Summary
Bu yöntem makalesinin amacı, cerrahi olarak rezeke edilmiş plevral mezotelyomadan primer tümör hücre hatlarının zenginleştirilmesi, üretilmesi ve genişletilmesi için sağlam ve tekrarlanabilir bir metodoloji göstermektir.
Abstract
Nadir tümör tiplerinden primer tümör hücre hatlarının genişlemesi için mevcut metodolojiler eksiktir. Bu protokol, primer tümör hücrelerini cerrahi olarak rezeke edilmiş, malign plevral mezotelyomadan (MPM) genişletme yöntemlerini açıklayarak, sindirimden zenginleştirmeye, genişlemeye, kriyoprezervasyona ve fenotipik karakterizasyona kadar olan sürece tam bir genel bakış sağlar. Ek olarak, bu protokol, diferansiyel tripsinizasyon ve ayrışma yöntemlerinin fenotipik karakterizasyon için hücre yüzey belirteçlerinin tespiti üzerindeki etkisi gibi çoklu tümör tipleri için yararlı olabilecek tümör üretimi için kavramlar sunmaktadır. Bu çalışmanın en büyük sınırlaması, iki boyutlu (2D) bir kültür sisteminde genişleyecek tümör hücrelerinin seçimidir. Üç boyutlu (3D) kültür sistemleri, medya takviyeleri, yapışmayı iyileştirmek için plaka kaplama ve alternatif ayrışma yöntemleri de dahil olmak üzere bu protokoldeki varyasyonlar, bu tekniği ve bir tümör hattı oluşturmanın genel başarı oranını artırabilir. Genel olarak, bu protokol bu nadir tümörden tümör hücrelerinin oluşturulması ve karakterize edilmesi için temel bir yöntem sağlar.
Introduction
Malign plevral mezotelyoma (MPM), asbest maruziyeti ile yüksek oranda ilişkili nadir bir tümördür. İmmünoterapiye dayalı yaklaşımlar cesaret verici sonuçlar göstermesine rağmen, bu hastalığı geliştiren hastalar için mevcut tedavi seçeneklerinin yetersizliği vardır ve genel 5 yıllık sağkalım oranı düşüktür 1,2. Bu hastalığı daha iyi anlamak ve hasta sonuçlarını iyileştirebilecek yeni terapötik hedefler belirlemek için birçok kurumda çabalar devam etmektedir. Birden fazla mezotelyoma fare modeli olsa da, primer mezotelyoma tümör hücrelerine erişim daha sınırlıdır3. Primer mezotelyoma tümör hücrelerinin in vitro genişlemesi, tümör hücrelerini doğrudan incelemek ve tümör infiltrasyonu yapan lenfositler gibi otolog immün hücrelerle etkileşimlerini incelemek için kullanılabilecek değerli bir model sistemi sağlayacaktır. Primer mezotelyoma tümör hücreleri hatlarının genişlemesi hakkında raporlar bulunmakla birlikte, bunlar azdır ve ayrıntılı bir standart operasyon prosedürü (SOP) sağlamamaktadır. Ayrıca, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) gibi ticari kaynaklardan birkaç hücre hattı mevcuttur. Primer tümör hatlarının mevcudiyeti sınırlı olmakla birlikte, tümör hücrelerinin plevral efüzyonlardan ve doğrudan tümör dokusundan genişletilebileceği gösterilmiştir 4,5. Ek olarak, genişlemiş tümör hücre hatlarının orijinal tümörün moleküler profilini koruduğu gösterilmiştir 4,5,6.
Laboratuvarımız MPM'nin tümör-immün mikroçevresini incelemekte ve cerrahi olarak rezeke edilen vakalardan primer MPM tümör hücreleri hatlarını genişletmek için bir yöntem geliştirmiştir. Bu yöntem, primer metastatik melanom tümör hücre hatlarının oluşturulmasındaki deneyimlerimizden uyarlanmıştır. Bu çalışmanın amacı, bir 2D model sistemi ve ardından fenotipik profilleme kullanarak primer mezotelyoma tümör hattı genişlemesine ayrıntılı ve pratik bir yaklaşım sağlamaktır. İlk basamak ayar2'de CTLA4 ve PD-1'i hedef alan kontrol noktası blokaj stratejilerinin son zamanlardaki başarısı göz önüne alındığında, birçok primer tümör hattı üretme yeteneği, hem tümörün içsel direnç mekanizmalarının anlaşılmasını daha da ileri götürebilir hem de T hücresi tanımayı değerlendirmek için önemli bir model sistemi sağlayabilir, böylece MPM'deki immün yanıt hakkındaki anlayışımızı derinleştirebilir.
