Summary
L’objectif de cet article sur la méthode est de démontrer une méthodologie robuste et reproductible pour l’enrichissement, la génération et l’expansion des lignées cellulaires tumorales primaires à partir du mésothéliome pleural réséqué chirurgicalement.
Abstract
Les méthodologies actuelles pour l’expansion des lignées cellulaires tumorales primaires à partir de types de tumeurs rares font défaut. Ce protocole décrit des méthodes pour élargir les cellules tumorales primaires à partir d’un mésothéliome pleural malin (MPM) réséqué chirurgicalement en fournissant un aperçu complet du processus, de la digestion à l’enrichissement, à l’expansion, à la cryoconservation et à la caractérisation phénotypique. En outre, ce protocole introduit des concepts de génération de tumeurs qui peuvent être utiles pour plusieurs types de tumeurs tels que la trypsinisation différentielle et l’impact des méthodes de dissociation sur la détection des marqueurs de surface cellulaire pour la caractérisation phénotypique. La principale limite de cette étude est la sélection de cellules tumorales qui se développeront dans un système de culture bidimensionnel (2D). Des variantes de ce protocole, y compris des systèmes de culture tridimensionnels (3D), des suppléments de milieu, un revêtement de plaque pour améliorer l’adhérence et d’autres méthodes de désagrégation, pourraient améliorer cette technique et le taux de réussite global de l’établissement d’une ligne tumorale. Dans l’ensemble, ce protocole fournit une méthode de base pour établir et caractériser les cellules tumorales de cette tumeur rare.
Introduction
Le mésothéliome pleural malin (MPM) est une tumeur rare fortement associée à l’exposition à l’amiante. Bien que les approches basées sur l’immunothérapie aient montré des résultats encourageants, il y a peu d’options de traitement disponibles pour les patients qui développent cette maladie, et le taux de survie global à 5 ans est faible 1,2. Des efforts sont en cours dans plusieurs établissements pour mieux comprendre cette maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques susceptibles d’améliorer les résultats pour les patients. Bien qu’il existe plusieurs modèles murins de mésothéliome, l’accès aux cellules tumorales primaires du mésothéliome est plus limité3. L’expansion in vitro des cellules tumorales primaires du mésothéliome fournirait un système modèle précieux qui peut être utilisé pour étudier directement les cellules tumorales et leur interaction avec les cellules immunitaires autologues telles que les lymphocytes infiltrant les tumeurs. Bien qu’il y ait eu des rapports sur l’expansion des lignées de cellules tumorales du mésothéliome primaire, ceux-ci sont peu nombreux et ne fournissent pas de procédure opératoire standard détaillée (SOP). De plus, peu de lignées cellulaires sont disponibles auprès de sources commerciales telles que l’American Type Culture Collection (ATCC). Bien que la disponibilité des lignées tumorales primaires soit limitée, il a été démontré que les cellules tumorales peuvent être élargies à partir d’épanchements pleuraux et directement à partir du tissu tumoral 4,5. En outre, il a été démontré que les lignées cellulaires tumorales élargies préservent le profil moléculaire de la tumeur d’origine 4,5,6.
Notre laboratoire étudie le microenvironnement tumoro-immunitaire de la MPM et a développé une méthode pour élargir les lignées de cellules tumorales MPM primaires à partir de cas réséqués chirurgicalement. Cette méthode est adaptée de notre expérience dans l’établissement de lignées cellulaires tumorales de mélanome métastatique primaire. L’objectif de ce travail est de fournir une approche détaillée et pratique de l’expansion de la ligne tumorale du mésothéliome primaire à l’aide d’un système de modèle 2D et d’un profilage phénotypique ultérieur. Compte tenu du succès récent des stratégies de blocage des points de contrôle ciblant CTLA4 et-1 dans le cadre de première ligne2, la capacité de générer de nombreuses lignées tumorales primaires pourrait approfondir la compréhension des deux mécanismes de résistance intrinsèques de la tumeur et fournir un système modèle important pour évaluer la reconnaissance des lymphocytes T, approfondissant ainsi notre compréhension de la réponse immunitaire dans la MPM.
