהליך מעיכול להעשרה, הרחבה, שימור בהקפאה ואפיון פנוטיפי. בנוסף, פרוטוקול זה מציג מושגים ליצירת גידולים שעשויים להיות שימושיים עבור סוגי גידולים מרובים כגון טריפסיניזציה דיפרנציאלית והשפעת שיטות הדיסוציאציה על זיהוי סמני פני השטח של התא לאפיון פנוטיפי. המגבלה העיקרית של מחקר זה היא בחירת תאי הגידול שיתרחבו במערכת תרביות דו-ממדית (דו-ממדית). וריאציות לפרוטוקול זה, כולל מערכות תרביות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות), תוספי מדיה, ציפוי צלחת לשיפור ההידבקות ושיטות פירוק חלופיות, יכולות לשפר טכניקה זו ואת שיעור ההצלחה הכולל של הקמת קו גידול. באופן כללי, פרוטוקול זה מספק שיטת בסיס לביסוס ואפיון תאי גידול מגידול נדיר זה.
Introduction
מזותליומה ממאירה (MPM) היא גידול נדיר הקשור מאוד לחשיפה לאסבסט. למרות שגישות מבוססות אימונותרפיה הראו תוצאות מעודדות, יש מחסור באפשרויות הטיפול הזמינות לחולים המפתחים מחלה זו, ושיעור ההישרדות הכולל ל-5 שנים נמוךב-1,2. במוסדות רבים נעשים מאמצים להבין טוב יותר את המחלה ולזהות מטרות טיפוליות חדשניות שעשויות לשפר את תוצאות המטופלים. בעוד ישנם מודלים מרובים של עכברי מזותליומה, הגישה לתאי גידול מזותליומה ראשוניים מוגבלת יותר3. הרחבה במבחנה של תאי גידול ראשוניים של מזותליומה תספק מערכת מודל רבת ערך שניתן להשתמש בה כדי לחקור את תאי הגידול ישירות ואת האינטראקציה שלהם עם תאי חיסון אוטולוגיים כגון לימפוציטים המסתננים לגידול. אמנם היו דיווחים על התרחבות של קווי תאים סרטניים ראשוניים של מזותליומה, אך אלה מעטים ואינם מספקים הליך פעולה סטנדרטי מפורט (SOP). יתר על כן, מעט שורות תאים זמינות ממקורות מסחריים כגון אוסף תרביות מסוג אמריקאי (ATCC). בעוד שהזמינות של קווי הגידול הראשוניים מוגבלת, הוכח כי ניתן להרחיב את תאי הגידול מהתפרצויות pleural ישירות מרקמת הגידול 4,5. בנוסף, הודגם כי קווי תאים מורחבים של הגידול משמרים את הפרופיל המולקולרי של הגידול המקורי 4,5,6.
המעבדה שלנו חוקרת את המיקרו-סביבה החיסונית-גידולית של MPM ופיתחה שיטה להרחבת קווי תאי הגידול הראשוניים של MPM ממקרים שעברו כריתה כירורגית. שיטה זו מותאמת מניסיוננו בהקמת קווי תאים ראשוניים של גידול מלנומה גרורתית. מטרת עבודה זו היא לספק גישה מפורטת ומעשית להרחבת קו הגידול הראשוני של מזותליומה באמצעות מערכת מודל דו-ממדית ופרופיל פנוטיפי לאחר מכן. בהתחשב בהצלחה האחרונה של אסטרטגיות חסימת מחסום המכוונות נגד CTLA4 ו- PD-1 בהגדרת קו ראשון2, היכולת ליצור קווי גידול ראשוניים רבים יכולה לקדם את ההבנה של שני מנגנוני ההתנגדות הפנימיים של הגידול, כמו גם לספק מערכת מודל חשובה להערכת זיהוי תאי T, ובכך להעמיק את הבנתנו את התגובה החיסונית ב- MPM.
המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא שכל גידול מכיל מיקרו-סביבה שונה, ויש רמה גבוהה של שונות של הצלחת ההתרחבות. בנוסף, שיטה זו בוחרת עבור תאים סרטניים שיכולים להתרחב במערכת תרבית דו-ממדית. שיטות אחרות הכוללות ייצור של תרבית ספרואידית או אורגנואידית תלת-ממדית יכולות לספק גישה חלופית שעשויה לאפשר שיעור הצלחה גבוה יותר של התפשטות או לגרום ליכולת להפיק קווי תאים שאינם מסוגלים להתרחב במערכת דו-ממדית מסורתית. תרביות תלת מימד כאלה הוכחו כמועילות ליצירת סוגי גידולים שקשה להרחיב, למשל, סרטן הלבלב7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי מועצת הביקורת של המוסד (IRB) של מרכז הסרטן של אוניברסיטת טקסס MD Anderson. זה נוגע לגידולי MPM סטנדרטיים של טיפול, שנותחו בניתוח, שהוסרו לאחר הסכמה מדעת.
