Summary
この方法論文の目標は、外科的に切除された胸膜中皮腫からの原発性腫瘍細胞株の濃縮、生成、および拡大のための堅牢で再現可能な方法論を実証することである。
Abstract
希少腫瘍型からの原発性腫瘍細胞株の拡大のための現在の方法論は欠けている。このプロトコルは、消化から濃縮、拡大、凍結保存、および表現型特性評価までのプロセスの完全な概要を提供することにより、外科的に切除された悪性胸膜中皮腫(MPM)から原発性腫瘍細胞を拡大する方法を記載している。さらに、このプロトコルは、示差的トリプシン処理や、表現型特徴付けのための細胞表面マーカーの検出に対する解離法の影響など、複数の腫瘍型に有用であり得る腫瘍生成の概念を導入する。この研究の主な限界は、2次元(2D)培養系で拡大する腫瘍細胞の選択である。3次元(3D)培養システム、培地サプリメント、接着性を改善するためのプレートコーティング、および代替の脱凝集法を含むこのプロトコルのバリエーションは、この技術および腫瘍ラインの確立の全体的な成功率を改善する可能性がある。全体として、このプロトコルは、この希少な腫瘍からの腫瘍細胞を樹立および特徴付けるための基本方法を提供する。
Introduction
悪性胸膜中皮腫(MPM)は、アスベスト曝露と高度に関連するまれな腫瘍である。免疫療法に基づくアプローチは有望な結果を示しているが、この疾患を発症する患者が利用できる治療選択肢は乏しく、5年生存率は低い1,2。この疾患をよりよく理解し、患者の転帰を改善する可能性のある新しい治療標的を特定するための努力が複数の施設で進行中である。複数の中皮腫マウスモデルが存在するが、原発性中皮腫腫瘍細胞へのアクセスはより限定的である3。原発性中皮腫腫瘍細胞のインビトロ増殖は、腫瘍細胞を直接研究し、腫瘍浸潤リンパ球などの自家免疫細胞との相互作用を研究するために利用できる貴重なモデル系を提供するであろう。原発性中皮腫腫瘍細胞株の拡大に関する報告はあるが、これらはほとんどなく、詳細な標準操作手順(SOP)を提供していない。さらに、American Type Culture Collection(ATCC)などの市販の供給源から入手できる細胞株はほとんどありません。原発性腫瘍株の利用可能性は限られているが、腫瘍細胞は胸水から、そして腫瘍組織から直接拡張され得ることが実証されている4,5。加えて、拡張腫瘍細胞株は、元の腫瘍の分子プロフィールを保存することが示されている4、5、6。
当研究室では、MPMの腫瘍免疫微小環境を研究しており、外科的に切除した症例から原発性MPM腫瘍細胞株を拡大する方法を開発しています。この方法は、原発性転移性黒色腫腫瘍細胞株の確立における我々の経験から適応される。この研究の目標は、2Dモデルシステムとその後の表現型プロファイリングを使用して、原発性中皮腫腫瘍ライン拡張に対する詳細で実用的なアプローチを提供することである。第一選択設定2におけるCTLA4およびPD-1を標的とするチェックポイント遮断戦略の最近の成功を考えると、多くの原発性腫瘍線を生成する能力は、腫瘍固有の耐性メカニズムの理解を深めるとともに、T細胞認識を評価するための重要なモデルシステムを提供し、MPMにおける免疫応答の理解を深める可能性がある。
このプロトコルの主な制限は、すべての腫瘍が異なる微小環境を含み、拡張の成功の高度の変動性があることである。さらに、この方法は、2D培養系において増殖し得る腫瘍細胞を選択する。3Dスフェロイドまたはオルガノイド培養物の生産を含む他の方法は、より高い成功率の拡張を可能にするか、または従来の2Dシステムでは拡張できない細胞株を誘導する能力をもたらす代替アプローチを提供する可能性がある。このような3D培養物は、例えば膵臓癌7の拡張が困難な腫瘍型の生成に有用であることが実証されている。
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Protocol
ここで説明するすべての方法は、テキサス大学MDアンダーソンがんセンターの施設審査委員会(IRB)によって承認されています。これは、インフォームドコンセント後に除去された標準治療、外科的に切除されたMPM腫瘍に関連する。
1. 腫瘍消化媒体およびその他の関連培地の調製
- 腫瘍消化培地を調製するには、層流フード内の滅菌ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地500mLに5mLの100%ペン/ストレップ(ペニシリン/ストレプトマイシン)を加える。
- 培地を真空ろ過用の500 mL、0.22 μmポリエーテルスルホン(PES)滅菌フィルターに移します。
