Summary
El objetivo de este documento de método es demostrar una metodología robusta y reproducible para el enriquecimiento, generación y expansión de líneas celulares tumorales primarias a partir de mesotelioma pleural resecado quirúrgicamente.
Abstract
Faltan metodologías actuales para la expansión de líneas celulares tumorales primarias a partir de tipos de tumores raros. Este protocolo describe métodos para expandir las células tumorales primarias del mesotelioma pleural maligno (MPM) resecado quirúrgicamente al proporcionar una visión general completa del proceso desde la digestión hasta el enriquecimiento, la expansión, la criopreservación y la caracterización fenotípica. Además, este protocolo introduce conceptos para la generación de tumores que pueden ser útiles para múltiples tipos de tumores, como la tripsinización diferencial y el impacto de los métodos de disociación en la detección de marcadores de superficie celular para la caracterización fenotípica. La principal limitación de este estudio es la selección de células tumorales que se expandirán en un sistema de cultivo bidimensional (2D). Las variaciones de este protocolo, incluidos los sistemas de cultivo tridimensionales (3D), los suplementos de medios, el recubrimiento de placas para mejorar la adhesión y los métodos alternativos de desagregación, podrían mejorar esta técnica y la tasa de éxito general de establecer una línea tumoral. En general, este protocolo proporciona un método básico para establecer y caracterizar las células tumorales de este tumor raro.
Introduction
El mesotelioma pleural maligno (MPM) es un tumor poco frecuente altamente asociado con la exposición al asbesto. Aunque los enfoques basados en la inmunoterapia han mostrado resultados alentadores, hay una escasez de opciones de tratamiento disponibles para los pacientes que desarrollan esta enfermedad, y la tasa general de supervivencia a 5 años es baja 1,2. Se están realizando esfuerzos en múltiples instituciones para comprender mejor esta enfermedad e identificar nuevos objetivos terapéuticos que puedan mejorar los resultados de los pacientes. Si bien existen múltiples modelos de ratón con mesotelioma, el acceso a las células tumorales primarias del mesotelioma es más limitado3. La expansión in vitro de las células tumorales del mesotelioma primario proporcionaría un valioso sistema modelo que se puede utilizar para estudiar las células tumorales directamente y su interacción con las células inmunes autólogas, como los linfocitos infiltrantes de tumores. Si bien ha habido informes sobre la expansión de las líneas de células tumorales de mesotelioma primario, estas son pocas y no proporcionan un procedimiento de operación estándar (SOP) detallado. Además, pocas líneas celulares están disponibles en fuentes comerciales como American Type Culture Collection (ATCC). Si bien la disponibilidad de líneas tumorales primarias es limitada, se ha demostrado que las células tumorales pueden expandirse a partir de derrames pleurales y directamente desde el tejido tumoral 4,5. Además, se ha demostrado que las líneas celulares tumorales expandidas preservan el perfil molecular del tumor original 4,5,6.
Nuestro laboratorio está estudiando el microambiente inmune al tumor de MPM y ha desarrollado un método para expandir las líneas de células tumorales primarias de MPM a partir de casos resecados quirúrgicamente. Este método se adapta de nuestra experiencia en el establecimiento de líneas celulares tumorales de melanoma metastásico primario. El objetivo de este trabajo es proporcionar un enfoque detallado y práctico para la expansión de la línea tumoral de mesotelioma primario utilizando un sistema modelo 2D y el posterior perfil fenotípico. Dado el éxito reciente de las estrategias de bloqueo de puntos de control dirigidas a CTLA4 y PD-1 en el entorno de primera línea2, la capacidad de generar muchas líneas tumorales primarias podría promover la comprensión de ambos mecanismos intrínsecos de resistencia tumoral, así como proporcionar un sistema modelo importante para evaluar el reconocimiento de células T, profundizando así nuestra comprensión de la respuesta inmune en MPM.
