Summary
الهدف من ورقة هذه الطريقة هو إظهار منهجية قوية وقابلة للتكرار لإثراء وتوليد وتوسيع خطوط الخلايا السرطانية الأولية من ورم المتوسطة الجنبي المستأصل جراحيا.
Abstract
المنهجيات الحالية لتوسيع خطوط الخلايا السرطانية الأولية من أنواع الأورام النادرة غير موجودة. يصف هذا البروتوكول طرق توسيع الخلايا السرطانية الأولية من ورم المتوسطة الجنبي الخبيث المقطوع جراحيا (MPM) من خلال تقديم نظرة عامة كاملة على العملية من الهضم إلى التخصيب والتوسع والحفظ بالتبريد والتوصيف الظاهري. بالإضافة إلى ذلك ، يقدم هذا البروتوكول مفاهيم لتوليد الورم قد تكون مفيدة لأنواع متعددة من الأورام مثل التربسينات التفاضلية وتأثير طرق التفكك على اكتشاف علامات سطح الخلية للتوصيف المظهري. القيد الرئيسي لهذه الدراسة هو اختيار الخلايا السرطانية التي ستتوسع في نظام ثقافة ثنائي الأبعاد (2D). يمكن أن تؤدي الاختلافات في هذا البروتوكول ، بما في ذلك أنظمة الزراعة ثلاثية الأبعاد (3D) ، ومكملات الوسائط ، وطلاء الألواح لتحسين الالتصاق ، وطرق التصنيف البديلة ، إلى تحسين هذه التقنية ومعدل النجاح الإجمالي لإنشاء خط ورم. بشكل عام ، يوفر هذا البروتوكول طريقة أساسية لإنشاء وتوصيف الخلايا السرطانية من هذا الورم النادر.
Introduction
ورم المتوسطة الجنبي الخبيث (MPM) هو ورم نادر يرتبط ارتباطا وثيقا بالتعرض للأسبستوس. على الرغم من أن النهج القائمة على العلاج المناعي قد أظهرت نتائج مشجعة ، إلا أن هناك ندرة في خيارات العلاج المتاحة للمرضى الذين يصابون بهذا المرض ، ومعدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات منخفض 1,2. وتبذل حاليا جهود في مؤسسات متعددة لفهم هذا المرض بشكل أفضل وتحديد أهداف علاجية جديدة قد تحسن نتائج المرضى. في حين أن هناك العديد من نماذج الفئران ورم المتوسطة ، فإن الوصول إلى خلايا ورم المتوسطة الأولية أكثر محدودية3. في المختبر ، سيوفر التوسع في خلايا ورم المتوسطة الأولية نظاما نموذجيا قيما يمكن استخدامه لدراسة الخلايا السرطانية مباشرة وتفاعلها مع الخلايا المناعية الذاتية مثل الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم. في حين كانت هناك تقارير عن توسيع خطوط الخلايا السرطانية الأولية لورم المتوسطة ، إلا أنها قليلة ولا توفر إجراء تشغيليا قياسيا مفصلا (SOP). علاوة على ذلك ، تتوفر خطوط خلوية قليلة من مصادر تجارية مثل مجموعة ثقافة النوع الأمريكية (ATCC). في حين أن توافر خطوط الورم الأولية محدود ، فقد ثبت أنه يمكن توسيع الخلايا السرطانية من الانصباب الجنبي ومباشرة من أنسجة الورم 4,5. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن خطوط الخلايا السرطانية الموسعة تحافظ على المظهر الجزيئي للورم الأصلي 4,5,6.
يدرس مختبرنا البيئة الدقيقة المناعية للورم في MPM وقد طور طريقة لتوسيع خطوط الخلايا السرطانية MPM الأولية من الحالات التي تم استئصالها جراحيا. هذه الطريقة مقتبسة من تجربتنا في إنشاء خطوط الخلايا السرطانية الميلانينية النقيلية الأولية. الهدف من هذا العمل هو توفير نهج مفصل وعملي لتوسيع خط ورم المتوسطة الأولي باستخدام نظام نموذج 2D والتنميط الظاهري اللاحق. وبالنظر إلى النجاح الأخير لاستراتيجيات حصار نقاط التفتيش التي تستهدف CTLA4 و PD-1 في إعداد الخط الأول2 ، فإن القدرة على توليد العديد من خطوط الورم الأولية يمكن أن تعزز فهم كل من آليات المقاومة الجوهرية للورم بالإضافة إلى توفير نظام نموذجي مهم لتقييم التعرف على الخلايا التائية ، وبالتالي تعميق فهمنا للاستجابة المناعية في MPM.