注:ろ過および吸引ステップは、75-150 torrの標準真空圧力で実行する必要があります。 - 腫瘍消化培地にラベルを付け、日付を付け、4°Cで保存する。
注:培地は4°Cで1ヶ月間保存することができます。
- 培地を真空ろ過用の500 mL、0.22 μmポリエーテルスルホン(PES)滅菌フィルターに移します。
- 腫瘍消化酵素カクテルを調製するには、層流フード内の50 mL円錐管に、2.5 mLの3%コラゲナーゼタイプ1、1.5 mg/mLヒアルロニダーゼ1 mL、250,000単位/mLの消化媒体20 μLのDNAse 1~16.5 mLを加えます。
注:腫瘍消化酵素カクテルの全容量は20mLです。しかし、腫瘍サンプルあたり10mLしか必要ありません。そのため、残りのカクテルは、必要になるまで-20°Cで保存することができます。アリコートを再凍結しないでください。 - 完全な腫瘍培地を調製するには、層流フード内の500mLの滅菌RPMI 1640に、5mLの100%Pen/Strepおよび50mLのウシ胎児血清(FBS)を加えます。
- 培地を真空ろ過用の500 mL、0.22 μm PES滅菌フィルターに移します。
- 完全な腫瘍培地にラベルを付け、日付を付け、4°Cで保存する。
注:培地は4°Cで1ヶ月間保存することができます。
- 飢餓のための還元血清培地を調製するには、層流フード内の滅菌RPMI 1640の500mLに、5mLの100%Pen/Strepおよび5mLのFBSを加える。
- 培地を真空ろ過用の500 mL、0.22 μm PES滅菌フィルターに移します。
- 還元血清培地にラベルを付け、日付を付け、4°Cで保存する。
注:培地は4°Cで1ヶ月間保存することができます。
- 凍結培地を調製するには、層流フード内の45mLのFBSに5mLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加える。
- 培地を真空ろ過用の50 mL、0.22 μm PES滅菌フィルターに移します。
- ラベルを付け、5本の15 mL円錐形チューブに日付を付けます。
- 各チューブに10 mLの凍結培地を移し、チューブを-20°Cで保存します。
- マイコプラズマ試験用の抗生物質フリー培地を調製するには、層流フード内の500mLの滅菌RPMI 1640に50mLのFBSを加える。
- 培地を真空ろ過用の50 mL、0.22 μm PES滅菌フィルターに移します。
- 抗生物質を含まない培地にラベルを付け、日付を付け、4°Cで保存する。
注:培地は4°Cで1ヶ月間保存することができます。
- 表現型解析用の蛍光活性化細胞選別(FACS)バッファーを調製するには、層流フード内の滅菌1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)500 mLに滅菌ウシ血清アルブミン16.6 mLを加えます。
- FACSバッファーにラベルを付け、日付を付け、4°Cで保存します。
メモ: FACS バッファーは、両方のコンポーネントが滅菌保存されている限り、フィルター滅菌を必要としません。FACS緩衝液は、開封前に4°Cで6ヶ月間保存することができる。
- FACSバッファーにラベルを付け、日付を付け、4°Cで保存します。
2. 腫瘍組織の消化
- 腫瘍消化酵素カクテル10mLをステップ1.2から解離チューブに移す。
- 腫瘍組織の片を滅菌メスを用いて滅菌6ウェルプレート蓋に移す。
注:腫瘍組織とともに移される培地の量は、処理に十分である。- 新しい滅菌メスと鉗子を使用して、すべての脂肪組織、壊死組織、および/または血栓を除去します。
注:脂肪組織は通常、外観が黄色がかっており、半固体です。壊死組織は、外観において周囲の組織よりも暗く、非常に柔らかい。脂肪組織と壊死組織の両方が簡単に分解されます。血まみれの組織は真っ赤に見え、操作すると培地中に血液を放出する可能性があります。一旦除去されると、得られた腫瘍組織は、組織タイプに応じて、形状を保持し、淡いまたはピンク色であるべきである。 - 腫瘍組織全体を1mm3 個の小さな断片に切断する。組織が乾燥しないようにするには、500 μLの滅菌1xハンクス平衡塩溶液(HBSS)を腫瘍組織に加えます。
- 新しい滅菌メスと鉗子を使用して、すべての脂肪組織、壊死組織、および/または血栓を除去します。
- 腫瘍断片を10mLの腫瘍消化酵素カクテルを含む解離チューブに移す(工程2.1)。チューブをしっかりと閉じ、組織解離器の上にキャップ側を下に置き、解離チューブの上にスリーブのように塗布し、所定の位置にクリックして押してヒーター装置を追加します。