1. הכנת מדיית עיכול גידולים ומדיה נלווית אחרת
- כדי להכין מדיה לעיכול הגידול, הוסיפו 5 מ"ל של 100% עט/סטרפ (פניצילין/סטרפטומיצין) ל-500 מ"ל של מכון ההנצחה הסטרילי רוזוול פארק (RPMI) 1640 בינוני במכסה מנוע של זרימה למינרית.
- העבר את המדיום למסנן סטרילי של 500 מ"ל, 0.22 מיקרומטר פוליאתרסולפון (PES) לסינון ואקום.
הערה: יש לבצע שלבי סינון ושאיפה בלחץ ואקום סטנדרטי של 75-150 torr. - תייג ותיארך את מדיום העיכול של הגידול ואחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
הערה: ניתן לאחסן את המדיום למשך חודש אחד בטמפרטורה של 4 °C (64 °F).
- העבר את המדיום למסנן סטרילי של 500 מ"ל, 0.22 מיקרומטר פוליאתרסולפון (PES) לסינון ואקום.
- כדי להכין את הקוקטייל האנזימטי המעכל גידול, הוסיפו 2.5 מ"ל של 3% קולגן מסוג 1, 1 מ"ל של 1.5 מ"ג/מ"ל היאלורונידאז, 20 μL של 250,000 יחידות/מ"ל DNAse 1 עד 16.5 מ"ל של מדיום עיכול בצינור חרוטי של 50 מ"ל במכסה גלימה למינרי.
הערה: הנפח הכולל של קוקטייל האנזימטי המעכל את הגידול הוא 20 מ"ל; עם זאת, יש צורך רק ב-10 מ"ל לכל דגימת גידול. ככזה, ניתן לאחסן את הקוקטייל הנותר בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד הצורך. אל תקפיא מחדש את האליקוטים. - כדי להכין מדיום גידול מלא, הוסיפו 5 מ"ל של 100% עט/סטרפ ו-50 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) ל-500 מ"ל של RPMI 1640 סטרילי במכסה גלימה למינרי.
- העבר את המדיום למסנן PES סטרילי של 500 מ"ל, 0.22 מיקרומטר, לסינון ואקום.
- סמן ותאריך את מדיום הגידול השלם ואחסן אותו ב 4 °C (74 °F).
הערה: ניתן לאחסן את המדיום למשך חודש אחד בטמפרטורה של 4 °C (64 °F).
- כדי להכין מדיום מופחת סרום לרעב, הוסיפו 5 מ"ל של 100% עט/סטרפ ו-5 מ"ל של FBS ל-500 מ"ל של RPMI 1640 סטרילי במכסה מנוע זרימה למינרי.
- העבר את המדיום למסנן PES סטרילי של 500 מ"ל, 0.22 מיקרומטר, לסינון ואקום.
- סמן ותאריך את המדיום המופחת בסרום ואחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
הערה: ניתן לאחסן את המדיום למשך חודש אחד בטמפרטורה של 4 °C (64 °F).
- כדי להכין מדיום הקפאה, יש להוסיף 5 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ל-45 מ"ל של FBS במכסה זרימה למינרי.
- העבר את המדיום למסנן סטרילי PES של 50 מ"ל, 0.22 מיקרומטר, לסינון ואקום.
- תווית ותאריך חמישה צינורות חרוטיים 15 מ"ל.
- מעבירים 10 מ"ל של מדיום הקפאה לכל צינור ומאחסנים את הצינורות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
- כדי להכין מדיום ללא אנטיביוטיקה לבדיקת מיקופלסמה, הוסיפו 50 מ"ל של FBS ל-500 מ"ל של RPMI 1640 סטרילי במכסה גלימה למינרי.
- העבר את המדיום למסנן סטרילי PES של 50 מ"ל, 0.22 מיקרומטר, לסינון ואקום.
- סמן ותאריך את המדיום ללא אנטיביוטיקה ואחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
הערה: ניתן לאחסן את המדיום למשך חודש אחד בטמפרטורה של 4 °C (64 °F).
- כדי להכין חיץ מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) לניתוח פנוטיפי, הוסיפו 16.6 מ"ל של אלבומין סטרילי בסרום בקר ל-500 מ"ל של מי מלח סטריליים בעלי מאגר פוספט (PBS) במכסה זרימה למינרי.
- סמן ותאריך את מאגר FACS ואחסן אותו בטמפרטורה של 4 °C (7 °F).
הערה: מאגר FACS אינו דורש עיקור מסנן כל עוד שני הרכיבים מאוחסנים בצורה סטרילית. ניתן לאחסן מאגר FACS לפני הפתיחה למשך 6 חודשים בטמפרטורה של 4 °C (74 °F).
