Summary
Her presenteres en TIRF-mikroskopibasert in vitro rekonstitueringsanalyse for samtidig å kvantifisere og sammenligne dynamikken i to mikrotubulpopulasjoner. En metode er beskrevet for samtidig å se den kollektive aktiviteten til flere mikrotubule-assosierte proteiner på krysskoblede mikrotubulbunter og enkle mikrotubuler.
Abstract
Mikrotubuler er polymerer av αβ-tubulin heterodimers som organiserer seg i forskjellige strukturer i celler. Mikrotubulebaserte arkitekturer og nettverk inneholder ofte delsett av mikrotubule-matriser som er forskjellige i deres dynamiske egenskaper. For eksempel, i å dele celler, sameksisterer stabile bunter av krysskoblede mikrotubuler i nærheten av dynamiske ikke-krysskoblede mikrotubuler. TIRF-mikroskopibaserte in vitro rekonstitueringsstudier muliggjør samtidig visualisering av dynamikken i disse forskjellige mikrotubule arrayene. I denne analysen er et bildekammer montert med overflate-immobiliserte mikrotubuler, som enten er til stede som enkeltfilamenter eller organisert i krysskoblede bunter. Innføring av tubulin-, nukleotider og proteinregulatorer tillater direkte visualisering av tilknyttede proteiner og av dynamiske egenskaper av enkle og krysskoblede mikrotubuler. Videre kan endringer som skjer som dynamiske enkeltmikrotubuler organiseres i bunter overvåkes i sanntid. Metoden beskrevet her tillater en systematisk evaluering av aktiviteten og lokaliseringen av individuelle proteiner, samt synergistiske effekter av proteinregulatorer på to forskjellige mikrotubule-delsett under identiske eksperimentelle forhold, og gir dermed mekanistisk innsikt som er utilgjengelig ved andre metoder.
Introduction
Mikrotubuler er biopolymerer som danner strukturelle stillaser som er avgjørende for flere cellulære prosesser, alt fra intracellulær transport og organellposisjonering til celledeling og forlengelse. For å utføre disse forskjellige funksjonene, er individuelle mikrotubuler organisert i mikron-størrelse arrays, for eksempel mitotiske spindler, ciliary axonemes, nevronale bunter, interfase arrays og plante kortikale arrayer. Et allestedsnærværende arkitektonisk motiv som finnes i disse strukturene er en bunt mikrotubuler krysset langs lengdene1. Et spennende trekk ved flere mikrotubulebaserte strukturer er sameksistensen av buntede mikrotubuler og ikke-krysskoblede enkeltmikrotubuler i nær romlig nærhet. Disse mikrotubule subpopulations kan vise sterkt forskjellig polymerisasjonsdynamikk fra hverandre, etter behov for riktig funksjon2,3,4,5. For eksempel, innenfor den mitotiske spindelen, er stabile krysskoblede bunter og dynamiske enkeltmikrotubuler til stede i et mikronskalaområde ved cellesenteret6. Å studere hvordan de dynamiske egenskapene til sameksistens mikrotubulpopulasjoner er spesifisert, er derfor sentralt for å forstå montering og funksjon av mikrotubulebaserte strukturer.
Mikrotubuler er dynamiske polymerer som veksler mellom faser av polymerisasjon og depolymerisering, og bytter mellom de to fasene i hendelser kjent som katastrofe og redning7. Dynamikken i cellulære mikrotubuler er regulert av myriade Microtubule Associated Proteins (MAPs) som modulerer frekvensen av mikrotubul polymerisering og depolymerisering og frekvensene av katastrofe- og redningshendelser. Det er utfordrende å undersøke maps aktivitet på romlig proksimale arrayer i celler, på grunn av begrensningene i romlig oppløsning i lysmikroskopi, spesielt i områder med høy mikrotubul tetthet. Videre hindrer tilstedeværelsen av flere MAPer i samme cellulære region tolkninger av cellebiologiske studier. In vitro rekonstitueringsanalyser, utført i forbindelse med TOTAL Internal Reflection Fluorescence (TIRF) mikroskopi, omgår utfordringene med å undersøke mekanismer der spesifikke undergrupper av MAPer regulerer dynamikken i proksimale cellulære mikrotubule arrayer. Her undersøkes dynamikken i mikrotubuler samlet in vitro i nærvær av en eller flere rekombinante MAPer under kontrollerte forhold8,9,10. Konvensjonelle rekonstitueringsanalyser utføres imidlertid vanligvis på enkle mikrotubuler eller på en type matrise, noe som utelukker visualiseringen av samtidige populasjoner.
Her presenterer vi in vitro rekonstitueringsanalyser som muliggjør samtidig visualisering av to mikrotubulpopulasjoner under de samme løsningsbetingelsene11. Vi beskriver en metode for samtidig å se den kollektive aktiviteten til flere MAPer på enkeltmikrotubuler og på mikrotubulbunter krysskoblet av det mititotiske spindel-assosierte proteinet PRC1. Proteinet PRC1 binder seg fortrinnsvis ved overlappingen mellom anti-parallelle mikrotubuler, krysskobler dem9. Kort sagt består denne protokollen av følgende trinn: (i) fremstilling av lagerløsninger og reagenser, (ii) rengjøring og overflatebehandling av deksler som brukes til å lage bildekammeret for mikroskopiforsøk, (iii) fremstilling av stabile mikrotubule "frø" hvorfra polymerisasjon initieres under eksperimentet, (iv) spesifikasjon av TIRF mikroskopinnstillinger for å visualisere mikrotubuldynamikk, (v) immobilisering av mikrotubule frø og generering av krysskoblede mikrotubule bunter i bildekammeret, og (vi) visualisering av mikrotubuldynamikk i bildekammeret gjennom TIRF-mikroskopi, ved tilsetning av løselig tubulin, MAPer og nukleotider. Disse analysene muliggjør kvalitativ evaluering og kvantitativ undersøkelse av MAP lokalisering og deres effekt på dynamikken i to mikrotubule populasjoner. I tillegg legger de til rette for evaluering av synergistiske effekter av flere MAPer på disse mikrotubule populasjonene, på tvers av et bredt spekter av eksperimentelle forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered reagenser
- Klargjør buffere og reagenser som beskrevet i tabell 1 og tabell 2. Under eksperimentet, hold alle løsninger på is, med mindre annet er angitt.
