Summary
O objetivo deste artigo método é demonstrar uma metodologia robusta e reprodutível para o enriquecimento, geração e expansão das linhas celulares tumorais primárias a partir de mesotelioma pleural ressecado cirurgicamente.
Abstract
As metodologias atuais para a expansão das linhas primárias de células tumorais de tipos raros de tumores estão em falta. Este protocolo descreve métodos para expandir as células tumorais primárias a partir de mesotelioma pleural ressecado cirurgicamente e maligno (MPM), fornecendo uma visão geral completa do processo desde a digestão até o enriquecimento, expansão, criopreservação e caracterização fenotípica. Além disso, este protocolo introduz conceitos para a geração de tumores que podem ser úteis para vários tipos de tumores, como a trippsinização diferencial e o impacto dos métodos de dissociação na detecção de marcadores de superfície celular para caracterização fenotípica. A maior limitação deste estudo é a seleção de células tumorais que se expandirão em um sistema de cultura bidimensional (2D). Variações neste protocolo, incluindo sistemas de cultura tridimensional (3D), suplementos de mídia, revestimento de placas para melhorar a adesão e métodos alternativos de desagregação, poderiam melhorar essa técnica e a taxa de sucesso geral do estabelecimento de uma linha de tumor. No geral, este protocolo fornece um método base para estabelecer e caracterizar células tumorais a partir deste tumor raro.
Introduction
O mesotelioma pleural maligno (MPM) é um tumor raro altamente associado à exposição ao amianto. Embora as abordagens baseadas em imunoterapia tenham mostrado resultados encorajadores, há uma escassez de opções de tratamento disponíveis para os pacientes que desenvolvem essa doença, e a taxa geral de sobrevivência de 5 anos é baixade 1,2. Esforços estão em andamento em várias instituições para entender melhor essa doença e identificar novos alvos terapêuticos que possam melhorar os resultados dos pacientes. Embora existam vários modelos de camundongos de mesotelioma, o acesso às células tumorais primárias do mesotelioma é mais limitado3. A expansão in vitro das células tumorais primárias do mesotelioma forneceria um valioso sistema modelo que pode ser utilizado para estudar diretamente as células tumorais e sua interação com células imunes autólogas, como linfócitos infiltrados em tumores. Embora tenha havido relatos sobre a expansão das linhas primárias de células tumorais de mesotelioma, estas são poucas e não fornecem um procedimento padrão de operação (SOP) detalhado. Além disso, poucas linhas de celular estão disponíveis a partir de fontes comerciais, como a American Type Culture Collection (ATCC). Embora a disponibilidade de linhas tumorais primárias seja limitada, foi demonstrado que as células tumorais podem ser expandidas a partir de derrames pleurais e diretamente do tecido tumoral 4,5. Além disso, linhas de células tumorais expandidas têm sido demonstradas para preservar o perfil molecular do tumor original 4,5,6.
Nosso laboratório está estudando o microambiente tumor-imune do MPM e desenvolveu um método para expandir as linhas primárias de células tumorais mpm a partir de casos ressecados cirurgicamente. Este método é adaptado de nossa experiência no estabelecimento de linhas celulares tumorais de melanoma metastático primário. O objetivo deste trabalho é fornecer uma abordagem detalhada e prática para a expansão da linha de tumores mesotelioma primário usando um sistema modelo 2D e perfil fenotípico subsequente. Dado o sucesso recente das estratégias de bloqueio de checkpoint visando CTLA4 e PD-1 na configuração de primeira linha2, a capacidade de gerar muitas linhas tumorais primárias poderia promover a compreensão de ambos os mecanismos intrínsecos de resistência tumorais, bem como fornecer um importante sistema de modelo para avaliar o reconhecimento de células T, aprofundando assim nossa compreensão da resposta imune no MPM.