La principale limitation de ce protocole est que chaque tumeur contient un microenvironnement différent et qu’il existe un degré élevé de variabilité du succès de l’expansion. En outre, cette méthode sélectionne les cellules tumorales qui peuvent se développer dans un système de culture 2D. D’autres méthodes impliquant la production d’une culture sphéroïde ou organoïde 3D pourraient fournir une approche alternative qui pourrait permettre un taux d’expansion plus élevé ou entraîner la capacité de dériver des lignées cellulaires incapables de se développer dans un système 2D traditionnel. De telles cultures 3D se sont avérées utiles pour la génération de types de tumeurs difficiles à développer, par exemple le cancer du pancréas7.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institution Review Board (IRB) du MD Anderson Cancer Center de l’Université du Texas. Cela concerne les tumeurs MPM standard réséquées chirurgicalement enlevées après consentement éclairé.
1. Préparation des milieux de digestion tumorale et d’autres milieux associés
- Pour préparer un milieu de digestion tumorale, ajoutez 5 mL de 100 % de pen/streptocoque (pénicilline/streptomycine) à 500 mL de milieu stérile Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 dans une hotte à écoulement laminaire.
- Transférer le milieu dans un filtre stérile en polyéthersulfone (PES) de 500 mL et 0,22 μm pour la filtration sous vide.
REMARQUE: Les étapes de filtration et d’aspiration doivent être effectuées avec une pression de vide standard de 75-150 torr. - Étiquetez et datez le milieu de digestion de la tumeur et conservez-le à 4 °C.
REMARQUE: Le milieu peut être conservé pendant 1 mois à 4 ° C.
- Transférer le milieu dans un filtre stérile en polyéthersulfone (PES) de 500 mL et 0,22 μm pour la filtration sous vide.
- Pour préparer le cocktail enzymatique qui digère la tumeur, ajouter 2,5 mL de collagénase de type 1 à 3 %, 1 mL de hyaluronidase à 1,5 mg/mL, 20 μL de 250 000 unités/mL de DNAse 1 à 16,5 mL de milieu de digestion dans un tube conique de 50 mL dans une hotte à écoulement laminaire.
REMARQUE: Le volume total du cocktail enzymatique de digestion tumorale est de 20 mL; cependant, seulement 10 mL sont nécessaires par échantillon de tumeur. En tant que tel, le cocktail restant peut être conservé à -20 ° C jusqu’à ce qu’il soit nécessaire. Ne recongelez pas les aliquotes. - Pour préparer un milieu tumoral complet, ajouter 5 mL de Pen/Strep à 100 % et 50 mL de sérum bovin fœtal (FBS) à 500 mL de RPMI 1640 stérile dans une hotte à écoulement laminaire.
- Transférer le milieu dans un filtre stérile PES de 500 mL et 0,22 μm pour la filtration sous vide.
- Étiquetez et datez le milieu tumoral complet et conservez-le à 4 °C.
REMARQUE: Le milieu peut être conservé pendant 1 mois à 4 ° C.
- Pour préparer le milieu sérique réduit à la famine, ajouter 5 mL de stylo/streptocoque à 100 % et 5 mL de FBS à 500 mL de RPMI 1640 stérile dans une hotte à écoulement laminaire.
- Transférer le milieu dans un filtre stérile PES de 500 mL et 0,22 μm pour la filtration sous vide.
- Étiqueter et dater le milieu à sérum réduit et le conserver à 4 °C.
REMARQUE: Le milieu peut être conservé pendant 1 mois à 4 ° C.
- Pour préparer le milieu de congélation, ajouter 5 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 45 mL de FBS dans une hotte à écoulement laminaire.
- Transférer le milieu dans un filtre stérile PES de 50 mL et 0,22 μm pour la filtration sous vide.
- Étiquetez et datez cinq tubes coniques de 15 mL.
- Transférer 10 mL de fluide lyophilisé dans chaque tube et stocker les tubes à -20 °C.
- Pour préparer un milieu sans antibiotique pour le test des mycoplasmes, ajoutez 50 mL de FBS à 500 mL de RPMI stérile 1640 dans une hotte à écoulement laminaire.
- Transférer le milieu dans un filtre stérile PES de 50 mL et 0,22 μm pour la filtration sous vide.
- Étiqueter et dater le milieu sans antibiotique et le conserver à 4 °C.
REMARQUE: Le milieu peut être conservé pendant 1 mois à 4 ° C.