- סמן ותאריך את מאגר FACS ואחסן אותו בטמפרטורה של 4 °C (7 °F).
2. עיכול רקמת הגידול
- מעבירים 10 מ"ל של קוקטייל אנזימטי מעכל גידול משלב 1.2 לצינור דיסוציאציה.
- מעבירים את פיסת רקמת הגידול למכסה צלחת סטרילי בעל 6 בארות באמצעות אזמל סטרילי.
הערה: כמות המדיום המועברת עם רקמת הגידול מספיקה לעיבוד.- יש להסיר את כל רקמת השומן, הרקמה הנמקית ו/או קרישי הדם באמצעות אזמל סטרילי חדש ומלקחיים.
הערה: רקמת שומן היא בדרך כלל צהבהבה במראה וחצי סולידית. רקמה נמקית כהה יותר מהרקמה הסובבת במראה ורכה מאוד; גם רקמה שומנית וגם נמקית יתפרקו בקלות. רקמה מדממת נראית אדומה בוהקת ועלולה לשחרר דם למדיום בעת מניפולציה. לאחר הסרתו, רקמת הגידול המתקבלת צריכה להחזיק צורה ולהיות חיוורת או ורודה, בהתאם לסוג הרקמה. - חותכים את כל רקמת הגידול ל-1 מ"מ3 שברים קטנים. כדי להבטיח שהרקמה לא תתייבש, הוסיפו 500 μL של תמיסת מלח מאוזנת סטרילית של 1x Hank (HBSS) לרקמת הגידול.
- יש להסיר את כל רקמת השומן, הרקמה הנמקית ו/או קרישי הדם באמצעות אזמל סטרילי חדש ומלקחיים.
- העברת שברי הגידול לצינור הדיסוציאציה המכיל 10 מ"ל של קוקטייל אנזימטי לעיכול גידול (שלב 2.1). סגרו את הצינור בחוזקה, הניחו אותו בצד המכסה על דיסוציאטור הרקמה והוסיפו את מנגנון התנור על ידי מריחתו כמו שרוול על צינור הדיסוציאציה ולחיצה כדי ללחוץ עליו במקומו.
הערה: הקיבולת המרבית עבור כל צינור היא 4 גרם של גידול ונפח של 10 מ"ל. - בחר את ההגדרה המתוכנתת מראש 37C_h_TDK_1 הדיסוציאטור. בדוק את המצב לאחר 10 דקות כדי לוודא שאין שגיאת סתימה כפי שמצוין על ידי האור האדום המהבהב.
הערה: תוכנית זו פועלת ב-1,865 סל"ד למשך שעה אחת עם טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: אם מתרחשת סתימה, הסר את צינור הדיסוציאציה וסובב אותו באופן ידני כדי לעקור כל רקמה שנתפסה במכסה; לאחר מכן החלף את הצינור על הדיסוציאטור וחדש את התוכנית. - לאחר העיכול של שעה אחת, יש להסיר את צינור הדיסוציאציה ולהניח אותו במכסה זרימה למינרי. סנן את הגידול המעוכל על ידי הנחת מסננת של 70 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי של 50 מ"ל ופיפטינג הגידול המעוכל באמצעות פיפטה של 10 מ"ל על המסנן. אם המסנן נתקע, עבור למסנן חדש.
- יש לשטוף את צינור הדיסוציאציה ב-10 מ"ל של מדיית עיכול טרייה של הגידול ולהעביר את הכביסה דרך המסנן.
- הסר את המסנן של 70 מיקרומטר והשלך אותו.
- הביאו את הנפח הכולל ל-40 מ"ל עם מדיום עיכול הגידול.
- צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- באמצעות פיפטה שאפתנית של 2 מ"ל המחוברת למקור ואקום, שואפים לסופרנטנט מבלי להפריע לכדור, ומחזירים את התאים באמצעות 10 מ"ל של מדיום גידול שלם סטרילי.
- חזור על שלב 2.6.
- שאפו את הסופר-נטנט כמתואר בשלב 2.7. יש להחיות את התאים ב-3 מ"ל של מדיום גידול שלם סטרילי ולהעביר את תרחיף התא לבאר אחת של צלחת סטרילית בעלת 6 בארות.
- שמור את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
- לאחר 24 שעות, העבר את המדיום המשומש מהגידול המעוכל בבאר 1 לבאר חדשה (באר 2) באותה צלחת של 6 בארות. הוסף 3 מ"ל של גידול שלם סטרילי בינוני לבאר 1.
- מעבירים את המדיום המשומש מבארות 1 ו-2 ומשלבים לבאר 3 באותה צלחת של 6 בארות 24 שעות לאחר שלב 2.11. הוסף 3 מ"ל של מדיום גידול שלם סטרילי לבארות 1 ו -2.