注:各チューブの最大容量は、腫瘍4gおよび10mL容量である。 - 解離器37C_h_TDK_1で事前にプログラムされた設定を選択します。10分後にステータスをチェックして、点滅する赤色のライトが示すように目詰まりエラーがないことを確認します。
注:このプログラムは、1,865 rpmで1時間、37°Cで温度をオンにして処理します。
メモ:目詰まりが発生した場合は、解離チューブを取り外し、手動で渦巻いて蓋に引っかかった組織を取り除きます。その後、チューブを解離器に交換し、プログラムを再開します。 - 1時間の消化に続いて、解離チューブを取り外し、層流フードに入れます。50 mL の円錐形チューブの上に 70 μm の細胞ストレーナーを置き、フィルター上に 10 mL のピペットを使用して消化腫瘍をピペッティングして、消化腫瘍をろ過します。フィルターが詰まった場合は、新しいフィルターに切り替えます。
- 解離チューブを10mLの新鮮な腫瘍消化培地ですすぎ、洗浄液をフィルターに通します。
- 70 μm フィルターを取り外し、廃棄します。
- 腫瘍消化培地で全量を40mLにする。
- 500× g で室温で5分間遠心分離する。
- 真空源に取り付けられた2mL吸引ピペットを用いて、ペレットを乱すことなく上清を吸引し、10mLの滅菌完全腫瘍培地を用いて細胞を再懸濁した。
- 手順 2.6 を繰り返します。
- ステップ2.7で説明したように上清を吸引する。細胞を3 mLの滅菌完全腫瘍培地に再懸濁し、細胞懸濁液を滅菌6ウェルプレートの1ウェルに移す。
- プレートを5%CO2で37°Cのインキュベーターに保管する。
- 24時間後、ウェル1の消化腫瘍から同じ6ウェルプレートの新しいウェル(ウェル2)に使用済み培地を移します。3mLの滅菌完全腫瘍培地をウェル1に加える。
- ウェル1および2から使用済み培地を移し、ステップ2.11の24時間後に同じ6ウェルプレート内のウェル3に結合します。3mLの滅菌完全腫瘍培地をウェル1および2に加える。
- ステップ2.12の48時間後に、3つのウェルすべておよび3mLの完全な腫瘍培地のピペットから培地を各ウェルに吸引する。
原発巣細胞株の作製
- 倒立相顕微鏡を用いて、継代培養初期における線維芽細胞汚染の割合を決定する。
注:線維芽細胞は一般に長くて不規則であり、不明確な細胞膜を有する。Zスケールでは薄くまたは平らに見えます。- 継代培養初期において線維芽細胞混入が細胞の20%を超える場合は、完全培地を還元血清培地に交換した後も培養を継続する。
- ステップ3.1.1の還元血清培地との交換を週に2回、3〜4週間繰り返す。
- 培養物が80%コンフルエントに達したら、50:50に6ウェルプレートの2つの新しいウェルに分割して細胞を継代する。細胞が80%のコンフルエントに達したら、還元血清培地で50:50継代を続けます。
- ステップ3.1.3を最大4週間繰り返し、培養物が80%のコンフルエント度に達したら50:50に分割することによって、必要に応じてより大きな培養フラスコで継代する。線維芽細胞集団が10%以下に減少しない場合は、ステップ3.2に進み、線維芽細胞汚染を除去するために示差トリプシン法を試みる。それ以外の場合は、ステップ 3.3 に進みます。
- 腫瘍細胞を富ませるには、ウェルを1x PBSで穏やかにすすぎ、血清を含む培地を除去します。
- トリプシンを次のように加える:6ウェルプレートの場合は1ウェルあたり1mL、T25フラスコの場合は2mL、T75フラスコの場合は3mL。
- 6ウェルプレートまたはフラスコを37°Cのインキュベーターに1分間置きます。プレートまたはフラスコをインキュベーターから取り出し、倒立顕微鏡を使用して細胞の接着を確認します。細胞が部分的に持ち上げたり浮いたりしている場合は、浮遊した細胞とトリプシンのみを静かに取り除きます。細胞を、同等以上の体積の完全な腫瘍培地を含む15mL円錐形チューブに入れる。
注:接着特性に基づく細胞のこの部分的なコレクションは、複数の画分の最初のものです。 - すべてのセルが持ち上げられるまで、または4つの画分が取り除かれるまで、手順3.2.1および3.2.2を繰り返します。
- すべての独立した画分を500× g で室温で5分間遠心分離する。
- ステップ2.7に記載されているように上清を吸引し、5mLの滅菌還元血清培地を用いて細胞を再懸濁する。
- 細胞を各画分のT25フラスコに按手し、フラスコを37°Cのインキュベーターに入れた。
