Summary
Målet med dette metodepapir er at demonstrere en robust og reproducerbar metode til berigelse, generering og udvidelse af primære tumorcellelinjer fra kirurgisk resekteret pleural mesotheliom.
Abstract
Nuværende metoder til udvidelse af primære tumorcellelinjer fra sjældne tumortyper mangler. Denne protokol beskriver metoder til at udvide primære tumorceller fra kirurgisk resekteret, malignt pleural mesotheliom (MPM) ved at give et komplet overblik over processen fra fordøjelse til berigelse, ekspansion, kryopræservering og fænotypisk karakterisering. Derudover introducerer denne protokol begreber til tumorgenerering, der kan være nyttige til flere tumortyper, såsom differentiel trypsinisering og virkningen af dissociationsmetoder på påvisning af celleoverflademarkører til fænotypisk karakterisering. Den største begrænsning af denne undersøgelse er udvælgelsen af tumorceller, der vil udvide sig i et todimensionelt (2D) kultursystem. Variationer til denne protokol, herunder tredimensionelle (3D) kultursystemer, medietilskud, pladebelægning for at forbedre vedhæftningen og alternative disaggregeringsmetoder, kunne forbedre denne teknik og den samlede succesrate for etablering af en tumorlinje. Samlet set giver denne protokol en basismetode til etablering og karakterisering af tumorceller fra denne sjældne tumor.
Introduction
Malign pleural mesotheliom (MPM) er en sjælden tumor, der er stærkt forbundet med asbesteksponering. Selvom immunterapibaserede tilgange har vist opmuntrende resultater, er der en mangel på behandlingsmuligheder til rådighed for patienter, der udvikler denne sygdom, og den samlede 5-årige overlevelsesrate er lav 1,2. Der arbejdes på flere institutioner for bedre at forstå denne sygdom og identificere nye terapeutiske mål, der kan forbedre patientresultaterne. Mens der er flere mesotheliom musemodeller, er adgangen til primære mesotheliom tumorceller mere begrænset3. In vitro-udvidelse af primære mesotheliom tumorceller ville give et værdifuldt modelsystem, der kan bruges til at studere tumorceller direkte og deres interaktion med autologe immunceller såsom tumorinfiltrerende lymfocytter. Mens der har været rapporter om udvidelsen af primære mesotheliom tumorceller linjer, disse er få og giver ikke en detaljeret standard operation procedure (SOP). Desuden er få cellelinjer tilgængelige fra kommercielle kilder såsom American Type Culture Collection (ATCC). Mens tilgængeligheden af primære tumorlinjer er begrænset, er det blevet påvist, at tumorceller kan udvides fra pleurale effusioner og direkte fra tumorvævet 4,5. Derudover har udvidede tumorcellelinjer vist sig at bevare molekylprofilen af den oprindelige tumor 4,5,6.
Vores laboratorium studerer tumorimmunmikromiljøet i MPM og har udviklet en metode til udvidelse af primære MPM-tumorcellelinjer fra kirurgisk resekterede tilfælde. Denne metode er tilpasset fra vores erfaring med at etablere primære metastatiske melanom tumorcellelinjer. Målet med dette arbejde er at give en detaljeret, praktisk tilgang til primær mesotheliom tumorlinjeudvidelse ved hjælp af et 2D-modelsystem og efterfølgende fænotypisk profilering. I betragtning af den nylige succes med checkpointblokadestrategier rettet mod CTLA4 og PD-1 i førstelinjeindstillingen2, kan evnen til at generere mange primære tumorlinjer fremme forståelsen af begge tumorinsistensektionsmekanismer samt give et vigtigt modelsystem til vurdering af T-cellegenkendelse og dermed uddybe vores forståelse af immunresponset i MPM.