- לשאוף את המדיום מכל 3 בארות ופיפטה 3 מ"ל של מדיום גידול שלם לתוך כל באר 48 שעות לאחר שלב 2.12.
3. יצירת קו תאי גידול ראשוניים
- באמצעות מיקרוסקופ פאזה הפוך, קבעו את אחוז הזיהום הפיברובלסטים בתרבית המעבר המוקדמת.
הערה: פיברובלסטים הם בדרך כלל ארוכים ולא סדירים ובעלי קרום תאי לא מוגדר. הם נראים דקים או שטוחים בסולם Z.- אם זיהום פיברובלסט גדול מ-20% מהתאים בתרבית המעבר המוקדמת, המשיכו להתרבות לאחר החלפת המדיום השלם במדיום מופחת בסרום.
- חזרו על ההחלפה עם מדיום מופחת בסרום בשלב 3.1.1 פעמיים בשבוע למשך 3-4 שבועות.
- כאשר התרבית מגיעה למפגש של 80%, העבירו את התאים על ידי פיצול 50:50 לשתי בארות חדשות של צלחת בת 6 בארות. המשך לעבור 50:50 במדיה מופחתת סרום ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80%.
- חזור על שלב 3.1.3 למשך עד 4 שבועות, תוך מעבר בצלוחיות תרבית גדולות יותר לפי הצורך על ידי פיצול 50:50 ברגע שהתרבות מגיעה למפגש של 80%. אם אוכלוסיית הפיברובלסטים אינה מצטמצמת ל-10% או פחות, המשיכו לשלב 3.2 כדי לנסות את שיטת הטריפסיניזציה הדיפרנציאלית להסרת זיהום פיברובלסטים. אחרת, המשך לשלב 3.3.
- כדי להעשיר את תאי הגידול, יש לשטוף בעדינות את הבאר עם 1x PBS כדי להסיר את הסרום המכיל את המדיום המכיל.
- הוסף טריפסין כדלקמן: 1 מ"ל לבאר אם בצלחת של 6 בארות, 2 מ"ל עבור בקבוקון T25, 3 מ"ל עבור בקבוקון T75.
- מניחים את הצלחת או הבקבוקון של 6 בארות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. הסר את הצלחת או הבקבוק מהאינקובטור ובדוק את הידבקות התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך. אם התאים מתרוממים חלקית או צפים, הסר בעדינות את התאים המרחפים וטריפסין בלבד. מקם את התאים בצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל נפח שווה או גדול יותר של מדיום גידול שלם.
הערה: אוסף חלקי זה של תאים המבוסס על תכונות הידבקות הוא הראשון מבין שברים מרובים. - חזור על שלבים 3.2.1 ו- 3.2.2 עד שכל התאים יוסרו, או שיוסרו 4 שברים.
- צנטריפוגה כל השברים העצמאיים ב 500 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- שאפו את ה-supernatant כמתואר בשלב 2.7, והחזירו את התאים באמצעות 5 מ"ל של מדיום סטרילי מופחת בסרום.
- צלחת את התאים בבקבוק T25 עבור כל שבר ומניחים את הצלוחיות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- הערך את התרבית לאחר 48 שעות כדי לקבוע איזה חלק מועשר עבור תאי הגידול לעומת פיברובלסטים. השליכו צלוחיות עשירות בפיברובלסטים. אם זיהום פיברובלסט הוא <10%, המשך להתרחב במדיום הגידול המלא והמשך לשלב 4. אם זיהום פיברובלסט הוא 10-30%, חזור על שלבים 3.1.2-3.1.4. אם זיהום פיברובלסט גדול מ-30%, חזור על שלבים 3.2-3.2.7.
- אם מתגלים פיברובלסטים מעטים או כלל לא מזוהים בתרבית המעבר המוקדמת, יש להמשיך להעביר את התאים בתווך הגידול השלם על ידי פיצול של 50:50 ברגע שהתאים נפגשים ב-80% בצלחת או בבקבוקון שלהם בעלי 6 בארות.
4. הרחבת קו תאי הגידול הראשוניים של המעבר המוקדם
- לאחר שתרבית הגידול הראשונית מכילה 10% או פחות של זיהום פיברובלסט, שאפו למדיום והחליפו אותו במדיום גידול שלם סטרילי פעמיים בשבוע.
הערה: נפח הביניים האופטימלי עבור T25 הוא 5 מ"ל; T75 הוא 12 מ"ל; T150 הוא 25 מ"ל.- מעבירים את התרבות 50:50 לצלוחיות גדולות יותר לפי הצורך ברגע שהיא מגיעה ל-80% מפגש בצלחת או בבקבוקון.
הערה: ייתכן שיהיה צורך להעביר את התרבות ביחס גבוה יותר בהתאם לצמיחתה. התאימו את עצמכם כך שהתרבות תגיע ל-80% מפגש כל 3-5 ימים.