- 48時間後に培養を評価して、腫瘍細胞対線維芽細胞についてどの画分が濃縮されているかを決定する。線維芽細胞が豊富なフラスコを捨てる。線維芽細胞汚染が<10%である場合、完全な腫瘍培地中で拡大を続け、ステップ4に進む。線維芽細胞汚染が10〜30%の場合は、ステップ3.1.2〜3.1.4を繰り返します。線維芽細胞汚染が30%を超える場合は、ステップ3.2〜3.2.7を繰り返します。
- 継代培養初期に線維芽細胞がほとんどまたはまったく検出されない場合は、細胞が6ウェルプレートまたはフラスコで80%コンフルエントになったら50:50に分割して、完全な腫瘍培地で細胞を継代し続けます。
4. 早期継代原発巣細胞株の拡大
- 原発性腫瘍培養物に線維芽細胞汚染が10%以下含まれたら、培地を吸引し、週に2回、滅菌した完全な腫瘍培地と交換する。
注:T25の最適な培地容量は5mLです。T75は12mLである。T150は25mLである。- 培養物をプレートまたはフラスコ内で80%のコンフルエンスに達したら、必要に応じてより大きなフラスコに50:50で通過させる。
注:培養物は、その成長に応じてより高い比率で継代する必要があるかもしれません。培養物が3〜5日ごとに80%のコンフルエンスに達するように調整します。
- 培養物をプレートまたはフラスコ内で80%のコンフルエンスに達したら、必要に応じてより大きなフラスコに50:50で通過させる。
- 培養物までの継代は継代4以上である。培養物が少なくとも2つのT75フラスコ中で80%コンフルエントになったら、ステップ5に進む。
5. 確立された原発性腫瘍細胞株の特性評価とバンキング
- T75フラスコ1本を早期通過凍結として凍結保存する。残りのT75フラスコのマイコプラズマ試験については、ステップ5.2に進んでください。
- 継代初期細胞の凍結保存のために、工程1.5で調製した凍結培地を小分けした1チューブを解凍する。
- 最初にステップ3.2で説明したようにプレートを1x PBSで洗浄し、ステップ3.2.1で説明したようにトリプシンを添加することによって、トリプシン処理によって細胞を集める。
- フラスコを37°Cのインキュベーターに3分間入れる。フラスコをインキュベーターから取り出し、倒立顕微鏡を用いて細胞の接着を確認した。細胞が浮き上がったり浮いたりしている場合は、浮遊した細胞とトリプシンを静かに取り除きます。細胞を、同等以上の体積の完全な腫瘍培地を含む15mL円錐形チューブに入れる。
注:3分後も細胞が付着したままの場合は、フラスコをインキュベーターに戻してさらに2分間待ちます。 - チューブをピペッティングしてよく混合し、カウントのために20μLを取り除きます。
- チューブを500× g で室温で5分間遠心分離する。
- 細胞が回転している間、トリパンブルーまたはアクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム(AO/PI)などのラボ固有の計数プロトコルを使用してカウントします。
- 遠心分離後の細胞を、少なくとも2~106 個/1mLの凍結培地で凍結培地×再懸濁する。
- ステップ5.1.7から細胞懸濁液1 mLを予め標識された1.5 mLクライオバイアルに移す。
- クライオバイアルを制御速度凍結チャンバーに入れ、直ちに-80°Cに移します。
- 細胞を-80°Cで最大1週間保存してから、液体窒素に移して長期間保存します。
- マイコプラズマ試験のためにT75フラスコを50:50に分割する。培地をステップ1.6で調製した抗生物質を含まない培地に変更する。
- 72時間後、マイコプラズマ検出試薬、基質を解凍し、試験前に室温で15分間コントロールした。
- 試験する各培養物から1mLの上清を採取し、15mLの円錐管に入れる。
- 任意の懸濁した細胞をペレット化し、上清を500× g で室温で5分間遠心分離する。
- サンプル上清および対照の100 μLを白色の96ウェルプレートに負荷します。各サンプルおよびコントロールにマイコプラズマ検出試薬100 μLを加える。
- 室温で5分間インキュベートする。
- プレートをプレートリーダーに置き、発光を読み取ります(読み取りA、すなわち、最初の読み取り)。
メモ:マイコプラズマキットの製造元のプロトコルでは、多機能プレートリーダーのデフォルト設定を維持することが示されています。読み取りはルミネッセンスエンドポイントに設定され、積分時間は1秒、ゲインは135です。プレートリーダーは、自動スケールルーチンを使用して、各実験のゲイン信号を最適化します。1 秒の積分時間は標準デフォルトです。どちらの設定も、プレートリーダーによって解釈される発光信号の強度を調整するために使用され、個々のプレートリーダーに応じて調整する必要がある場合があります。 - プレートリーダーからプレートを取り出し、各サンプルおよび対照に100μLのマイコプラズマ検出基質を加える。