Bu protokolün en büyük sınırlaması, her tümörün farklı bir mikro çevre içermesi ve genişleme başarısının yüksek derecede değişkenliğinin olmasıdır. Ek olarak, bu yöntem bir 2D kültür sisteminde genişleyebilen tümör hücrelerini seçer. Bir 3D sferoid veya organoid kültürünün üretimini içeren diğer yöntemler, daha yüksek bir genişleme başarı oranına izin verebilecek veya geleneksel bir 2D sistemde genişleyemeyen hücre çizgilerini türetme yeteneği ile sonuçlanabilecek alternatif bir yaklaşım sağlayabilir. Bu tür 3D kültürlerin, örneğin pankreas kanseri7 gibi genişlemesi zor olan tümör tiplerinin üretimi için yararlı olduğu gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler, Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi Kurum İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır. Bu, bilgilendirilmiş onam sonrasında çıkarılan bakım standardı, cerrahi olarak rezeke edilmiş MPM tümörleri ile ilgilidir.
1. Tümör sindirim ortamının ve diğer ilişkili ortamların hazırlanması
- Tümör sindirim ortamını hazırlamak için, laminer akışlı bir davlumbazda 500 mL steril Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamına 5 mL% 100 Pen / Strep (Penisilin / Streptomisin) ekleyin.
- Vakum filtrasyonu için ortamı 500 mL, 0,22 μm polietersülfon (PES) steril filtreye aktarın.
NOT: Filtrasyon ve aspirasyon adımları 75-150 torr'luk standart bir vakum basıncı ile yapılmalıdır. - Tümör sindirim ortamını etiketleyip tarihlendirin ve 4 ° C'de saklayın.
NOT: Ortam, 4 °C'de 1 ay boyunca saklanabilir.
- Vakum filtrasyonu için ortamı 500 mL, 0,22 μm polietersülfon (PES) steril filtreye aktarın.
- Tümör sindirici enzimatik kokteyli hazırlamak için, laminer bir akış başlığında 50 mL'lik bir konik tüpe 2.5 mL'lik bir sindirim ortamına 2.5 mL% 3 kollajenaz tip 1, 1 mL 1.5 mg / mL hyaluronidaz, 20 μL 250.000 ünite / mL DNAse 1 ila 16.5 mL sindirim ortamı ekleyin.
NOT: Tümör sindirici enzimatik kokteylin toplam hacmi 20 mL'dir; Bununla birlikte, tümör örneği başına sadece 10 mL'ye ihtiyaç vardır. Bu nedenle, kalan kokteyl ihtiyaç duyulana kadar -20 ° C'de saklanabilir. Aliquots'u yeniden dondurmayın. - Tam tümör ortamı hazırlamak için, laminer bir akış başlığında 500 mL steril RPMI 1640'a 5 mL% 100 Pen / Strep ve 50 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin.
- Vakum filtrasyonu için ortamı 500 mL, 0,22 μm PES steril filtreye aktarın.
- Tüm tümör ortamını etiketleyip tarihlendirin ve 4 ° C'de saklayın.
NOT: Ortam, 4 °C'de 1 ay boyunca saklanabilir.
- Açlığa indirgenmiş serum ortamı hazırlamak için, laminer akışlı bir davlumbazda 500 mL steril RPMI 1640'a 5 mL %100 Pen/Strep ve 5 mL FBS ekleyin.
- Vakum filtrasyonu için ortamı 500 mL, 0,22 μm PES steril filtreye aktarın.
- İndirgenmiş serum ortamını etiketleyip tarihlendirin ve 4 °C'de saklayın.
NOT: Ortam, 4 °C'de 1 ay boyunca saklanabilir.
- Dondurucu ortam hazırlamak için, laminer bir akış başlığına 45 mL FBS'ye 5 mL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin.
- Vakum filtrasyonu için ortamı 50 mL, 0,22 μm PES steril filtreye aktarın.
- Beş adet 15 mL konik tüpü etiketleyin ve tarihlendirin.
- Her tüpe 10 mL donma ortamı aktarın ve tüpleri -20 ° C'de saklayın.
- Mikoplazma testi için antibiyotik içermeyen ortam hazırlamak için, laminer bir akış başlığında 500 mL steril RPMI 1640'a 50 mL FBS ekleyin.
- Vakum filtrasyonu için ortamı 50 mL, 0,22 μm PES steril filtreye aktarın.
- Antibiyotiksiz ortamı etiketleyip tarihlendirin ve 4 °C'de saklayın.
NOT: Ortam, 4 °C'de 1 ay boyunca saklanabilir.
- Fenotipik analiz için floresan ile aktive edilen hücre sıralama (FACS) tamponu hazırlamak için, laminer bir akış başlığında 500 mL steril 1x fosfat tamponlu saline (PBS) 16,6 mL steril sığır serum albümini ekleyin.