La principal limitación de este protocolo es que cada tumor contiene un microambiente diferente, y hay un alto grado de variabilidad del éxito de la expansión. Además, este método selecciona células tumorales que pueden expandirse en un sistema de cultivo 2D. Otros métodos que implican la producción de un esferoide 3D o un cultivo de organoides podrían proporcionar un enfoque alternativo que puede permitir una mayor tasa de éxito de expansión o dar como resultado la capacidad de derivar líneas celulares que no pueden expandirse en un sistema 2D tradicional. Se ha demostrado que estos cultivos 3D son útiles para la generación de tipos de tumores que son difíciles de expandir, por ejemplo, el cáncer de páncreas7.
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Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por la Junta de Revisión de Instituciones (IRB) del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas. Esto se refiere a los tumores MPM resecados quirúrgicamente de atención estándar que se extirpan después del consentimiento informado.
1. Preparación de medios de digestión tumoral y otros medios asociados
- Para preparar los medios de digestión tumoral, agregue 5 ml de pen/estreptococo al 100% (penicilina/estreptomicina) a 500 ml de medio estéril Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 en una campana de flujo laminar.
- Transfiera el medio a un filtro estéril de polietersulfona (PES) de 500 ml y 0,22 μm para la filtración al vacío.
NOTA: Los pasos de filtración y aspiración deben realizarse con una presión de vacío estándar de 75-150 torr. - Etiquete y ponga fecha al medio de digestión del tumor y guárdelo a 4 °C.
NOTA: El medio se puede almacenar durante 1 mes a 4 °C.
- Transfiera el medio a un filtro estéril de polietersulfona (PES) de 500 ml y 0,22 μm para la filtración al vacío.
- Para preparar el cóctel enzimático de digestión tumoral, agregue 2.5 mL de colagenasa al 3% tipo 1, 1 mL de 1.5 mg / ml hialuronidasa, 20 μL de 250,000 unidades / ml DNAse 1 a 16.5 ml de medio de digestión en un tubo cónico de 50 ml en una campana de flujo laminar.
NOTA: El volumen total del cóctel enzimático de digestión tumoral es de 20 ml; sin embargo, solo se necesitan 10 ml por muestra de tumor. Como tal, el cóctel restante se puede almacenar a -20 ° C hasta que sea necesario. No vuelva a congelar las alícuotas. - Para preparar el medio tumoral completo, agregue 5 ml de 100% Pen/Strep y 50 ml de suero fetal bovino (FBS) a 500 ml de RPMI 1640 estéril en una campana de flujo laminar.
- Transfiera el medio a un filtro estéril PES de 500 ml y 0,22 μm para la filtración al vacío.
- Etiquete y ponga fecha al medio tumoral completo y guárdelo a 4 °C.
NOTA: El medio se puede almacenar durante 1 mes a 4 °C.
- Para preparar el medio sérico reducido para la inanición, agregue 5 ml de pluma / estreptococo al 100% y 5 ml de FBS a 500 ml de RPMI 1640 estéril en una campana de flujo laminar.
- Transfiera el medio a un filtro estéril PES de 500 ml y 0,22 μm para la filtración al vacío.
- Etiquete y ponga fecha al medio sérico reducido y guárdelo a 4 °C.
NOTA: El medio se puede almacenar durante 1 mes a 4 °C.
- Para preparar el medio de congelación, agregue 5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) a 45 ml de FBS en una campana de flujo laminar.
- Transfiera el medio a un filtro estéril PES de 50 ml y 0,22 μm para filtración al vacío.
- Etiquetar y fechar cinco tubos cónicos de 15 ml.
- Transfiera 10 ml de medio de congelación a cada tubo y guarde los tubos a -20 °C.
- Para preparar un medio libre de antibióticos para las pruebas de micoplasma, agregue 50 ml de FBS a 500 ml de RPMI 1640 estéril en una campana de flujo laminar.
- Transfiera el medio a un filtro estéril PES de 50 ml y 0,22 μm para filtración al vacío.