- 室温で10分間インキュベートする。
- プレートリーダーにプレートを置き、発光を読み取ります(読み取りB、すなわち、2番目の読み取り)。
- マイコプラズマ陽性率を決定するには、読み取り値Bと読み取り値Aの比率を決定します。
注:マイコプラズマ陽性比は、マイコプラズマキットメーカーのプロトコルに記載されています。読み取り値Aと読み取り値Bは同じ設定で取得され、単に読み取り順序を反映しています。- 1<比をマイコプラズマ陰性であると考えてください。
- 1-1.2 の比率は決定的ではないと考え、手順 5.2 を繰り返します。
- 1.2>比をマイコプラズマ陽性とみなし、この培養物を監視する。必要に応じて培養を終了します。
- マイコプラズマ陰性腫瘍細胞のフローサイトメトリー特性評価
- 細胞解離バッファーを用いて腫瘍細胞を脱離させる。
- 細胞をカウントし、ステップ1.7からFACS緩衝液中に1 × 106/mLで細胞を再懸濁する。
- 100 μL の細胞懸濁液を個々のチューブに取り出して表面染色します。
- 500× g で室温で5分間遠心分離する。
- 上清を吸引し、FACS緩衝液中の5%ヤギ血清500μL中の細胞を室温で10分間インキュベートすることによってFc受容体をブロックする。
- 2mLのFACS緩衝液を加え、懸濁液を500× g で室温で5分間遠心分離する。
- 上清を吸引し、抗体(表1)とFACSバッファーの表面染色混合物を最終容量が100μLになるように添加し、サンプルを覆い、氷上で30分間染色します。
- 手順 5.3.6 を繰り返します。
- 上清を吸引し、1%パラホルムアルデヒド(PFA)と0.25%EtOHの200μLに再懸濁して細胞を固定します。サンプルを光から保護した状態で室温で20分間インキュベートします。
- 手順 5.3.6 を繰り返します。適切なフローサイトメーターを用いて取得のために200 μLのFACSバッファーに細胞を再懸濁する。
注:中皮腫腫瘍細胞は、メソセリンおよびN-カドヘリンに対して陽性であると予想される。CD90を発現させるものもある。
- ステップ4.1および5.1にそれぞれ記載されているように、完全な腫瘍培地およびバンク中で展開する。
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Representative Results
早期継代培養物の線維芽細胞汚染を決定するために、細胞を倒立期顕微鏡を用いて評価し、存在する他の付着細胞に対する線維芽細胞の頻度を同定する。図1は、線維芽細胞汚染のない培養物(図1D)と比較して、線維芽細胞汚染を80%(図1A)、50%(図1B)、および30%(図1C)増加させた例を示す。この視覚的評価に基づいて、上記のように膨張条件を調整する。<10%の線維芽細胞汚染を伴うマイコプラズマフリー培養が確立されると、フローサイトメトリーを使用して中皮腫腫瘍ラインの純度を決定する。
図2A、Bは、黒色腫腫瘍株(MEL526)を陰性対照として用いたATCC確立中皮腫腫瘍株(NCI−H2452およびMSTO−211H)と比較して、2つの原発性中皮腫腫瘍株(MESO171およびMESO176)の代表的なフローサイトメトリー表面染色を示す。中皮腫腫瘍細胞は、メソセリン(図2A)およびN-カドヘリン(図2B)を発現することができる。使用したフローサイトメトリーパネルに関する詳細情報を表1に示す。ゲーティング ストラテジーを補足図 1 に示します。注目すべきは、CD90は中皮腫腫瘍細胞によっても発現され得るため、線維芽細胞特異的マーカーとして使用することはできない。表面タンパク質マーカー発現に対する酵素的剥離の影響を試験することの重要性は、トリプシンおよびプロテアーゼ - コラゲナーゼ混合物の両方がN-カドヘリンの表面発現の喪失をもたらした(図2C)が、CD90は影響を受けなかった(図2D)。
図1:初期継代培養における線維芽細胞汚染頻度の増加および確立された腫瘍ラインの代表的な画像。 (A)線維芽細胞汚染を80%含む早期継代培養の画像。(b)線維芽細胞汚染を50%含む継代培養の画像。(c)線維芽細胞汚染を30%含む初期継代培養の画像。(D)確立された原発性中皮腫腫瘍線の画像。スケール バー = 200 μm 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:確立された中皮腫腫瘍細胞株の代表的なフローサイトメトリー表現型 。 (A および B)ATCC中皮腫細胞株、対照黒色腫腫瘍株、および原発性中皮腫腫瘍株におけるメソセリンおよびN-カドヘリンの表面発現パターンを示すヒストグラム。(C および D)N-カドヘリンおよびCD90に対するトリプシン、プロテアーゼ-コラゲナーゼ混合物、および細胞解離バッファーの影響。略語: Comp-X-A = 蛍光色素分子 X の補償領域;PE = フィコエリスリン;APC = アロフィコシアニン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 表面抗体 | フォルテッサX20チャンネル | レーザー | クローン | アイソタイプ | 容量/サンプル(μL) |
