Summary
Das Ziel dieser Methodenarbeit ist es, eine robuste und reproduzierbare Methodik für die Anreicherung, Erzeugung und Expansion von primären Tumorzelllinien aus chirurgisch resezierten Pleuramesotheliomen zu demonstrieren.
Abstract
Aktuelle Methoden zur Erweiterung primärer Tumorzelllinien aus seltenen Tumorarten fehlen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Erweiterung primärer Tumorzellen aus chirurgisch reseziertem, malignem Pleuramesotheliom (MPM), indem es einen vollständigen Überblick über den Prozess von der Verdauung bis zur Anreicherung, Expansion, Kryokonservierung und phänotypischen Charakterisierung bietet. Darüber hinaus stellt dieses Protokoll Konzepte für die Tumorgenerierung vor, die für mehrere Tumorarten nützlich sein können, wie z. B. die differentielle Trypsinisierung und den Einfluss von Dissoziationsmethoden auf den Nachweis von Zelloberflächenmarkern für die phänotypische Charakterisierung. Die Haupteinschränkung dieser Studie ist die Auswahl von Tumorzellen, die sich in einem zweidimensionalen (2D) Kultursystem ausdehnen. Variationen dieses Protokolls, einschließlich dreidimensionaler (3D) Kultursysteme, Medienergänzungen, Plattenbeschichtung zur Verbesserung der Haftung und alternativer Disaggregationsmethoden, könnten diese Technik und die Gesamterfolgsrate bei der Etablierung einer Tumorlinie verbessern. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine Basismethode zur Etablierung und Charakterisierung von Tumorzellen aus diesem seltenen Tumor.
Introduction
Das maligne Pleuramesotheliom (MPM) ist ein seltener Tumor, der stark mit Asbestexposition assoziiert ist. Obwohl immuntherapiebasierte Ansätze ermutigende Ergebnisse gezeigt haben, gibt es einen Mangel an Behandlungsmöglichkeiten für Patienten, die diese Krankheit entwickeln, und die Gesamtüberlebensrate von 5 Jahren ist niedrig 1,2. An mehreren Institutionen werden Anstrengungen unternommen, um diese Krankheit besser zu verstehen und neue therapeutische Ziele zu identifizieren, die die Patientenergebnisse verbessern können. Während es mehrere Mesotheliom-Mausmodelle gibt, ist der Zugang zu primären Mesotheliom-Tumorzellen begrenzter3. Die In-vitro-Expansion primärer Mesotheliom-Tumorzellen würde ein wertvolles Modellsystem liefern, mit dem Tumorzellen und ihre Interaktion mit autologen Immunzellen wie tumorinfiltrierenden Lymphozyten direkt untersucht werden können. Während es Berichte über die Expansion der primären Mesotheliom-Tumorzelllinien gibt, sind diese wenige und bieten keine detaillierte Standard-Operationsmethode (SOP). Darüber hinaus sind nur wenige Zelllinien aus kommerziellen Quellen wie der American Type Culture Collection (ATCC) verfügbar. Während die Verfügbarkeit von primären Tumorlinien begrenzt ist, wurde gezeigt, dass Tumorzellen aus Pleuraergüssen und direkt aus dem Tumorgewebe erweitert werden können 4,5. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass erweiterte Tumorzelllinien das molekulare Profil des ursprünglichen Tumors 4,5,6 erhalten.
Unser Labor untersucht die tumorimmune Mikroumgebung von MPM und hat eine Methode zur Erweiterung primärer MPM-Tumorzelllinien aus chirurgisch resezierten Fällen entwickelt. Diese Methode basiert auf unseren Erfahrungen bei der Etablierung primärer metastasierender Melanom-Tumorzelllinien. Ziel dieser Arbeit ist es, einen detaillierten, praktischen Ansatz für die Erweiterung der primären Mesotheliom-Tumorlinie unter Verwendung eines 2D-Modellsystems und anschließender phänotypischer Profilierung zu bieten. Angesichts des jüngsten Erfolgs von Checkpoint-Blockadestrategien, die auf CTLA4 und PD-1 in der Erstlinieneinstellungabzielen 2, könnte die Fähigkeit, viele primäre Tumorlinien zu erzeugen, das Verständnis sowohl der intrinsischen Resistenzmechanismen des Tumors fördern als auch ein wichtiges Modellsystem zur Beurteilung der T-Zell-Erkennung bereitstellen und so unser Verständnis der Immunantwort bei MPM vertiefen.