| Løsning | Komponenter | Anbefalt lagringsvarighet | Notater | ||
| 5X BRB80 | 400 mM K-RØR, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, pH 6,8 med KOH, filtrer steriliser | opptil 2 år | Oppbevars ved 4 °C | ||
| 1X BRB80 | 80 mM K-RØR, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 | opptil 2 år | Oppbevars ved 4 °C | ||
| BRB80-DTT | 1X BRB80, 1 mM DTT | opptil 2 dager | |||
| Analysebuffer | 80 mM K-RØR, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8, 5% sukrose (OR 1X BRB80, 5% sukrose, 2 mM MgCl2) | opptil 1 år | Oppbevars ved 4 °C | ||
| Hovedbuffer (MB) | Analysebuffer, 5mM TCEP | 1 uke | Forbered deg på eksperimentdagen; Separat i to rør: MB-varm ved romtemperatur og MB-kald på is; inkluderer 1 mM DTT ved bruk av fluorescerende fargestoffer | ||
| Hovedbuffer med MethylCellulose (MBMC) | 1X BRB80, 0,8% metylcellulose, 5 mM TCEP, 5 mM MgCl2 | 1 uke | Forbered deg på eksperimentdagen; inkluderer 1 mM DTT ved bruk av fluorescerende fargestoffer | ||
| Proteinfortynningsbuffer (DB) | MB, 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA), 1 μM ATP | 1 dag, på is | Forbered deg på eksperimentdagen; inkluderer 1 mM DTT ved bruk av fluorescerende fargestoffer | ||
| Oksygenoppfinnende blanding (OSM) | MB, 389 μg/ml katarase, 4,44 mg/ml glukoseoksidase, 15,9 mM 2-mercaptoetanol (BME) | 1 dag, på is | Forbered deg på eksperimentdagen | ||
| Endelig oksygenfanging (OSF) | MB, 350 μg/ml katarase, 4mg/ml glukoseoksidase, 14,3 mM BME, 15 mg/ml glukose | bruk innen 30 min | Forbered umiddelbart før bruk ved å tilsette 1 μL glukose til 9 μL OSM | ||
Tabell 1: Liste over buffere som brukes i denne protokollen og deres komponenter. Se kolonnen Anbefalt lagringsvarighet hvis du vil ha veiledning om hvor langt i forveien hver buffer kan utarbeides.
| Reagent | Konsentrasjon av lagring | Oppbevaringsløsningsmiddel | Lagringstemperatur | Arbeidskonsentrasjon | Endelig konsentrasjon | Anbefalt lagringsvarighet | Notater | |||||||||
| Neutravidin (NA) | 5 mg/ml | 1X BRB80 | -80°C | 0,2 mg/ml | 0,2 mg/ml | opptil 1 år | Brukes til å immobilisere mikrotubuler via en biotin-neutravidin-biotin linkage; lagre i små aliquots | |||||||||
| Kappa-kasein (KC) | 5 mg/ml | 1X BRB80 | -80°C | 0,5 mg/ml | 0,5 mg/ml | opptil 2 år | Brukes til å blokkere bildekammerets overflate; Lagre i små aliquots; På eksperimentdagen setter du et lite volum til side ved romtemperatur | |||||||||
| Bovine serum albumin (BSA) | 50 mg/ml | 1X BRB80 | -20°C | 1 mg/ml (i DB) | N/A | opptil 2 år | lagre i små aliquots | |||||||||
| Catalase | 3,5 mg/ml | 1X BRB80 | -80°C | 350 μg/ml (i OSF) | 35 μg/ml | opptil 2 år | komponent av oksygen scavenging blanding; lagre i små aliquots | |||||||||
| Glukoseoksidase | 40 mg/ml | 1X BRB80 | -80°C | 4 mg/ml (i OSF) | 0,4 mg/ml | opptil 2 år | komponent av oksygen scavenging blanding; lagre i små aliquots | |||||||||
| Tubulin | Lyofilisert | N/A | 4°C | 10 mg/ml | 2,12 mg/ml (i tubulinblanding) | opptil 1 år | Når tubulin er i løsning, hold det kaldt for å unngå polymerisering. | |||||||||
| Adenosin Triphosphate (ATP) | 100 mM | ultrarent vann | -20°C | 10 mM | 1 mM | 6 måneder | Forbered oppløsningen i filtersterilisert vann, juster pH til ~7,0, og frys i små aliquots. | |||||||||
| Guanosin Triphosfat (GTP) | 100 mM | ultrarent vann | -20°C | 10 mM | 1,29 mM (i tubulinblanding) | 6 måneder | Forbered oppløsningen i filtersterilisert vann, juster pH til ~7,0, og frys i små aliquots. | |||||||||
| Guanosin-5'-[(α,β)-metyleno] tripfosfat (GMPCPP) | 10 mM | ultrarent vann | -20°C | 10 μM | 0,5 μM | 6 måneder | ||||||||||
| Dithiothreitol (DTT) | 1 M | sterilt vann | -20°C | 1 mM | N/A | opptil 2 år | ||||||||||
| Tris(2-karboksyetyl) fosfin (TCEP) | 0,5 M | filtersterilisert vann | Romtemperatur | 5 mM | N/A | opptil 2 år | ||||||||||
| Metylcellulose | 1% | sterilt vann | Romtemperatur | 0,8 % (i MBMC) | 0,21 % (i tubulinblanding) | opptil 1 år | Løs opp metylcellulose ved å sakte legge den til nesten kokende vann. La det avkjøles under omrøring kontinuerlig. | |||||||||