Den største begrænsning af denne protokol er, at hver tumor indeholder et andet mikromiljø, og der er en høj grad af variation i ekspansionssucces. Derudover vælger denne metode for tumorceller, der kan ekspandere i et 2D-kultursystem. Andre metoder, der involverer produktion af en 3D-sfæroid- eller organoidkultur, kan give en alternativ tilgang, der kan give mulighed for en højere succesrate for ekspansion eller resultere i evnen til at udlede cellelinjer, der ikke er i stand til at ekspandere i et traditionelt 2D-system. Sådanne 3D-kulturer har vist sig at være nyttige til generering af tumortyper, der er vanskelige at udvide, for eksempel kræft i bugspytkirtlen7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institution Review Board (IRB) ved University of Texas MD Anderson Cancer Center. Dette vedrører standard-of-care, kirurgisk resekteret MPM tumorer fjernet efter informeret samtykke.
1. Fremstilling af tumorfordøjelsesmedier og andre tilknyttede medier
- For at forberede tumorfordøjelsesmedier tilsættes 5 ml 100% Pen / Strep (Penicillin / Streptomycin) til 500 ml steril Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium i en laminær flowhætte.
- Overfør mediet til et 500 ml, 0,22 μm polyethersulfon (PES) sterilt filter til vakuumfiltrering.
BEMÆRK: Filtrerings- og aspirationstrin skal udføres med et standard vakuumtryk på 75-150 torr. - Tumorfordøjelsesmediet mærkes og dateres, og det opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: Mediet kan opbevares i 1 måned ved 4 °C.
- Overfør mediet til et 500 ml, 0,22 μm polyethersulfon (PES) sterilt filter til vakuumfiltrering.
- For at forberede den tumorfordøjende enzymatiske cocktail tilsættes 2,5 ml 3% collagenase type 1, 1 ml 1,5 mg / ml hyaluronidase, 20 μL 250,000 enheder / ml DNAse 1 til 16,5 ml fordøjelsesmedium i et 50 ml konisk rør i en laminær flowhætte.
BEMÆRK: Det samlede volumen af den tumorfordøjende enzymatiske cocktail er 20 ml; der kræves dog kun 10 ml pr. Tumorprøve. Som sådan kan den resterende cocktail opbevares ved -20 ° C, indtil det er nødvendigt. Genfrys ikke aliquoter. - For at forberede komplet tumormedium tilsættes 5 ml 100% Pen / Strep og 50 ml føtalt bovint serum (FBS) til 500 ml steril RPMI 1640 i en laminær flowhætte.
- Overfør mediet til et 500 ml, 0,22 μm PES sterilt filter til vakuumfiltrering.
- Det komplette tumormedium mærkes og dateres, og det opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: Mediet kan opbevares i 1 måned ved 4 °C.
- For at forberede reduceret serummedium til sult tilsættes 5 ml 100% Pen / Strep og 5 ml FBS til 500 ml steril RPMI 1640 i en laminær flowhætte.
- Overfør mediet til et 500 ml, 0,22 μm PES sterilt filter til vakuumfiltrering.
- Det reducerede serummedium mærkes og dateres, og det opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: Mediet kan opbevares i 1 måned ved 4 °C.
- For at forberede frysemedium tilsættes 5 ml dimethylsulfoxid (DMSO) til 45 ml FBS i en laminær flowhætte.
- Overfør mediet til et 50 ml, 0,22 μm PES sterilt filter til vakuumfiltrering.
- Mærk og dater fem 15 ml koniske rør.
- Der overføres 10 ml frysemedium til hvert rør, og rørene opbevares ved -20 °C.
- For at forberede antibiotikafrit medium til mycoplasma-test tilsættes 50 ml FBS til 500 ml steril RPMI 1640 i en laminær flowhætte.
- Overfør mediet til et 50 ml, 0,22 μm PES sterilt filter til vakuumfiltrering.
- Det antibiotikafrie medium mærkes og dateres, og det opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: Mediet kan opbevares i 1 måned ved 4 °C.
- For at forberede fluorescensaktiveret cellesorteringsbuffer (FACS) til fænotypisk analyse tilsættes 16,6 ml sterilt bovint serumalbumin til 500 ml steril 1x phosphatbufferet saltvand (PBS) i en laminær flowhætte.
- FACS-bufferen mærkes og dateres, og den opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: FACS-buffer kræver ikke filtersterilisering, så længe begge komponenter opbevares sterilt. FACS-bufferen kan opbevares inden åbning i 6 måneder ved 4 °C.