- מעבירים את התרבות 50:50 לצלוחיות גדולות יותר לפי הצורך ברגע שהיא מגיעה ל-80% מפגש בצלחת או בבקבוקון.
- מעבר עד שהתרבות נמצאת בקטע 4 ומעלה. ברגע שהתרבות מתכנסת ב-80% לפחות בשתי צלוחיות T75, המשיכו לשלב 5.
5. אפיון ובנקאות של קו תאי הגידול הראשוניים המבוססים
- Cryopreserve בקבוקון T75 אחד כהקפאה מוקדמת של המעבר. לבדיקת מיקופלסמה של צלוחיות T75 הנותרות, המשך לשלב 5.2.
- לצורך שימור בהקפאה של תאים בתחילת המעבר, הפשרה של שפופרת אחת של מדיום הקפאה אליקוטית שהוכנה בשלב 1.5.
- אסוף את התאים על ידי טריפסיניזציה על ידי שטיפת הצלחת תחילה עם 1x PBS כמתואר בשלב 3.2 והוספת טריפסין כמתואר בשלב 3.2.1.
- מניחים את הבקבוקון באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. הסר את הבקבוקון מהאינקובטור ובדוק את הידבקות התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך. אם התאים מתרוממים או צפים, הסר בעדינות את התאים המרחפים ואת טריפסין. מקם את התאים בצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל נפח שווה או גדול יותר של מדיום גידול שלם.
הערה: אם התאים נשארים דביקים לאחר 3 דקות, הניחו את הבקבוקון בחזרה באינקובטור למשך 2 דקות נוספות. - ערבבו היטב את הצינור על ידי צנרת בעדינות והסירו 20 μL לספירה.
- צנטריפוגה הצינור ב 500 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- בזמן שהתאים מסתובבים, ספרו באמצעות פרוטוקול ספירה ספציפי למעבדה כגון טריפאן כחול או אקריפין כתום/פרופידיום יודיד (AO/PI).
- החייאת התאים לאחר צנטריפוגה בתווך הקפאה עם מינימום של 2 × 106 תאים/1 מ"ל מדיום הקפאה.
- העברת 1 מ"ל של מתלי התא משלב 5.1.7 לתווית מוקדמת של 1.5 מ"ל קריוביאלים.
- הניחו את הקריוביציאלים בתא הקפאה בקצב מבוקר והעבירו אותם מיד ל-80 מעלות צלזיוס.
- אחסנו את התאים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לפני העברתם לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
- פיצול בקבוקון T75 50:50 לבדיקת מיקופלסמה. שנה את המדיום למדיום ללא אנטיביוטיקה שהוכן בשלב 1.6.
- לאחר 72 שעות, הפשירו את ריאגנט זיהוי המיקופלסמה, המצע והבקרות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפני הבדיקה.
- אספו 1 מ"ל של הסופרנטנט מכל תרבית כדי להיבדק והניחו אותו בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
- גלול כל התאים המרחפים על ידי צנטריפוגה של הסופרנאטנט ב-500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- טען 100 μL של סופרנאטים לדוגמה ובקרה לתוך צלחת לבנה של 96 בארות. הוסף 100 μL של מגיב זיהוי מיקופלסמה לכל דגימה ובקרה.
- דגירה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הניחו את הצלחת בקורא צלחות וקראו את הזוהר (קריאה א', כלומר קריאה ראשונה).
הערה: הפרוטוקול של יצרן ערכת mycoplasma מציין שמירה על הגדרות ברירת המחדל בקוראי צלחות רב-תכליתיים. הקריאה מוגדרת בנקודת הקצה של Luminescence עם זמן אינטגרציה של 1 s ורווח של 135. קורא הצלחות משתמש בשגרת קנה מידה אוטומטי כדי למטב את אות הרווח עבור כל ניסוי. זמן האינטגרציה של 1 שניות הוא ברירת המחדל הסטנדרטית. שתי ההגדרות משמשות להתאמת עוצמת האות הזוהר המתפרש על ידי קורא הלוחיות וייתכן שיהיה צורך לכוונן אותן בהתאם לקורא הלוחיות הבודד. - הסר את הצלחת מקורא הצלחות והוסף 100 μL של מצע זיהוי המיקופלסמה לכל דגימה ולפקדים.
- דגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- מניחים את הלוח בקורא הלוח וקוראים את הזוהר (קריאה ב', כלומר קריאה שנייה).
- כדי לקבוע את החיוביות של מיקופלסמה, קבעו את היחס בין קריאה ב' לקריאה א'.