| Beta-mercaptoetanol (BME) | 143 mM | sterilt vann | Romtemperatur | 14,3 mM (i OSF) | 1,43 mM | opptil 5 år | 143 mM er en 1:100 fortynning av lager BME | |||||||||
| Glukose | 150 mg/ml | 1X BRB80 | -80°C | 15 mg/ml (i OSF) | 1,5 mg/ml | opptil 2 år | Legg til OSM umiddelbart før bruk | |||||||||
| (±)-6-Hydroksy-2,5,7,8-tetrametylkromatan-2-karboksylsyre (Trolox) | 10mM | 1X BRB80 | -80°C | 10 mM | 1 mM | opptil 1 år | Oppløses ikke helt. Tilsett naoh, rør i ca 4 timer, og filtrer steriliser før bruk | |||||||||
| mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5000 | pudder | N/A | -20°C | 333 mg/ml (i 0,1 M natriumbikarbonat) |
324 mg/ml (i 0,1 M natriumbikarbonat) |
6 måneder | Forbered ~34 mg aliquots, og hvert rør med en nøyaktig vekt av pulver. Før nitrogengass over de faste tetningsrørene med parafilm, og oppbevar den ved -20 °C i en beholder med tørkemiddel. | |||||||||
| Biotin-PEG-SVA, MW 5000 | pudder | N/A | -20°C | 111 mg/ml (i 0,1 M natriumbikarbonat) |
3,24 mg/ml (i 0,1 M natriumbikarbonat) | 6 måneder | Forbered ~3 mg aliquots, og hvert rør med en nøyaktig vekt av pulver. Før nitrogengass over de faste tetningsrørene med parafilm, og oppbevar den ved -20 °C i en beholder med tørkemiddel. | |||||||||
Tabell 2: Liste over reagenser som brukes i denne protokollen. Inkludert er de anbefalte lagringsforholdene og konsentrasjonene, arbeidskonsentrasjoner av lagerløsninger som brukes under eksperimentet, og endelig konsentrasjon i bildekammeret. Tilleggsmerknader er gitt i kolonnen helt til høyre.
2. Forbered Biotin-PEG lysbilder
MERK: Forbered bildekamrene så nær starten av et eksperiment som mulig, og ikke mer enn 2 uker i forveien.
- Rene deksler
- Plasser et likt tall på henholdsvis 24 x 60 mm og 18 x 18 mm #1,5 deksler (figur 1F) i skyveglass og skyvevaskstativer (figur 1A,B). Plasser skyvevaskestativene som inneholder 18 x 18 mm deksler i et 100 ml beger.
- Skyll alle deksler 5-6 ganger i ultrarent vann (18,2 MΩ-cm resistivitet) og fjern overflødig væske etter hver skylling med en pipettespiss festet til et vakuumrør (figur 1C).
- Fyll beger og skyveflekker som inneholder dekslene med ultrarent vann, tetning med parafilm og soniker i 10 minutter.
- Fyll to 150 ml beger med 200-bevis etanol. Bruk pinsett, dypp hvert deksle i ett beger fylt med etanol, og deretter den andre.
- Bruk pinsett, overfør deksler til glidetørkestativet (figur 1D), tørk dem under nitrogengassstrøm og inkuber ved 37 °C til de er helt tørre (~15 min).
- Plasser de tørkede dekslene i et enkelt lag inne i plasmarenseren. Form støvsugerforsegling, og sett deretter radiofrekvensnivået (RF) på plasmarenseren til ~ 8 MHz.
- Når plasmaet er generert, la dekslerlips i plasmarenser i 5 min. Slå av plasmarenseren og slipp støvsugeren langsomt.
- Når vakuumtetningen er sluppet, snur du dekslene og gjentar plasmarengjøringen i 5 minutter for den andre siden av dekslene.
- Alternativ til plasmarengjøring: I stedet for trinn 2.1.2-2.1.3, sonicate dekslerlips i en varm løsning av 2% vaskemiddel (i ultrapure vann) i 10 min. Vask deretter dekslene grundig med ultrarent vann og soniker i ultrarent vann 2-3 ganger (10 min hver). Vask deretter i etanol og tørk som i trinn 2.1.4-2.1.5. Hopp over trinn 2.1.6-2.1.8.
- Biotin-PEG behandling
- Umiddelbart før bruk oppløses 400 μL 3-Aminopropyltriethoxysilane i 40 ml aceton. Bruk pinsett til å flytte plasmarensede deksler inn i glidevaskestativet og skyveglassene. Nedsenket deksler i 3-Aminopropyltriethoxysilane løsning og inkubere i 5 min12,13.
- Vask alle deksler 5-6 ganger med ultrarent vann.
- Overfør deksler til glidetørkestativet, tørk dem under en nitrogengassstrøm og inkuber ved 37 °C til de er helt tørre (~20 min).
- Legg de tørkede dekslene på delikate oppgaveservietter og merk hvert deksle på ett hjørne, for eksempel 'p' på hver 18 x 18 mm dekslelip og 'b' på hver 24 x 60 mmlip (se figur 2).
- På eksperimentets dag, lag en frisk 0,1 M natriumbikarbonatoppløsning ved å oppløse 0,84 mg NaHCO3 i 10 ml ultrarent vann.