- FACS-bufferen mærkes og dateres, og den opbevares ved 4 °C.
2. Fordøjelse af tumorvæv
- Overfør 10 ml tumorfordøjende enzymatisk cocktail fra trin 1.2 til et dissociationsrør.
- Overfør tumorvævet til et sterilt 6-brønd pladelåg ved hjælp af en steril skalpel.
BEMÆRK: Mængden af medium, der overføres med tumorvævet, er tilstrækkelig til behandling.- Fjern alt fedtvæv, nekrotisk væv og / eller blodpropper ved hjælp af en ny steril skalpel og tang.
BEMÆRK: Fedtvæv er normalt gulligt i udseende og halvfast. Nekrotisk væv er mørkere end det omgivende væv i udseende og meget blødt; både fedt- og nekrotisk væv vil let bryde fra hinanden. Blodigt væv ser lyst rødt ud og kan frigive blod i mediet, når det manipuleres. Når det er fjernet, skal det resulterende tumorvæv holde form og være bleg eller lyserød, afhængigt af vævstypen. - Skær hele tumorvævet i 1 mm3 små fragmenter. For at sikre, at vævet ikke tørrer ud, tilsættes 500 μL steril 1x Hanks balanced saltopløsning (HBSS) til tumorvævet.
- Fjern alt fedtvæv, nekrotisk væv og / eller blodpropper ved hjælp af en ny steril skalpel og tang.
- Overfør tumorfragmenter til dissociationsrøret indeholdende 10 ml tumorfordøjende enzymatisk cocktail (trin 2.1). Luk røret tæt, placer det med hættesiden nedad på vævsdissociatoren, og tilsæt varmeapparatet ved at påføre det som en muffe over dissociationsrøret og trykke for at klikke det på plads.
BEMÆRK: Den maksimale kapacitet for hvert rør er 4 g tumor og 10 ml volumen. - Vælg den forprogrammerede indstilling på dissociatoren 37C_h_TDK_1. Kontroller status efter 10 minutter for at sikre, at der ikke er nogen tilstopningsfejl som angivet med det blinkende røde lys.
BEMÆRK: Dette program behandler ved 1.865 o / min i 1 time med temperatur på ved 37 ° C.
BEMÆRK: Hvis der opstår tilstopning, skal du fjerne dissociationsrøret og manuelt hvirvle det for at løsne væv, der er fanget i låget; Udskift derefter røret på dissociatoren og genoptag programmet. - Efter 1 timers fordøjelse skal du fjerne dissociationsrøret og placere det i en laminær flowhætte. Filtrer den fordøjede tumor ved at placere en 70 μm cellesi på toppen af et 50 ml konisk rør og pipettere den fordøjede tumor ved hjælp af en 10 ml pipette på filteret. Hvis filteret tilstoppes, skal du skifte til et nyt filter.
- Skyl dissociationsrøret med 10 ml frisk tumorfordøjelsesmedie og før vasken gennem filteret.
- Fjern filteret på 70 μm, og kassér det.
- Bring det samlede volumen til 40 ml med tumorfordøjelsesmedium.
- Centrifuger ved 500 × g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Brug en 2 ml aspirerende pipette fastgjort til en vakuumkilde, opsuge supernatanten uden at forstyrre pelleten, og resuspend cellerne ved hjælp af 10 ml sterilt komplet tumormedium.
- Gentag trin 2.6.
- Supernatanten aspireres som beskrevet i trin 2.7. Resuspend cellerne i 3 ml sterilt komplet tumormedium og overfør cellesuspensionen til en brønd af en steril 6-brøndplade.
- Opbevar pladen i en inkubator ved 37 °C med 5 % CO2.
- Efter 24 timer overføres det anvendte medium fra den fordøjede tumor i brønd 1 til en ny brønd (godt 2) i samme 6-brøndplade. Tilsæt 3 ml sterilt komplet tumormedium til brønd 1.
- Overfør det brugte medium fra brønd 1 og 2 og kombiner til brønd 3 i samme 6-brøndplade 24 timer efter trin 2.11. Tilsæt 3 ml sterilt komplet tumormedium i hul 1 og 2.