القيد الرئيسي لهذا البروتوكول هو أن كل ورم يحتوي على بيئة دقيقة مختلفة ، وهناك درجة عالية من التباين في نجاح التوسع. بالإضافة إلى ذلك ، تختار هذه الطريقة الخلايا السرطانية التي يمكن أن تتوسع في نظام زراعة 2D. يمكن أن توفر الطرق الأخرى التي تنطوي على إنتاج كروية 3D أو ثقافة عضوية نهجا بديلا قد يسمح بمعدل نجاح أعلى للتوسع أو يؤدي إلى القدرة على اشتقاق خطوط الخلايا غير القادرة على التوسع في نظام 2D التقليدي. وقد ثبت أن هذه الثقافات 3D لتكون مفيدة لتوليد أنواع الأورام التي يصعب توسيعها ، على سبيل المثال ، سرطان البنكرياس7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل مجلس مراجعة المؤسسة (IRB) التابع لمركز إم دي أندرسون للسرطان بجامعة تكساس. يتعلق هذا بمعايير الرعاية ، واستئصال أورام MPM جراحيا التي تمت إزالتها بعد الموافقة المستنيرة.
1. إعداد وسائط هضم الورم وغيرها من الوسائط المرتبطة بها
- لإعداد وسائط هضم الورم، أضف 5 مل من القلم / العقدية 100٪ (البنسلين / الستربتومايسين) إلى 500 مل من معهد روزويل بارك التذكاري المعقم (RPMI) 1640 وسط في غطاء التدفق الرقائقي.
- انقل الوسط إلى فلتر معقم بسعة 500 مل و 0.22 ميكرومتر من البولي إيثرسلفون (PES) للترشيح الفراغي.
ملاحظة: يجب تنفيذ خطوات الترشيح والشفط بضغط فراغ قياسي يتراوح بين 75 و 150 تور. - قم بتسمية وتأريخ وسط هضم الورم وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين الوسط لمدة 1 شهر عند 4 درجات مئوية.
- انقل الوسط إلى فلتر معقم بسعة 500 مل و 0.22 ميكرومتر من البولي إيثرسلفون (PES) للترشيح الفراغي.
- لتحضير الكوكتيل الأنزيمي المهضوم للورم، أضف 2.5 مل من 3٪ كولاجيناز من النوع 1، و 1 مل من 1.5 ملغم/مل هيالورونيداز، و 20 ميكرولتر من 250,000 وحدة/مل من الحمض النووي من 1 إلى 16.5 مل من وسط الهضم في أنبوب مخروطي 50 مل في غطاء التدفق الرقائقي.
ملاحظة: الحجم الإجمالي للكوكتيل الأنزيمي الهضم للورم هو 20 مل. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى 10 مل فقط لكل عينة ورم. على هذا النحو ، يمكن تخزين الكوكتيل المتبقي في -20 درجة مئوية حتى الحاجة إليه. لا تقم بإعادة تجميد الأليكوت. - لإعداد وسط ورم كامل، أضف 5 مل من القلم / العقدية 100٪ و 50 مل من مصل البقر الجنيني (FBS) إلى 500 مل من RPMI 1640 المعقم في غطاء التدفق الرقائقي.
- انقل الوسط إلى مرشح PES معقم 500 مل ، 0.22 ميكرومتر للترشيح الفراغي.
- قم بتسمية وتأريخ وسط الورم الكامل وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين الوسط لمدة 1 شهر عند 4 درجات مئوية.
- لإعداد وسط مصل منخفض للمجاعة، أضف 5 مل من القلم / البكتيريا العقدية بنسبة 100٪ و 5 مل من FBS إلى 500 مل من RPMI 1640 المعقم في غطاء التدفق الرقائقي.
- انقل الوسط إلى مرشح PES معقم 500 مل ، 0.22 ميكرومتر للترشيح الفراغي.
- قم بتسمية وتأريخ وسط المصل المنخفض وتخزينه على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين الوسط لمدة 1 شهر عند 4 درجات مئوية.
- لتحضير وسط التجميد، أضف 5 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى 45 مل من FBS في غطاء التدفق الرقائقي.
- انقل الوسط إلى مرشح PES معقم 50 مل ، 0.22 ميكرومتر للترشيح الفراغي.
- تسمية وتاريخ خمسة أنابيب مخروطية 15 مل.
- انقل 10 مل من وسط التجميد إلى كل أنبوب وخزن الأنابيب عند -20 درجة مئوية.
- لإعداد وسط خال من المضادات الحيوية لاختبار الميكوبلازما، أضف 50 مل من FBS إلى 500 مل من RPMI 1640 المعقم في غطاء التدفق الرقائقي.
- انقل الوسط إلى مرشح PES معقم 50 مل ، 0.22 ميكرومتر للترشيح الفراغي.
- قم بتسمية وتأريخ الوسط الخالي من المضادات الحيوية وتخزينه على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين الوسط لمدة 1 شهر عند 4 درجات مئوية.
- لإعداد المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) لتحليل النمط الظاهري ، أضف 16.6 مل من ألبومين مصل البقر المعقم إلى 500 مل من الملح المعقم 1x المخزن بالفوسفات (PBS) في غطاء تدفق صفائحي.