- Pour préparer le tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour l’analyse phénotypique, ajouter 16,6 mL d’albumine sérique bovine stérile à 500 mL de solution saline stérile 1x tamponnée au phosphate (PBS) dans une hotte à écoulement laminaire.
- Étiquetez et datez le tampon FACS et conservez-le à 4 °C.
REMARQUE: Le tampon FACS ne nécessite pas de stérilisation du filtre tant que les deux composants sont stockés stériles. Le tampon FACS peut être stocké avant ouverture pendant 6 mois à 4 °C.
- Étiquetez et datez le tampon FACS et conservez-le à 4 °C.
2. Digestion du tissu tumoral
- Transférer 10 mL de cocktail enzymatique de digestion tumorale de l’étape 1.2 vers un tube de dissociation.
- Transférez le morceau de tissu tumoral sur un couvercle stérile à 6 puits à l’aide d’un scalpel stérile.
REMARQUE: La quantité de milieu qui est transférée avec le tissu tumoral est suffisante pour le traitement.- Enlevez tous les tissus adipeux, les tissus nécrotiques et / ou les caillots sanguins à l’aide d’un nouveau scalpel stérile et d’une pince.
REMARQUE: Le tissu adipeux est normalement jaunâtre et semi-solide. Le tissu nécrotique est plus foncé que le tissu environnant en apparence et très doux; les tissus gras et nécrotiques se briseront facilement. Les tissus sanglants apparaissent rouge vif et peuvent libérer du sang dans le milieu lorsqu’ils sont manipulés. Une fois retiré, le tissu tumoral résultant doit conserver sa forme et être pâle ou rose, selon le type de tissu. - Couper tout le tissu tumoral en 1 mm3 petits fragments. Pour vous assurer que le tissu ne se dessèche pas, ajoutez 500 μL de solution saline équilibrée (HBSS) stérile 1x Hank’s au tissu tumoral.
- Enlevez tous les tissus adipeux, les tissus nécrotiques et / ou les caillots sanguins à l’aide d’un nouveau scalpel stérile et d’une pince.
- Transférer des fragments tumoraux dans le tube de dissociation contenant 10 mL de cocktail enzymatique de digestion tumorale (étape 2.1). Fermez hermétiquement le tube, placez-le côté capuchon vers le bas sur le dissociateur tissulaire et ajoutez l’appareil chauffant en l’appliquant comme un manchon sur le tube de dissociation et en appuyant pour le cliquer en place.
REMARQUE: La capacité maximale pour chaque tube est de 4 g de tumeur et de 10 mL de volume. - Sélectionnez le paramètre préprogrammé sur le 37C_h_TDK_1 dissociateur. Vérifiez l’état après 10 minutes pour vous assurer qu’il n’y a pas d’erreur de colmatage comme indiqué par le voyant rouge clignotant.
REMARQUE: Ce programme traite à 1 865 tr / min pendant 1 h avec une température à 37 ° C.
REMARQUE: Si un colmatage se produit, retirez le tube de dissociation et faites-le tourbillonner manuellement pour déloger tout tissu coincé dans le couvercle; puis replacez le tube sur le dissociateur et reprenez le programme. - Après 1 h de digestion, retirez le tube de dissociation et placez-le dans une hotte à écoulement laminaire. Filtrer la tumeur digérée en plaçant une passoire cellulaire de 70 μm sur un tube conique de 50 mL et en pipetant la tumeur digérée à l’aide d’une pipette de 10 mL sur le filtre. Si le filtre se bouche, passez à un nouveau filtre.
- Rincez le tube de dissociation avec 10 mL de milieu de digestion tumorale frais et passez le lavage à travers le filtre.
- Retirez le filtre de 70 μm et jetez-le.
- Porter le volume total à 40 mL avec un milieu de digestion tumorale.
- Centrifuger à 500 × g pendant 5 min à température ambiante.
- À l’aide d’une pipette d’aspiration de 2 mL fixée à une source de vide, aspirer le surnageant sans perturber la pastille et remettre en suspension les cellules à l’aide de 10 mL de milieu tumoral complet stérile.
- Répétez l’étape 2.6.
- Aspirer le surnageant comme décrit à l’étape 2.7. Remettre en suspension les cellules dans 3 mL de milieu tumoral complet stérile et transférer la suspension cellulaire dans un puits d’une plaque stérile de 6 puits.