- Mediet opsuges fra alle 3 huller, og 3 ml komplet tumormedium pipetteres i hver brønd 48 timer efter trin 2.12.
3. Generering af primær tumorcellelinje
- Brug et omvendt fasemikroskop til at bestemme procentdelen af fibroblastforurening i den tidlige passagekultur.
BEMÆRK: Fibroblaster er generelt lange og uregelmæssige og har en dårligt defineret cellulær membran. De ser tynde eller flade ud på en Z-skala.- Hvis fibroblastforurening er større end 20% af cellerne i den tidlige passagekultur, skal du fortsætte dyrkningen efter udskiftning af det komplette medium med reduceret serummedium.
- Udskiftningen gentages med reduceret serummedium i trin 3.1.1 to gange om ugen i 3-4 uger.
- Når kulturen når 80% sammenløb, skal du passere cellerne ved at opdele 50:50 i 2 nye brønde af en 6-brøndplade. Fortsæt med at passere 50:50 i reduceret serummedier, når cellerne når 80% sammenløb.
- Trin 3.1.3 gentages i op til 4 uger, og der gives gennemløb i større kulturkolber efter behov ved opdeling 50:50, når kulturen når 80 % sammenløb. Hvis fibroblastpopulationen ikke reduceres til 10% eller mindre, skal du fortsætte med trin 3.2 for at forsøge den differentielle trypsiniseringsmetode for at fjerne fibroblastforurening. Ellers fortsæt til trin 3.3.
- For at berige for tumorceller skylles brønden forsigtigt med 1x PBS for at fjerne det mediumholdige serum.
- Der tilsættes trypsin som følger: 1 ml pr. brønd, hvis det er i en 6-brønds plade, 2 ml for en T25-kolbe, 3 ml for en T75-kolbe.
- Pladen eller kolben med 6 brønde anbringes i en kuvøse ved 37 °C i 1 min. Fjern pladen eller kolben fra inkubatoren og kontroller vedhæftningen af cellerne ved hjælp af et omvendt mikroskop. Hvis cellerne delvist løfter eller flyder, skal du forsigtigt fjerne de suspenderede celler og kun trypsin. Anbring cellerne i et 15 ml konisk rør indeholdende et lige eller større volumen komplet tumormedium.
BEMÆRK: Denne delvise samling af celler baseret på vedhæftningsegenskaber er den første af flere fraktioner. - Trin 3.2.1 og 3.2.2 gentages, indtil alle cellerne er løftet, eller der er fjernet 4 fraktioner.
- Centrifuger alle uafhængige fraktioner ved 500 × g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten aspireres som beskrevet i trin 2.7, og cellerne resuspenderes ved hjælp af 5 ml sterilt, reduceret serummedium.
- Cellerne anbringes i en T25-kolbe for hver fraktion, og kolberne anbringes i en kuvøse ved 37 °C.
- Vurder kulturen efter 48 timer for at bestemme, hvilken fraktion der er beriget til tumorceller versus fibroblaster. Kassér fibroblastrige kolber. Hvis fibroblastforurening er <10%, skal du fortsætte ekspansionen i komplet tumormedium og fortsætte til trin 4. Hvis fibroblastforurening er 10-30%, gentages trin 3.1.2-3.1.4. Hvis fibroblastforurening er større end 30%, gentages trin 3.2-3.2.7.
- Hvis der påvises få eller ingen fibroblaster inden for den tidlige passagekultur, skal du fortsætte med at passagere cellerne i komplet tumormedium ved at opdele 50:50, når cellerne er 80% sammenflydende i deres 6-brønds plade eller kolbe.
4. Udvidelse af tidlig passage primær tumorcellelinje
- Når den primære tumorkultur indeholder 10% eller mindre fibroblastforurening, aspireres mediet og erstattes med sterilt komplet tumormedium to gange om ugen.
BEMÆRK: Det optimale mediumvolumen for en T25 er 5 ml; T75 er 12 ml; T150 er 25 ml.- Før kulturen 50:50 i større kolber efter behov, når den når 80% sammenløb i pladen eller kolben.
BEMÆRK: Kulturen skal muligvis passeres i et højere forhold afhængigt af dens vækst. Juster, så kulturen når 80% sammenløb hver 3-5 dag.