A maior limitação deste protocolo é que cada tumor contém um microambiente diferente, e há um alto grau de variabilidade do sucesso de expansão. Além disso, este método seleciona para células tumorais que podem se expandir em um sistema de cultura 2D. Outros métodos que envolvem a produção de uma cultura esferoide ou organoide 3D poderiam fornecer uma abordagem alternativa que pode permitir uma maior taxa de sucesso de expansão ou resultar na capacidade de derivar linhas celulares que são incapazes de se expandir em um sistema 2D tradicional. Tais culturas 3D têm sido demonstradas como úteis para a geração de tipos de tumores que são difíceis de expandir, por exemplo, o câncer de pâncreas7.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Institution Review Board (IRB) do Centro de Câncer Anderson da Universidade do Texas MD Anderson. Isso diz respeito aos tumores mpm ressecção cirúrgica e padrão removidos após o consentimento informado.
1. Preparação de mídia de digestão de tumores e outras mídias associadas
- Para preparar a mídia de digestão tumoral, adicione 5 mL de 100% Pen/Strep (Penicillin/Streptomycin) a 500 mL de estéril Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médio em uma capa de fluxo laminar.
- Transfira o filtro estéril médio para 500 mL, 0,22 μm poliethersulfone (PES) para filtragem a vácuo.
NOTA: As etapas de filtragem e aspiração devem ser realizadas com uma pressão padrão de vácuo de 75-150 torr. - Rotule e atue o meio de digestão do tumor e armazene-o a 4 °C.
NOTA: O médio pode ser armazenado por 1 mês a 4 °C.
- Transfira o filtro estéril médio para 500 mL, 0,22 μm poliethersulfone (PES) para filtragem a vácuo.
- Para preparar o coquetel enzimático de digestão do tumor, adicionar 2,5 mL de 3% de colagenase tipo 1, 1 mL de 1,5 mg/mL de higina, 20 μL de 250.000 unidades/mL DNAse 1 a 16,5 mL de meio de digestão em um tubo cônico de 50 mL em um capô de fluxo laminar a 1.
NOTA: O volume total do coquetel enzimático de digestão do tumor é de 20 mL; no entanto, apenas 10 mL é necessário por amostra de tumor. Como tal, o coquetel restante pode ser armazenado a -20 °C até que seja necessário. Não recongele alíquotas. - Para preparar o meio tumoral completo, adicione 5 mL de 100% Pen/Strep e 50 mL de soro bovino fetal (FBS) a 500 mL de RPMI 1640 estéril em uma capa de fluxo laminar.
- Transfira o médio para um filtro estéril pes de 500 mL e 0,22 μm para filtração a vácuo.
- Rotule e data o meio tumor completo e armazene-o a 4 °C.
NOTA: O médio pode ser armazenado por 1 mês a 4 °C.
- Para preparar o meio de soro reduzido para a fome, adicione 5 mL de 100% De Caneta/Estreptococos e 5 mL de FBS a 500 mL de RPMI 1640 estéril em uma capa de fluxo laminar.
- Transfira o médio para um filtro estéril pes de 500 mL e 0,22 μm para filtração a vácuo.
- Rotule e data o meio de soro reduzido e armazene-o a 4 °C.
NOTA: O médio pode ser armazenado por 1 mês a 4 °C.
- Para preparar o meio de congelamento, adicione 5 mL de sulfóxido de dimetil (DMSO) a 45 mL de FBS em uma capa de fluxo laminar.
- Transfira o médio para um filtro estéril pes de 50 mL e 0,22 μm para filtração a vácuo.
- Rotule e data cinco tubos cônicos de 15 mL.
- Transfira 10 mL de meio de congelamento para cada tubo e armazene os tubos a -20 °C.
- Para preparar o meio sem antibióticos para o teste de mycoplasma, adicione 50 mL de FBS a 500 mL de RPMI 1640 estéril em uma capa de fluxo laminar.
- Transfira o médio para um filtro estéril pes de 50 mL e 0,22 μm para filtração a vácuo.