- FACS tamponunu etiketleyip tarihlendirin ve 4 °C'de saklayın.
NOT: FACS tamponu, her iki bileşen de steril olarak depolandığı sürece filtre sterilizasyonu gerektirmez. FACS tamponu açılmadan önce 4 °C'de 6 ay saklanabilir.
- FACS tamponunu etiketleyip tarihlendirin ve 4 °C'de saklayın.
2. Tümör dokusunun sindirimi
- 10 mL tümör sindiren enzimatik kokteyli adım 1.2'den bir ayrışma tüpüne aktarın.
- Tümör dokusu parçasını steril bir neşter kullanarak steril bir 6 delikli plaka kapağına aktarın.
NOT: Tümör dokusu ile transfer edilen ortam miktarı işlem için yeterlidir.- Yeni bir steril neşter ve forseps kullanarak tüm yağ dokusunu, nekrotik dokuyu ve / veya kan pıhtılarını çıkarın.
NOT: Yağ dokusu normalde sarımsı görünümde ve yarı katıdır. Nekrotik doku görünüşte çevreleyen dokudan daha koyu ve çok yumuşaktır; hem yağlı hem de nekrotik doku kolayca parçalanır. Kanlı doku parlak kırmızı görünür ve manipüle edildiğinde kanı ortama bırakabilir. Çıkarıldıktan sonra, ortaya çıkan tümör dokusu şekli tutmalı ve doku tipine bağlı olarak soluk veya pembe olmalıdır. - Tüm tümör dokusunu 1mm3 küçük parçalara ayırın. Dokunun kurumamasını sağlamak için, tümör dokusuna 500 μL steril 1x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ekleyin.
- Yeni bir steril neşter ve forseps kullanarak tüm yağ dokusunu, nekrotik dokuyu ve / veya kan pıhtılarını çıkarın.
- Tümör fragmanlarını, 10 mL tümör sindiren enzimatik kokteyl içeren ayrışma tüpüne aktarın (adım 2.1). Tüpü sıkıca kapatın, kapağı doku ayrıştırıcısının üzerine yan tarafa yerleştirin ve ısıtıcı aparatını, ayrışma tüpünün üzerine bir manşon gibi uygulayarak ve yerine tıklamak için bastırarak ekleyin.
NOT: Her tüp için maksimum kapasite 4 g tümör ve 10 mL hacimdir. - Ayrıştırıcı 37C_h_TDK_1 önceden programlanmış ayarı seçin. Yanıp sönen kırmızı ışıkta belirtildiği gibi tıkanma hatası olmadığından emin olmak için 10 dakika sonra durumu kontrol edin.
NOT: Bu program, sıcaklık 37 °C'de açıkken 1 saat boyunca 1.865 rpm'de çalışır.
NOT: Tıkanma meydana gelirse, ayrışma tüpünü çıkarın ve kapakta sıkışan herhangi bir dokuyu yerinden çıkarmak için manuel olarak döndürün; daha sonra tüpü ayrıştırıcının üzerine yerleştirin ve programa devam edin. - 1 saatlik sindirimi takiben, ayrışma tüpünü çıkarın ve laminer bir akış başlığına yerleştirin. 50 mL'lik bir konik tüpün üzerine 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirerek ve sindirilen tümörü filtreye 10 mL'lik bir pipet kullanarak pipetleyerek sindirilmiş tümörü filtreleyin. Filtre tıkanırsa, yeni bir filtreye geçin.
- Ayrışma tüpünü 10 mL taze tümör sindirim ortamı ile durulayın ve yıkamayı filtreden geçirin.
- 70 μm filtreyi çıkarın ve atın.
- Tümör sindirim ortamı ile toplam hacmi 40 mL'ye getirin.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj.
- Bir vakum kaynağına bağlı 2 mL aspire edici pipet kullanarak, peleti rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin ve 10 mL steril tam tümör ortamı kullanarak hücreleri yeniden askıya alın.
- 2.6 adımını yineleyin.
- Süpernatantı adım 2.7'de açıklandığı gibi aspire edin. Hücreleri 3 mL steril tam tümör ortamında yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu steril 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın.
- Plakayı% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir inkübatörde tutun.
- 24 saat sonra, kullanılan ortamı sindirilmiş tümörden 1. kuyudaki aynı 6 delikli plakadaki yeni bir kuyuya (kuyu 2) aktarın. 1'e 3 mL steril tam tümör ortamı ekleyin.
- Kullanılan ortamı kuyu 1 ve 2'den aktarın ve adım 2.11'den 24 saat sonra aynı 6 delikli plakada kuyu 3'te birleştirin. Kuyu 1 ve 2'ye 3 mL steril tam tümör ortamı ekleyin.