- Før kulturen 50:50 i større kolber efter behov, når den når 80% sammenløb i pladen eller kolben.
- Passage indtil kulturen er ved passage 4 eller derover. Når kulturen er 80% sammenflydende i mindst to T75-kolber, fortsættes til trin 5.
5. Karakterisering og bankvirksomhed af etableret primær tumorcellelinje
- Kryopreserver en T75-kolbe som en tidlig passagefrysning. Ved mycoplasma-test af de resterende T75-kolber fortsættes til trin 5.2.
- Til kryopræservering af celler med tidlig passage optøs 1 tube aliquoteret frysesubstrat fremstillet i trin 1.5.
- Cellerne opsamles ved trypsinisering ved først at vaske pladen med 1x PBS som beskrevet i trin 3.2 og tilsætte trypsin som beskrevet i trin 3.2.1.
- Kolben anbringes i en kuvøse ved 37 °C i 3 min. Fjern kolben fra inkubatoren og kontroller vedhæftningen af cellerne ved hjælp af et omvendt mikroskop. Hvis cellerne løfter eller flyder, skal du forsigtigt fjerne de suspenderede celler og trypsin. Anbring cellerne i et 15 ml konisk rør indeholdende et lige eller større volumen komplet tumormedium.
BEMÆRK: Hvis cellerne forbliver klæbende efter 3 minutter, skal kolben anbringes tilbage i inkubatoren i yderligere 2 minutter. - Bland røret godt ved pipette forsigtigt og fjern 20 μL til tælling.
- Centrifuger røret ved 500 × g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Mens cellerne spinder, skal du tælle ved hjælp af en laboratoriespecifik tælleprotokol, såsom trypanblå eller akridin orange / propidiumiodid (AO / PI).
- Cellerne resuspenderes efter centrifugering i frysemedium med mindst 2 × 106 celler/1 ml frysemedium.
- 1 ml af cellesuspensionen overføres fra trin 5.1.7 til forudmærkede 1,5 ml kryoviraler.
- Kryovirale produkter anbringes i et frysekammer med kontrolleret hastighed, og de overføres straks til -80 °C.
- Cellerne opbevares ved -80 °C i op til 1 uge, før de overføres til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
- En T75-kolbe deles 50:50 til mycoplasma-test. Mediet ændres til antibiotikafrit medium fremstillet i trin 1.6.
- Efter 72 timer optøs mycoplasma-detektionsreagenset, substratet og kontrollerne ved stuetemperatur i 15 minutter før test.
- Saml 1 ml supernatant fra hver kultur, der skal testes, og læg den i et 15 ml konisk rør.
- Pellet eventuelle suspenderede celler ved centrifugering af supernatanten ved 500 × g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Der hældes 100 μL prøvesupernatanter og kontroller i en hvid 96-brøndplade. Der tilsættes 100 μL mycoplasma-detektionsreagens til hver prøve og kontrol.
- Inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Placer pladen i en pladelæser og læs luminescensen (læsning A, dvs. første læsning).
BEMÆRK: Mycoplasma kit producentens protokol angiver at holde standardindstillingerne på multifunktionelle pladelæsere. Aflæsningen indstilles til Luminescens-slutpunktet med en integrationstid på 1 s og forstærkning på 135. Pladelæseren bruger en rutine for automatisk skalering til at optimere forstærkningssignalet for hvert eksperiment. Integrationstiden på 1 s er standard standard. Begge indstillinger bruges til at justere intensiteten af det selvlysende signal, der fortolkes af pladelæseren, og skal muligvis justeres afhængigt af den enkelte pladelæser. - Pladen fjernes fra pladelæseren, og der tilsættes 100 μL mycoplasma-detektionssubstrat til hver prøve og kontrollerne.
- Inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Placer pladen i pladelæseren og læs luminescensen (læsning B, dvs. anden læsning).
- For at bestemme mycoplasma positivitet skal du bestemme forholdet mellem læsning B og læsning A.