- Etiquete y ponga fecha al medio libre de antibióticos y guárdelo a 4 °C.
NOTA: El medio se puede almacenar durante 1 mes a 4 °C.
- Para preparar el tampón de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para el análisis fenotípico, agregue 16,6 ml de albúmina sérica bovina estéril a 500 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en una campana de flujo laminar.
- Etiquete y ponga fecha al tampón FACS y guárdelo a 4 °C.
NOTA: El tampón FACS no requiere esterilización por filtro siempre que ambos componentes se almacenen estériles. El búfer FACS se puede almacenar antes de abrirse durante 6 meses a 4 °C.
- Etiquete y ponga fecha al tampón FACS y guárdelo a 4 °C.
2. Digestión del tejido tumoral
- Transfiera 10 ml de cóctel enzimático de digestión tumoral del paso 1.2 a un tubo de disociación.
- Transfiera el trozo de tejido tumoral a una tapa estéril de la placa de 6 pocillos con un bisturí estéril.
NOTA: La cantidad de medio que se transfiere con el tejido tumoral es suficiente para el procesamiento.- Retire todo el tejido graso, tejido necrótico y / o coágulos de sangre con un nuevo bisturí estéril y fórceps.
NOTA: El tejido graso es normalmente de aspecto amarillento y semisólido. El tejido necrótico es más oscuro que el tejido circundante en apariencia y muy suave; tanto el tejido graso como el necrótico se romperán fácilmente. El tejido sanguinolento aparece de color rojo brillante y puede liberar sangre en el medio cuando se manipula. Una vez extirpado, el tejido tumoral resultante debe mantener su forma y ser pálido o rosado, dependiendo del tipo de tejido. - Cortar todo el tejido tumoral en 1 mm3 fragmentos pequeños. Para asegurarse de que el tejido no se seque, agregue 500 μL de solución de sal equilibrada de Hank (HBSS) estéril 1x al tejido tumoral.
- Retire todo el tejido graso, tejido necrótico y / o coágulos de sangre con un nuevo bisturí estéril y fórceps.
- Transferir fragmentos tumorales al tubo de disociación que contiene 10 ml de cóctel enzimático de digestión tumoral (paso 2.1). Cierre el tubo herméticamente, colóquelo con el lado de la tapa hacia abajo sobre el disociador de tejido y agregue el aparato calentador aplicándolo como una manga sobre el tubo de disociación y presionando para que lo haga clic en su lugar.
NOTA: La capacidad máxima para cada tubo es de 4 g de tumor y 10 ml de volumen. - Seleccione la configuración preprogramada en el 37C_h_TDK_1 disociador. Verifique el estado después de 10 minutos para asegurarse de que no haya ningún error de obstrucción como lo indica la luz roja parpadeante.
NOTA: Este programa procesa a 1.865 rpm durante 1 h con la temperatura encendida a 37 °C.
NOTA: Si se produce una obstrucción, retire el tubo de disociación y agítelo manualmente para desalojar cualquier tejido atrapado en la tapa; luego reemplace el tubo en el disociador y reanude el programa. - Después de la digestión de 1 h, retire el tubo de disociación y colóquelo en una campana de flujo laminar. Filtre el tumor digerido colocando un colador de células de 70 μm encima de un tubo cónico de 50 ml y canalizando el tumor digerido con una pipeta de 10 ml en el filtro. Si el filtro se obstruye, cambie a un filtro nuevo.
- Enjuague el tubo de disociación con 10 ml de medios frescos de digestión tumoral y pase el lavado a través del filtro.
- Retire el filtro de 70 μm y deséchelo.
- Llevar el volumen total a 40 ml con el medio de digestión tumoral.
- Centrifugar a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Usando una pipeta aspiradora de 2 ml unida a una fuente de vacío, aspire el sobrenadante sin alterar el gránulo y resuspenda las células utilizando 10 ml de medio tumoral completo estéril.
- Repita el paso 2.6.