- Ortamı 3 kuyucuğun hepsinden aspire edin ve 3 mL'lik tam tümör ortamını pipet, adım 2.12'den 48 saat sonra her bir kuyucuğa aspire edin.
3. Primer tümör hücre hattının oluşturulması
- Ters faz mikroskobu kullanarak, erken geçiş kültüründe fibroblast kontaminasyonunun yüzdesini belirleyin.
NOT: Fibroblastlar genellikle uzun ve düzensizdir ve kötü tanımlanmış bir hücresel zara sahiptir. Z ölçeğinde ince veya düz görünürler.- Fibroblast kontaminasyonu, erken geçiş kültüründeki hücrelerin% 20'sinden fazlaysa, tüm ortamı azaltılmış serum ortamı ile değiştirdikten sonra kültürlemeye devam edin.
- 3.1.1. adımdaki azaltılmış serum ortamı ile değiştirmeyi 3-4 hafta boyunca haftada iki kez tekrarlayın.
- Kültür% 80 akıcılığa ulaştığında, 50:50'yi 6 delikli bir plakanın 2 yeni kuyucuğuna bölerek hücreleri geçirin. Hücreler% 80 akıcılığa ulaştığında azaltılmış serum ortamında 50:50 pasajına devam edin.
- Adım 3.1.3'ü 4 haftaya kadar tekrarlayın, kültür %80 akıcılığa ulaştığında 50:50'yi bölerek gerektiğinde daha büyük kültür şişelerinde geçiş yapın. Fibroblast popülasyonu% 10 veya daha azına düşürülmezse, fibroblast kontaminasyonunu gidermek için diferansiyel tripsinizasyon yöntemini denemek için adım 3.2'ye devam edin. Aksi takdirde, adım 3.3'e geçin.
- Tümör hücrelerini zenginleştirmek için, serum içeren ortamı çıkarmak için kuyuyu 1x PBS ile hafifçe durulayın.
- Tripsin aşağıdaki gibi ekleyin: 6 delikli bir plakada kuyu başına 1 mL, T25 şişe için 2 mL, T75 şişe için 3 mL.
- 6 delikli plakayı veya şişeyi 1 dakika boyunca 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin. Plakayı veya şişeyi inkübatörden çıkarın ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücrelerin yapışmasını kontrol edin. Hücreler kısmen kalkıyor veya yüzüyorsa, askıya alınmış hücreleri ve tripsini sadece yavaşça çıkarın. Hücreleri, eşit veya daha büyük hacimli tam tümör ortamı içeren 15 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin.
NOT: Yapışma özelliklerine dayanan bu kısmi hücre koleksiyonu, çoklu fraksiyonların ilkidir. - Tüm hücreler kaldırılana veya 4 kesir kaldırılana kadar 3.2.1 ve 3.2.2 numaralı adımları yineleyin.
- Tüm bağımsız fraksiyonları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj yapın.
- Süpernatantı adım 2.7'de açıklandığı gibi aspire edin ve 5 mL steril, azaltılmış serum ortamı kullanarak hücreleri yeniden askıya alın.
- Hücreleri her fraksiyon için bir T25 şişesine yerleştirin ve şişeleri 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin.
- Fibroblastlara karşı tümör hücreleri için hangi fraksiyonun zenginleştirildiğini belirlemek için 48 saat sonra kültürü değerlendirin. Fibroblast bakımından zengin şişeleri atın. Fibroblast kontaminasyonu% <10 ise, tam tümör ortamında genişlemeye devam edin ve adım 4'e geçin. Fibroblast kontaminasyonu% 10-30 ise, 3.1.2-3.1.4 adımlarını tekrarlayın. Fibroblast kontaminasyonu% 30'dan büyükse, 3.2-3.2.7 adımlarını tekrarlayın.
- Erken geçiş kültüründe az sayıda fibroblast tespit edilirse veya hiç fibroblast tespit edilmezse, hücreler 6 delikli plakalarında veya şişelerinde% 80 oranında birleştikten sonra 50:50'yi bölerek hücreleri tam tümör ortamında geçirmeye devam edin.
4. Erken pasaj primer tümör hücre hattının genişlemesi
- Primer tümör kültürü% 10 veya daha az fibroblast kontaminasyonu içerdiğinde, ortamı aspire edin ve haftada iki kez steril tam tümör ortamı ile değiştirin.
NOT: Bir T25 için en uygun orta hacim 5 mL'dir; T75 12 mL'dir; T150 25 mL'dir.- Kültür 50:50'yi, plakada veya şişede% 80 akıcılığa ulaştığında gerektiğinde daha büyük şişelere geçirin.