BEMÆRK: Mycoplasma positivitetsforhold er beskrevet i mycoplasma kit producentens protokol. Aflæsninger A og B erhverves med de samme indstillinger og afspejler simpelthen læserækkefølgen.- Overvej et forhold < 1 for at være mycoplasma-negativt.
- Betragt et forhold på 1-1,2 som inkonklusivt, og gentag trin 5.2.
- Overvej et forhold > 1,2 for at være mycoplasma-positiv og overvåge denne kultur; afslut kulturen om nødvendigt.
- Flowcytometri karakterisering af mycoplasma-negative tumorceller
- Løsrive tumorcellerne ved hjælp af celledissociationsbuffer.
- Cellerne tælles, og cellerne resuspenderes ved 1 × 106/ml i FACS-buffer fra trin 1.7.
- Fjern 100 μL cellesuspension i individuelle rør til overfladefarvning.
- Centrifuger ved 500 × g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirere supernatanten og blokere Fc-receptorer ved at inkubere cellerne i 500 μL 5% gedeserum i FACS-buffer ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Der tilsættes 2 ml FACS-buffer, og suspensionen centrifugeres ved 500 × g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer supernatanten og tilsæt overfladepletblandingen af antistoffer (tabel 1) og FACS-buffer, så det endelige volumen er 100 μL. Dæk prøverne og pletter dem på is i 30 min.
- Gentag trin 5.3.6.
- Aspirere supernatanten og fiksere cellerne ved at genoplive i 200 μL 1% paraformaldehyd (PFA) plus 0,25% EtOH. Inkuberes ved stuetemperatur i 20 minutter med prøverne beskyttet mod lys.
- Gentag trin 5.3.6. Resuspend cellerne i 200 μL FACS-buffer til erhvervelse ved hjælp af et passende flowcytometer.
BEMÆRK: Mesotheliom tumorceller forventes at være positive for mesothelin og N-cadherin. Nogle kan også udtrykke CD90.
- Der udspændes i komplet tumormedium og bank som beskrevet i henholdsvis trin 4.1 og 5.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at bestemme fibroblastforurening af tidlige passagekulturer vurderes celler ved hjælp af et omvendt fasemikroskop for at identificere hyppigheden af fibroblaster i forhold til de andre tilstedeværende klæbende celler. Figur 1 viser eksempler på stigende fibroblastforurening på 80% (figur 1A), 50% (figur 1B) og 30% (figur 1C) sammenlignet med en kultur uden fibroblastforurening (figur 1D). På baggrund af denne visuelle vurdering foretages justeringer af ekspansionsforholdene som beskrevet ovenfor. Når en mycoplasmafri kultur med <10% fibroblastforurening er etableret, anvendes flowcytometri til at bestemme renheden af mesotheliomtumorlinjen.
Figur 2A,B viser repræsentativ flowcytometri overfladefarvning af to primære mesotheliom tumorlinjer (MESO171 og MESO176) sammenlignet med ATCC-etablerede mesotheliom tumorlinjer (NCI-H2452 og MSTO-211H) med en melanom tumor linje (MEL526) som en negativ kontrol. Mesotheliom tumorceller kan udtrykke mesothelin (figur 2A) og N-cadherin (figur 2B). Detaljerede oplysninger vedrørende det anvendte flowcytometripanel er vist i tabel 1. Gating-strategien er vist i supplerende figur 1. Bemærk, CD90 kan ikke bruges som en fibroblast-specifik markør, da den også kan udtrykkes af mesotheliom tumorceller. Betydningen af at teste virkningen af enzymatisk løsrivelse på overfladeproteinmarkørekspression er også vist, da både trypsin og protease-collagenase-blandingen resulterede i tab af overfladeekspression af N-cadherin (figur 2C), mens CD90 ikke blev påvirket (figur 2D).