- Rotule e data o meio sem antibióticos e armazene-o a 4 °C.
NOTA: O médio pode ser armazenado por 1 mês a 4 °C.
- Para preparar o tampão de triagem celular ativado pela fluorescência (FACS) para análise fenotípica, adicione 16,6 mL de albumina de soro bovino estéril a 500 mL de salina estéril tamponada de fosfato (PBS) em um capô de fluxo laminar.
- Rotule e data o buffer FACS e armazene-o a 4 °C.
NOTA: O tampão FACS não requer esterilização do filtro, desde que ambos os componentes estejam armazenados estéreis. O buffer FACS pode ser armazenado antes da abertura por 6 meses a 4 °C.
- Rotule e data o buffer FACS e armazene-o a 4 °C.
2. Digestão do tecido tumoral
- Transfira 10 mL de coquetel enzimático de digestão tumoral da etapa 1.2 para um tubo de dissociação.
- Transfira o pedaço do tecido tumoral para uma tampa de placa estéril de 6 poços usando um bisturi estéril.
NOTA: A quantidade de meio transferido com o tecido tumoral é suficiente para o processamento.- Remova todos os tecidos gordurosos, tecido necrosado e/ou coágulos sanguíneos usando um novo bisturi estéril e fórceps.
NOTA: O tecido gorduroso é normalmente amarelado na aparência e semisólida. O tecido necrosado é mais escuro que o tecido circundante na aparência e muito macio; tanto o tecido gorduroso quanto o necrosado se desfazão facilmente. O tecido sangrento parece vermelho brilhante e pode liberar sangue para o meio quando manipulado. Uma vez removido, o tecido tumoral resultante deve manter a forma e ser pálido ou rosa, dependendo do tipo de tecido. - Corte todo o tecido tumoral em 1 mm3 pequenos fragmentos. Para garantir que o tecido não seque, adicione 500 μL de solução de sal balanceado estéril de 1x Hank 's (HBSS) ao tecido tumoral.
- Remova todos os tecidos gordurosos, tecido necrosado e/ou coágulos sanguíneos usando um novo bisturi estéril e fórceps.
- Transfira fragmentos tumorais para o tubo de dissociação contendo 10 mL de coquetel enzimático de digestão tumoral (passo 2.1). Feche o tubo firmemente, coloque-o lado da tampa para baixo sobre o dissociador de tecido, e adicione o aparelho de aquecedor aplicando-o como uma manga sobre o tubo de dissociação e pressionando para clicar no lugar.
NOTA: A capacidade máxima para cada tubo é de 4 g de tumor e volume de 10 mL. - Selecione a configuração pré-programada no 37C_h_TDK_1 dissociador. Verifique o status após 10 minutos para garantir que não haja erro de entupimento conforme indicado pela luz vermelha piscando.
NOTA: Este programa processa a 1.865 rpm por 1h com temperatura em 37 °C.
NOTA: Se ocorrer entupimento, remova o tubo de dissociação e gire-o manualmente para desalojar qualquer tecido preso na tampa; em seguida, substitua o tubo sobre o dissociador e retome o programa. - Após a digestão de 1 h, remova o tubo de dissociação e coloque-o em uma coifa de fluxo laminar. Filtre o tumor digerido colocando um coador de células de 70 μm em cima de um tubo cônico de 50 mL e tubos do tumor digerido usando uma pipeta de 10 mL no filtro. Se o filtro obstruír, mude para um novo filtro.
- Enxágüe o tubo de dissociação com 10 mL de mídia de digestão de tumores frescos e passe a lavagem através do filtro.
- Remova o filtro de 70 μm e descarte-o.
- Leve o volume total para 40 mL com meio de digestão tumoral.
- Centrifugar a 500 × g por 5 min a temperatura ambiente.
- Usando uma pipeta aspirando de 2 mL presa a uma fonte de vácuo, aspire o supernatante sem perturbar a pelota, e resuspenque as células usando 10 mL de meio tumor completo estéril.