NOT: Kültürün, büyümesine bağlı olarak daha yüksek bir oranda geçirilmesi gerekebilir. Kültürün her 3-5 günde bir% 80 akıcılığa ulaşmasını sağlayın.
- Kültür 50:50'yi, plakada veya şişede% 80 akıcılığa ulaştığında gerektiğinde daha büyük şişelere geçirin.
- Kültür 4. veya daha yüksek bir geçitte olana kadar geçiş. Kültür, en az iki T75 şişesinde %80 oranında birleştiğinde, 5. adıma geçin.
5. Kurulan primer tümör hücre hattının karakterizasyonu ve bankacılığı
- Cryopreserve bir T75 şişeyi erken geçiş donması olarak. Kalan T75 şişelerinin mikoplazma testi için, adım 5.2'ye devam edin.
- Erken geçiş hücrelerinin kriyoprezervasyonu için, adım 1.5'te hazırlanan 1 tüp aliquoted dondurma ortamını çözün.
- Hücreleri tripsinizasyon yoluyla toplayın, önce plakayı adım 3.2'de açıklandığı gibi 1x PBS ile yıkayın ve adım 3.2.1'de açıklandığı gibi tripsin ekleyin.
- Şişeyi 3 dakika boyunca 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin. Şişeyi inkübatörden çıkarın ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücrelerin yapışmasını kontrol edin. Hücreler kalkıyor veya yüzüyorsa, asılı hücreleri ve tripsinimi yavaşça çıkarın. Hücreleri, eşit veya daha büyük hacimli tam tümör ortamı içeren 15 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin.
NOT: Hücreler 3 dakika sonra yapışkan kalırsa, şişeyi 2 dakika daha inkübatöre geri yerleştirin. - Tüpü hafifçe pipetleyerek iyice karıştırın ve saymak için 20 μL'yi çıkarın.
- Tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj yapın.
- Hücreler dönerken, tripan mavisi veya akridin turuncu / propidium iyodür (AO / PI) gibi laboratuvara özgü bir sayma protokolü kullanarak sayın.
- Dondurucu ortamda santrifüjlemeyi takiben hücreleri en az 2 × 106 hücre/1 mL dondurucu ortam ile yeniden askıya alın.
- Hücre süspansiyonunun 1 mL'sini adım 5.1.7'den önceden etiketlenmiş 1.5 mL kriyovyallere aktarın.
- Kriyovalleri kontrollü bir donma odasına yerleştirin ve hemen -80 ° C'ye aktarın.
- Hücreleri uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarmadan önce -80 ° C'de 1 haftaya kadar saklayın.
- Mikoplazma testi için bir T75 şişe 50:50'yi bölün. Ortamı adım 1.6'da hazırlanan antibiyotiksiz ortama değiştirin.
- 72 saat sonra, testten önce mikoplazma tespit reaktifini, substratını ve kontrollerini oda sıcaklığında 15 dakika boyunca çözün.
- Test edilecek her kültürden 1 mL süpernatant toplayın ve 15 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin.
- Süpernatantı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj ederek askıya alınmış hücreleri toplayın.
- 100 μL numune süpernatantını ve kontrollerini beyaz bir 96 delikli plakaya yükleyin. Her numuneye ve kontrole 100 μL mikoplazma tespit reaktifi ekleyin.
- Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin ve parlaklığı okuyun (A Okuma, yani ilk Okuma).
NOT: Mikoplazma kiti üreticisinin protokolü, çok işlevli plaka okuyucularda varsayılan ayarların korunmasını belirtir. Okuma, 1 sn'lik bir entegrasyon süresi ve 135 kazanç ile Lüminesans uç noktasında ayarlanır. Plaka okuyucu, her deney için kazanç sinyalini optimize etmek üzere bir Otomatik ölçeklendirme rutini kullanır. 1 s entegrasyon süresi standart varsayılandır. Her iki ayar da plaka okuyucu tarafından yorumlanan ışıldayan sinyalin yoğunluğunu ayarlamak için kullanılır ve bireysel plaka okuyucusuna bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. - Plakayı plaka okuyucudan çıkarın ve her numuneye ve kontrollere 100 μL mikoplazma algılama substratı ekleyin.
- Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve parlaklığı okuyun (B Okuma, yani ikinci Okuma).
- Mikoplazma pozitifliğini belirlemek için, Reading B'nin Reading A'ya oranını belirleyin.
NOT: Mikoplazma pozitiflik oranları, mikoplazma kiti üreticisinin protokolünde açıklanmıştır. A ve B okumaları aynı ayarlarla elde edilir ve sadece okuma sırasını yansıtır.- 1'< bir oranın mikoplazma-negatif olduğunu düşünün.
- 1-1.2 oranının sonuçsuz olduğunu düşünün ve adım 5.2'yi tekrarlayın.