Die Haupteinschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass jeder Tumor eine andere Mikroumgebung enthält und ein hohes Maß an Variabilität des Expansionserfolgs besteht. Darüber hinaus selektiert diese Methode nach Tumorzellen, die sich in einem 2D-Kultursystem ausdehnen können. Andere Methoden, die die Herstellung einer 3D-Sphäroid- oder Organoidkultur beinhalten, könnten einen alternativen Ansatz bieten, der eine höhere Erfolgsrate der Expansion ermöglichen oder dazu führen kann, dass Zelllinien abgeleitet werden können, die sich in einem traditionellen 2D-System nicht ausdehnen können. Solche 3D-Kulturen haben sich als nützlich für die Erzeugung von Tumorarten erwiesen, die schwer zu erweitern sind, zum Beispiel Bauchspeicheldrüsenkrebs7.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institution Review Board (IRB) des MD Anderson Cancer Center der University of Texas genehmigt. Dies betrifft Standard-of-Care, chirurgisch resezierte MPM-Tumoren, die nach Einverständniserklärung entfernt wurden.
1. Aufbereitung von Tumorverdauungsmedien und anderen zugehörigen Medien
- Um Tumorverdauungsmedien vorzubereiten, fügen Sie 5 ml 100% Pen / Streptokokken (Penicillin / Streptomycin) zu 500 ml sterilem Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium in einer Laminar-Flow-Haube hinzu.
- Überführen Sie das Medium zu einem 500 ml, 0,22 μm Polyethersulfon (PES) Sterilfilter für die Vakuumfiltration.
HINWEIS: Filtrations- und Ansaugschritte sollten mit einem Standard-Vakuumdruck von 75-150 Torr durchgeführt werden. - Beschriften und datieren Sie das Tumorverdauungsmedium und lagern Sie es bei 4 °C.
HINWEIS: Das Medium kann 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.
- Überführen Sie das Medium zu einem 500 ml, 0,22 μm Polyethersulfon (PES) Sterilfilter für die Vakuumfiltration.
- Um den tumorverdauenden enzymatischen Cocktail vorzubereiten, fügen Sie 2,5 ml 3% Kollagenase Typ 1, 1 ml 1,5 mg / ml Hyaluronidase, 20 μL 250.000 Einheiten / ml DNA 1 bis 16,5 ml Verdauungsmedium in einem konischen 50 ml Schlauch in einer laminaren Durchflusshaube hinzu.
HINWEIS: Das Gesamtvolumen des tumorverdauenden enzymatischen Cocktails beträgt 20 ml; pro Tumorprobe werden jedoch nur 10 ml benötigt. So kann der restliche Cocktail bei -20 °C gelagert werden, bis er benötigt wird. Aliquots nicht wieder einfrieren. - Um das vollständige Tumormedium herzustellen, fügen Sie 5 ml 100% Pen / Streptokokken und 50 ml fetales Rinderserum (FBS) zu 500 ml sterilem RPMI 1640 in einer Laminar-Flow-Haube hinzu.
- Überführen Sie das Medium auf einen 500 mL, 0,22 μm PES Sterilfilter für die Vakuumfiltration.
- Beschriften und datieren Sie das komplette Tumormedium und lagern Sie es bei 4 °C.
HINWEIS: Das Medium kann 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.
- Um serumreduziertes Medium für den Hungertod vorzubereiten, fügen Sie 5 ml 100% Pen/Streptokokken und 5 ml FBS zu 500 ml sterilem RPMI 1640 in einer Laminar-Flow-Haube hinzu.
- Überführen Sie das Medium auf einen 500 mL, 0,22 μm PES Sterilfilter für die Vakuumfiltration.
- Das serreduzierte Medium etikettieren, datieren und bei 4 °C lagern.
HINWEIS: Das Medium kann 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.
- Zur Herstellung des Gefriermediums fügen Sie 5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) zu 45 ml FBS in einer Laminar-Flow-Haube hinzu.
- Übertragen Sie das Medium auf einen 50 mL, 0,22 μm PES Sterilfilter für die Vakuumfiltration.
- Etikettieren und datieren fünf 15 ml konische Röhrchen.
- Übertragen Sie 10 ml Gefriermedium auf jedes Rohr und lagern Sie die Röhrchen bei -20 °C.
- Um antibiotikafreies Medium für Mykoplasmentests vorzubereiten, fügen Sie 50 ml FBS zu 500 ml sterilem RPMI 1640 in einer Laminar-Flow-Haube hinzu.
- Übertragen Sie das Medium auf einen 50 mL, 0,22 μm PES Sterilfilter für die Vakuumfiltration.
- Kennzeichnen und datieren Sie das antibiotikafreie Medium und lagern Sie es bei 4 °C.
HINWEIS: Das Medium kann 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.
- Um den Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierpuffer (FACS) für die phänotypische Analyse vorzubereiten, fügen Sie 16,6 ml steriles Rinderserumalbumin zu 500 ml steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Laminar-Flow-Haube hinzu.