- Ta med aliquots av mPEG-Succinimidyl Valerate (PEG-SVA) og Biotin-PEG-SVA til romtemperatur, umiddelbart før bruk. Se merknader om polyetylenglykol (PEG) aliquotpreparat i tabell 2.
MERK: Arbeid raskt fordi hydrolyse halveringstiden til Succinimidyl Valerate (SVA) moiety er ~ 30 min. - Tilsett 102 μL 0,1 M NaHCO3 til 34 mg PEG-SVA, spinn i en mikrosentermikrosenter på 2656 x g i 20 s, og bland deretter ved å pipettere opp og ned. Løs opp 3 mg Biotin-PEG-SVA i 27 μL 0,1 M NaHCO3 ved å pipettere opp og ned. Juster fortynningsvolumene i henhold til den nøyaktige vekten av PEG som er notert på rørene (se tabell 2).
- Forbered 100:1 m/w PEG:biotin-PEG-blanding ved å kombinere 75 μL PEG-SVA-oppløsning og 2,25 μL Biotin-PEG-SVA-oppløsning for 20 deksler, 100 μL og 3 μL for 30 deksler, eller 125 μL og 3,75 μL for 40 deksler.
- Konstruer et hydreringskammer ved å plassere våte papirhåndklær under spissstativet nederst i en tom 10 μL-spissboks (figur 1E). Dette vil forhindre fordampning av PEG-løsningene.
- Pipette 6 μL 100:1 PEG-SVA:biotin-PEG-blanding på midten av en 24 x 60 mm dekslerlip på den merkede siden. Plasser ytterligere 24 x 60 mm deksler på toppen av den første dekslen slik at paret danner en X-form, med sidene merket 'b' vendt mot hverandre. Plasser paret på et tomt spissstativ i hydreringskammeret og gjenta for de resterende 24 x 60 mm dekslene.
- Pipette 6 μL PEG-SVA på midten av en 18 x 18 mm dekslelip på den merkede siden. Plasser ytterligere 18 x 18 mm deksler på toppen av den første dekslen, med sidene merket 'p' vendt mot hverandre. Plasser paret på et tomt spissstativ i hydreringskammeret og gjenta for de resterende 18 x 18 mm dekslene.
- Lukk hydreringskammeret og inkuber i 3 timer eller over natten.
- Skill parene med deksler og skyll i ultrarent vann.
- Tørre dekslerlips med en nitrogenstrøm og legg dem i en 37 °C inkubator for å tørke helt.
- For å konstruere bildekammeret, fest tre strimler med dobbeltsidig tape på en 24 x 60 mm dekslelip på siden merket 'b'. På den andre siden av båndstrimlene fester du en 18 x 18 mm deksleslip med siden merket 'p' vendt mot den større dekslen. Dette danner to strømningskamre for mikroskopiforsøk, med behandlede overflater vendt mot hverandre (figur 2 og figur 1G).
Figur 1: Utstyr for tiltrekksbehandling og klargjøring av bildekammer. (A) skyveglass for 24 x 60 mm deksler, (B) skyvevaskestativer for 18 x 18 mm deksler, (C) vakuumoppsett, (D) skyvetørkestativ, (E) hydreringskammer, (F) deksler, (G) bildekammer, (H) skyveholder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk for fremstilling av bildekamre ved hjelp av dobbeltsidig tape (grå) og PEG/Biotin-PEG-behandlede deksler. Opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Polymeriser mikrotubuler
- Forbered GMPCPP frø
MERK: Forbered GMPCPP frø i et kaldt rom, og hold alle reagenser, tips og rør ved 4 °C. GMPCPP frø kan tilberedes på forhånd og lagres ved -80 °C i opptil 1 år. Plasser ultrasenterrotoren med fast vinkel, som inneholder 1 ml sentrifugerør, i ultracentrifuge og sett temperaturen til 4 °C.- Resuspend lyofilisert tubulin (tabell 2) til ~10 mg/ml i 1X BRB80, umiddelbart før bruk.
- Bland komponenter av GMPCPP frø som beskrevet i tabell 3.
MERK: Hold alle tubulinkomponenter på is så mye som mulig for å minimere polymeriseringen av løselig tubulin. - Avklar blandingen i en ultracentrifuge-rotor med fast vinkel ved 352 700 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Del supernatanten inn i 5 μL aliquots, klikk frys dem i flytende nitrogen, og lagre dem ved -80 °C.
- Polymeriser frø på eksperimentets dag
- Varm 1-2 ml BRB80-DTT (tabell 1) til 37 °C.
- Plasser 5 μL aliquot av GMPCPP frø (-80 °C) fra trinn 3.1.4 på is og oppløses umiddelbart i 20 μL varm BRB80-DTT. Spinn på 2000 x g i 5 s ved romtemperatur og trykk for å blande.
MERK: Det første fortynningsvolumet kan variere mellom 13 μL og 21 μL og bestemmes empirisk for hver gruppe frø. Hvis frø ikke polymeriseres, kan du feilsøke ved å supplere den første fortynningsbufferen (trinn 3.2.2) med 0,5 μM GMPCPP. - Beskytt mot lys og inkuber ved 37 °C i 30–45 minutter.
MERK: Lengden på mikrotubulene avhenger av inkubasjonsvarigheten. For korte mikrotubuler kan inkubasjonstiden være så kort som 15 min. For lange mikrotubuler kan inkubasjonstiden være så lang som 2 timer. Biotinylerte mikrotubuler har en tendens til å kreve lengre inkubasjonstider enn ikke-biotinylerte mikrotubuler. - Plasser ultrasenterrotor med fast vinkel, som inneholder 500 μL sentrifugerør, i ultracentrifuge og forvarm til 30 °C.