- 1.2> bir oranın mikoplazma-pozitif olduğunu düşünün ve bu kültürü izleyin; gerekirse kültürü sonlandırın.
- Mikoplazma-negatif tümör hücrelerinin akım sitometrisi karakterizasyonu
- Hücre ayrışma tamponu kullanarak tümör hücrelerini yerinden çıkarın.
- Hücreleri sayın ve hücreleri adım 1.7'den itibaren FACS tamponunda 1 × 106 / mL'de yeniden askıya alın.
- Yüzey boyama için 100 μL hücre süspansiyonunu ayrı tüplere çıkarın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj.
- Süpernatantı aspire edin ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca FACS tamponunda 500 μL% 5 keçi serumunda inkübe ederek Fc reseptörlerini bloke edin.
- 2 mL FACS tamponu ekleyin ve süspansiyonu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj yapın.
- Süpernatantı aspire edin ve antikorların yüzey leke karışımını (Tablo 1) ve FACS tamponunu ekleyin, böylece son hacim 100 μL olur.
- Adım 5.3.6'yı yineleyin.
- Süpernatantı aspire edin ve 200 μL% 1 paraformaldehit (PFA) artı% 0.25 EtOH'de yeniden süspansiyon sağlayarak hücreleri sabitleyin. Numuneler ışıktan korunarak oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
- Adım 5.3.6'yı yineleyin. Uygun bir akış sitometresi kullanarak elde etmek için hücreleri 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın.
NOT: Mezotelyoma tümör hücrelerinin mezotelin ve N-kadherin için pozitif olması beklenmektedir. Bazıları CD90'ı da ifade edebilir.
- Sırasıyla adım 4.1 ve 5.1'de açıklandığı gibi tam tümör ortamında ve bankada genişletin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Erken geçiş kültürlerinin fibroblast kontaminasyonunu belirlemek için, hücreler, fibroblastların mevcut diğer yapışkan hücrelere göre sıklığını tanımlamak için ters faz mikroskobu kullanılarak değerlendirilir. Şekil 1, fibroblast kontaminasyonu olmayan bir kültüre kıyasla% 80 (Şekil 1A),% 50 (Şekil 1B) ve% 30 (Şekil 1C) artan fibroblast kontaminasyonunun örneklerini göstermektedir (Şekil 1D). Bu görsel değerlendirmeye dayanarak, yukarıda açıklandığı gibi genişletme koşullarında ayarlamalar yapılır. % <10 fibroblast kontaminasyonuna sahip mikoplazmasız bir kültür oluşturulduktan sonra, mezotelyoma tümör hattının saflığını belirlemek için akış sitometrisi kullanılır.
Şekil 2A,B, negatif kontrol olarak bir melanom tümör hattı (MEL526) ile ATCC tarafından kurulan mezotelyoma tümör hatlarına (NCI-H2452 ve MSTO-211H) kıyasla iki primer mezotelyoma tümör hattının (MESO171 ve MESO176) temsili akış sitometri yüzey boyamasını göstermektedir. Mezotelyoma tümör hücreleri mezotelin (Şekil 2A) ve N-kadherini (Şekil 2B) eksprese edebilir. Kullanılan akış sitometri paneli ile ilgili detaylı bilgiler Tablo 1'de gösterilmiştir. Geçit stratejisi Ek Şekil 1'de gösterilmiştir. Not olarak, CD90, mezotelyoma tümör hücreleri tarafından da eksprese edilebildiği için fibroblasta özgü bir belirteç olarak kullanılamaz. Enzimatik ayrılmanın yüzey proteini belirteci ekspresyonu üzerindeki etkisinin test edilmesinin önemi, hem tripsin hem de proteaz-kollajenaz karışımının N-kadherinin yüzey ekspresyonunun kaybına neden olduğu (Şekil 2C) ve CD90'ın etkilenmediği (Şekil 2D) gösterilmiştir.