- Beschriften und datieren Sie den FACS-Puffer und lagern Sie ihn bei 4 °C.
HINWEIS: Der FACS-Puffer erfordert keine Filtersterilisation, solange beide Komponenten steril gelagert werden. Der FACS-Puffer kann vor dem Öffnen 6 Monate bei 4 °C gelagert werden.
- Beschriften und datieren Sie den FACS-Puffer und lagern Sie ihn bei 4 °C.
2. Verdauung von Tumorgewebe
- Übertragen Sie 10 ml tumorverdauenden enzymatischen Cocktail von Schritt 1.2 in einen Dissoziationsschlauch.
- Übertragen Sie das Stück Tumorgewebe mit einem sterilen Skalpell auf einen sterilen 6-Well-Plattendeckel.
HINWEIS: Die Menge an Medium, die mit dem Tumorgewebe übertragen wird, ist für die Verarbeitung ausreichend.- Entfernen Sie alles Fettgewebe, nekrotisches Gewebe und / oder Blutgerinnsel mit einem neuen sterilen Skalpell und einer neuen Pinzette.
HINWEIS: Fettgewebe ist normalerweise gelblich im Aussehen und halbfest. Nekrotisches Gewebe ist dunkler als das umgebende Gewebe im Aussehen und sehr weich; Sowohl Fett- als auch nekrotisches Gewebe brechen leicht auseinander. Blutiges Gewebe erscheint leuchtend rot und kann bei Manipulation Blut in das Medium abgeben. Nach der Entfernung sollte das resultierende Tumorgewebe je nach Gewebetyp Form behalten und blass oder rosa sein. - Schneiden Sie das gesamte Tumorgewebe in 1 mm3 kleine Fragmente. Um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht austrocknet, fügen Sie dem Tumorgewebe 500 μL sterile 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) hinzu.
- Entfernen Sie alles Fettgewebe, nekrotisches Gewebe und / oder Blutgerinnsel mit einem neuen sterilen Skalpell und einer neuen Pinzette.
- Tumorfragmente in den Dissoziationsschlauch mit 10 ml tumorverdauendem enzymatischem Cocktail überführen (Schritt 2.1). Schließen Sie den Schlauch fest, legen Sie ihn mit der Kappe nach unten auf den Gewebedissoziator und fügen Sie den Heizapparat hinzu, indem Sie ihn wie eine Hülse über den Dissoziationsschlauch auftragen und drücken, um ihn an Ort und Stelle zu klicken.
HINWEIS: Die maximale Kapazität für jede Röhre beträgt 4 g Tumor und 10 ml Volumen. - Wählen Sie die vorprogrammierte Einstellung auf der Dissoziator-37C_h_TDK_1 aus. Überprüfen Sie den Status nach 10 Minuten, um sicherzustellen, dass kein Verstopfungsfehler vorliegt, wie durch das blinkende rote Licht angezeigt.
HINWEIS: Dieses Programm arbeitet bei 1.865 U / min für 1 h bei eingeschalteter Temperatur bei 37 ° C.
HINWEIS: Wenn eine Verstopfung auftritt, entfernen Sie den Dissoziationsschlauch und schwenken Sie ihn manuell, um das im Deckel gefangene Gewebe zu entfernen. Ersetzen Sie dann die Röhre auf dem Dissoziator und setzen Sie das Programm fort. - Nach dem 1 h Aufschluss das Dissoziationsrohr entfernen und in eine Laminar-Flow-Haube legen. Filtern Sie den verdauten Tumor, indem Sie ein 70 μm Zellsieb auf ein 50 ml konisches Rohr legen und den verdauten Tumor mit einer 10 ml Pipette auf den Filter pipettieren. Wenn der Filter verstopft, wechseln Sie zu einem neuen Filter.
- Spülen Sie das Dissoziationsröhrchen mit 10 ml frischen Tumoraufschlussmedien aus und führen Sie die Wäsche durch den Filter.
- Entfernen Sie den 70-μm-Filter und entsorgen Sie ihn.
- Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 40 ml mit Tumorverdauungsmedium.
- Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Mit einer 2 ml Ansaugpipette, die an einer Vakuumquelle befestigt ist, saugen Sie den Überstand ab, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie die Zellen mit 10 ml sterilem vollständigem Tumormedium.
- Wiederholen Sie Schritt 2.6.
- Saugen Sie den Überstand wie in Schritt 2.7 beschrieben ab. Suspendieren Sie die Zellen in 3 ml sterilem vollständigem Tumormedium und übertragen Sie die Zellsuspension in eine Vertiefung einer sterilen 6-Well-Platte.
- Halten Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2.
- Nach 24 h das verwendete Medium aus dem verdauten Tumor in Brunnen 1 in einen neuen Brunnen (Brunnen 2) in derselben 6-Well-Platte übertragen. Fügen Sie 3 ml steriles vollständiges Tumormedium zu Brunnen 1 hinzu.