- Aspire el sobrenadante como se describe en el paso 2.7. Resuspend las células en 3 ml de medio tumoral completo estéril y transfiera la suspensión celular a un pocillo de una placa estéril de 6 pocillos.
- Mantenga la placa en una incubadora a 37 °C con un 5% de CO2.
- Después de 24 h, transfiera el medio utilizado del tumor digerido en el pozo 1 a un nuevo pozo (pozo 2) en la misma placa de 6 pocillos. Añadir 3 ml de medio tumoral completo estéril al pozo 1.
- Transfiera el medio usado de los pozos 1 y 2 y combínelo en el pozo 3 en la misma placa de 6 pocillos 24 h después del paso 2.11. Agregue 3 ml de medio tumoral completo estéril en los pozos 1 y 2.
- Aspire el medio de los 3 pocillos y pipetee 3 ml de medio tumoral completo en cada pozo 48 h después del paso 2.12.
3. Generación de línea celular tumoral primaria
- Utilizando un microscopio de fase invertida, determine el porcentaje de contaminación por fibroblastos en el cultivo de paso temprano.
NOTA: Los fibroblastos son generalmente largos e irregulares y tienen una membrana celular mal definida. Aparecen delgados o planos en una escala Z.- Si la contaminación por fibroblastos es superior al 20% de las células en el cultivo de paso temprano, continúe el cultivo después de reemplazar el medio completo con medio sérico reducido.
- Repita el reemplazo con medio sérico reducido en el paso 3.1.1 dos veces por semana durante 3-4 semanas.
- Cuando el cultivo alcanza el 80% de confluencia, pase las células dividiéndose 50:50 en 2 nuevos pocillos de una placa de 6 pocillos. Continúe con el pasaje 50:50 en medios séricos reducidos una vez que las células alcancen el 80% de confluencia.
- Repita el paso 3.1.3 durante un máximo de 4 semanas, pasando en matraces de cultivo más grandes según sea necesario dividiendo 50:50 una vez que el cultivo alcance el 80% de confluencia. Si la población de fibroblastos no se reduce al 10% o menos, continúe con el paso 3.2 para intentar el método de tripsinización diferencial para eliminar la contaminación por fibroblastos. De lo contrario, continúe con el paso 3.3.
- Para enriquecer las células tumorales, enjuague suavemente el pozo con 1x PBS para eliminar el medio que contiene suero.
- Agregue tripsina de la siguiente manera: 1 ml por pozo si está en una placa de 6 pocillos, 2 ml para un matraz T25, 3 ml para un matraz T75.
- Coloque la placa o matraz de 6 pocillos en una incubadora a 37 °C durante 1 min. Retire la placa o el matraz de la incubadora y compruebe la adhesión de las células con un microscopio invertido. Si las células están parcialmente levantadas o flotando, retire suavemente las células suspendidas y la tripsina solamente. Coloque las células en un tubo cónico de 15 ml que contenga un volumen igual o mayor de medio tumoral completo.
NOTA: Esta colección parcial de células basada en propiedades de adhesión es la primera de múltiples fracciones. - Repita los pasos 3.2.1 y 3.2.2 hasta que se levanten todas las celdas o se eliminen 4 fracciones.
- Centrifugar todas las fracciones independientes a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Aspire el sobrenadante como se describe en el paso 2.7 y resuspenda las células utilizando 5 ml de medio sérico estéril y reducido.
- Coloque las células en un matraz T25 para cada fracción y coloque los matraces en una incubadora a 37 °C.
- Evaluar el cultivo después de 48 h para determinar qué fracción está enriquecida para las células tumorales frente a los fibroblastos. Deseche los matraces ricos en fibroblastos. Si la contaminación por fibroblastos es <10%, continúe la expansión en el medio tumoral completo y proceda al paso 4. Si la contaminación por fibroblastos es del 10-30%, repita los pasos 3.1.2-3.1.4. Si la contaminación por fibroblastos es superior al 30%, repita los pasos 3.2-3.2.7.