- Repita o passo 2.6.
- Aspire o supernante como descrito na etapa 2.7. Resuspenque as células em 3 mL de meio tumor completo estéril e transfira a suspensão celular para um poço de uma placa estéril de 6 poços.
- Mantenha a placa em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2.
- Após 24 horas, transfira o meio usado do tumor digerido em bem 1 para um novo poço (bem 2) na mesma placa de 6-bem. Adicione 3 mL de tumor completo estéril ao poço 1.
- Transfira o meio usado dos poços 1 e 2 e combine em bem 3 na mesma placa de 6-bem 24 horas após a etapa 2.11. Adicione 3 mL de meio tumor completo estéril nos poços 1 e 2.
- Aspire o médio de todos os 3 poços e pipeta 3 mL de meio tumor completo em cada poço 48 h após a etapa 2.12.
3. Geração de linha celular tumoral primária
- Usando um microscópio de fase invertida, determine a porcentagem de contaminação do fibroblasto na cultura de passagem precoce.
NOTA: Os fibroblastos são geralmente longos e irregulares e têm uma membrana celular mal definida. Eles parecem magros ou planos em uma escala Z.- Se a contaminação do fibroblasto for superior a 20% das células da cultura de passagem precoce, continue a cultivar após substituir o meio completo por meio de soro reduzido.
- Repita a substituição com meio de soro reduzido na etapa 3.1.1 duas vezes por semana durante 3-4 semanas.
- Quando a cultura atingir 80% de confluência, passagem as células dividindo 50:50 em 2 novos poços de uma placa de 6 poços. Continue a passar 50:50 em mídia de soro reduzido uma vez que as células atingem 80% de confluência.
- Repita o passo 3.1.3 por até 4 semanas, passando em frascos de cultura maiores conforme necessário, dividindo 50:50 quando a cultura atinge 80% de confluência. Se a população de fibroblasto não for reduzida a 10% ou menos, continue a etapa 3.2 para tentar o método diferenciado de trippsinização para remover a contaminação do fibroblasto. Caso contrário, prossiga para a etapa 3.3.
- Para enriquecer para as células tumorais, enxágue suavemente o poço com 1x PBS para remover o soro médio contendo.
- Adicione trippsina da seguinte forma: 1 mL por bem se em uma placa de 6 poços, 2 mL para um frasco T25, 3 mL para um frasco T75.
- Coloque a placa de 6 poços ou o frasco em uma incubadora a 37 °C por 1 min. Remova a placa ou o frasco da incubadora e verifique a adesão das células usando um microscópio invertido. Se as células estiverem parcialmente levantando ou flutuando, remova suavemente as células suspensas e tente apenas. Coloque as células em um tubo cônico de 15 mL contendo um volume igual ou maior de meio tumor completo.
NOTA: Esta coleta parcial de células baseadas em propriedades de adesão é a primeira de múltiplas frações. - Repita as etapas 3.2.1 e 3.2.2 até que todas as células sejam levantadas, ou haja 4 frações removidas.
- Centrifugar todas as frações independentes a 500 × g por 5 min a temperatura ambiente.
- Aspire o supernante conforme descrito na etapa 2.7, e resuspenque as células usando 5 mL de meio estéril e reduzido de soro.
- Coloque as células em um frasco T25 para cada fração e coloque os frascos em uma incubadora a 37 °C.
- Avalie a cultura após 48 horas para determinar qual fração é enriquecida para células tumorais versus fibroblastos. Descarte frascos ricos em fibroblastos. Se a contaminação do fibroblasto for <10%, continue a expansão em meio tumor completo e prossiga para a etapa 4. Se a contaminação do fibroblasto for de 10 a 30%, a repetição das etapas 3.1.2-3.1.4. Se a contaminação do fibroblasto for superior a 30%, repetimos as etapas 3.2-3.2.7.