Şekil 1: Erken geçiş kültürlerinde fibroblast kontaminasyonunun artan sıklığının temsili görüntüleri ve yerleşik bir tümör hattı . (A) %80 fibroblast kontaminasyonu içeren erken geçiş kültürünün görüntüsü. (B) %50 fibroblast kontaminasyonu içeren erken geçiş kültürünün görüntüsü. (C) %30 fibroblast kontaminasyonu içeren erken geçiş kültürünün görüntüsü. (D) Yerleşmiş bir primer mezotelyoma tümör hattının görüntüsü. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yerleşmiş mezotelyoma tümör hücre hattının temsili akım sitometrisi fenotiplemesi. (A ve B) ATCC mezotelyoma hücre hatları, kontrol melanom tümör hattı ve primer mezotelyoma tümör hatları üzerinde mezotelin ve N-kadherinin yüzey ekspresyon paternini gösteren histogramlar. (C ve D) Tripsin, proteaz-kollajenaz karışımı ve hücre ayrışma tamponunun N-kadherin ve CD90 üzerine etkisi. Kısaltmalar: Comp-X-A = florofor X'in telafi edilmiş alanı; PE = fikoeritrin; APC = allophycocyanin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Yüzey Antikoru | Fortessa X20 Kanal | Lazer | Klon | Izotip | Hacim / Numune (μL) |
| Canlı/Ölü Sarı | BV510 Serisi | MENEKŞE | Yok | Yok | 1 |
| anti-mezotelin APC | Apc | Kırmızı | REA1057 Serisi | IgG1 | 2 |
| anti-CD325 (N-Kadherin) PE | Pe | cesaret | 8C11 Serisi | IgG1 | 5 |
| anti-CD90 PE-Cy7 | PE-Cy7 | cesaret | 5E10 Serisi | IgG1 | 5 |
Tablo 1: Fenotipteki tümör hatlarında kullanılan akım sitometri antikorları. Kısaltmalar: PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin.
Ek Şekil S1: Tümör hatlarının fenotipik analizi için geçit stratejisi. Geçit stratejisindeki her adım için, ilgilenilen belirteçlerin ifadesinin değerlendirilmesine yol açan nokta grafikleri gösterilir. İleri saçılma ve yan saçılma özelliklerini kullanan herhangi bir ilk kapı, ilgilenilen hücreleri tanımlamak için yapılır, ardından zaman özelliğine dayalı bir QC kapısı gelir. Hücreler daha sonra ileri ve yan saçılma özelliklerini kullanarak herhangi bir çifti çıkarmak için alt kümelenir. Son QC kapısı canlılığa dayanır ve ölü hücreler boya için pozitif boyanır. Canlılık kapısının ardından, panele göre sübvansiyon yapılabilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol basit olsa da, yakından takip edilmesi gereken birkaç kritik adım vardır. Erken pasaj dondurma, başlangıçta başarısız olursa tümör hücresi zenginleştirme işlemini tekrarlama yeteneğini korumak için önemlidir. Doğru bölünme ve ortam açlığı tekniğine karar vermek için fibroblastik kontaminasyonu gözle değerlendirme yeteneği, kültürde fibroblast aşırı büyümesini önlemek için hayati öneme sahiptir. Ek olarak, diferansiyel tripsinizasyon yöntemi, inkübasyon sırasında hücrelerin dikkatli bir şekilde gözlemlenmesini gerektirir. Hücreler plastik plakayı farklı oranlarda kaldırabilir ve bu hücre hattından hücre hattına değişecektir. Bu süreci öğrenirken ve bu karar verme adımını geliştirirken, orijinal kültürün bir kısmı, tümör hücresi zenginleştirmesi gözlenene kadar azaltılmış serum açlık ortamı (% 1 Pen / Strep ve% 1 FBS ile RPMI 1640) kullanılarak 6 kuyucuklu bir plakada korunabilir.
Mezotelyoma tümör hatlarının doğrulanmış fenotipik karakterizasyonunda dikkat çeken önemli bir faktör, tripsinizasyonun ve proteaz-kollajenaz karışımının mezotelyoma tümör hücre yüzey belirteci N-kadherin8'in ekspresyonu üzerindeki etkisiydi. Hücreler daha önce tarif edilen bu enzimler kullanılarak ayrılmışsa, yüzey belirtecinin kaybını gözlemledik, 9. Çoğu yüzey proteininin tripsinden olumsuz etkilenmediği gösterilmiş olsa da, akış paneli tasarımı10 sırasında her yüzey işaretleyicisini test etmek önemlidir. Ek olarak, hücreler bir log genişleme aşamasına ulaşana ve bu belirteçleri yeniden ifade etmek için zamana sahip olana kadar tümör hücrelerinin kültürlenmesi veya genişletilmesi şiddetle tavsiye edilir. Hücre ayrışma ortamının kullanılması, akış sitometrisi kullanılarak tespit için N-kadherin ekspresyonunun tutulmasına izin verdi. Diğer ayrışma ortamı türleri de işaretleyici tutulmasına izin verebilir; Bununla birlikte, bireysel laboratuvarlar bir akış sitometri paneli kurmadan önce bu ortamları dikkatlice test etmelidir.