- Si se detectan pocos o ningún fibroblasto dentro del cultivo de paso temprano, continúe pasando las células en medio tumoral completo dividiendo 50:50 una vez que las células estén 80% confluentes en su placa o matraz de 6 pocillos.
4. Expansión de la línea celular tumoral primaria de paso temprano
- Una vez que el cultivo del tumor primario contenga un 10% o menos de contaminación por fibroblastos, aspire el medio y reemplácelo con un medio tumoral completo estéril dos veces por semana.
NOTA: El volumen medio óptimo para un T25 es de 5 ml; T75 es de 12 ml; T150 es de 25 ml.- Pasar el cultivo 50:50 a matraces más grandes según sea necesario una vez que alcance el 80% de confluencia en la placa o matraz.
NOTA: Es posible que el cultivo deba pasarse en una proporción más alta dependiendo de su crecimiento. Ajuste para que el cultivo alcance el 80% de confluencia cada 3-5 días.
- Pasar el cultivo 50:50 a matraces más grandes según sea necesario una vez que alcance el 80% de confluencia en la placa o matraz.
- Pasaje hasta que la cultura esté en el pasaje 4 o superior. Una vez que el cultivo esté confluente al 80% en un mínimo de dos matraces T75, continúe con el paso 5.
5. Caracterización y almacenamiento de la línea celular tumoral primaria establecida
- Criopreservar un matraz T75 como congelación de paso temprano. Para las pruebas de micoplasma de los matraces T75 restantes, continúe con el paso 5.2.
- Para la criopreservación de células de paso temprano, descongelar 1 tubo de medio de congelación alicitado preparado en la etapa 1.5.
- Recolecte las células por tripsinización lavando primero la placa con 1x PBS como se describe en el paso 3.2 y agregando tripsina como se describe en el paso 3.2.1.
- Coloque el matraz en una incubadora a 37 °C durante 3 min. Retire el matraz de la incubadora y compruebe la adhesión de las células con un microscopio invertido. Si las células están levantando o flotando, retire suavemente las células suspendidas y la tripsina. Coloque las células en un tubo cónico de 15 ml que contenga un volumen igual o mayor de medio tumoral completo.
NOTA: Si las células permanecen adheridas después de 3 minutos, vuelva a colocar el matraz en la incubadora durante 2 minutos adicionales. - Mezcle bien el tubo pipeteando suavemente y retire 20 μL para contar.
- Centrifugar el tubo a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Mientras las células están girando, cuente utilizando un protocolo de conteo específico del laboratorio, como el azul de tripano o el yoduro de acridina naranja / propidio (AO / PI).
- Resuspender las células después de la centrifugación en medio de congelación con un mínimo de 2 × 106 celdas/medio de congelación de 1 ml.
- Transfiera 1 ml de la suspensión celular del paso 5.1.7 a crioviales preetiquetados de 1,5 ml.
- Coloque los crioviales en una cámara de congelación de velocidad controlada y transfiéralos inmediatamente a -80 °C.
- Almacene las células a -80 °C durante un máximo de 1 semana antes de transferirlas a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
- Divida un matraz T75 50:50 para la prueba de micoplasma. Cambie el medio por un medio libre de antibióticos preparado en el paso 1.6.
- Después de 72 h, descongele el reactivo de detección de micoplasma, el sustrato y los controles a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de la prueba.
- Recoger 1 mL del sobrenadante de cada cultivo a probar y colocarlo en un tubo cónico de 15 mL.
- Granular cualquier célula suspendida centrifugando el sobrenadante a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Cargue 100 μL de sobrenadantes de muestra y controles en una placa blanca de 96 pocillos. Añadir 100 μL de reactivo de detección de micoplasma a cada muestra y control.
- Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- Coloque la placa en un lector de placas y lea la luminiscencia (Lectura A, es decir, primera lectura).