הערה: יחסי החיוביות של Mycoplasma מתוארים בפרוטוקול של יצרן ערכת mycoplasma. קריאות A ו- B נרכשות באותן הגדרות ופשוט משקפות את סדר הקריאה.- שקול יחס < 1 להיות מיקופלסמה-שלילי.
- שקול יחס של 1-1.2 כלא חד משמעי וחזור על שלב 5.2.
- שקול יחס > 1.2 כדי להיות חיובי מיקופלסמה ולפקח על תרבות זו; לסיים את התרבות במידת הצורך.
- אפיון ציטומטריה של זרימה של תאי גידול שליליים מיקופלסמה
- היפטרו מתאי הגידול באמצעות מאגר דיסוציאציה של תאים.
- ספרו את התאים ובצעו החייאה של התאים ב-1 × 106/מ"ל במאגר FACS משלב 1.7.
- הסר 100 μL של תרחיף התא לתוך צינורות בודדים עבור צביעת פני השטח.
- צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשאוף לסופרנטנט ולחסום את קולטני ה-Fc על ידי דגירה של התאים ב-500 μL של 5% סרום עיזים במאגר FACS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- הוסף 2 מ"ל של מאגר FACS וצנטריפוגה את המתלים ב 500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- שאפו את הסופרנטנט והוסיפו את תערובת הכתמים על פני השטח של נוגדנים (טבלה 1) וחיץ FACS כך שהנפח הסופי יהיה 100 μL. כסו את הדגימות והכתימו אותן על קרח למשך 30 דקות.
- חזור על שלב 5.3.6.
- לשאוף את הסופרנטנט ולתקן את התאים על ידי החייאה ב 200 μL של 1% paraformaldehyde (PFA) בתוספת 0.25% EtOH. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כאשר הדגימות מוגנות מפני אור.
- חזור על שלב 5.3.6. בצעו החייאה של התאים ב-200 μL של מאגר FACS לרכישה באמצעות ציטומטר זרימה מתאים.
הערה: תאי גידול מזותליומה צפויים להיות חיוביים למזותלין ו-N-קדהרין. חלקם עשויים גם לבטא CD90.
- הרחבה במדיום הגידול השלם ובבנק כמתואר בשלבים 4.1 ו-5.1, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לקבוע זיהום פיברובלסטים של תרביות מעבר מוקדם, התאים נבחנים באמצעות מיקרוסקופ פאזה הפוך כדי לזהות את התדירות של פיברובלסטים ביחס לתאים הדבקים האחרים הקיימים. איור 1 מראה דוגמאות לעלייה בזיהום פיברובלסטים של 80% (איור 1A), 50% (איור 1B) ו-30% (איור 1C), בהשוואה לתרבית ללא זיהום פיברובלסט (איור 1D). בהתבסס על הערכה חזותית זו, נעשות התאמות לתנאי ההרחבה כמתואר לעיל. ברגע שנוצרת תרבית נטולת מיקופלסמה עם זיהום פיברובלסט <10%, ציטומטריית זרימה משמשת לקביעת טוהר קו הגידולים של מזותליומה.
איור 2A,B מראה צביעה מייצגת של פני השטח של ציטומטריית זרימה של שני קווי גידול ראשוניים של מזותליומה (MESO171 ו-MESO176) בהשוואה לקווי גידול מזותליומה שהוקמו על-ידי ATCC (NCI-H2452 ו-MSTO-211H) עם קו גידול מלנומה (MEL526) כבקרה שלילית. תאי גידול מזותליומה יכולים לבטא מזותלין (איור 2A) ו-N-cadherin (איור 2B). מידע מפורט הקשור ללוח ציטומטריית הזרימה שבו נעשה שימוש מוצג בטבלה 1. אסטרטגיית ה-gating מוצגת באיור משלים 1. יש לציין כי CD90 אינו יכול לשמש כסמן ספציפי לפיברובלסט מכיוון שהוא יכול לבוא לידי ביטוי גם על ידי תאי גידול מזותליומה. החשיבות של בדיקת ההשפעה של ניתוק אנזימטי על ביטוי סמן חלבון על פני השטח מוצגת גם כאשר גם טריפסין וגם תערובת הפרוטאז-קולגן גרמו לאובדן ביטוי פני השטח של N-cadherin (איור 2C) בעוד ש-CD90 לא הושפע (איור 2D).