- Se poucos ou nenhum fibroblastos forem detectados dentro da cultura de passagem precoce, continuem a passar as células em meio tumor completo, dividindo 50:50 uma vez que as células são 80% confluentes em sua placa de 6 poços ou frasco.
4. Expansão da linha celular tumoral primária de passagem precoce
- Uma vez que a cultura tumoral primária contenha 10% ou menos de contaminação por fibroblasto, aspire o meio e substitua-o por meio tumor completo estéril duas vezes por semana.
NOTA: O volume médio ideal para um T25 é de 5 mL; T75 tem 12 mL; T150 é de 25 mL.- Passar a cultura 50:50 em frascos maiores conforme necessário, uma vez que atinge 80% de confluência na placa ou frasco.
NOTA: A cultura pode precisar ser passagem em uma proporção maior dependendo do seu crescimento. Ajuste para que a cultura atinja 80% de confluência a cada 3-5 dias.
- Passar a cultura 50:50 em frascos maiores conforme necessário, uma vez que atinge 80% de confluência na placa ou frasco.
- Passagem até a cultura está na passagem 4 ou superior. Uma vez que a cultura é 80% confluente em um mínimo de dois frascos T75, continue a passo 5.
5. Caracterização e banco da linha celular tumoral primária estabelecida
- Criopreserve um frasco T75 como um congelamento de passagem antecipada. Para o teste de mycoplasma dos frascos T75 restantes, continue a etapa 5.2.
- Para criopreservação de células de passagem precoce, descongele 1 tubo de meio de congelamento aliquoted preparado na etapa 1.5.
- Colete as células por experimentação, primeiro lavando a placa com 1x PBS como descrito na etapa 3.2 e adicionando trippsina conforme descrito na etapa 3.2.1.
- Coloque o frasco em uma incubadora a 37 °C por 3 min. Remova o frasco da incubadora e verifique a adesão das células usando um microscópio invertido. Se as células estiverem levantando ou flutuando, remova suavemente as células suspensas e a trippsina. Coloque as células em um tubo cônico de 15 mL contendo um volume igual ou maior de meio tumor completo.
NOTA: Se as células permanecerem aderentes após 3 min, coloque o frasco de volta na incubadora por mais 2 minutos. - Misture bem o tubo por tubos suavemente e remova 20 μL para contar.
- Centrifugar o tubo a 500 × g por 5 min a temperatura ambiente.
- Enquanto as células estão girando, conte usando um protocolo de contagem específico de laboratório, como azul trypan ou iodeto de acridina laranja/propídio (AO/PI).
- Resuspengue as células após a centrifugação em meio de congelamento com um mínimo de 2 × 106 células/1 mL meio de congelamento.
- Transfira 1 mL da suspensão celular da etapa 5.1.7 para criovials de 1,5 mL pré-rotulados.
- Coloque os criovias em uma câmara de congelamento de taxa controlada e transfira-as imediatamente para -80 °C.
- Armazene as células a -80 °C por até 1 semana antes de transferi-las para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
- Divida um frasco T75 às 50:50 para o teste de mycoplasma. Alterar o meio médio para o meio sem antibióticos preparado na etapa 1.6.
- Depois de 72 h, descongele o reagente de detecção de mycoplasma, substrato e controles em temperatura ambiente por 15 minutos antes do teste.
- Colete 1 mL do supernaente de cada cultura a ser testado e coloque-o em um tubo cônico de 15 mL.
- Pelota qualquer célula suspensa por centrifugação do supernante a 500 × g por 5 min a temperatura ambiente.
- Carregue 100 μL de supernacantes de amostra e controles em uma placa branca de 96 poços. Adicione 100 μL de reagente de detecção de mycoplasma a cada amostra e controle.
- Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Coloque a placa em um leitor de placas e leia a luminescência (Leitura A, ou seja, primeira leitura).