Bu çalışmanın önemli bir sınırlaması, bir hücre hattı oluşturmanın başarı oranının sadece% 50 olmasıdır. Bu, tümör mikro ortamının heterojen doğasından kaynaklanıyor olabilir. Bu süreci iyileştirmek için yollar arasında 3D kültür sistemlerinin kullanımı, tümör hücresi genişlemesini teşvik etmek için medya takviyelerinin eklenmesi, gelişmiş ayrıştırma yöntemleri, hasta kaynaklı ksenogreftlerin kullanımı veya tümör hücresi yapışmasını iyileştirmek için plaka kaplamasıyer alabilir 11. Gerçekten de, 3D kültürlerin pankreas kanseri7 gibi zorlu tümör hücre hatlarının oluşturulmasında başarılı olduğu gösterilmiştir.
Bu protokole dahil edilmeyen bir seçim yolu, mezotelin gibi bir mezotelyoma tümör belirtecine dayanan hücre sıralaması ile tümör-hücre zenginleştirmesidir. Mezotelyoma tümör hücreleri standart fibroblast belirteci CD90'ı eksprese edebildiğinden, pozitif seçim daha iyi bir alternatif olabilir. Bu yöntemin uyarısı, erken kültürlerde düşük hücresellik derecesidir ve bu da 384 veya 96 kuyucuklu bir plaka gibi küçük hacimli, çok kuyulu bir plakaya ayırmayı gerektirir. Ek olarak, bu protokol doku sindirimi için kollajenaz kullanımını içerdiğinden, bunun N-kadherin veya mezotelinin yüzey ekspresyonunu da etkileyip etkilemeyeceği bilinmemektedir. Mezotelin ekspresyonunun mekanizması nispeten bilinmemekle birlikte, N-kadherin hücresel yapışmada önemli bir rol oynar ve bu proteinin çıkarılması bir tümör hattı12'nin oluşumunu olumsuz yönde etkileyebilir. Bu şu anda değerlendiriliyor.
Bu yöntem, bu nadir tümör tipini incelemek için in vitro model bir sistemin oluşturulmasına izin verdiği için önemlidir. Bu, mezotelyomanın CAR-T hücreleri ile mezotelyon gibi yeni yüzey hedeflerini tanımlayan ve hedeflenen veya immünoterapilere karşı direncin tümör-intrinsik özelliklerini ortaya çıkaran çalışmaları içerebilir. Ek olarak, eğer bu hücreler fare modellerinde in vivo olarak genişletilebilirse, bu aynı zamanda hücre bazlı ve antikor bazlı terapötiklerin yanı sıra küçük molekülleri test etmek için bir kaynak yaratacaktır. Bu protokol için gelecekteki bir yön, sarkomatoid ve bifazik alt kümeler gibi MPM'lerin diğer alt tiplerini genişletme yeteneğini test etmek olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CH, Briacell Therapeutics için SAB ve Mezotelyoma Uygulamalı Araştırma Vakfı üyesidir. Diğer tüm yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Raquel Laza-Briviesca'ya bu protokolün başlatılmasına katkılarından ve Dr. Boris Sepesi, Reza Mehran ve David Rice'a doku koleksiyonları konusundaki işbirliğinden dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışmayla ilgili ek bir finansman yoktur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
- Guzman-Casta, J., et al. Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma. Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).
- Baas, P., et al. First-line nivolumab plus ipilimumab in unresectable malignant pleural mesothelioma (CheckMate 743): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 397 (10272), 375-386 (2021).
- Testa, J. R., Berns, A.
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Kobayashi, M., Takeuchi, T., Ohtsuki, Y. Establishment of three novel human malignant pleural mesothelioma cell lines: morphological and cytogenetical studies and EGFR mutation status. Anticancer Research. 28 (1), 197-208 (2008).
- Chernova, T., et al. Molecular profiling reveals primary mesothelioma cell lines recapitulate human disease. Cell Death and Differentiation. 23 (7), 1152-1164 (2016).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Han, A. C., et al. Differential expression of N-cadherin in pleural mesotheliomas and E-cadherin in lung adenocarcinomas in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Human Pathology. 28 (6), 641-645 (1997).
- Tachibana, K. N-cadherin-mediated aggregate formation; cell detachment by Trypsin-EDTA loses N-cadherin and delays aggregate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (2), 414-418 (2019).
- Donnenberg, V. S., Corselli, M., Normolle, D. P., Meyer, E. M., Donnenberg, A. D. Flow cytometric detection of most proteins in the cell surface proteome is unaffected by trypsin treatment. Cytometry A. 93 (8), 803-810 (2018).
- Pham, K., et al. Isolation of pancreatic cancer cells from a patient-derived xenograft model allows for practical expansion and preserved heterogeneity in culture. American Journal of Pathology. 186 (6), 1537-1546 (2016).
- Derycke, L. D., Bracke, M. E. N-cadherin in the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation, embryogenesis, invasion and signalling. International Journal of Developmental Biology. 48 (5-6), 463-476 (2004).