NOTA: El protocolo del fabricante del kit de micoplasma indica mantener la configuración predeterminada en los lectores de placas multifuncionales. La lectura se establece en el punto final de luminiscencia con un tiempo de integración de 1 s y una ganancia de 135. El lector de placas utiliza una rutina de escala automática para optimizar la señal de ganancia para cada experimento. El tiempo de integración de 1 s es el predeterminado estándar. Ambos ajustes se utilizan para ajustar la intensidad de la señal luminiscente interpretada por el lector de placas y es posible que deban ajustarse en función del lector de placas individual. - Retire la placa del lector de placas y agregue 100 μL del sustrato de detección de micoplasma a cada muestra y a los controles.
- Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
- Coloque la placa en el lector de placas y lea la luminiscencia (Lectura B, es decir, segunda lectura).
- Para determinar la positividad del micoplasma, determine la proporción de lectura B a lectura A.
NOTA: Las proporciones de positividad de Mycoplasma se describen en el protocolo del fabricante del kit de micoplasma. Las lecturas A y B se adquieren con los mismos ajustes y simplemente reflejan el orden de lectura.- Considere una proporción < 1 para ser micoplasma negativo.
- Considere que una proporción de 1-1.2 no es concluyente y repita el paso 5.2.
- Considere una proporción > 1.2 para ser positivo para micoplasma y monitoree este cultivo; terminar la cultura si es necesario.
- Caracterización por citometría de flujo de células tumorales micoplasmáticas negativas
- Desalojar las células tumorales utilizando un tampón de disociación celular.
- Cuente las celdas y vuelva a suspender las celdas a 1 × 106/ml en el búfer FACS del paso 1.7.
- Retire 100 μL de suspensión celular en tubos individuales para la tinción de la superficie.
- Centrifugar a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y bloquear los receptores Fc incubando las células en 500 μL de suero de cabra al 5% en tampón FACS a temperatura ambiente durante 10 min.
- Añadir 2 ml de tampón FACS y centrifugar la suspensión a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Aspire el sobrenadante y agregue la mezcla de anticuerpos de la mancha superficial (Tabla 1) y el tampón FACS para que el volumen final sea de 100 μL. Cubra las muestras y las manche en hielo durante 30 min.
- Repita el paso 5.3.6.
- Aspirar el sobrenadante y fijar las células resuspiendo en 200 μL de paraformaldehído al 1% (PFA) más 0,25% etOH. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min con las muestras protegidas de la luz.
- Repita el paso 5.3.6. Resuspend las células en 200 μL de tampón FACS para su adquisición utilizando un citómetro de flujo apropiado.
NOTA: Se espera que las células tumorales de mesotelioma sean positivas para mesotelina y N-cadherina. Algunos también pueden expresar CD90.
- Expandirse en medio tumoral completo y banco como se describe en los pasos 4.1 y 5.1, respectivamente.
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Representative Results
Para determinar la contaminación por fibroblastos de cultivos de paso temprano, las células se evalúan utilizando un microscopio de fase invertida para identificar la frecuencia de fibroblastos en relación con las otras células adherentes presentes. La Figura 1 muestra ejemplos de aumento de la contaminación por fibroblastos del 80% (Figura 1A), 50% (Figura 1B) y 30% (Figura 1C), en comparación con un cultivo sin contaminación por fibroblastos (Figura 1D). Sobre la base de esta evaluación visual, se realizan ajustes a las condiciones de expansión descritas anteriormente. Una vez que se establece un cultivo libre de micoplasma con < 10% de contaminación por fibroblastos, se utiliza la citometría de flujo para determinar la pureza de la línea tumoral del mesotelioma.