NOTA: O protocolo do fabricante do kit mycoplasma indica manter as configurações padrão nos leitores de placas multifuncionais. A leitura é definida no ponto final da Luminescência com um tempo de integração de 1 s e ganho de 135. O leitor de placas usa uma rotina de escala automática para otimizar o sinal de ganho para cada experimento. O tempo de integração de 1 s é padrão padrão. Ambas as configurações são usadas para ajustar a intensidade do sinal luminescente interpretado pelo leitor de placas e podem precisar ser ajustadas dependendo do leitor de placas individuais. - Remova a placa do leitor de placas e adicione 100 μL do substrato de detecção de mycoplasma a cada amostra e aos controles.
- Incubar por 10 minutos à temperatura ambiente.
- Coloque a placa no leitor de placas e leia a luminescência (Leitura B, ou seja, segunda Leitura).
- Para determinar a positividade do micoplasma, determine a razão da leitura B com a leitura A.
NOTA: As razões de positividade do mycoplasma são descritas no protocolo do fabricante do kit mycoplasma. As leituras A e B são adquiridas com as mesmas configurações e simplesmente refletem a ordem de leitura.- Considere uma razão < 1 para ser mycoplasma negativo.
- Considere uma razão de 1-1.2 para ser inconclusiva e repetir o passo 5.2.
- Considere uma razão > 1,2 para ser mycoplasma-positiva e monitorar essa cultura; acabar com a cultura, se necessário.
- Caracterização da citometria de fluxo das células tumorais mycoplasma-negativa
- Desalojar as células tumorais usando tampão de dissociação celular.
- Conte as células e resuspenda as células a 1 × 106/mL no buffer FACS a partir da etapa 1.7.
- Remova 100 μL de suspensão celular em tubos individuais para coloração superficial.
- Centrifugar a 500 × g por 5 min a temperatura ambiente.
- Aspire os receptores supernacantantes e bloqueiem os receptores Fc incubando as células em 500 μL de soro de cabra de 5% no tampão FACS à temperatura ambiente por 10 minutos.
- Adicione 2 mL de tampão FACS e centrifule a suspensão a 500 × g por 5 min a temperatura ambiente.
- Aspire o supernasciente e adicione a mistura de manchas de superfície de anticorpos (Tabela 1) e tampão FACS de modo que o volume final seja de 100 μL. Cubra as amostras e manche-as no gelo por 30 minutos.
- Repita o passo 5.3.6.
- Aspire o supernasal e fixe as células resuscupando em 200 μL de 1% de paraformaldeído (PFA) mais 0,25% EtOH. Incubar em temperatura ambiente por 20 minutos com as amostras protegidas da luz.
- Repita o passo 5.3.6. Resuspende as células em 200 μL de tampão FACS para aquisição usando um citômetro de fluxo apropriado.
NOTA: Espera-se que as células tumorais de mesotelioma sejam positivas para a mesotelina e a N-cadherina. Alguns também podem expressar CD90.
- Expanda em meio e banco tumor completo, conforme descrito nas etapas 4.1 e 5.1, respectivamente.
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Representative Results
Para determinar a contaminação do fibroblasto das culturas de passagem precoce, as células são avaliadas usando um microscópio de fase invertida para identificar a frequência de fibroblastos em relação às outras células aderentes presentes. A Figura 1 mostra exemplos de aumento da contaminação do fibroblasto de 80% (Figura 1A), 50% (Figura 1B) e 30% (Figura 1C), em comparação com uma cultura sem contaminação por fibroblasto (Figura 1D). Com base nessa avaliação visual, são feitos ajustes nas condições de expansão descritas acima. Uma vez estabelecida uma cultura livre de micoplasma com <10% de contaminação por fibroblasto, a citometria de fluxo é usada para determinar a pureza da linha tumoral de mesotelioma.