Figur 1: Repræsentative billeder af stigende hyppighed af fibroblastforurening i tidlige passagekulturer og en etableret tumorlinje. (A) billede af tidlig passagekultur indeholdende 80% fibroblastforurening. (B) Billede af tidlig passagekultur indeholdende 50% fibroblastforurening. (C) Billede af tidlig passagekultur indeholdende 30% fibroblastforurening. (D) Billede af en etableret primær mesotheliom tumorlinje. Skalabjælker = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentativ flowcytometri fænotypning af etableret mesotheliom tumor cellelinje. (A og B) Histogrammer, der viser overfladeekspressionsmønsteret af mesothelin og N-cadherin på ATCC mesotheliom cellelinjer, kontrol melanom tumor linje, og primære mesotheliom tumor linjer. (C og D) Virkningen af trypsin, protease-collagenase blanding og celledissociationsbuffer på N-cadherin og CD90. Forkortelser: Comp-X-A = kompenseret område af fluorofor X; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Overflade antistof | Fortessa X20-kanalen | Laser | Klon | Isotype | Volumen/ prøve (μL) |
| Levende/død gul | Bv510 | VIOLET | Nielsen | Nielsen | 1 |
| anti-mesothelin APC | Apc | Rød | REA1057 | IgG1 | 2 |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Pe | ÅG | 8C11 | IgG1 | 5 |
| anti-CD90 PE-Cy7 | PE-Cy7 | ÅG | 5E10 | IgG1 | 5 |
Tabel 1: Flowcytometri antistoffer anvendes til fænotype tumorlinjer. Forkortelser: PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin.
Supplerende figur S1: Gating strategi for fænotypisk analyse af tumorlinjer. Punktdiagrammer vises for hvert trin i gatingstrategien, der fører til vurdering af udtryk for interessemarkørerne. Enhver indledende port ved hjælp af fremad scatter og side scatter egenskaber er lavet til at identificere cellerne af interesse, efterfulgt af en QC gate baseret på tidsfunktionen. Cellerne underlejres derefter for at fjerne eventuelle dubletter ved hjælp af fremad- og sidespredningsegenskaber. Den endelige QC-port er baseret på levedygtighed, hvor de døde celler farver positivt for farvestoffet. Efter levedygtighedsporten kan subgating udføres baseret på panelet. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvom denne protokol er ligetil, er der et par kritiske trin, der skal følges nøje. Den tidlige passagefrysning er vigtig for at bevare evnen til at gentage tumorcelleberigelsesprocessen, hvis den oprindeligt ikke lykkes. Evnen til at vurdere fibroblastisk forurening med øjet for at bestemme den korrekte opdelings- og mediesulteteknik er afgørende for at forhindre fibroblastovervækst i kulturen. Derudover kræver den differentielle trypsiniseringsmetode omhyggelig observation af cellerne under inkubation. Cellerne kan løfte plastpladen af med forskellige hastigheder, og dette vil variere fra cellelinje til cellelinje. Mens du lærer denne proces og forfiner dette beslutningstrin, kan en del af den oprindelige kultur bevares i en 6-brønds plade ved hjælp af reduceret serum sultmedium (RPMI 1640 med 1% Pen / Strep og 1% FBS), indtil tumorcelleberigelse kan observeres.
En vigtig faktor, der blev bemærket i valideret fænotypisk karakterisering af mesotheliomtumorlinjerne, var virkningen af trypsinisering og protease-collagenaseblandingen på ekspressionen af mesotheliomtumorcelleoverflademarkøren, N-cadherin8. Vi observerede et tab af overflademarkøren, hvis celler blev løsnet ved hjælp af disse enzymer, som tidligere er beskrevet9. Selvom det har vist sig, at de fleste overfladeproteiner ikke påvirkes negativt af trypsin, er det vigtigt at teste hver overflademarkør under flowpaneldesign10. Derudover anbefales det stærkt at dyrke eller udvide tumorcellerne, indtil cellerne når en logfase af ekspansion og har tid til at udtrykke disse markører igen. Anvendelse af celledissociationsmedium tillod retention af ekspression af N-cadherin til påvisning ved anvendelse af flowcytometri. Andre typer dissociationsmedier kan også tillade markørretention; Individuelle laboratorier bør dog omhyggeligt teste disse medier, inden der etableres et flowcytometripanel.