- Etter inkubasjon, tilsett 50 μL varm BRB80-DTT (trinn 3.2.1) til polymeriserte GMPCPP frø og overfør blandingen til et 500 μL sentrifugerør. Vask det tomme røret som inneholdt GMPCPP-frøene med ytterligere 50 μL varm BRB80-DTT, pipette opp og ned, og legg til denne bufferen til 500 μL sentrifugerøret som inneholder blandingen.
- Før du snurrer, merk kanten på sentrifugerøret for å indikere hvor pelletsen vil være (pelletsen vil være for liten til å se). Spinn i 10 min ved 244 900 x g ved 30 °C12.
- Rør forsiktig ut supernatanten og kast den. Resuspend pellet i 100 μL varm BRB80-DTT. Trykk for å blande.
- Spinn i 10 min ved 244 900 x g ved 30 °C, og juster markeringen med rotoren slik at pelletsen er på samme sted.
- Fjern supernatanten og resuspend pellet i 16 μL varm BRB80-DTT. Overfør mikrotubulløsningen til et rent 0,6 ml mikrosenterrør. Beskytt mot lys og hold ved eller over romtemperatur.
MERK: Hold mikrotubuler ved eller over romtemperatur etter polymerisering. Hvis de blir kalde, vil de depolymerisere. Inkuber ved 28 °C for økt stabilitet.
- Sjekk mikrotubuler via TIRF mikroskopi
- Pipette en blanding av 4,5 μL BRB80-DTT og 1 μL mikrotubuloppløsning (trinn 3.2.9) på et mikroskopsklie. Dekk med en 18 x 18 mm dekslerlip og forsegle kantene med enten klar neglelakk eller en 1:1:1 blanding av petrolatum, lanolin og paraffin (valap tetningsmasse), som er solid ved romtemperatur og væske ved 95 °C.
- Plasser TIRF-målet under dekslene (se trinn 4 for anbefalte mikroskopinnstillinger) og visualiser de nylig polymeriserte mikrotubulene ved bølgelengde som passer for fluorescerende merket tubulin i Bright mix (tabell 3), for å bestemme hvilken fortynning av mikrotubuler som skal brukes i de kommende forsøkene.
| Reagent | Lys blanding (μL) | Rekkefølge av tillegg | Lys blanding + biotin (μL) | Rekkefølge av tillegg |
| Fluorescerende tubulin, 10 mg/ml | 2 | 6 | 2 | 7 |
| Biotin-tubulin, 10 mg/ml | 0 | N/A | 2 | 6 |
| Umerket tubulin, 10 mg/ml | 20 | 5 | 18 | 5 |
| GMPCPP, 10 mM | 30 | 4 | 30 | 4 |
| DTT, 0,2 M | 0.7 | 3 | 0.7 | 3 |
| 5X BRB80 | 26.4 | 2 | 26.4 | 2 |
| sterilt vann | 52.9 | 1 | 52.9 | 1 |
| Totalt volum (μL) | 132 | 132 |
Tabell 3: GMPCPP frøblanding. Komponenter av GMPCPP mikrotubule frø, inkludert volum og rekkefølge av addisjon. Forbered 5 μL aliquots og oppbevar i opptil 1 år ved -80 °C.
4. Innstillinger for mikroskop
- Temperatur: Sett mikroskoptemperaturen til 28 °C for å vise dynamiske mikrotubuler.
- Filtre: Bruk den beste kombinasjonen av filterkuber og utslippsfiltre, avhengig av fluorescerende kanaler som skal avbildes. For å visualisere bølgelengder på 488 nm, 560 nm og 647 nm i samme eksperiment, bruk et 405/488/560/647 nm Laser Quad Band Set, kombinert med utslippsfiltre for de angitte bølgelengdene.
- Juster lasere: Kontroller at laserstrålene som brukes i eksperimentet, er justert. Bestem laserintensiteten for eksperimentet empirisk, slik at alle fluorescerende proteiner kan avbildes med høyest mulig signal-til-støy-forhold, men ikke gjennomgå betydelig fotobleaching i løpet av eksperimentet.
- Hensikt: Bruk linsepapir til å rengjøre et mål på 100x med 70 % etanol. Før avbildning, legg til en dråpe mikroskop nedsenkningsolje til målet.
- Sette opp en bildesekvens
- For et eksperiment med 647 nm fluorofor-merkede biotinylerte mikrotubuler, 560 nm fluorofor-merket ikke-biotinylerte mikrotubuler og løselig tubulin, og GFP-merket protein av interesse, bilde i 20 min. Se for deg 560 nm- og 488 nm-kanalene hver 10.
- For å fange et referansebilde av bunter før du legger til løselige tubulin- og MAPer, sett opp en sekvens med ett bilde hver i 560 nm og 647 nm bølgelengder.
5. Generer overflate-immobiliserte mikrotubulbunter
MERK: For følgende trinn, flyt alle løsninger inn i et strømningskammer ved å pipettere inn i den ene åpne siden, mens du plasserer et filterpapir mot den andre siden. Beskytt bildekammeret mot lys for å redusere fotobleking av fluorescerende merkede proteiner. Tape det forberedte bildekammeret til en skyveholder (figur 1G,H). Følg trinnene i tabell 4, som tilsvarer protokollsteps 5.2-6.4.
- Forbered løselig tubulinblanding i henhold til tabell 5 og hold den på is.
MERK: Løselig tubulin må alltid plasseres på is for å forhindre polymerisering. Forbered en frisk løselig tubulinblanding omtrent hver annen time, eller når mikrotubuler ikke lenger polymeriserer. - For å immobilisere mikrotubuler via en biotin-neutravidin-biotin linkage, første strømning i Neutravidin (NA) løsning til kammeret er fylt (~ 7,5 μL) og inkubere i 5 min.