La Figura 2A,B muestra la tinción superficial de citometría de flujo representativa de dos líneas tumorales de mesotelioma primario (MESO171 y MESO176) en comparación con las líneas tumorales de mesotelioma establecidas por ATCC (NCI-H2452 y MSTO-211H) con una línea tumoral de melanoma (MEL526) como control negativo. Las células tumorales del mesotelioma pueden expresar mesotelina (Figura 2A) y N-cadherina (Figura 2B). La información detallada relacionada con el panel de citometría de flujo utilizado se muestra en la Tabla 1. La estrategia de cierre se muestra en la Figura Suplementaria 1. Cabe destacar que CD90 no se puede utilizar como un marcador específico de fibroblastos, ya que también puede ser expresado por las células tumorales del mesotelioma. La importancia de probar el impacto del desprendimiento enzimático en la expresión de marcadores de proteínas de superficie también se muestra, ya que tanto la tripsina como la mezcla de proteasa-colagenasa resultaron en la pérdida de la expresión superficial de N-cadherina (Figura 2C) mientras que CD90 no se vio afectada (Figura 2D).
Figura 1: Imágenes representativas de la frecuencia creciente de contaminación por fibroblastos en cultivos de paso temprano y una línea tumoral establecida. (A) imagen de cultivo de paso temprano que contiene un 80% de contaminación por fibroblastos. (B) Imagen de cultivo de paso temprano que contiene un 50% de contaminación por fibroblastos. (C) Imagen de cultivo de paso temprano que contiene un 30% de contaminación por fibroblastos. (D) Imagen de una línea tumoral de mesotelioma primario establecida. Barras de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Fenotipado de citometría de flujo representativo de la línea celular tumoral de mesotelioma establecida. (A y B) Histogramas que muestran el patrón de expresión superficial de mesotelina y N-cadherina en líneas celulares de mesotelioma ATCC, línea tumoral de melanoma de control y líneas tumorales de mesotelioma primario. (C y D) Impacto de la tripsina, la mezcla de proteasa-colagenasa y el tampón de disociación celular en N-cadherina y CD90. Abreviaturas: Comp-X-A = área compensada del fluoróforo X; PE = ficoeritrina; APC = aloficocianina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Anticuerpo de superficie | Canal Fortessa X20 | Láser | Clon | Isotipo | Volumen/Muestra (μL) |
| Amarillo Vivo/Muerto | BV510 | VIOLETA | N/A | N/A | 1 |
| APC anti-mesotelina | Apc | Rojo | REA1057 | IgG1 | 2 |
| anti-CD325 (N-Cadherina) PE | Pei | YG | 8C11 | IgG1 | 5 |
| anti-CD90 PE-Cy7 | PE-Cy7 | YG | 5E10 | IgG1 | 5 |
Tabla 1: Anticuerpos de citometría de flujo utilizados para fenotipar líneas tumorales. Abreviaturas: PE = ficoeritrina; APC = aloficocianina.
Figura suplementaria S1: Estrategia de gating para el análisis fenotípico de líneas tumorales. Se muestran diagramas de puntos para cada paso en la estrategia de cierre que conduce a la evaluación de la expresión de los marcadores de interés. Cualquier puerta inicial que utilice las propiedades de dispersión hacia adelante y dispersión lateral se realiza para identificar las celdas de interés, seguidas de una puerta de control de calidad basada en la función de tiempo. A continuación, las celdas se subgatean para eliminar cualquier doblete utilizando las propiedades de dispersión hacia adelante y hacia el lado. La compuerta de control de calidad final se basa en la viabilidad, con las células muertas teñendo positivamente para el tinte. Siguiendo la puerta de viabilidad, la subgating se puede realizar en función del panel. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Si bien este protocolo es sencillo, hay algunos pasos críticos que deben seguirse de cerca. La congelación temprana del paso es importante para preservar la capacidad de repetir el proceso de enriquecimiento de células tumorales si inicialmente no tiene éxito. La capacidad de evaluar la contaminación fibroblástica a ojo para decidir la correcta técnica de división e inanición media es vital para prevenir el crecimiento excesivo de fibroblastos en el cultivo. Además, el método de tripsinización diferencial requiere una observación cuidadosa de las células durante la incubación. Las células pueden despegar de la placa de plástico a diferentes velocidades, y esto variará de una línea celular a otra. Mientras se aprende este proceso y se refina este paso de toma de decisiones, una parte del cultivo original se puede preservar en una placa de 6 pocillos utilizando un medio de inanición sérica reducida (RPMI 1640 con 1% de Pen/Strep y 1% de FBS) hasta que se pueda observar el enriquecimiento de células tumorales.