איור 1: תמונות מייצגות של שכיחות גוברת של זיהום פיברובלסטים בתרביות מעבר מוקדמות וקו גידולים מבוסס. (A) תמונה של תרבית מעבר מוקדם המכילה 80% זיהום פיברובלסט. (B) תמונה של תרבית מעבר מוקדם המכילה 50% זיהום פיברובלסט. (C) תמונה של תרבית מעבר מוקדם המכילה 30% זיהום פיברובלסט. (D) תמונה של קו גידול מזותליומה ראשוני מבוסס. סרגלי קנה מידה = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: פנוטיפ ציטומטריה של זרימה מייצגת של קו תאי הגידול של מזותליומה מבוססת. (A ו-B) היסטוגרמות המציגות את תבנית ביטוי פני השטח של מזותלין ו-N-קדהרין על קווי תאי מזותליומה ATCC, קו גידולי מלנומה שולטת וקווי גידול מזותליומה ראשוניים. (ג ו-ד) השפעת טריפסין, תערובת פרוטאז-קולגן ובופר דיסוציאציה של תאים על N-cadherin ו-CD90. קיצורים: Comp-X-A = שטח פיצוי של פלואורופור X; PE = פיקוריתרין; APC = אלופיקוציאנין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| נוגדן פני השטח | פורטסה X20 ערוץ | לייזר | שיבוט | איזוטיפ | נפח/ דוגמה (μL) |
| צהוב חי/מת | BV510 | ויולט | N/A | N/A | 1 |
| נגמ"ש אנטי-מזותלין | APC | אדום | REA1057 | IgG1 | 2 |
| נגד CD325 (N-Cadherin) PE | פי.פי. | י.ג. | 8ג11 | IgG1 | 5 |
| אנטי CD90 PE-Cy7 | PE-Cy7 | י.ג. | 5ה10 | IgG1 | 5 |
טבלה 1: נוגדני ציטומטריה של זרימה המשמשים לפנוטיפ קווי גידול. קיצורים: PE = פיקוריתרין; APC = אלופיקוציאנין.
איור משלים S1: אסטרטגיית Gating לניתוח פנוטיפי של קווי הגידול. עלילות נקודות מוצגות עבור כל שלב באסטרטגיית ה-gating המובילה להערכת הבעת ההבעה של סמני העניין. כל שער ראשוני המשתמש בתכונות פיזור קדימה ופיזור צד נעשה כדי לזהות את התאים המעניינים, ואחריו שער QC בהתבסס על תכונת הזמן. לאחר מכן התאים מחולקים לתת-מקטעים כדי להסיר את כל הכפילים באמצעות תכונות פיזור קדימה וצד. שער ה-QC הסופי מבוסס על כדאיות, כאשר התאים המתים מכתימים חיוביים לצבע. לאחר שער הכדאיות, ניתן לבצע תת-חלוקה על בסיס הלוח. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד שפרוטוקול זה הוא פשוט, ישנם כמה צעדים קריטיים שיש לעקוב אחריהם מקרוב. ההקפאה של המעבר המוקדם חשובה כדי לשמר את היכולת לחזור על תהליך העשרת תאי הגידול אם בתחילה לא הצליח. היכולת להעריך זיהום פיברובלסטי בעין כדי להחליט על טכניקת הפיצול והרעב התקשורתי הנכונה היא חיונית למניעת צמיחת יתר של פיברובלסטים בתרבית. בנוסף, שיטת הטריפסיניזציה הדיפרנציאלית דורשת תצפית זהירה על התאים במהלך הדגירה. התאים עשויים להרים את צלחת הפלסטיק בקצבים שונים, וזה ישתנה מקו התא לקו התא. תוך כדי לימוד תהליך זה ועידון שלב קבלת ההחלטות הזה, ניתן לשמר חלק מהתרבית המקורית בצלחת של 6 בארות באמצעות מדיום הרעבה מופחת בסרום (RPMI 1640 עם 1% Pen/Strep ו-1% FBS) עד שניתן יהיה להבחין בהעשרת תאי הגידול.
אחד הגורמים החשובים שצוינו באפיון פנוטיפי מאומת של קווי הגידול במזותליומה היה השפעת הטריפסיניזציה ותערובת הפרוטאז-קולגן על הביטוי של סמן פני השטח של תאי הגידול במזותליומה, N-cadherin8. ראינו אובדן של סמן פני השטח אם התאים נותקו באמצעות האנזימים האלה, שתואר בעבר9. אמנם הוכח כי רוב חלבוני פני השטח אינם מושפעים לרעה מטריפסין, אך חשוב לבדוק כל סמן משטח במהלך תכנון לוח זרימה10. בנוסף, מומלץ מאוד לתרבת או להרחיב את תאי הגידול עד שהתאים יגיעו לשלב יומן של התפשטות ויהיה להם זמן לבטא מחדש סמנים אלה. שימוש במדיום דיסוציאציה של תאים איפשר את שימור הביטוי של N-cadherin לזיהוי באמצעות ציטומטריה של זרימה. סוגים אחרים של מדיית דיסוציאציה עשויים גם הם לאפשר שימור סמנים; עם זאת, מעבדות בודדות צריכות לבדוק בקפידה את המדיה הזו לפני הקמת פאנל ציטומטריה של זרימה.