- Das verwendete Medium aus den Vertiefungen 1 und 2 übertragen und nach Schritt 2.11 24 h in der gleichen 6-Well-Platte zu Welle 3 kombinieren. Fügen Sie 3 ml steriles vollständiges Tumormedium in die Vertiefungen 1 und 2 hinzu.
- Das Medium aus allen 3 Vertiefungen absaugen und 3 ml vollständiges Tumormedium nach Schritt 2.12 48 h in jede Vertiefung pipettieren.
3. Generierung der primären Tumorzelllinie
- Bestimmen Sie mit einem Inverted-Phase-Mikroskop den Prozentsatz der Fibroblastenkontamination in der frühen Passagekultur.
HINWEIS: Fibroblasten sind im Allgemeinen lang und unregelmäßig und haben eine schlecht definierte Zellmembran. Sie erscheinen dünn oder flach auf einer Z-Skala.- Wenn die Fibroblastenkontamination größer als 20% der Zellen in der frühen Passagekultur ist, kultivieren Sie weiter, nachdem Sie das vollständige Medium durch ein reduziertes Serummedium ersetzt haben.
- Wiederholen Sie den Ersatz mit reduziertem Serummedium in Schritt 3.1.1 zweimal pro Woche für 3-4 Wochen.
- Wenn die Kultur eine Konfluenz von 80% erreicht, passieren Sie die Zellen, indem Sie 50: 50 in 2 neue Vertiefungen einer 6-Well-Platte aufteilen. Fahren Sie mit 50:50 in reduzierten Serummedien fort, sobald die Zellen eine Konfluenz von 80% erreicht haben.
- Wiederholen Sie Schritt 3.1.3 bis zu 4 Wochen lang und gehen Sie bei Bedarf in größeren Kulturkolben durch, indem Sie 50:50 aufteilen, sobald die Kultur 80% Konfluenz erreicht hat. Wenn die Fibroblastenpopulation nicht auf 10% oder weniger reduziert ist, fahren Sie mit Schritt 3.2 fort, um die differentielle Trypsinisierungsmethode zur Entfernung der Fibroblastenkontamination zu versuchen. Fahren Sie andernfalls mit Schritt 3.3 fort.
- Um Tumorzellen anzureichern, spülen Sie den Brunnen vorsichtig mit 1x PBS ab, um das serumhaltige Medium zu entfernen.
- Fügen Sie Trypsin wie folgt hinzu: 1 ml pro Well, wenn Sie sich in einer 6-Well-Platte befinden, 2 mL für einen T25-Kolben, 3 mL für einen T75-Kolben.
- Legen Sie die 6-Well-Platte oder den Kolben für 1 min in einen Inkubator bei 37 °C. Entfernen Sie die Platte oder den Kolben aus dem Inkubator und überprüfen Sie die Adhäsion der Zellen mit einem inversen Mikroskop. Wenn sich die Zellen teilweise heben oder schweben, entfernen Sie vorsichtig die suspendierten Zellen und nur Trypsin. Legen Sie die Zellen in eine 15 ml konische Röhre, die ein gleiches oder größeres Volumen an vollständigem Tumormedium enthält.
HINWEIS: Diese partielle Sammlung von Zellen, die auf Adhäsionseigenschaften basiert, ist die erste von mehreren Fraktionen. - Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 und 3.2.2, bis alle Zellen angehoben sind oder 4 Fraktionen entfernt wurden.
- Zentrifugieren Sie alle unabhängigen Fraktionen bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Aspirieren Sie den Überstand wie in Schritt 2.7 beschrieben und resuspendieren Sie die Zellen mit 5 ml sterilem, serumreduziertem Medium.
- Die Zellen werden für jede Fraktion in einem T25-Kolben beschichtet und die Kolben bei 37 °C in einen Inkubator gegeben.
- Beurteilen Sie die Kultur nach 48 h, um festzustellen, welche Fraktion für Tumorzellen im Vergleich zu Fibroblasten angereichert ist. Entsorgen Sie fibroblastenreiche Kolben. Wenn die Fibroblastenkontamination <10% beträgt, setzen Sie die Expansion im gesamten Tumormedium fort und fahren Sie mit Schritt 4 fort. Wenn die Fibroblastenkontamination 10-30% beträgt, wiederholen Sie die Schritte 3.1.2-3.1.4. Wenn die Fibroblastenkontamination größer als 30% ist, wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.2.7.
- Wenn in der frühen Passagekultur nur wenige oder keine Fibroblasten nachgewiesen werden, setzen Sie die Passage der Zellen im vollständigen Tumormedium fort, indem Sie 50:50 spalten, sobald die Zellen zu 80% in ihrer 6-Well-Platte oder ihrem Kolben zusammenfließen.