En stor begrænsning for denne undersøgelse er, at succesraten for etablering af en cellelinje kun er 50%. Dette kan skyldes den heterogene karakter af tumormikromiljøet. Veje til forbedring af denne proces kunne omfatte brugen af 3D-kultursystemer, tilsætning af medietilskud til fremme af tumorcelleudvidelse, forbedrede disaggregeringsmetoder, anvendelse af patientafledte xenotransplantater eller pladebelægning for at forbedre tumorcelleadhæsion11. Faktisk har 3D-kulturer vist sig at være vellykkede i dannelsen af udfordrende tumorcellelinjer såsom kræft i bugspytkirtlen7.
En udvælgelsesvej, der ikke er inkluderet i denne protokol, er tumorcelleberigelse ved cellesortering baseret på en mesotheliom tumormarkør såsom mesothelin. Da mesotheliom tumorceller kan udtrykke standard fibroblastmarkøren, CD90, kan positiv selektion være et bedre alternativ. Advarslen til denne metode er den lave grad af cellularitet i tidlige kulturer, hvilket ville kræve sortering i et lille volumen, multiwell plade såsom en 384- eller 96-brøndplade. Da denne protokol desuden involverer anvendelse af collagenase til vævsfordøjelse, vides det ikke, om dette også kan påvirke overfladeekspressionen af N-cadherin eller mesothelin. Mens mekanismen for mesothelinekspression er relativt ukendt, spiller N-cadherin en vigtig rolle i cellulær adhæsion, og fjernelsen af dette protein kan påvirke etableringen af en tumorlinje12 negativt. Dette er i øjeblikket ved at blive vurderet.
Denne metode er signifikant, da den gør det muligt at generere et in vitro-modelsystem til at studere denne sjældne tumortype. Dette kan omfatte undersøgelser, der identificerer nye overflademål for mesotheliom, såsom mesothelin med CAR-T-celler og afdækning af tumor-iboende egenskaber ved resistens over for målrettede eller immunterapier. Hertil kommer, at hvis disse celler kan udvides in vivo i musemodeller, vil dette også skabe en kilde til test af cellulære baserede og antistofbaserede terapier samt små molekyler. En fremtidig retning for denne protokol vil teste evnen til at udvide andre undertyper af MPM'er såsom sarkomatoid og bifasiske delmængder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CH er medlem af SAB for Briacell Therapeutics og Mesotheliom Applied Research Foundation. Alle andre forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende Raquel Laza-Briviesca for hendes bidrag til at starte denne protokol og Dr. Boris Sepesi, Reza Mehran og David Rice for samarbejde om vævssamlinger. Der er ingen yderligere finansiering forbundet med dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
- Guzman-Casta, J., et al. Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma. Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).
- Baas, P., et al. First-line nivolumab plus ipilimumab in unresectable malignant pleural mesothelioma (CheckMate 743): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 397 (10272), 375-386 (2021).
- Testa, J. R., Berns, A.
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Kobayashi, M., Takeuchi, T., Ohtsuki, Y. Establishment of three novel human malignant pleural mesothelioma cell lines: morphological and cytogenetical studies and EGFR mutation status. Anticancer Research. 28 (1), 197-208 (2008).
- Chernova, T., et al. Molecular profiling reveals primary mesothelioma cell lines recapitulate human disease. Cell Death and Differentiation. 23 (7), 1152-1164 (2016).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Han, A. C., et al. Differential expression of N-cadherin in pleural mesotheliomas and E-cadherin in lung adenocarcinomas in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Human Pathology. 28 (6), 641-645 (1997).
- Tachibana, K. N-cadherin-mediated aggregate formation; cell detachment by Trypsin-EDTA loses N-cadherin and delays aggregate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (2), 414-418 (2019).
- Donnenberg, V. S., Corselli, M., Normolle, D. P., Meyer, E. M., Donnenberg, A. D. Flow cytometric detection of most proteins in the cell surface proteome is unaffected by trypsin treatment. Cytometry A. 93 (8), 803-810 (2018).
- Pham, K., et al. Isolation of pancreatic cancer cells from a patient-derived xenograft model allows for practical expansion and preserved heterogeneity in culture. American Journal of Pathology. 186 (6), 1537-1546 (2016).
- Derycke, L. D., Bracke, M. E. N-cadherin in the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation, embryogenesis, invasion and signalling. International Journal of Developmental Biology. 48 (5-6), 463-476 (2004).