- قم بتسمية وتأريخ المخزن المؤقت FACS وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: لا يتطلب المخزن المؤقت FACS تعقيم المرشح طالما يتم تخزين كلا المكونين معقمين. يمكن تخزين المخزن المؤقت FACS قبل الفتح لمدة 6 أشهر عند 4 درجات مئوية.
- قم بتسمية وتأريخ المخزن المؤقت FACS وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
2. هضم أنسجة الورم
- انقل 10 مل من الكوكتيل الأنزيمي لهضم الورم من الخطوة 1.2 إلى أنبوب التفكك.
- انقل قطعة أنسجة الورم إلى غطاء صفيحة معقم من 6 آبار باستخدام مشرط معقم.
ملاحظة: كمية الوسط الذي يتم نقله مع أنسجة الورم كافية للمعالجة.- قم بإزالة جميع الأنسجة الدهنية والأنسجة الميتة و / أو جلطات الدم باستخدام مشرط وملقط معقم جديد.
ملاحظة: الأنسجة الدهنية عادة ما تكون صفراء في المظهر وشبه صلبة. الأنسجة الميتة أغمق من الأنسجة المحيطة في المظهر وناعمة جدا. سوف تتفكك كل من الأنسجة الدهنية والنخرية بسهولة. تظهر الأنسجة الدموية حمراء زاهية وقد تطلق الدم في الوسط عند التلاعب بها. بمجرد إزالته ، يجب أن يكون نسيج الورم الناتج على شكل وأن يكون شاحبا أو ورديا ، اعتمادا على نوع الأنسجة. - قطع أنسجة الورم بأكملها إلى 1 مم3 شظايا صغيرة. لضمان عدم جفاف الأنسجة ، أضف 500 ميكرولتر من محلول الملح المتوازن المعقم 1x Hank's (HBSS) إلى أنسجة الورم.
- قم بإزالة جميع الأنسجة الدهنية والأنسجة الميتة و / أو جلطات الدم باستخدام مشرط وملقط معقم جديد.
- انقل شظايا الورم إلى أنبوب التفكك الذي يحتوي على 10 مل من الكوكتيل الأنزيمي الهضام للورم (الخطوة 2.1). أغلق الأنبوب بإحكام ، وضعه على جانب الغطاء لأسفل على مفكك الأنسجة ، وأضف جهاز السخان عن طريق تطبيقه مثل الأكمام فوق أنبوب التفكك والضغط للنقر عليه في مكانه.
ملاحظة: السعة القصوى لكل أنبوب هي 4 غرام من الورم وحجم 10 مل. - حدد الإعداد المبرمج مسبقا على 37C_h_TDK_1 المنفصل. تحقق من الحالة بعد 10 دقائق للتأكد من عدم وجود خطأ في الانسداد كما هو موضح في الضوء الأحمر الوامض.
ملاحظة: يعالج هذا البرنامج عند 1865 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة مع درجة حرارة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: في حالة حدوث انسداد ، قم بإزالة أنبوب التفكك وقم بتحريكه يدويا لإزاحة أي نسيج عالق في الغطاء ؛ ثم استبدل الأنبوب على الفاصل واستأنف البرنامج. - بعد عملية الهضم لمدة 1 ساعة ، قم بإزالة أنبوب التفكك وضعه في غطاء تدفق صفائحي. قم بتصفية الورم المهضوم عن طريق وضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل وسحب الورم المهضوم باستخدام ماصة 10 مل على الفلتر. إذا انسد عامل التصفية، فقم بالتبديل إلى فلتر جديد.
- شطف أنبوب التفكك مع 10 مل من وسائط هضم الورم الطازجة وتمرير الغسيل من خلال الفلتر.
- قم بإزالة مرشح 70 ميكرومتر وتجاهله.
- ارفع الحجم الإجمالي إلى 40 مل مع وسط هضم الورم.
- جهاز طرد مركزي على ارتفاع 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- باستخدام ماصة شفط 2 مل متصلة بمصدر فراغ ، قم بشفط السوبرناتانت دون إزعاج الكريات ، وأعد تعليق الخلايا باستخدام 10 مل من وسط الورم الكامل المعقم.
- كرر الخطوة 2.6.
- شفط supernatant كما هو موضح في الخطوة 2.7. أعد تعليق الخلايا في 3 مل من وسط الورم الكامل المعقم وانقل تعليق الخلية إلى بئر واحد من صفيحة معقمة من 6 آبار.
- احتفظ باللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- بعد 24 ساعة ، انقل الوسط المستخدم من الورم المهضوم في البئر 1 إلى بئر جديد (بئر 2) في نفس اللوحة المكونة من 6 آبار. أضف 3 مل من الورم الكامل المعقم المتوسط إلى البئر 1.
- انقل الوسط المستخدم من البئرين 1 و 2 وادمجه في بئر 3 في نفس اللوحة المكونة من 6 آبار على مدار 24 ساعة بعد الخطوة 2.11. أضف 3 مل من وسط الورم الكامل المعقم إلى الآبار 1 و 2.
- استنشاق الوسط من جميع الآبار الثلاثة وماصة 3 مل من وسط الورم الكامل في كل بئر 48 ساعة بعد الخطوة 2.12.