4. Erweiterung der primären Tumorzelllinie der frühen Passage
- Sobald die primäre Tumorkultur 10% oder weniger der Fibroblastenkontamination enthält, aspirieren Sie das Medium und ersetzen Sie es zweimal pro Woche durch steriles vollständiges Tumormedium.
HINWEIS: Das optimale mittlere Volumen für einen T25 beträgt 5 ml; T75 ist 12 ml; T150 ist 25 ml.- Passage der Kultur 50:50 in größere Flaschen nach Bedarf, sobald sie 80% Konfluenz in der Platte oder Flasche erreicht hat.
HINWEIS: Die Kultur muss je nach Wachstum möglicherweise mit einem höheren Verhältnis verabschiedet werden. Passen Sie an, dass die Kultur alle 3-5 Tage eine 80% ige Konfluenz erreicht.
- Passage der Kultur 50:50 in größere Flaschen nach Bedarf, sobald sie 80% Konfluenz in der Platte oder Flasche erreicht hat.
- Passage bis die Kultur in Passage 4 oder höher ist. Sobald die Kultur zu 80% in mindestens zwei T75-Kolben konfluent ist, fahren Sie mit Schritt 5 fort.
5. Charakterisierung und Banking etablierter primärer Tumorzelllinie
- Kryokonservieren Sie einen T75-Kolben als frühes Durchgangsgefrieren. Für Mykoplasmentests der verbleibenden T75-Kolben fahren Sie mit Schritt 5.2 fort.
- Zur Kryokonservierung von Zellen mit früher Passage wird 1 Röhrchen alizitiertes Gefriermedium aufgetaut, das in Schritt 1.5 hergestellt wurde.
- Sammeln Sie die Zellen durch Trypsinisierung, indem Sie zuerst die Platte mit 1x PBS waschen, wie in Schritt 3.2 beschrieben, und Trypsin hinzufügen, wie in Schritt 3.2.1 beschrieben.
- Stellen Sie den Kolben für 3 min in einen Inkubator bei 37 °C. Entfernen Sie den Kolben aus dem Inkubator und überprüfen Sie die Adhäsion der Zellen mit einem inversen Mikroskop. Wenn sich die Zellen heben oder schweben, entfernen Sie vorsichtig die suspendierten Zellen und das Trypsin. Legen Sie die Zellen in eine 15 ml konische Röhre, die ein gleiches oder größeres Volumen an vollständigem Tumormedium enthält.
HINWEIS: Wenn die Zellen nach 3 min haften, legen Sie den Kolben für weitere 2 Minuten zurück in den Inkubator. - Mischen Sie das Röhrchen gut durch vorsichtiges Pipettieren und entfernen Sie 20 μL zum Zählen.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Während sich die Zellen drehen, zählen Sie mit einem laborspezifischen Zählprotokoll wie Trypanblau oder Acridin Orange / Propidiumiodid (AO / PI).
- Resuspendieren Sie die Zellen nach der Zentrifugation in Gefriermedium mit mindestens 2 × 106 Zellen/1 ml Gefriermedium.
- Übertragen Sie 1 ml der Zellsuspension von Schritt 5.1.7 auf vormarkierte 1,5 ml Kryoviale.
- Legen Sie die Kryoviale in eine Gefrierkammer mit kontrollierter Rate und übertragen Sie sie sofort auf -80 °C.
- Lagern Sie die Zellen bis zu 1 Woche bei -80 °C, bevor sie zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführt werden.
- Teilen Sie einen T75-Kolben 50:50 für Mykoplasmentests. Wechseln Sie das Medium in ein antibiotikafreies Medium, das in Schritt 1.6 hergestellt wurde.
- Nach 72 h tauen Sie das Mykoplasmen-Detektionsreagenz, das Substrat und die Kontrollen vor dem Test 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf.
- Sammeln Sie 1 ml des zu testenden Überstands aus jeder zu testenden Kultur und legen Sie ihn in ein 15 ml konisches Rohr.
- Pelletieren Sie alle suspendierten Zellen, indem Sie den Überstand bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
- Laden Sie 100 μL Probenüberstände und Kontrollen in eine weiße 96-Well-Platte. 100 μL Mykoplasmen-Detektionsreagenz zu jeder Probe und Kontrolle hinzufügen.
- 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Legen Sie die Platte in einen Plattenleser und lesen Sie die Lumineszenz ab (Lesen A, d.h. erste Lesung).