| ライブ/デッドイエロー | BV510 · | 紫 | 該当なし | 該当なし | 1 |
| 抗メソセリンAPC | ティッカー | 赤い | REA1057 | IgG1 | 2 |
| 抗CD325 (N-カドヘリン) PE | ティッカー | ティッカー | 8C11 · | IgG1 | 5 |
| 抗CD90 PE - Cy7 | PE-Cy7 | ティッカー | 5E10 · | IgG1 | 5 |
表1:腫瘍株の表現型に使用したフローサイトメトリー抗体。 略語:PE=フィコエリスリン;APC = アロフィコシアニン。
補足図S1:腫瘍株の表現型解析のためのゲーティング戦略。 ドットプロットは、関心のあるマーカーの発現を評価するまでのゲーティング戦略の各ステップについて示されている。前方散乱特性と側方散乱特性を使用する初期ゲートは、目的のセルを識別するために作成され、その後に時間特徴に基づいてQCゲートが続きます。次に、セルをサブゲート化して、前方散乱プロパティと側面散乱プロパティを使用してダブレットを削除します。最終的なQCゲートは生存率に基づいており、死細胞染色は色素に対して陽性です。生存率ゲートに続いて、パネルに基づいてサブゲートを行うことができる。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは簡単ですが、厳密に従わなければならない重要な手順がいくつかあります。早期継代凍結は、最初に成功しなかった場合に腫瘍細胞濃縮プロセスを繰り返す能力を保持するために重要である。正しい分割および培地飢餓技術を決定するために、目で線維芽細胞汚染を評価する能力は、培養中の線維芽細胞の過剰増殖を防ぐために不可欠である。さらに、示差トリプシン法は、インキュベーション中に細胞を注意深く観察することを必要とする。細胞は異なる速度でプラスチックプレートから持ち上げることができ、これは細胞株ごとに異なる。このプロセスを学び、この意思決定ステップを洗練させながら、元の培養物の一部は、腫瘍細胞の濃縮が観察されるまで、血清飢餓低減培地(1%Pen/Strepおよび1%FBSを含むRPMI 1640)を使用して6ウェルプレートに保存することができます。
中皮腫腫瘍株の検証された表現型特性評価において注目された重要な要因の1つは、中皮腫腫瘍細胞表面マーカーであるN-カドヘリン8の発現に対するトリプシン化およびプロテアーゼ-コラゲナーゼ混合物の影響であった。我々は、これらの酵素を用いて細胞を剥離した場合、表面マーカーの喪失を観察したが、これは以前に記載されている9。ほとんどの表面タンパク質がトリプシンによって悪影響を受けないことが示されていますが、フローパネル設計10中に各表面マーカーをテストすることが重要です。さらに、細胞が拡大の対数期に達し、これらのマーカーを再発現する時間があるまで、腫瘍細胞を培養または拡張することが強く推奨される。細胞解離培地を用いて、フローサイトメトリーを用いた検出のためにN−カドヘリンの発現の保持を可能にした。他のタイプの解離媒体もマーカー保持を可能にし得る。ただし、個々のラボでは、フローサイトメトリーパネルを設置する前に、これらの培地を慎重にテストする必要があります。
この研究の主な制限は、細胞株の確立の成功率がわずか50%であることです。これは、腫瘍微小環境の不均質な性質に起因する可能性がある。このプロセスを改善するための道には、3D培養システムの使用、腫瘍細胞の増殖を促進するための培地サプリメントの添加、分解方法の改善、患者由来の異種移植片の使用、または腫瘍細胞の接着を改善するためのプレートコーティングが含まれる可能性がある11。実際、3D培養は、膵臓癌などの困難な腫瘍細胞株の生成に成功することが示されている7。