- Conserver la plaque dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Après 24 h, transférer le milieu utilisé de la tumeur digérée dans le puits 1 vers un nouveau puits (puits 2) dans la même plaque de 6 puits. Ajouter 3 mL de milieu tumoral complet stérile au puits 1.
- Transférer le milieu utilisé des puits 1 et 2 et combiner dans le puits 3 dans la même plaque de 6 puits 24 h après l’étape 2.11. Ajouter 3 mL de milieu tumoral complet stérile dans les puits 1 et 2.
- Aspirer le milieu des 3 puits et pipeter 3 mL de milieu tumoral complet dans chaque puits 48 h après l’étape 2.12.
3. Génération d’une lignée cellulaire tumorale primaire
- À l’aide d’un microscope à phase inversée, déterminez le pourcentage de contamination par les fibroblastes dans la culture à passage précoce.
REMARQUE: Les fibroblastes sont généralement longs et irréguliers et ont une membrane cellulaire mal définie. Ils apparaissent minces ou plats sur une échelle Z.- Si la contamination par les fibroblastes est supérieure à 20 % des cellules dans la culture à passage précoce, poursuivre la culture après avoir remplacé le milieu complet par un milieu à sérum réduit.
- Répétez le remplacement par un milieu sérique réduit à l’étape 3.1.1 deux fois par semaine pendant 3 à 4 semaines.
- Lorsque la culture atteint 80% de confluence, passez les cellules en divisant 50:50 en 2 nouveaux puits d’une plaque de 6 puits. Continuer à passer 50:50 dans un milieu à sérum réduit une fois que les cellules atteignent 80% de confluence.
- Répétez l’étape 3.1.3 pendant 4 semaines maximum, en passant dans des flacons de culture plus grands au besoin en divisant 50:50 une fois que la culture atteint 80% de confluence. Si la population de fibroblastes n’est pas réduite à 10 % ou moins, passez à l’étape 3.2 pour tenter la méthode de trypsinisation différentielle afin d’éliminer la contamination par les fibroblastes. Sinon, passez à l’étape 3.3.
- Pour enrichir les cellules tumorales, rincez doucement le puits avec 1x PBS pour éliminer le milieu contenant du sérum.
- Ajouter la trypsine comme suit : 1 mL par puits dans une plaque à 6 puits, 2 mL pour une fiole T25, 3 mL pour une fiole T75.
- Placer la plaque ou la fiole à 6 puits dans un incubateur à 37 °C pendant 1 min. Retirez la plaque ou la fiole de l’incubateur et vérifiez l’adhérence des cellules à l’aide d’un microscope inversé. Si les cellules se soulèvent partiellement ou flottent, retirez doucement les cellules en suspension et la trypsine seulement. Placez les cellules dans un tube conique de 15 mL contenant un volume égal ou supérieur de milieu tumoral complet.
REMARQUE: Cette collection partielle de cellules basée sur les propriétés d’adhérence est la première de plusieurs fractions. - Répétez les étapes 3.2.1 et 3.2.2 jusqu’à ce que toutes les cellules soient levées ou qu’il y ait 4 fractions enlevées.
- Centrifuger toutes les fractions indépendantes à 500 × g pendant 5 min à température ambiante.
- Aspirer le surnageant comme décrit à l’étape 2.7 et remettre les cellules en suspension à l’aide de 5 mL de milieu stérile à sérum réduit.
- Plaquer les cellules dans une fiole T25 pour chaque fraction et placer les fioles dans un incubateur à 37 °C.
- Évaluez la culture après 48 h pour déterminer quelle fraction est enrichie pour les cellules tumorales par rapport aux fibroblastes. Jetez les flacons riches en fibroblastes. Si la contamination par les fibroblastes est <10%, poursuivre l’expansion dans le milieu tumoral complet et passer à l’étape 4. Si la contamination par les fibroblastes est de 10 à 30 %, répétez les étapes 3.1.2 à 3.1.4. Si la contamination par les fibroblastes est supérieure à 30 %, répétez les étapes 3.2 à 3.2.7.
- Si peu ou pas de fibroblastes sont détectés dans la culture de passage précoce, continuez à passer les cellules dans un milieu tumoral complet en divisant 50:50 une fois que les cellules sont confluentes à 80% dans leur plaque ou fiole à 6 puits.