HINWEIS: Das Protokoll des Herstellers des Mykoplasmen-Kits gibt an, dass die Standardeinstellungen der multifunktionalen Plattenleser beibehalten werden. Der Messwert wird am Lumineszenzendpunkt mit einer Integrationszeit von 1 s und einer Verstärkung von 135 festgelegt. Der Plattenleser verwendet eine Auto-Scale-Routine, um das Verstärkungssignal für jedes Experiment zu optimieren. Die Integrationszeit von 1 s ist Standardstandard. Beide Einstellungen dienen zur Einstellung der Intensität des vom Plattenleser interpretierten Leuchtsignals und müssen je nach Plattenleser ggf. angepasst werden. - Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenleser und fügen Sie jeder Probe und den Kontrollen 100 μL des Mykoplasmen-Detektionssubstrats hinzu.
- 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Legen Sie die Platte in den Plattenleser und lesen Sie die Lumineszenz ab (Lesung B, d.h. zweite Lesung).
- Um die Mykoplasmen-Positivität zu bestimmen, bestimmen Sie das Verhältnis von Lesen B zu Lesen A.
HINWEIS: Mykoplasmen-Positivitätsverhältnisse sind im Protokoll des Herstellers des Mykoplasmen-Kits beschrieben. Die Messwerte A und B werden mit den gleichen Einstellungen erfasst und spiegeln einfach die Lesereihenfolge wider.- Betrachten Sie ein Verhältnis < 1 als Mykoplasmen-negativ.
- Betrachten Sie ein Verhältnis von 1-1,2 als nicht schlüssig und wiederholen Sie Schritt 5.2.
- Betrachten Sie ein Verhältnis > 1,2 als Mykoplasma-positiv und überwachen Sie diese Kultur; Beenden Sie die Kultur bei Bedarf.
- Durchflusszytometrie-Charakterisierung von Mykoplasmen-negativen Tumorzellen
- Lösen Sie die Tumorzellen mit Hilfe des Zelldissoziationspuffers.
- Zählen Sie die Zellen und suspendieren Sie die Zellen bei 1 × 106/ml im FACS-Puffer aus Schritt 1.7.
- Entfernen Sie 100 μL Zellsuspension in einzelne Röhrchen zur Oberflächenfärbung.
- Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Aspirieren Sie den Überstand und blockieren Sie Fc-Rezeptoren, indem Sie die Zellen in 500 μL 5% Ziegenserum im FACS-Puffer bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.
- Fügen Sie 2 ml FACS-Puffer hinzu und zentrifieren Sie die Suspension bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie die Oberflächenfleckenmischung aus Antikörpern (Tabelle 1) und FACS-Puffer hinzu, so dass das endgültige Volumen 100 μL beträgt. Bedecken Sie die Proben und färben Sie sie 30 min lang auf Eis.
- Wiederholen Sie Schritt 5.3.6.
- Aspirieren Sie den Überstand und fixieren Sie die Zellen, indem Sie in 200 μL 1% Paraformaldehyd (PFA) plus 0,25% EtOH resuspendieren. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 20 Minuten mit den Proben vor Licht geschützt.
- Wiederholen Sie Schritt 5.3.6. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μL FACS-Puffer zur Erfassung mit einem geeigneten Durchflusszytometer.
HINWEIS: Es wird erwartet, dass Mesotheliom-Tumorzellen positiv für Mesothelin und N-Cadherin sind. Einige können auch CD90 ausdrücken.
- Erweitern Sie in vollständiges Tumormedium und Bank, wie in den Schritten 4.1 bzw. 5.1 beschrieben.
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Representative Results
Um die Fibroblastenkontamination von frühen Passagekulturen zu bestimmen, werden Zellen mit einem Inverted-Phase-Mikroskop bewertet, um die Häufigkeit von Fibroblasten im Verhältnis zu den anderen vorhandenen adhärenten Zellen zu identifizieren. Abbildung 1 zeigt Beispiele für eine zunehmende Fibroblastenkontamination von 80% (Abbildung 1A), 50% (Abbildung 1B) und 30% (Abbildung 1C) im Vergleich zu einer Kultur ohne Fibroblastenkontamination (Abbildung 1D). Basierend auf dieser visuellen Bewertung werden Anpassungen an den Ausdehnungsbedingungen wie oben beschrieben vorgenommen. Sobald eine mykoplasmenfreie Kultur mit <10% Fibroblastenkontamination etabliert ist, wird die Durchflusszytometrie verwendet, um die Reinheit der Mesotheliom-Tumorlinie zu bestimmen.