このプロトコールに含まれていない選択の1つの道は、メソセリンなどの中皮腫腫瘍マーカーに基づく細胞選別による腫瘍細胞富化である。中皮腫腫瘍細胞が標準的な線維芽細胞マーカーCD90を発現できるように、ポジティブセレクションは、より良い代替手段であり得る。この方法の注意点は、初期の培養における細胞性の程度が低いことであり、384ウェルプレートや96ウェルプレートなどの少量のマルチウェルプレートにソートする必要があります。さらに、このプロトコルは組織消化のためのコラゲナーゼの使用を含むので、これがN-カドヘリンまたはメソセリンの表面発現にも影響するかどうかは不明である。メソセリン発現のメカニズムは比較的不明であるが、N-カドヘリンは細胞接着において重要な役割を果たしており、このタンパク質の除去は腫瘍ライン12の樹立に悪影響を及ぼす可能性がある。これは現在評価中です。
この方法は、このまれな腫瘍型を研究する ためのin vitro モデルシステムの生成を可能にするので重要である。これには、CAR-T細胞を用いたメソセリンなどの中皮腫の新規表面標的を同定し、標的化または免疫療法に対する耐性の腫瘍固有の特性を明らかにする研究が含まれ得る。さらに、これらの細胞をマウスモデル でin vivoで 拡張することができれば、細胞ベースおよび抗体ベースの治療薬、ならびに小分子を試験するための供給源も創出されるであろう。このプロトコルの将来の方向性は、肉腫様および二相性サブセットなどのMPMの他のサブタイプを拡張する能力をテストすることです。
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Disclosures
CHは、SAB for Briacell Therapeuticsおよび中皮腫応用研究財団のメンバーです。他のすべての著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
このプロトコルの開始に貢献したRaquel Laza-Briviescaと、組織コレクションに関するコラボレーションのためにBoris Sepesi博士、Reza Mehran博士、David Rice博士に感謝します。この作業に関連する追加の資金はありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
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- Baas, P., et al. First-line nivolumab plus ipilimumab in unresectable malignant pleural mesothelioma (CheckMate 743): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 397 (10272), 375-386 (2021).
- Testa, J. R., Berns, A.
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- Chernova, T., et al. Molecular profiling reveals primary mesothelioma cell lines recapitulate human disease. Cell Death and Differentiation. 23 (7), 1152-1164 (2016).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Han, A. C., et al. Differential expression of N-cadherin in pleural mesotheliomas and E-cadherin in lung adenocarcinomas in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Human Pathology. 28 (6), 641-645 (1997).
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- Donnenberg, V. S., Corselli, M., Normolle, D. P., Meyer, E. M., Donnenberg, A. D. Flow cytometric detection of most proteins in the cell surface proteome is unaffected by trypsin treatment. Cytometry A. 93 (8), 803-810 (2018).
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