4. Expansion de la lignée cellulaire tumorale primaire à passage précoce
- Une fois que la culture tumorale primaire contient 10% ou moins de contamination par les fibroblastes, aspirez le milieu et remplacez-le par un milieu tumoral complet stérile deux fois par semaine.
REMARQUE: Le volume moyen optimal pour un T25 est de 5 mL; T75 est de 12 mL; T150 est de 25 mL.- Passez la culture 50:50 dans des flacons plus grands au besoin une fois qu’elle atteint 80% de confluence dans la plaque ou la fiole.
REMARQUE: La culture peut avoir besoin d’être passée à un ratio plus élevé en fonction de sa croissance. Ajustez pour que la culture atteigne 80% de confluence tous les 3-5 jours.
- Passez la culture 50:50 dans des flacons plus grands au besoin une fois qu’elle atteint 80% de confluence dans la plaque ou la fiole.
- Passage jusqu’à ce que la culture soit au passage 4 ou au-dessus. Une fois que la culture est confluente à 80 % dans un minimum de deux flacons T75, passez à l’étape 5.
5. Caractérisation et mise en banque de lignées cellulaires tumorales primaires établies
- Cryoconservez une fiole T75 comme congélation à passage précoce. Pour l’analyse des mycoplasmes des flacons T75 restants, passez à l’étape 5.2.
- Pour la cryoconservation des cellules à passage précoce, décongeler 1 tube de milieu de congélation aliquoted préparé à l’étape 1.5.
- Prélever les cellules par trypsinisation en lavant d’abord la plaque avec 1x PBS comme décrit à l’étape 3.2 et en ajoutant de la trypsine comme décrit à l’étape 3.2.1.
- Placer la fiole dans un incubateur à 37 °C pendant 3 min. Retirez la fiole de l’incubateur et vérifiez l’adhérence des cellules à l’aide d’un microscope inversé. Si les cellules se soulèvent ou flottent, retirez doucement les cellules en suspension et la trypsine. Placez les cellules dans un tube conique de 15 mL contenant un volume égal ou supérieur de milieu tumoral complet.
REMARQUE: Si les cellules restent adhérentes après 3 minutes, replacez la fiole dans l’incubateur pendant 2 minutes supplémentaires. - Bien mélanger le tube en pipetant doucement et retirer 20 μL pour le comptage.
- Centrifuger le tube à 500 × g pendant 5 min à température ambiante.
- Pendant que les cellules tournent, comptez à l’aide d’un protocole de comptage spécifique au laboratoire tel que le bleu de trypan ou l’orange acridine / iodure de propidium (AO / PI).
- Remettre en suspension les cellules après centrifugation en milieu de congélation avec un minimum de 2 × 106 cellules/1 mL de milieu de congélation.
- Transférer 1 mL de la suspension cellulaire de l’étape 5.1.7 à des cryoviales prémarquées de 1,5 mL.
- Placer les cryoviaux dans une chambre de congélation à vitesse contrôlée et les transférer immédiatement à -80 °C.
- Conservez les cellules à -80 °C jusqu’à 1 semaine avant de les transférer dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.
- Fendez une fiole T75 à 50:50 pour le test des mycoplasmes. Remplacez le milieu par un milieu sans antibiotique préparé à l’étape 1.6.
- Après 72 h, décongeler le réactif de détection des mycoplasmes, le substrat et les témoins à température ambiante pendant 15 minutes avant le test.
- Prélever 1 mL du surnageant de chaque culture à tester et le placer dans un tube conique de 15 mL.
- Pastillez toutes les cellules en suspension en centrifugant le surnageant à 500 × g pendant 5 min à température ambiante.
- Chargez 100 μL de surnageants et de témoins d’échantillon dans une plaque blanche de 96 puits. Ajouter 100 μL de réactif de détection de mycoplasmes à chaque échantillon et témoin.
- Incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Placez la plaque dans un lecteur de plaque et lisez la luminescence (lecture A, c’est-à-dire première lecture).