Un factor importante observado en la caracterización fenotípica validada de las líneas tumorales de mesotelioma fue el impacto de la tripsinización y la mezcla de proteasa-colagenasa en la expresión del marcador de superficie de células tumorales de mesotelioma, N-cadherina8. Observamos una pérdida del marcador superficial si las células se desprendían utilizando estas enzimas, lo que se ha descrito previamente9. Si bien se ha demostrado que la mayoría de las proteínas de superficie no se ven afectadas negativamente por la tripsina, es importante probar cada marcador de superficie durante el diseño del panelde flujo 10. Además, es muy recomendable cultivar o expandir las células tumorales hasta que las células alcancen una fase logarítmica de expansión y tengan tiempo para volver a expresar estos marcadores. El uso de medios de disociación celular permitió la retención de la expresión de N-cadherina para su detección mediante citometría de flujo. Otros tipos de medios de disociación también pueden permitir la retención de marcadores; sin embargo, los laboratorios individuales deben probar cuidadosamente estos medios antes de establecer un panel de citometría de flujo.
Una limitación importante de este estudio es que la tasa de éxito de establecer una línea celular es solo del 50%. Esto podría deberse a la naturaleza heterogénea del microambiente tumoral. Las vías para mejorar este proceso podrían incluir el uso de sistemas de cultivo 3D, la adición de suplementos de medios para promover la expansión de las células tumorales, métodos mejorados de desagregación, el uso de xenoinjertos derivados del paciente o el recubrimiento de placas para mejorar la adhesión de las células tumorales11. De hecho, se ha demostrado que los cultivos 3D tienen éxito en la generación de líneas celulares tumorales desafiantes como el cáncer de páncreas7.
Una vía de selección que no está incluida en este protocolo es el enriquecimiento de células tumorales por clasificación celular basada en un marcador tumoral de mesotelioma como la mesotelina. Como las células tumorales de mesotelioma pueden expresar el marcador estándar de fibroblastos, CD90, la selección positiva puede ser una mejor alternativa. La advertencia a este método es el bajo grado de celularidad en los primeros cultivos, lo que requeriría clasificar en un pequeño volumen, placa multipozo, como una placa de 384 o 96 pocillos. Además, como este protocolo implica el uso de colagenasa para la digestión de tejidos, no se sabe si esto también puede afectar la expresión superficial de N-cadherina o mesotelina. Si bien el mecanismo de expresión de mesotelina es relativamente desconocido, la N-cadherina juega un papel importante en la adhesión celular, y la eliminación de esta proteína podría afectar negativamente el establecimiento de una línea tumoral12. Esto se está evaluando actualmente.
Este método es significativo ya que permite la generación de un sistema modelo in vitro para estudiar este tipo de tumor raro. Esto puede incluir estudios que identifiquen nuevos objetivos superficiales de mesotelioma como la mesotelina con células CAR-T y descubran las propiedades intrínsecas del tumor de resistencia a las inmunoterapias dirigidas o inmunoterapias. Además, si estas células se pueden expandir in vivo en modelos de ratón, esto también crearía una fuente para probar terapias basadas en células y anticuerpos, así como moléculas pequeñas. Una dirección futura para este protocolo será probar la capacidad de expandir otros subtipos de MPM, como los subconjuntos sarcomatoide y bifásico.
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Disclosures
CH es miembro del SAB de Briacell Therapeutics y de la Mesothelioma Applied Research Foundation. Todos los demás autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Raquel Laza-Briviesca por su contribución al inicio de este protocolo y a los Dres. Boris Sepesi, Reza Mehran y David Rice por su colaboración en la recolección de tejidos. No hay fondos adicionales asociados con este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
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