3. توليد خط الخلايا السرطانية الأولية
- باستخدام مجهر الطور المقلوب، حدد النسبة المئوية لتلوث الخلايا الليفية في ثقافة المرور المبكر.
ملاحظة: عادة ما تكون الخلايا الليفية طويلة وغير منتظمة ولها غشاء خلوي غير محدد بشكل جيد. تبدو رقيقة أو مسطحة على مقياس Z.- إذا كان تلوث الخلايا الليفية أكبر من 20٪ من الخلايا في مزرعة المرور المبكر ، فاستمر في الزراعة بعد استبدال الوسط الكامل بوسط مصل منخفض.
- كرر الاستبدال بوسط مصل منخفض في الخطوة 3.1.1 مرتين في الأسبوع لمدة 3-4 أسابيع.
- عندما تصل الثقافة إلى 80٪ من الالتقاء ، قم بتمرير الخلايا عن طريق تقسيم 50:50 إلى 2 بئر جديدة من لوحة 6 آبار. استمر في تمرير 50:50 في وسائط المصل المنخفض بمجرد وصول الخلايا إلى التقاء بنسبة 80٪.
- كرر الخطوة 3.1.3 لمدة تصل إلى 4 أسابيع ، وتمر في قوارير الثقافة الأكبر حسب الحاجة عن طريق تقسيم 50:50 بمجرد وصول الثقافة إلى 80٪ من الالتقاء. إذا لم يتم تقليل عدد الخلايا الليفية إلى 10٪ أو أقل ، فاستمر في الخطوة 3.2 لمحاولة طريقة التربسين التفاضلية لإزالة تلوث الخلايا الليفية. وإلا، انتقل إلى الخطوة 3.3.
- لإثراء الخلايا السرطانية ، اشطف البئر بلطف باستخدام 1x PBS لإزالة الوسط الذي يحتوي على المصل.
- أضف التربسين على النحو التالي: 1 مل لكل بئر إذا كان في لوحة من 6 آبار ، 2 مل لقارورة T25 ، 3 مل لقارورة T75.
- ضع الصفيحة أو القارورة المكونة من 6 آبار في حاضنة على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. قم بإزالة اللوحة أو القارورة من الحاضنة وتحقق من التصاق الخلايا باستخدام مجهر مقلوب. إذا كانت الخلايا ترفع جزئيا أو تطفو ، فقم بإزالة الخلايا المعلقة والتريبسين بلطف فقط. ضع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على حجم مساو أو أكبر من وسط الورم الكامل.
ملاحظة: هذه المجموعة الجزئية من الخلايا القائمة على خصائص الالتصاق هي الأولى من الكسور المتعددة. - كرر الخطوتين 3.2.1 و3.2.2 حتى يتم رفع كافة الخلايا، أو تتم إزالة 4 كسور.
- جهاز طرد مركزي لجميع الكسور المستقلة عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- قم بشفط المادة الفائقة كما هو موضح في الخطوة 2.7 ، وأعد تعليق الخلايا باستخدام 5 مل من وسط المصل المعقم والمنخفض.
- قم بصفيحة الخلايا في قارورة T25 لكل جزء ووضع القوارير في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
- قم بتقييم الثقافة بعد 48 ساعة لتحديد الجزء الذي يتم إثراؤه للخلايا السرطانية مقابل الخلايا الليفية. تخلص من القوارير الغنية بالخلايا الليفية. إذا كان تلوث الخلايا الليفية <10٪ ، فاستمر في التوسع في وسط الورم الكامل وانتقل إلى الخطوة 4. إذا كان تلوث الخلايا الليفية 10-30٪ ، كرر الخطوات 3.1.2-3.1.4. إذا كان تلوث الخلايا الليفية أكبر من 30٪ ، فكرر الخطوات 3.2-3.2.7.
- إذا تم الكشف عن عدد قليل من الخلايا الليفية أو لم يتم اكتشافها في مزرعة المرور المبكرة ، فاستمر في تمرير الخلايا في وسط الورم الكامل عن طريق الانقسام بنسبة 50:50 بمجرد أن تلتقي الخلايا بنسبة 80٪ في صفيحتها أو قارورتها المكونة من 6 آبار.
4. توسيع خط الخلايا السرطانية الأولية للمرور المبكر
- بمجرد أن تحتوي ثقافة الورم الأولية على 10٪ أو أقل من تلوث الخلايا الليفية ، قم بشفط الوسط واستبدله بوسط ورم كامل معقم مرتين في الأسبوع.
ملاحظة: الحجم المتوسط الأمثل ل T25 هو 5 مل ؛ T75 هو 12 مل. T150 هو 25 مل.- مرر الثقافة بنسبة 50:50 إلى قوارير أكبر حسب الحاجة بمجرد أن تصل إلى 80٪ من الالتقاء في اللوحة أو القارورة.