REMARQUE: Le protocole du fabricant du kit de mycoplasmes indique de conserver les paramètres par défaut sur les lecteurs de plaques multifonctions. La lecture est réglée au point de terminaison Luminescence avec un temps d’intégration de 1 s et un gain de 135. Le lecteur de plaques utilise une routine de mise à l’échelle automatique pour optimiser le signal de gain pour chaque expérience. Le temps d’intégration de 1 s est la valeur par défaut standard. Les deux réglages sont utilisés pour régler l’intensité du signal luminescent interprété par le lecteur de plaques et peuvent devoir être ajustés en fonction du lecteur de plaques individuel. - Retirez la plaque du lecteur de plaques et ajoutez 100 μL de substrat de détection de mycoplasmes à chaque échantillon et aux témoins.
- Incuber pendant 10 min à température ambiante.
- Placez la plaque dans le lecteur de plaque et lisez la luminescence (lecture B, c’est-à-dire deuxième lecture).
- Pour déterminer la positivité des mycoplasmes, déterminez le rapport entre la lecture B et la lecture A.
REMARQUE: Les rapports de positivité des mycoplasmes sont décrits dans le protocole du fabricant du kit de mycoplasmes. Les lectures A et B sont acquises avec les mêmes paramètres et reflètent simplement l’ordre de lecture.- Considérons un rapport < 1 comme étant mycoplasmique négatif.
- Considérez qu’un rapport de 1 à 1,2 n’est pas concluant et répétez l’étape 5,2.
- Considérez un rapport > 1,2 pour être positif aux mycoplasmes et surveillez cette culture; mettre fin à la culture si nécessaire.
- Caractérisation par cytométrie en flux de cellules tumorales mycoplasmiques négatives
- Déloger les cellules tumorales à l’aide d’un tampon de dissociation cellulaire.
- Comptez les cellules et remettez-les en suspension à 1 × 106/mL dans le tampon FACS à partir de l’étape 1.7.
- Retirez 100 μL de suspension cellulaire dans des tubes individuels pour la coloration de surface.
- Centrifuger à 500 × g pendant 5 min à température ambiante.
- Aspirer le surnageant et bloquer les récepteurs Fc en incubant les cellules dans 500 μL de sérum de chèvre à 5% dans un tampon FACS à température ambiante pendant 10 min.
- Ajouter 2 mL de tampon FACS et centrifuger la suspension à 500 × g pendant 5 min à température ambiante.
- Aspirer le surnageant et ajouter le mélange d’anticorps (tableau 1) et le tampon FACS pour que le volume final soit de 100 μL. Couvrir les échantillons et les tacher sur de la glace pendant 30 min.
- Répétez l’étape 5.3.6.
- Aspirer le surnageant et fixer les cellules en les réutilisant dans 200 μL de 1% de paraformaldéhyde (PFA) plus 0,25% d’EtOH. Incuber à température ambiante pendant 20 min avec les échantillons à l’abri de la lumière.
- Répétez l’étape 5.3.6. Remettre les cellules en suspension dans 200 μL de tampon FACS pour acquisition à l’aide d’un cytomètre en flux approprié.
REMARQUE: Les cellules tumorales du mésothéliome devraient être positives pour la mésothéline et la N-cadhérine. Certains peuvent également exprimer CD90.
- Développer dans le milieu tumoral complet et la banque comme décrit aux étapes 4.1 et 5.1, respectivement.
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Representative Results
Pour déterminer la contamination par les fibroblastes des cultures à passage précoce, les cellules sont évaluées à l’aide d’un microscope à phase inversée afin d’identifier la fréquence des fibroblastes par rapport aux autres cellules adhérentes présentes. La figure 1 montre des exemples d’augmentation de la contamination par les fibroblastes de 80 % (figure 1A), de 50 % (figure 1B) et de 30 % (figure 1C), par rapport à une culture sans contamination par les fibroblastes (figure 1D). Sur la base de cette évaluation visuelle, des ajustements sont apportés aux conditions d’expansion décrites ci-dessus. Une fois qu’une culture sans mycoplasme avec une contamination par <10% de fibroblastes est établie, la cytométrie en flux est utilisée pour déterminer la pureté de la ligne tumorale du mésothéliome.