Abbildung 2A,B zeigt eine repräsentative Durchflusszytometrie-Oberflächenfärbung von zwei primären Mesotheliom-Tumorlinien (MESO171 und MESO176) im Vergleich zu ATCC-etablierten Mesotheliom-Tumorlinien (NCI-H2452 und MSTO-211H) mit einer Melanom-Tumorlinie (MEL526) als Negativkontrolle. Mesotheliom-Tumorzellen können Mesothelinin (Abbildung 2A) und N-Cadherin (Abbildung 2B) exprimieren. Detaillierte Informationen zum verwendeten Durchflusszytometrie-Panel sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Gating-Strategie ist in Ergänzender Abbildung 1 dargestellt. Bemerkenswert ist, dass CD90 nicht als fibroblastenspezifischer Marker verwendet werden kann, da es auch von Mesotheliom-Tumorzellen exprimiert werden kann. Die Bedeutung der Prüfung des Einflusses der enzymatischen Ablösung auf die Expression von Oberflächenproteinmarkern wird ebenfalls gezeigt, da sowohl Trypsin als auch das Protease-Kollagenase-Gemisch zum Verlust der Oberflächenexpression von N-Cadherin führten (Abbildung 2C), während CD90 nicht beeinflusst wurde (Abbildung 2D).
Abbildung 1: Repräsentative Bilder der zunehmenden Häufigkeit der Fibroblastenkontamination in frühen Passagekulturen und einer etablierten Tumorlinie . (A) Bild einer Frühpassagekultur mit 80%iger Fibroblastenkontamination. (B) Bild einer Frühpassagekultur mit 50%iger Fibroblastenkontamination. (C) Bild einer Frühpassagekultur mit 30%iger Fibroblastenkontamination. (D) Bild einer etablierten primären Mesotheliom-Tumorlinie. Maßstabsbalken = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative Durchflusszytometrie-Phänotypisierung der etablierten Mesotheliom-Tumorzelllinie. (A und B) Histogramme, die das Oberflächenexpressionsmuster von Mesothelin und N-Cadherin auf ATCC-Mesotheliom-Zelllinien, Kontrollmelanom-Tumorlinie und primären Mesotheliom-Tumorlinien zeigen. (C und D) Einfluss von Trypsin, Protease-Kollagenase-Gemisch und Zelldissoziationspuffer auf N-Cadherin und CD90. Abkürzungen: Comp-X-A = kompensierte Fläche von Fluorophor X; PE = Phycoerythrin; APC = Allophycocyanin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Oberflächen-Antikörper | Fortessa X20 Kanal | Laser | Klonen | Isotyp | Volumen/ Probe (μL) |
| Lebend/Totengelb | BV510 | VIOLETT | N/A | N/A | 1 |
| Anti-Mesothelin-APC | Apc | Rot | REA1057 | IgG1 | 2 |
| Anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Pe | YG | 8C11 | IgG1 | 5 |
| Anti-CD90 PE-Cy7 | PE-Cy7 | YG | 5E10 | IgG1 | 5 |
Tabelle 1: Durchflusszytometrie-Antikörper zur Phänotypisierung von Tumorlinien. Abkürzungen: PE = phycoerythrin; APC = Allophycocyanin.
Ergänzende Abbildung S1: Gating-Strategie zur phänotypischen Analyse von Tumorlinien. Punktdiagramme werden für jeden Schritt in der Gating-Strategie angezeigt, der zur Bewertung des Ausdrucks der Marker von Interesse führt. Jedes anfängliche Gate, das Vorwärtsstreu- und Seitenstreueigenschaften verwendet, wird erstellt, um die interessierenden Zellen zu identifizieren, gefolgt von einem QC-Gatter basierend auf dem Zeitmerkmal. Die Zellen werden dann subgiert, um alle Dubletten mithilfe von Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften zu entfernen. Das endgültige QC-Gate basiert auf der Lebensfähigkeit, wobei die toten Zellen positiv für den Farbstoff färben. Nach dem Viability Gate kann das Subgating basierend auf dem Panel durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Während dieses Protokoll einfach ist, gibt es ein paar kritische Schritte, die genau befolgt werden müssen. Das Einfrieren der frühen Passage ist wichtig, um die Fähigkeit zu erhalten, den Tumorzellanreicherungsprozess zu wiederholen, wenn er zunächst nicht erfolgreich ist. Die Fähigkeit, die fibroblastische Kontamination mit dem Auge zu beurteilen, um die richtige Spaltungs- und Medienhungertechnik zu bestimmen, ist entscheidend für die Verhinderung von Fibroblastenüberwucherung in der Kultur. Darüber hinaus erfordert die differentielle Trypsinisierungsmethode eine sorgfältige Beobachtung der Zellen während der Inkubation. Die Zellen können die Kunststoffplatte mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten abheben, und dies variiert von Zelllinie zu Zelllinie. Während dieses Prozesses gelernt und dieser Entscheidungsschritt verfeinert wird, kann ein Teil der ursprünglichen Kultur in einer 6-Well-Platte mit reduziertem Serumhungermedium (RPMI 1640 mit 1% Pen / Strep und 1% FBS) konserviert werden, bis eine Tumorzellanreicherung beobachtet werden kann.