מגבלה עיקרית למחקר זה היא ששיעור ההצלחה של הקמת קו תאים הוא 50% בלבד. זה יכול להיות בגלל האופי ההטרוגני של המיקרו-סביבה של הגידול. דרכים לשיפור תהליך זה יכולות לכלול שימוש במערכות תרביות תלת-ממדיות, תוספת של תוספי מדיה לקידום התפשטות תאי הגידול, שיטות פירוק משופרות, שימוש ב-xenografts שמקורם בחולה, או ציפוי צלחת כדי לשפר את הידבקות תאי הגידול11. ואכן, תרביות תלת-ממדיות הוכחו כמוצלחות ביצירת קווי תאים מאתגרים של הגידול כגון סרטן הלבלב7.
אחת הדרכים של בחירה שאינה כלולה בפרוטוקול זה היא העשרת תאי הגידול על ידי מיון תאים על בסיס סמן גידול מזותליומה כגון מזותלין. מכיוון שתאי גידול מזותליומה יכולים לבטא את הסמן הפיברובלסט הסטנדרטי, CD90, בחירה חיובית עשויה להיות חלופה טובה יותר. האזהרה לשיטה זו היא הרמה הנמוכה של התאים בתרביות המוקדמות, מה שידרוש מיון לצלחת רב-וולית בנפח קטן כמו צלחת של 384 או 96 בארות. בנוסף, כמו פרוטוקול זה כרוך בשימוש קולגןאז לעיכול רקמות, לא ידוע אם זה עשוי להשפיע גם על ביטוי פני השטח של N-cadherin או מזותלין. בעוד שמנגנון ביטוי המזותלין אינו ידוע יחסית, N-cadherin ממלא תפקיד חשוב בהדבקה תאית, והסרת חלבון זה עלולה להשפיע לרעה על הקמת קו גידול12. זה נבדק כרגע.
שיטה זו משמעותית מכיוון שהיא מאפשרת יצירת מערכת מודלים במבחנה לחקור את סוג הגידול הנדיר הזה. זה יכול לכלול מחקרים המזהים מטרות פני שטח חדשות של מזותליומה כגון מזותלין עם תאי CAR-T וחושפים תכונות פנימיות של הגידול של עמידות בפני מטרות ממוקדות או אימונותרפיות. בנוסף, אם ניתן יהיה להרחיב את התאים האלה במודלים של עכברים, זה גם ייצור מקור לבדיקת טיפולים מבוססי תאים ומבוססי נוגדנים, כמו גם מולקולות קטנות. כיוון עתידי לפרוטוקול זה יהיה בדיקת היכולת להרחיב תת-סוגים אחרים של MPMs כגון תת-הקבוצות הסרקומטואידיות והדו-פאזיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CH היא חברה ב- SAB עבור Briacell Therapeutics ובקרן המחקר היישומי של מזותליומה. לכל שאר המחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לראקל לאזה-בריוויסקה על תרומתה להתחלת פרוטוקול זה ולד"ר בוריס ספסי, רזא מהרן ודיוויד רייס על שיתוף הפעולה באיסוף רקמות. אין מימון נוסף הקשור לעבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
- Guzman-Casta, J., et al. Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma. Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).
- Baas, P., et al. First-line nivolumab plus ipilimumab in unresectable malignant pleural mesothelioma (CheckMate 743): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 397 (10272), 375-386 (2021).
- Testa, J. R., Berns, A.
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Kobayashi, M., Takeuchi, T., Ohtsuki, Y. Establishment of three novel human malignant pleural mesothelioma cell lines: morphological and cytogenetical studies and EGFR mutation status. Anticancer Research. 28 (1), 197-208 (2008).
- Chernova, T., et al. Molecular profiling reveals primary mesothelioma cell lines recapitulate human disease. Cell Death and Differentiation. 23 (7), 1152-1164 (2016).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Han, A. C., et al. Differential expression of N-cadherin in pleural mesotheliomas and E-cadherin in lung adenocarcinomas in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Human Pathology. 28 (6), 641-645 (1997).
- Tachibana, K. N-cadherin-mediated aggregate formation; cell detachment by Trypsin-EDTA loses N-cadherin and delays aggregate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (2), 414-418 (2019).
- Donnenberg, V. S., Corselli, M., Normolle, D. P., Meyer, E. M., Donnenberg, A. D. Flow cytometric detection of most proteins in the cell surface proteome is unaffected by trypsin treatment. Cytometry A. 93 (8), 803-810 (2018).
- Pham, K., et al. Isolation of pancreatic cancer cells from a patient-derived xenograft model allows for practical expansion and preserved heterogeneity in culture. American Journal of Pathology. 186 (6), 1537-1546 (2016).
- Derycke, L. D., Bracke, M. E. N-cadherin in the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation, embryogenesis, invasion and signalling. International Journal of Developmental Biology. 48 (5-6), 463-476 (2004).