ملاحظة: قد تحتاج الثقافة إلى المرور بنسبة أعلى اعتمادا على نموها. اضبط بحيث تصل الثقافة إلى 80٪ من الالتقاء كل 3-5 أيام.
- مرر الثقافة بنسبة 50:50 إلى قوارير أكبر حسب الحاجة بمجرد أن تصل إلى 80٪ من الالتقاء في اللوحة أو القارورة.
- المرور حتى تكون الثقافة في الممر 4 أو أعلى. بمجرد أن تلتقي الثقافة بنسبة 80٪ في قوارير T75 على الأقل ، استمر في الخطوة 5.
5. توصيف وبنوك خط الخلايا السرطانية الأولية المعمول به
- قم بحفظ قارورة T75 واحدة بالتبريد كتجميد للمرور المبكر. لاختبار الميكوبلازما لقوارير T75 المتبقية ، استمر في الخطوة 5.2.
- للحفظ بالتبريد للخلايا ذات المرور المبكر ، قم بإذابة أنبوب واحد من وسط التجميد المقتبس المحضر في الخطوة 1.5.
- جمع الخلايا عن طريق التربسين عن طريق غسل اللوحة أولا مع 1x PBS كما هو موضح في الخطوة 3.2 وإضافة التربسين كما هو موضح في الخطوة 3.2.1.
- ضع القارورة في حاضنة على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. قم بإزالة القارورة من الحاضنة وتحقق من التصاق الخلايا باستخدام مجهر مقلوب. إذا كانت الخلايا ترفع أو تطفو ، فقم بإزالة الخلايا المعلقة والتريبسين برفق. ضع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على حجم مساو أو أكبر من وسط الورم الكامل.
ملاحظة: إذا ظلت الخلايا ملتصقة بعد 3 دقائق، ضع القارورة مرة أخرى في الحاضنة لمدة 2 دقيقة إضافية. - امزج الأنبوب جيدا عن طريق السحب بلطف وإزالة 20 ميكرولتر للعد.
- جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 500 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- أثناء دوران الخلايا ، عد باستخدام بروتوكول عد خاص بالمختبر مثل أزرق التريبان أو يوديد الأكريدين البرتقالي / البروبيديوم (AO / PI).
- أعد تعليق الخلايا بعد الطرد المركزي في وسط تجميد بحد أدنى 2 × 106 خلايا / 1 مل وسط تجميد.
- انقل 1 مل من تعليق الخلية من الخطوة 5.1.7 إلى 1.5 مل من الكريوفيالات المصنفة مسبقا.
- ضع الكريوفيالات في غرفة تجميد ذات معدل متحكم فيه وانقلها على الفور إلى -80 درجة مئوية.
- تخزين الخلايا في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع قبل نقلها إلى النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
- قم بتقسيم قارورة T75 بنسبة 50:50 لاختبار الميكوبلازما. قم بتغيير الوسط إلى وسط خال من المضادات الحيوية تم إعداده في الخطوة 1.6.
- بعد 72 ساعة ، قم بإذابة كاشف الكشف عن الميكوبلازما والركيزة وعناصر التحكم في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل الاختبار.
- جمع 1 مل من supernatant من كل ثقافة ليتم اختبارها ووضعها في أنبوب مخروطي 15 مل.
- قم بتكوير أي خلايا معلقة عن طريق الطرد المركزي للجهاز الفائق عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- قم بتحميل 100 ميكرولتر من عينات المواد الفائقة وعناصر التحكم في لوحة بيضاء ذات 96 بئرا. أضف 100 ميكرولتر من كاشف الكشف عن الميكوبلازما إلى كل عينة والتحكم.
- احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- ضع اللوحة في قارئ لوحة واقرأ التلألؤ (القراءة A ، أي القراءة الأولى).
ملاحظة: يشير بروتوكول الشركة المصنعة لمجموعة الميكوبلازما إلى الاحتفاظ بالإعدادات الافتراضية على قارئات اللوحات متعددة الوظائف. يتم تعيين القراءة عند نقطة نهاية التلألؤ مع وقت تكامل قدره 1 ثانية وكسب 135. يستخدم قارئ اللوحات روتين القياس التلقائي لتحسين إشارة الكسب لكل تجربة. وقت التكامل 1 ثانية هو الافتراضي القياسي. يستخدم كلا الإعدادين لضبط شدة الإشارة المضيئة التي يفسرها قارئ الألواح وقد تحتاج إلى تعديلها اعتمادا على قارئ اللوحة الفردي. - قم بإزالة اللوحة من قارئ الألواح وأضف 100 ميكرولتر من ركيزة الكشف عن الميكوبلازما إلى كل عينة وعناصر التحكم.
- احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- ضع اللوحة في قارئ اللوحة واقرأ التلألؤ (القراءة B ، أي القراءة الثانية).
- لتحديد إيجابية الميكوبلازما ، أوجد نسبة القراءة B إلى القراءة A.