- Vask med 10 μL MB-kald.
- Strømning i 7,5 μL av det blokkerende proteinet κ-casein (KC) og inkuber i 2 min.
- Vask med 10 μL MB-varm for å forberede kammeret for innføring av mikrotubuler.
- Fortynn bestanden av biotinylerte mikrotubuler (i henhold til observasjoner i trinn 3.3.2) i 1X BRB80-DTT og tilsett 1 μL av denne fortynning til 9 μL MB-varm. Strømning blandingen inn i kammeret og inkuber i 10 min. Bruk en høyere konsentrasjon av mikrotubuler for flere bunter.
- Vask bort ikke-immobiliserte mikrotubuler med 10 μL MB-varm.
- Strømning 7,5 μL varm KC inn i kammeret og inkuber i 2 min.
- Under inkubasjonen, lag en 2 nM-løsning av krysskoblingsproteinet PRC1 i varm KC. Strømning 10 μL av denne løsningen inn i strømningskammeret og inkuber i 5 min.
MERK: Rekombinant PRC1 uttrykkes og renses fra bakterieceller som tidligere beskrevet13. - For å lage bunter vil strømning 10 μL ikke-biotinylerte mikrotubuler inn i kammeret og inkubere i 10 min. PRC1 vil krysskoble de ikke-biotinylerte og immobiliserte biotinylerte mikrotubulene15,16 (figur 3).
MERK: Se trinn 6.1 for klargjøring av analyseblandingen under inkubasjonstiden. - Vask kammeret to ganger med 10 μL MB-varm. De vedlagte mikrotubulene er stabile i rundt 20 minutter fra dette punktet.
| Skritt | Reagent | Volum (μL) | Inkubasjonstid (minutter) |
| 1 | Neutravidin | 7.5 | 5 |
| 2 | MB-kald | 10 | - |
| 3 | κ-casein | 7.5 | 2 |
| 4 | MB-varm | 10 | - |
| 5 | Biotinylert mikrotubul (fortynnet i MB-varm) | 10 | 10 |
| 6 | MB-varm | 10 | - |
| 7 | Varm κ-casein | 7.5 | 2 |
| 8 | 2 nM PRC1 fortynnet i κ-casein | 10 | 5 |
| 9 | Ikke-biotinylert mikrotubul | 10 | 10 |
| 10 | MB-varm x 2 | 10 | - |
| 11 | Analyseblanding | 10 | - |
| Vedlagte frø er stabile i rundt 20 minutter på dette tidspunktet | |||
Tabell 4: Analysetrinn. Liste over reagenser lagt til bildekammeret, med indikasjon på vask (-) eller inkubasjonstid.
| Reagent | Volum (μL) |
| Resirkulert tubulin, 10 mg/ml | 10 |
| MB-kald | 10.3 |
| MBMC | 13.7 |
| BRB80-DTT | 3.4 |
| GTP, 10 mM | 6.7 |
| ATP, 10 mM (Hvis du bruker kinesiner) |
6.7 |
| Fluorescerende merket tubulin, 10 mg/ml |
1 (Resuspend lyofilisert merket tubulin i kald BRB80-DTT) |
Tabell 5: Løselige tubulinblandingskomponenter. Bland i begynnelsen av eksperimentet og hold på is.
Figur 3: Skjematisk for tilsetning av analysekomponenter for å lage og bilde fluorescerende merkede bunter og enkle mikrotubuler. Biotinylerte frø er vist i blå, ikke-biotinylerte frø og løselig tubulin i rødt, PRC1 i svart og protein av interesse for cyan. Trinntall i figur tilsvarer tallene i tabell 4. Panel som tilsvarer trinn 9 viser en forhåndsformet bunt (nederst til venstre); trinn 11 viser en nyopprettet bunt (øverst til venstre). Opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
6. Bilde mikrotubule dynamikk
- I løpet av 10 min inkubasjonstid i trinn 5.10, lag 10 μL analyseblanding som inneholder proteiner av interesse, løselig tubulin, nukleotider, oksygenfangere14 og antioksidanter i henhold til tabell 6. Hold blandingen på is.
- Legg det forberedte bildekammeret, teipet til skyveholderen, på 100x TIRF-målet. Bruk 560 nm og 647 nm kanaler for å finne et synsfelt som inneholder et optimalt antall og tetthet av enkelt mikrotubuler og bunter.
MERK: Hvis både biotinylerte og ikke-biotinylerte mikrotubuler er merket med samme fluorofor, kan linjeskanningsanalyser av fluorescensintensiteter skille mellom enkeltmikrotubuler og bunter. - Når et synsfelt er identifisert, tar du et referansebilde.
- Strømning forsiktig i analyseblandingen uten å forstyrre bildekammeret.
- Forsegle de åpne endene av kammeret med valap tetningsmasse.
- Start bildesekvensen som beskrevet i trinn 4.5.1.