La figure 2A,B montre une coloration de surface de cytométrie en flux représentative de deux lignées tumorales primaires de mésothéliome (MESO171 et MESO176) par rapport aux lignées tumorales de mésothéliome établies par ATCC (NCI-H2452 et MSTO-211H) avec une ligne tumorale de mélanome (MEL526) comme témoin négatif. Les cellules tumorales du mésothéliome peuvent exprimer la mésothéline (Figure 2A) et la N-cadhérine (Figure 2B). Des informations détaillées relatives au panel de cytométrie en flux utilisé sont présentées dans le tableau 1. La stratégie de contrôle est illustrée à la figure supplémentaire 1. Il est à noter que CD90 ne peut pas être utilisé comme marqueur spécifique des fibroblastes car il peut également être exprimé par les cellules tumorales du mésothéliome. L’importance de tester l’impact du détachement enzymatique sur l’expression des marqueurs protéiques de surface est également démontrée, car la trypsine et le mélange protéase-collagénase ont entraîné une perte d’expression de surface de la N-cadhérine (figure 2C) alors que CD90 n’a pas été touché (figure 2D).
Figure 1 : Images représentatives de la fréquence croissante de la contamination par les fibroblastes dans les cultures à passage précoce et une lignée tumorale établie. (A) image de culture à passage précoce contenant 80 % de contamination par les fibroblastes. (B) Image d’une culture à passage précoce contenant 50 % de contamination par les fibroblastes. (C) Image d’une culture à passage précoce contenant 30 % de contamination par les fibroblastes. (D) Image d’une lignée tumorale primitive établie du mésothéliome. Barres d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Phénotypage représentatif par cytométrie en flux de la lignée cellulaire tumorale établie du mésothéliome. (A et B) Histogrammes montrant le profil d’expression de surface de la mésothéline et de la N-cadhérine sur les lignées cellulaires du mésothéliome ATCC, la lignée tumorale du mélanome de contrôle et les lignées tumorales du mésothéliome primitif. (C et D) Impact de la trypsine, du mélange protéase-collagénase et du tampon de dissociation cellulaire sur la N-cadhérine et le CD90. Abréviations : Comp-X-A = aire compensée du fluorophore X ; PE = phycoérythrine; APC = allophycocyanine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Anticorps de surface | Canal Fortessa X20 | Laser | Clone | Isotype | Volume/Échantillon (μL) |
| Jaune vivant/mort | BV510 | VIOLET | N/a | N/a | 1 |
| anti-mésothéline APC | Apc | Rouge | REA1057 | IgG1 | 2 |
| anti-CD325 (N-Cadhérine) PE | Pe | YG | 8C11 | IgG1 | 5 |
| anti-CD90 PE-Cy7 | PE-Cy7 | YG | 5E10 | IgG1 | 5 |
Tableau 1 : Anticorps de cytométrie en flux utilisés pour phénotyper les lignées tumorales. Abréviations : PE = phycoérythrine; APC = allophycocyanine.
Figure supplémentaire S1: Stratégie de contrôle pour l’analyse phénotypique des lignes tumorales. Des diagrammes à points sont affichés pour chaque étape de la stratégie de contrôle menant à l’évaluation de l’expression des marqueurs d’intérêt. Toute porte initiale utilisant des propriétés de dispersion vers l’avant et de dispersion latérale est conçue pour identifier les cellules d’intérêt, suivie d’une porte QC basée sur la fonction de temps. Les cellules sont ensuite subgated pour supprimer tous les doublets à l’aide des propriétés de dispersion avant et latérale. La porte qc finale est basée sur la viabilité, les cellules mortes étant positives pour le colorant. Après la porte de viabilité, le sous-gating peut être effectué en fonction du panneau. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Bien que ce protocole soit simple, il y a quelques étapes critiques qui doivent être suivies de près. Le gel précoce est important pour préserver la capacité de répéter le processus d’enrichissement des cellules tumorales en cas d’échec initial. La capacité d’évaluer la contamination fibroblastique par l’œil pour décider de la bonne technique de division et de famine des milieux est essentielle pour prévenir la prolifération des fibroblastes dans la culture. De plus, la méthode de trypsinisation différentielle nécessite une observation attentive des cellules pendant l’incubation. Les cellules peuvent décoller de la plaque de plastique à des vitesses différentes, et cela variera d’une lignée cellulaire à l’autre. Tout en apprenant ce processus et en affinant cette étape de prise de décision, une partie de la culture originale peut être conservée dans une plaque de 6 puits en utilisant un milieu de famine sérique réduit (RPMI 1640 avec 1% de stylo / streptocoque et 1% fbS) jusqu’à ce qu’un enrichissement des cellules tumorales puisse être observé.