ملاحظة: يتم وصف نسب إيجابية الميكوبلازما في بروتوكول الشركة المصنعة لمجموعة الميكوبلازما. يتم الحصول على القراءات A و B بنفس الإعدادات وتعكس ببساطة ترتيب القراءة.- ضع في اعتبارك أن النسبة < 1 تكون سلبية الميكوبلازما.
- ضع في اعتبارك أن نسبة 1-1.2 غير حاسمة وكرر الخطوة 5.2.
- النظر في نسبة > 1.2 لتكون إيجابية الميكوبلازما ومراقبة هذه الثقافة ؛ إنهاء الثقافة إذا لزم الأمر.
- توصيف التدفق الخلوي للخلايا السرطانية سالبة الميكوبلازما
- إزاحة الخلايا السرطانية باستخدام المخزن المؤقت لتفكك الخلايا.
- عد الخلايا وأعد تعليق الخلايا عند 1 × 106/mL في المخزن المؤقت FACS من الخطوة 1.7.
- قم بإزالة 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا في أنابيب فردية لتلطيخ السطح.
- جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- استنشاق مستقبلات Fc الفائقة وكتلتها عن طريق احتضان الخلايا في 500 ميكرولتر من مصل الماعز بنسبة 5٪ في مخزن FACS المؤقت في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- أضف 2 مل من المخزن المؤقت FACS وقم بالطرد المركزي للتعليق عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- شفط السوبرناتانت وإضافة مزيج البقع السطحية من الأجسام المضادة (الجدول 1) والمخزن المؤقت FACS بحيث يكون الحجم النهائي 100 ميكرولتر.
- كرر الخطوة 5.3.6.
- شفط supernatant وإصلاح الخلايا عن طريق تعليق في 200 ميكرولتر من 1 ٪ paraformaldehyde (PFA) بالإضافة إلى 0.25 ٪ EtOH. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة مع العينات المحمية من الضوء.
- كرر الخطوة 5.3.6. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS للحصول عليها باستخدام مقياس التدفق الخلوي المناسب.
ملاحظة: من المتوقع أن تكون الخلايا السرطانية في ورم المتوسطة إيجابية للميزوثيلين و N-cadherin. قد يعبر البعض أيضا عن CD90.
- توسع في وسط الورم الكامل والبنك كما هو موضح في الخطوتين 4.1 و 5.1 ، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتحديد تلوث الخلايا الليفية لمزارع المرور المبكر ، يتم تقييم الخلايا باستخدام مجهر الطور المقلوب لتحديد تواتر الخلايا الليفية بالنسبة للخلايا الملتصقة الأخرى الموجودة. يوضح الشكل 1 أمثلة على زيادة تلوث الخلايا الليفية بنسبة 80٪ (الشكل 1A) و 50٪ (الشكل 1B) و 30٪ (الشكل 1C) ، مقارنة بثقافة لا تلوث بالخلايا الليفية (الشكل 1D). وبناء على هذا التقييم البصري، يتم إجراء تعديلات على ظروف التوسع كما هو موضح أعلاه. بمجرد إنشاء ثقافة خالية من الميكوبلازما مع تلوث بالخلايا الليفية بنسبة <10٪ ، يتم استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد نقاء خط ورم المتوسطة الظهارة.
يوضح الشكل 2A,B تلطيخ سطح التدفق الخلوي التمثيلي لخطين رئيسيين لورم المتوسطة (MESO171 و MESO176) مقارنة بخطوط ورم المتوسطة التي أنشأتها ATCC (NCI-H2452 و MSTO-211H) مع خط ورم سرطان الجلد (MEL526) كعنصر تحكم سلبي. يمكن للخلايا السرطانية ورم المتوسطة التعبير عن الميزوثيلين (الشكل 2A) و N-cadherin (الشكل 2B). ويبين الجدول 1 معلومات مفصلة تتعلق بلوحة قياس التدفق الخلوي المستخدمة. وتظهر استراتيجية البوابات في الشكل التكميلي 1. تجدر الإشارة إلى أنه لا يمكن استخدام CD90 كعلامة خاصة بالخلايا الليفية حيث يمكن التعبير عنها أيضا بواسطة خلايا ورم المتوسطة السرطانية. كما تظهر أهمية اختبار تأثير الانفصال الإنزيمي على التعبير عن علامات البروتين السطحي حيث أدى كل من التربسين وخليط البروتياز والكولاجيناز إلى فقدان التعبير السطحي عن N-cadherin (الشكل 2C) بينما لم يتأثر CD90 (الشكل 2D).