| Reagent | Volum (μL) |
| Løselig tubulinblanding | 4 |
| OSF | 1 |
| Trolox (hvis du bruker mikrotubuler merket med en lett-fotobleaching fluorofor) | 1 |
| ATP, 10 mM (Hvis du bruker kinesiner) |
1 |
| Prc1 (eller crosslinker av valg) | 1 |
| Proteiner av interesse | X |
| MB-kald | 2-X |
Tabell 6: Analyseblandingskomponenter. Bland, flyt inn i bildekammer og bildemikrotubuldynamikk innen 30 minutter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksperimentet beskrevet ovenfor ble utført ved hjelp av 647 nm fluorofor-merkede biotinylerte mikrotubuler, 560 nm fluorofor-merket ikke-biotinylerte mikrotubuler og 560 nm fluorofor-merket løselig tubulinblanding. Mikrotubuler ble krysskoblet av krysskoblingsproteinet PRC1 (GFP-merket). Etter at overflate-immobiliserte bunter og enkeltmikrotubuler ble generert (trinn 5.11), ble bildekammeret montert på et TIRF 100X 1.49 NA oljemål og sett i 560 nm og 647 nm fluorescenskanaler. Enkeltmikrotubuler ble identifisert av deres fluorescenssignal i 647 nm-kanalen. Mikrotubuler med fluorescenssignaler i begge kanaler ble identifisert som forhåndsformede bunter (figur 4). Hvis eksperimenter utføres med biotinylerte og ikke-biotinylerte mikrotubuler med samme fluorescerende etikett, vil påviste fluorescensintensiteter for bunter være rundt to ganger eller høyere enn for enkle mikrotubuler. Basert på andelen og tettheten til hver befolkning, kan konsentrasjonen av mikrotubulfrø i trinn 5,6 og 5,10 optimaliseres.
Figur 4: Identifisering av enkeltmikrotubuler og krysskoblede mikrotubuler innen synsfeltet. Representativt synsfelt som viser 647 nm (venstre), 560 nm (midten) og sammenslåtte (høyre) kanaler. Enkle mikrotubuler (gule pilspisser) og bunter (hvite pilspisser) er angitt i den sammenslåtte kanalen. Skalalinjen representerer 2 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Dynamikk i enkeltmikrotubuler og PRC1-krysskoblede bunter. Representativ video som viser mikrotubuldynamikk, med 647 nm fluorofor-merkede biotinylerte mikrotubulefrø (blå), 560 nm fluorofor-merket ikke-biotinylerte mikrotubulefrø og 560 nm fluoroforemerket løselig tubulin (rød) og GFP-merket PRC1 (grønn). Enkle og krysskoblede mikrotubuler er indikert med henholdsvis hvite og gule piler. Filmen ble spilt inn over 10 minutter (61 bilder) og vist med en hastighet på 12 bilder/sekund. Analyseforhold: 0,5 nM GFP-PRC1, 50 mM KCl og 37 °C. Skalalinje: 5 μm. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Når en bildesekvens er anskaffet, analyserer du videoen for å sikre at mikrotubulene er dynamiske (video 1). Juster analysekomponenter (tubulinvolum i løselig tubulinblanding, nukleotidlagre, proteinkonsentrasjoner) i henhold til observasjoner. For eksempel, hvis mikrotubuler ikke polymeriserer, øker konsentrasjonen av løselig tubulin og / eller GTP i løselig tubulinblanding. På samme måte øker arbeidskonsentrasjonen av fluorescerende merkede MAPer hvis de ikke er synlige på mikrotubuler, og reduserer konsentrasjoner hvis deres bakgrunnsfluorescensintensitet innen synsfeltet er sammenlignbar med deres intensitet på mikrotubuler. Ved visualisering av motile motorproteiner, øk ATP-konsentrasjonen hvis motorer ikke viser motilitet på mikrotubuler. Juster laserintensiteten for eksitasjonskanalene som tilsvarer mikrotubul fluorescens for å sikre at forskjeller i fluorescensintensitet mellom enkle mikrotubuler og bunter kan fanges opp innenfor detektorens dynamiske område.
Video 2: Forskjeller i dynamikken i enkeltmikrotubuler og PRC1-krysskoblede bunter i nærvær av to MAPer: CLASP1 og Kif4A. Representativ video som viser mikrotubuldynamikk, med 647 nm fluorofor-merkede biotinylerte mikrotubulefrø (blå) og 560 nm fluorofor-merkede ikke-biotinylerte mikrotubulefrø og 560 nm fluorofor-merket løselig tubulin (rød). Enkle og krysskoblede mikrotubuler er indikert med henholdsvis hvite og gule piler. Filmen ble spilt inn over 20 min (121 bilder) og vist med en hastighet på 20 bilder/ sekund. Analysebetingelser: 200 nM CLASP1-GFP, 0,5 nM PRC1 og 10 nM Kif4A. Skala bar: 2 μm. Videoen gjengis fra referanse11. Klikk her for å laste ned denne videoen.
I det representative eksemplet som vises i Video 2, vises et synsfelt som inneholder enkle mikrotubuler og krysskoblede bunter. Det er funnet at under disse analyseforholdene (analyseblanding som inneholder 0,5 nM PRC1, 50 mM KCl og MASTER av interesse: 200 nM GFP-merket CLASP1, 10 nM Kinesin Kif4A), enkle mikrotubuler forlenges i løpet av analysen, mens veksten av krysskoblede mikrotuber stoppes.
For kvantitativ analyse av mikrotubuldynamikk, åpne mikroskopifiler i FIJI-programvaren, og velg enkle mikrotubuler og bunter for analyse. Bruk følgende kriterier for å utelukke enkle mikrotubuler og bunter fra videre analyse: utelukke mikrotubuler eller bunter (i) som finnes på kantene av synsfeltet, (ii) skjult av proteinaggregater, eller (iii) hvis filamenter beveger seg i z-retningen ut av TIRF-området. Parametere for mikrotubuldynamikk, for eksempel lengde, vekstrate, redningsfrekvens og katastrofefrekvens, kan oppnås ved å konstruere og analysere kymografer for hvert enkelt mikrotubule- eller mikrotubulpar11,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksperimentet beskrevet her utvider omfanget og kompleksiteten til konvensjonelle mikrotubul rekonstitueringsanalyser, som tradisjonelt utføres på enkeltmikrotubuler eller på en type array. Den nåværende analysen gir en metode for samtidig å kvantifisere og sammenligne den regulatoriske MAP-aktiviteten på to populasjoner, nemlig enkle mikrotubuler og krysskoblede bunter. Videre tillater denne analysen undersøkelse av to typer bunter: de som er forhåndsformet fra stabile frø før oppstart av dynamikk, og de som nylig dannes når to voksende ender møter hverandre og blir krysskoblet (figur 3). Videre, i tillegg til konvensjonelle eksperimentelle variabler, som proteinkonsentrasjoner og bufferforhold, muliggjør disse analysene evalueringen av effektene av geometriske egenskaper av mikrotubule arrays, for eksempel lengder og vinkler mellom tilstøtende filamenter i en bunt, som fremstår som viktige determinanter for mikrotubuldynamikk og MAP-aktivitet16.