Figura 2A,B mostram a coloração representativa da superfície da citometria de fluxo de duas linhas primárias de tumores de mesotelioma (MESO171 e MESO176) em comparação com as linhas tumorais de mesotelioma estabelecidas pela ATCC (NCI-H2452 e MSTO-211H) com uma linha de tumor de melanoma (MEL526) como controle negativo. As células tumorais de mesotelioma podem expressar mesotelina (Figura 2A) e N-cadherin (Figura 2B). Informações detalhadas relacionadas ao painel de citometria de fluxo utilizadas estão mostradas na Tabela 1. A estratégia de gating é mostrada na Figura Suplementar 1. Note-se que o CD90 não pode ser usado como um marcador específico do fibroblasto, pois também pode ser expresso por células tumorais de mesotelioma. A importância de testar o impacto do descolamento enzimático na expressão do marcador de proteína superficial também é mostrada como trypsin e a mistura protease-colagenase resultou na perda da expressão superficial de N-cadherin (Figura 2C) enquanto CD90 não foi impactado (Figura 2D).
Figura 1: Imagens representativas do aumento da frequência de contaminação do fibroblasto em culturas de passagem precoce e uma imagem estabelecida da linha tumoral. (A) imagem da cultura de passagem precoce contendo 80% de contaminação por fibroblasto. (B) Imagem da cultura de passagem precoce contendo 50% de contaminação por fibroblasto. (C) Imagem da cultura de passagem precoce contendo 30% de contaminação do fibroblasto. (D) Imagem de uma linha de tumores de mesotelioma primário estabelecida. Barras de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fenotometria de fluxo representativo da linha celular tumoral de mesotelioma estabelecida. (A e B) Histogramas mostrando o padrão de expressão superficial de mesothelin e N-cadherin nas linhas celulares atcc mesotelioma, linha tumoral de controle e linhas primárias de tumor mesotelioma. (C e D) Impacto da trippsina, mistura protease-colagenase e tampão de dissociação celular em N-cadherin e CD90. Abreviaturas: Comp-X-A = área compensada do fluorohore X; PE = ficoerthrina; APC = aofilia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Anticorpo superficial | Fortessa X20 Channel | Laser | Clone | Isotipo | Volume/ Amostra (μL) |
| Amarelo vivo/morto | BV510 | VIOLETA | N/A | N/A | 1 |
| anti-mesothelin APC | Apc | Vermelho | REA1057 | IgG1 | 2 |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Pe | YG | 8C11 | IgG1 | 5 |
| anti-CD90 PE-Cy7 | PE-Cy7 | YG | 5E10 | IgG1 | 5 |
Tabela 1: Anticorpos de citometria de fluxo usados para linhas tumorais fenótipos. Abreviaturas: PE = ficoerthrin; APC = aofilia.
Figura Suplementar S1: Estratégia de gating para análise fenotípica das linhas tumorais. Os gráficos de ponto são mostrados para cada passo na estratégia de gating que leva à avaliação da expressão dos marcadores de interesse. Qualquer portão inicial usando propriedades de dispersão para a frente e dispersão lateral é feito para identificar as células de interesse, seguido por um portão QC com base no recurso de tempo. As células são então subaltedas para remover quaisquer dobras usando propriedades de dispersão para a frente e para o lado. O portão QC final é baseado na viabilidade, com as células mortas manchando positivo para o corante. Seguindo o portão de viabilidade, o subsaramento pode ser realizado com base no painel. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Embora este protocolo seja simples, existem alguns passos críticos que devem ser seguidos de perto. O congelamento da passagem precoce é importante para preservar a capacidade de repetir o processo de enriquecimento tumoral-células, se inicialmente mal sucedido. A capacidade de avaliar a contaminação fibroblástica pelo olho para decidir a técnica correta de divisão e fome da mídia é vital para evitar o crescimento excessivo do fibroblasto na cultura. Além disso, o método diferencial de trippsinização requer uma observação cuidadosa das células durante a incubação. As células podem decolar da placa de plástico a diferentes taxas, e isso vai variar de linha celular para linha celular. Ao aprender esse processo e refinar essa etapa de tomada de decisão, uma parte da cultura original pode ser preservada em uma placa de 6 poços usando meio de fome de soro reduzido (RPMI 1640 com 1% de Caneta/Estreptococos e 1% FBS) até que o enriquecimento de células tumorais possa ser observado.