الشكل 1: صور تمثيلية لزيادة تواتر تلوث الخلايا الليفية في مزارع المرور المبكر وخط ورم ثابت . (أ) صورة لثقافة المرور المبكر التي تحتوي على 80٪ من تلوث الخلايا الليفية. (ب) صورة لمزرعة المرور المبكر التي تحتوي على 50٪ من تلوث الخلايا الليفية. (ج) صورة لمزرعة المرور المبكر التي تحتوي على 30٪ من تلوث الخلايا الليفية. (د) صورة لخط ورم المتوسطة الأولي الثابت. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النمط الظاهري للتدفق الخلوي التمثيلي لخط الخلايا السرطانية المتوسطة الراسخ. (A و B) رسم بياني يوضح نمط التعبير السطحي للميزوثيلين و N-cadherin على خطوط خلايا ورم المتوسطة ATCC ، وخط ورم سرطان الجلد المتحكم فيه ، وخطوط ورم المتوسطة الأولية. (جيم ودال) تأثير التربسين وخليط البروتياز والكولاجيناز والمخزن المؤقت لتفكك الخلايا على N-cadherin و CD90. الاختصارات: Comp-X-A = المنطقة التعويضية من الفلوروفور X ؛ PE = فيكويريثرين. APC = الوفيكوسيانين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الأجسام المضادة السطحية | قناة فورتيسا X20 | ليزر | استنساخ | النمط الايزوتايب | الحجم / العينة (ميكرولتر) |
| أصفر حي / ميت | BV510 | بنفسج | غير متوفر | غير متوفر | 1 |
| المضادة للميزوثيلين APC | إيه بي سي | أحمر | REA1057 | IgG1 | 2 |
| مكافحة CD325 (N-كادهيرين) PE | PE | YG | 8C11 | IgG1 | 5 |
| مكافحة CD90 PE-Cy7 | PE-Cy7 | YG | 5E10 | IgG1 | 5 |
الجدول 1: الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي المستخدمة في خطوط الورم الظاهري. الاختصارات: PE = phycoerythrin; APC = الوفيكوسيانين.
الشكل التكميلي S1: استراتيجية البوابة لتحليل النمط الظاهري لخطوط الورم. يتم عرض مخططات النقاط لكل خطوة في استراتيجية البوابة التي تؤدي إلى تقييم التعبير عن علامات الاهتمام. يتم إنشاء أي بوابة أولية باستخدام خصائص التشتت الأمامي والتشتت الجانبي لتحديد الخلايا ذات الأهمية ، تليها بوابة مراقبة الجودة بناء على ميزة الوقت. ثم يتم تقسيم الخلايا لإزالة أي ثنائيات باستخدام خصائص التشتت الأمامي والجانبي. تعتمد بوابة مراقبة الجودة النهائية على الجدوى ، حيث تلطيخ الخلايا الميتة بشكل إيجابي للصبغة. بعد بوابة الجدوى ، يمكن إجراء التقسيم الفرعي بناء على اللوحة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين أن هذا البروتوكول واضح ، إلا أن هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب اتباعها عن كثب. يعد تجميد المرور المبكر مهما للحفاظ على القدرة على تكرار عملية إثراء الخلايا السرطانية إذا لم تنجح في البداية. تعد القدرة على تقييم تلوث الخلايا الليفية بالعين لتحديد تقنية الانقسام الصحيح وتجويع الوسائط أمرا حيويا لمنع فرط نمو الخلايا الليفية في الثقافة. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب طريقة التربسين التفاضلية مراقبة دقيقة للخلايا أثناء الحضانة. قد ترفع الخلايا عن اللوحة البلاستيكية بمعدلات مختلفة ، وهذا سيختلف من خط خلية إلى خط خلية. أثناء تعلم هذه العملية وتحسين خطوة صنع القرار هذه ، يمكن الحفاظ على جزء من الثقافة الأصلية في صفيحة من 6 آبار باستخدام وسط تجويع مصل منخفض (RPMI 1640 مع 1٪ Pen / Strep و 1٪ FBS) حتى يمكن ملاحظة إثراء الخلايا السرطانية.
كان أحد العوامل المهمة التي لوحظت في التوصيف الظاهري المصادق عليه لخطوط ورم المتوسطة هو تأثير التربسينات وخليط البروتياز والكولاجيناز على التعبير عن علامة سطح الخلية السرطانية المتوسطة ، N-cadherin8. لاحظنا فقدان علامة السطح إذا تم فصل الخلايا باستخدام هذه الإنزيمات ، والتي تم وصفها سابقا9. في حين ثبت أن معظم البروتينات السطحية لا تتأثر سلبا بالتريبسين ، فمن المهم اختبار كل علامة سطح أثناء تصميم لوحة التدفق10. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بشدة بزراعة الخلايا السرطانية أو توسيعها حتى تصل الخلايا إلى مرحلة سجل التوسع ويكون لديها الوقت لإعادة التعبير عن هذه العلامات. سمح استخدام وسيط تفكك الخلايا بالاحتفاظ بالتعبير عن N-cadherin للكشف عنه باستخدام قياس التدفق الخلوي. قد تسمح أنواع أخرى من وسائط التفكك أيضا بالاحتفاظ بالعلامات. ومع ذلك ، يجب على المختبرات الفردية اختبار هذه الوسائط بعناية قبل إنشاء لوحة قياس التدفق الخلوي.