For å utvide denne eksperimentelle metoden for in vitro-rekonstituering av flere mikrotubulebaserte strukturer, må følgende viktige problemer løses: (i) PRC1 krysskobler fortrinnsvis mikrotubuler som er orientert mot hverandre. Mens slike bunter finnes på cellesenteret under mitose, er bunter av parallelle mikrotubuler et vanlig trekk i andre mikrotubulebaserte strukturer innen nevronale axoner og den mitotiske spindelen. Protokollen beskrevet ovenfor kan enkelt tilpasses for å generere krysskoblede parallelle mikrotubuler ved hjelp av rekombinante krysskoblinger som Kinesin-1 og TRIM4610,17. (ii) I disse rekonstitueringsanalysene kan forskjeller i fluorescensintensitet brukes til å skille mellom enkeltmikrotubuler og par mikrotubuler11,15. Under de eksperimentelle forholdene som brukes her, indikerer intensitetsanalyser at de fleste bunter inneholder to krysskoblede mikrotubuler, og linjeskanningsanalyser gir informasjon om deres relative posisjonering. Men når det er mer enn to eller tre filamenter i en bunt, hindrer den romlige oppløsningen av standard TIRF-baserte bildesystemer identifisering av endene og polariteten til individuelle mikrotubuler (~ 25 nm diameter)18. Videre, mens det er mulig å identifisere pluss endene av krysskoblede anti-parallelle mikrotubuler fra vekstretningen, er det hindret av den romlige oppløsningen av optisk mikroskopi å skille endene av krysskoblede parallelle mikrotubuler som vokser i samme retning. En forlengelse av eksperimentet som er beskrevet her er å bruke polaritetsmerkede mikrotubuler eller mikrotubule tip-bindende proteiner for å plassere individuelle mikrotubuler. For bunter med titalls mikrotubuler, som komplementerer den høye temporale oppløsningen til TIRF-baserte analyser med teknikker som har høy romlig oppløsning, for eksempel Atomic Force Microscopy19, lover å gi ny innsikt i dynamikken i individuelle mikrotubuler i en bunt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra NIH (nr. 1DP2GM126894-01), og av midler fra Pew Charitable Trusts og Smith Family Foundation til R.S. Forfatterne takker Dr. Shuo Jiang for hans bidrag til utvikling og optimalisering av protokollene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma Aldrich | 238813 | |
| 1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma Aldrich | P6757 | |
| 18x18 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63787 | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M-6250 | |
| 24x60 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| 405/488/560/647 nm Laser Quad Band | Chroma | TRF89901-NK | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 320110 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma Aldrich | A7699-5G | |
| Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®) | Thermo Fischer Scientific | A2666 | |
| Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner | Branson | CPX2800H | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343778 | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343776 | |
| Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | Laysan Bio | #Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 2905 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V | Corning | 6670 | |
| Delicate Task Wipes | Kimtech | 34120 | |
| Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT10 | |
| Emission filter | Chroma | ET610/75m | |
| Ethanol (200-proof) | Decon Labs | 2705 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 3777 | |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | G2133 | |
| GMPCPP | Jena Bioscience | NU-405 | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma Aldrich | G8877 | |
| Hellmanex III detergent | Sigma Aldrich | Z805939 | |
| Immersion oil, Type A | Fisher Scientific | 77010 | |
| Kappa-casein | Sigma Aldrich | C0406 | |
| Lanolin | Fisher Scientific | S25376 | |
| Lens Cleaning Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Methylcellulose | Sigma Aldrich | M0512 | |
| Microfuge 16 Benchtop Centrifuge | Beckman-Coulter | A46474 | |
| Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted | Globe Scientific | 1380-50W | |
| mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 | Laysan Bio | #NH2-PEG-VA-5K | |
| Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | 393315 | |
| Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
| PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers | Ted Pella | 5377-NM | |
| Petrolatum, White | Fisher Scientific | 18-605-050 | |
| Plasma Cleaner, 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1101 | |
| Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes | USA Scientific | 2520-0000 | |
| Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM | Thermo Fischer Scientific | PI-77720 | |
| TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective | Nikon | CFI Apochromat TIRF 100XC Oil | |
| TIRF microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| TLA 120.1 rotor | Beckman-Coulter | 362224 | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman-Coulter | 357656 | |
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton | T240 | |
| Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain | Cytoskeleton | T333P | |
| Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain | Cytoskeleton | TL670M | |
| Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain | Cytoskeleton | TL620M | |
| VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion | Vector Biolabs | SP-1800-7 | |
| VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A | VWR | 97025-630 |
References
- Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
- Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L.
- Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape. Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).
- Foe, V. E., von Dassow, G. Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation. The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).
- Pous, C., et al. Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells. The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).
- Uehara, R., Goshima, G. Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase. The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
- Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module. Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).
- Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
- Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Wijeratne, S., Subramanian, R. Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A. eLife. 7, 32595 (2018).
- Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization. eLife. 10, 63880 (2021).
- Freal, A., et al. Feedback-driven assembly of the axon initial segment. Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).
- Ledbetter, M., Porter, K. A "microtubule" in plant cell fine structure. The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).
- Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).