Um fator importante observado na caracterização fenotípica validada das linhas tumorais do mesotelioma foi o impacto da trippsinização e da mistura protease-colagenase na expressão do marcador de superfície celular tumoral de mesotelioma, N-cadherin8. Observamos uma perda do marcador de superfície se as células fossem destacadas usando essas enzimas, que foi descrita anteriormente9. Embora tenha sido demonstrado que a maioria das proteínas superficiais não são afetadas negativamente pela trippsina, é importante testar cada marcador de superfície durante o projeto do painelde fluxo 10. Além disso, é altamente recomendável cultivar ou expandir as células tumorais até que as células atinjam uma fase de tronco de expansão e tenham tempo para reexpressar esses marcadores. O uso do meio de dissociação celular permitiu a retenção da expressão de N-cadherin para detecção usando citometria de fluxo. Outros tipos de mídia de dissociação também podem permitir a retenção de marcadores; no entanto, os laboratórios individuais devem testar cuidadosamente essas mídias antes de estabelecer um painel de citometria de fluxo.
Uma grande limitação para este estudo é que a taxa de sucesso do estabelecimento de uma linha celular é de apenas 50%. Isso pode ser devido à natureza heterogênea do microambiente tumoral. As avenidas para melhorar esse processo podem incluir o uso de sistemas de cultura 3D, a adição de suplementos de mídia para promover a expansão das células tumorais, melhores métodos de desagregação, o uso de xenoenxertos derivados do paciente ou revestimento de placas para melhorar a adesão de células tumorais11. De fato, as culturas 3D têm se mostrado bem sucedidas na geração de linhas de células tumorais desafiadoras, como o câncer de pâncreas7.
Uma via de seleção que não está incluída neste protocolo é o enriquecimento de células tumorais por triagem celular baseada em um marcador tumoral de mesotelioma, como a mesotelina. Como as células tumorais de mesotelioma podem expressar o marcador padrão do fibroblasto, CD90, a seleção positiva pode ser uma alternativa melhor. A ressalva a este método é o baixo grau de celularidade nas culturas primitivas, o que exigiria a classificação em um pequeno volume, placa multiwell, como uma placa de 384 ou 96 poços. Além disso, como este protocolo envolve o uso de colagemnase para digestão tecidual, não se sabe se isso também pode impactar a expressão superficial de N-cadherin ou mesothelin. Embora o mecanismo da expressão de mesotelina seja relativamente desconhecido, a N-cadherin desempenha um papel importante na adesão celular, e a remoção dessa proteína pode impactar negativamente o estabelecimento de uma linhade tumor 12. Isso está sendo avaliado.
Este método é significativo, pois permite que a geração de um sistema de modelo in vitro estude esse tipo de tumor raro. Isso pode incluir estudos que identificam novos alvos superficiais de mesotelioma, como a mesotelina com células CAR-T, e a descoberta de propriedades intrínsecas tumorais de resistência a imunoterapias direcionadas ou imunoterápicos. Além disso, se essas células puderem ser expandidas in vivo em modelos de camundongos, isso também criaria uma fonte para testar terapêuticas baseadas em celulares e anticorpos, bem como pequenas moléculas. Uma direção futura para este protocolo será testar a capacidade de expandir outros subtipos de MPMs, como os subconjuntos sarcomatoides e bifásicos.
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Disclosures
Ch é membro da SAB for Briacell Therapeutics e da Mesothelioma Applied Research Foundation. Todos os outros autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de reconhecer Raquel Laza-Briviesca por sua contribuição para iniciar este protocolo e os Drs. Boris Sepesi, Reza Mehran e David Rice por colaboração em coleções de tecidos. Não há financiamento adicional associado a este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
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