أحد القيود الرئيسية لهذه الدراسة هو أن معدل نجاح إنشاء خط خلوي هو 50٪ فقط. قد يكون هذا بسبب الطبيعة غير المتجانسة للبيئة الدقيقة للورم. يمكن أن تشمل طرق تحسين هذه العملية استخدام أنظمة زراعة 3D ، وإضافة مكملات الوسائط لتعزيز توسع الخلايا السرطانية ، وتحسين طرق التصنيف ، واستخدام xenografts المشتقة من المريض ، أو طلاء لوحة لتحسين التصاق الخلايا السرطانية11. في الواقع ، وقد ثبت أن الثقافات 3D ناجحة في توليد خطوط الخلايا السرطانية الصعبة مثل سرطان البنكرياس7.
أحد طرق الاختيار التي لم يتم تضمينها في هذا البروتوكول هو إثراء الخلايا السرطانية عن طريق فرز الخلايا بناء على علامة ورم المتوسطة مثل الميزوثلين. نظرا لأن الخلايا السرطانية لورم المتوسطة يمكن أن تعبر عن علامة الخلايا الليفية القياسية ، CD90 ، فقد يكون الاختيار الإيجابي بديلا أفضل. التحذير من هذه الطريقة هو انخفاض درجة الخلوية في الثقافات المبكرة ، والتي تتطلب الفرز إلى حجم صغير ، لوحة متعددة الآبار مثل لوحة 384 أو 96 بئرا. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن هذا البروتوكول ينطوي على استخدام الكولاجيناز لهضم الأنسجة ، فمن غير المعروف ما إذا كان هذا قد يؤثر أيضا على التعبير السطحي ل N-cadherin أو mesothelin. في حين أن آلية التعبير عن الميزوثيلين غير معروفة نسبيا ، يلعب N-cadherin دورا مهما في الالتصاق الخلوي ، ويمكن أن تؤثر إزالة هذا البروتين سلبا على إنشاء خط الورم12. ويجري حاليا تقييم ذلك.
هذه الطريقة مهمة لأنها تسمح بتوليد نظام نموذج في المختبر لدراسة هذا النوع النادر من الأورام. يمكن أن يشمل ذلك دراسات تحدد أهدافا سطحية جديدة لورم المتوسطة مثل الميزوثيلين مع خلايا CAR-T والكشف عن الخصائص الجوهرية للورم لمقاومة العلاجات المستهدفة أو المناعية. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان من الممكن توسيع هذه الخلايا في الجسم الحي في نماذج الفئران ، فإن هذا من شأنه أيضا أن يخلق مصدرا لاختبار العلاجات القائمة على الخلايا والأجسام المضادة وكذلك الجزيئات الصغيرة. سيكون الاتجاه المستقبلي لهذا البروتوكول هو اختبار القدرة على توسيع أنواع فرعية أخرى من MPMs مثل المجموعات الفرعية الساركوماتويد والثنائية الطور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CH هي عضو في SAB ل Briacell Therapeutics ومؤسسة البحوث التطبيقية لورم الظهارة المتوسطة. جميع المؤلفين الآخرين ليس لديهم ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نود أن نشيد براكيل لازا بريفيسكا لمساهمتها في بدء هذا البروتوكول والدكتور بوريس سيبيسي ورضا مهران وديفيد رايس للتعاون في مجموعات الأنسجة. ولا يوجد تمويل إضافي مرتبط بهذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
- Guzman-Casta, J., et al. Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma. Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).
- Baas, P., et al. First-line nivolumab plus ipilimumab in unresectable malignant pleural mesothelioma (CheckMate 743): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 397 (10272), 375-386 (2021).
- Testa, J. R., Berns, A.
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Kobayashi, M., Takeuchi, T., Ohtsuki, Y. Establishment of three novel human malignant pleural mesothelioma cell lines: morphological and cytogenetical studies and EGFR mutation status. Anticancer Research. 28 (1), 197-208 (2008).
- Chernova, T., et al. Molecular profiling reveals primary mesothelioma cell lines recapitulate human disease. Cell Death and Differentiation. 23 (7), 1152-1164 (2016).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Han, A. C., et al. Differential expression of N-cadherin in pleural mesotheliomas and E-cadherin in lung adenocarcinomas in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Human Pathology. 28 (6), 641-645 (1997).
- Tachibana, K. N-cadherin-mediated aggregate formation; cell detachment by Trypsin-EDTA loses N-cadherin and delays aggregate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (2), 414-418 (2019).
- Donnenberg, V. S., Corselli, M., Normolle, D. P., Meyer, E. M., Donnenberg, A. D. Flow cytometric detection of most proteins in the cell surface proteome is unaffected by trypsin treatment. Cytometry A. 93 (8), 803-810 (2018).
- Pham, K., et al. Isolation of pancreatic cancer cells from a patient-derived xenograft model allows for practical expansion and preserved heterogeneity in culture. American Journal of Pathology. 186 (6), 1537-1546 (2016).
- Derycke, L. D., Bracke, M. E. N-cadherin in the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation, embryogenesis, invasion and signalling. International Journal of Developmental Biology. 48 (5-6), 463-476 (2004).