Un facteur important noté dans la caractérisation phénotypique validée des lignées tumorales du mésothéliome était l’impact de la trypsinisation et du mélange protéase-collagénase sur l’expression du marqueur de surface des cellules tumorales du mésothéliome, la N-cadhérine8. Nous avons observé une perte du marqueur de surface si les cellules étaient détachées à l’aide de ces enzymes, ce qui a été décrit précédemment9. Bien qu’il ait été démontré que la plupart des protéines de surface ne sont pas affectées négativement par la trypsine, il est important de tester chaque marqueur de surface lors de la conception du panneau d’écoulement10. En outre, il est fortement recommandé de cultiver ou d’étendre les cellules tumorales jusqu’à ce que les cellules atteignent une phase logarithmique d’expansion et aient le temps de réexprimer ces marqueurs. L’utilisation d’un milieu de dissociation cellulaire a permis la rétention de l’expression de la N-cadhérine pour la détection par cytométrie en flux. D’autres types de supports de dissociation peuvent également permettre la rétention de marqueurs; cependant, les laboratoires individuels devraient tester soigneusement ces milieux avant d’établir un panel de cytométrie en flux.
Une limite majeure de cette étude est que le taux de réussite de l’établissement d’une lignée cellulaire n’est que de 50%. Cela pourrait être dû à la nature hétérogène du microenvironnement tumoral. Les moyens d’améliorer ce processus pourraient inclure l’utilisation de systèmes de culture 3D, l’ajout de suppléments de milieux pour favoriser l’expansion des cellules tumorales, des méthodes de désagrégation améliorées, l’utilisation de xénogreffes dérivées du patient ou un revêtement de plaques pour améliorer l’adhésion des cellules tumorales11. En effet, il a été démontré que les cultures 3D réussissent à générer des lignées cellulaires tumorales difficiles telles que le cancer du pancréas7.
Une avenue de sélection qui n’est pas incluse dans ce protocole est l’enrichissement des cellules tumorales par tri cellulaire basé sur un marqueur tumoral du mésothéliome tel que la mésothéline. Comme les cellules tumorales du mésothéliome peuvent exprimer le marqueur standard des fibroblastes, CD90, la sélection positive peut être une meilleure alternative. La mise en garde à cette méthode est le faible degré de cellularité dans les cultures précoces, ce qui nécessiterait un tri dans une plaque multipuits de petit volume telle qu’une plaque de 384 ou 96 puits. De plus, comme ce protocole implique l’utilisation de la collagénase pour la digestion des tissus, on ne sait pas si cela peut également avoir un impact sur l’expression superficielle de la N-cadhérine ou de la mésothéline. Alors que le mécanisme d’expression de la mésothéline est relativement inconnu, la N-cadhérine joue un rôle important dans l’adhésion cellulaire, et l’élimination de cette protéine pourrait avoir un impact négatif sur l’établissement d’une lignée tumorale12. Cette mesure est en cours d’évaluation.
Cette méthode est importante car elle permet la génération d’un système modèle in vitro pour étudier ce type de tumeur rare. Cela peut inclure des études identifiant de nouvelles cibles de surface du mésothéliome telles que la mésothéline avec des cellules CAR-T et la découverte des propriétés intrinsèques de la tumeur de résistance aux thérapies ciblées ou immunothérapeutiques. En outre, si ces cellules peuvent être étendues in vivo dans des modèles murins, cela créerait également une source pour tester des thérapies à base de cellules et d’anticorps ainsi que de petites molécules. Une orientation future de ce protocole consistera à tester la capacité d’étendre d’autres sous-types de MPM tels que les sous-ensembles sarcomatoïdes et biphasiques.
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Disclosures
CH est membre du SAB pour Briacell Therapeutics et de la Mesothelioma Applied Research Foundation. Tous les autres auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Raquel Laza-Briviesca pour sa contribution au lancement de ce protocole et les Drs Boris Sepesi, Reza Mehran et David Rice pour leur collaboration sur les collections de tissus. Il n’y a pas de financement supplémentaire associé à ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
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