Ein wichtiger Faktor, der bei der validierten phänotypischen Charakterisierung der Mesotheliom-Tumorlinien festgestellt wurde, war der Einfluss der Trypsinisierung und der Protease-Kollagenase-Mischung auf die Expression des Mesotheliom-Tumorzelloberflächenmarkers N-Cadherin8. Wir beobachteten einen Verlust des Oberflächenmarkers, wenn Zellen mit diesen Enzymen abgelöst wurden, was zuvor beschrieben wurde9. Während gezeigt wurde, dass die meisten Oberflächenproteine nicht negativ von Trypsin beeinflusst werden, ist es wichtig, jeden Oberflächenmarker während des Flow-Panel-Designszu testen 10. Darüber hinaus wird dringend empfohlen, die Tumorzellen zu kultivieren oder zu erweitern, bis die Zellen eine logarithmische Expansionsphase erreichen und Zeit haben, diese Marker erneut zu exprimieren. Die Verwendung von Zelldissoziationsmedium ermöglichte die Beibehaltung der Expression von N-Cadherin für den Nachweis mittels Durchflusszytometrie. Andere Arten von Dissoziationsmedien können ebenfalls eine Markerretention ermöglichen; Einzelne Labore sollten diese Medien jedoch sorgfältig testen, bevor sie ein Durchflusszytometrie-Panel einrichten.
Eine wesentliche Einschränkung dieser Studie besteht darin, dass die Erfolgsquote bei der Etablierung einer Zelllinie nur 50% beträgt. Dies könnte auf die heterogene Natur der Tumormikroumgebung zurückzuführen sein. Wege zur Verbesserung dieses Prozesses könnten die Verwendung von 3D-Kultursystemen, die Zugabe von Medienpräparaten zur Förderung der Tumorzellexpansion, verbesserte Disaggregationsmethoden, die Verwendung von patientenabgeleiteten Xenotransplantaten oder Plattenbeschichtungen zur Verbesserung der Tumorzelladhäsionumfassen 11. Tatsächlich haben sich 3D-Kulturen bei der Erzeugung anspruchsvoller Tumorzelllinien wie Bauchspeicheldrüsenkrebsals erfolgreich erwiesen 7.
Ein Weg der Selektion, der in diesem Protokoll nicht enthalten ist, ist die Tumorzellanreicherung durch Zellsortierung basierend auf einem Mesotheliom-Tumormarker wie Mesothelin. Da Mesotheliom-Tumorzellen den Standard-Fibroblastenmarker CD90 exprimieren können, kann eine positive Selektion eine bessere Alternative sein. Der Vorbehalt dieser Methode ist der geringe Grad an Zellularität in frühen Kulturen, der das Sortieren in eine kleinvolumige Multiwell-Platte wie eine 384- oder 96-Well-Platte erfordern würde. Da dieses Protokoll die Verwendung von Kollagenase für die Gewebeverdauung beinhaltet, ist nicht bekannt, ob dies auch die Oberflächenexpression von N-Cadherin oder Mesothelin beeinflussen kann. Während der Mechanismus der Mesothelinexpression relativ unbekannt ist, spielt N-Cadherin eine wichtige Rolle bei der zellulären Adhäsion, und die Entfernung dieses Proteins könnte sich negativ auf die Etablierung einer Tumorlinie12 auswirken. Dies wird derzeit geprüft.
Diese Methode ist von Bedeutung, da sie die Generierung eines In-vitro-Modellsystems zur Untersuchung dieses seltenen Tumortyps ermöglicht. Dies kann Studien umfassen, die neue Oberflächenziele von Mesotheliomen wie Mesothelin mit CAR-T-Zellen identifizieren und tumorintrinsische Eigenschaften der Resistenz gegen gezielte oder Immuntherapien aufdecken. Wenn diese Zellen in Mausmodellen in vivo erweitert werden können, würde dies auch eine Quelle für die Prüfung von zellbasierten und Antikörper-basierten Therapeutika sowie von kleinen Molekülen schaffen. Eine zukünftige Richtung für dieses Protokoll wird darin bestehen, die Fähigkeit zu testen, andere Subtypen von MPMs wie die sarkomatoiden und biphasischen Teilmengen zu erweitern.
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Disclosures
CH ist Mitglied des SAB für Briacell Therapeutics und der Mesothelioma Applied Research Foundation. Alle anderen Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir möchten Raquel Laza-Briviesca für ihren Beitrag zum Start dieses Protokolls und Dr. Boris Sepesi, Dr. Reza Mehran und Dr. David Rice für die Zusammenarbeit bei der Gewebeentnahme danken. Es gibt keine zusätzlichen Mittel, die mit dieser Arbeit verbunden sind.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
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