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Biology

研究夜间人造光对自由放养动物影响的实验方法：实施，结果和未来研究的方向

Published: February 2, 2022 doi: 10.3791/63381
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1
1Department of Biology, Behavioural Ecology and Ecophysiology Group, University of Antwerp, 2Faculty of Social Sciences, Antwerp School of Education, University of Antwerp

Summary

夜间人造光（ALAN）具有广泛的生物效应。本文介绍了一种在监控行为时在巢箱内操作 ALAN 的系统，该系统由连接到电池、定时器和支持音频的红外摄像机的 LED 灯组成。 研究人员可以利用该系统来探索有关ALAN对生物体影响的许多悬而未决的问题。

Abstract

动物已经进化出光明和黑暗的自然模式。然而，人造光正越来越多地从人类基础设施和娱乐活动中引入环境。夜间人造光（ALAN）有可能对动物行为，生理学和适应性产生广泛影响，这可以转化为对种群和社区的更广泛影响。了解ALAN对自由放养动物的影响并非易事，因为存在诸如测量移动生物遇到的光照水平以及将ALAN的影响与其他人为干扰因素的影响区分开来等挑战。在这里，我们描述了一种方法，该方法使我们能够通过实验性地操纵巢箱内的光照水平来隔离人造光照射对个体动物的影响。为此，可以使用由附着在板上并连接到电池和定时器系统的发光二极管（LED）光组成的系统。该设置允许巢箱内的个体暴露在ALAN的不同强度和持续时间下，同时获得视频记录，其中还包括音频。该系统已被用于对自由放养的大山雀（Parus major）和蓝山雀（Cyanistes caeruleus）的研究，以深入了解ALAN如何影响成人的睡眠和活动模式以及发育雏鸟的生理学和端粒动力学。该系统或其适应性可用于回答许多其他有趣的研究问题，例如ALAN如何与其他干扰因子相互作用并影响生物能量平衡。此外，类似的系统可以安装在各种物种的巢箱，巢穴或洞穴中或附近，以操纵ALAN的水平，评估生物反应，并致力于建立种间视角。特别是当与其他监测自由生活动物的行为和运动的先进方法相结合时，这种方法有望为我们理解ALAN的生物学意义做出持续的贡献。

Introduction

动物已经进化出定义白天和黑夜的光明和黑暗的自然模式。因此，荷尔蒙系统中的昼夜节律协调休息和活动模式，并允许动物最大限度地提高健身1，2，3。例如，糖皮质激素中的昼夜节律在日常活动开始时达到峰值，通过对葡萄糖代谢和对环境应激源的反应，使脊椎动物在24小时内表现适当4。同样，在黑暗中释放的松果体激素褪黑激素与昼夜节律性的控制模式有关，并且还具有抗氧化特性5，6。昼夜节律性的许多方面的夹带，例如褪黑激素的释放，受到环境中光照水平的光接收的影响。因此，将人造光引入环境以支持人类活动，娱乐和基础设施有可能对自由放养动物的行为，生理和适应性产生广泛的影响7，8。事实上，夜间暴露于人造光（ALAN）的各种影响已被记录为9，10，并且ALAN已被强调为21世纪10年全球变化研究的优先事项。

由于多种原因，测量ALAN对自由放养动物的影响带来了不小的挑战。首先，在环境中移动的动物不断经历不同程度的光照。因此，如何量化单个动物暴露的光照水平？即使可以量化动物领地上的光照水平，动物也可能采用影响暴露模式的回避策略，从而要求同时跟踪动物的位置和光照水平。事实上，在大多数实地研究中，光照水平的平均值和变化是未知的11。其次，暴露于ALAN通常与暴露于其他人为干扰因素有关，例如噪声污染，化学品暴露和栖息地退化。例如，占据道路边缘栖息地的动物将暴露在路灯的光线，车辆交通的噪音和车辆排放的空气污染中。那么，如何有效地将 ALAN 的影响与混杂变量的影响隔离开来呢？能够对光照水平和反应变量进行良好测量的严格现场实验对于评估ALAN生物效应的严重程度以及制定有效的缓解策略至关重要11。

本文描述了一种实验方法，尽管并非没有限制（参见讨论部分），但有助于缓解（如果不是消除上述困难的话）。该方法需要使用发光二极管（LED）灯系统和安装在巢箱内的红外（IR）摄像机，在自由生活的昼夜鸟类大山雀（Parus major）的巢箱内实验性地操纵ALAN水平。该设置可以同时采集视频记录，包括音频，使研究人员能够评估对行为和发声的影响。大山雀利用巢箱繁殖，并在11月至3月期间睡在巢箱中。雌性在繁殖季节12期间也会睡在巢箱内。该系统也已在较小程度上用于研究ALAN对蓝山雀（Cyanistes caeruleus）的影响。第一个困难，涉及了解动物遇到的光照水平，由于个体愿意进入巢箱（或者在不动的雏鸟的情况下已经在巢箱中），光照水平可以由研究人员精确确定。第二个困难涉及与混杂变量的相关性，可以通过在类似环境中使用嵌套框和/或测量嵌套框附近混杂变量的水平来控制。此外，在空巢筑巢鸟类中，采用实验方法是强大的，因为巢箱或自然洞穴可以保护雏鸟和成虫免受ALAN13的影响，这也许可以解释为什么一些相关研究发现ALAN（或人为噪音）的影响很小14，而实验研究更经常发现明显的效果（见下文）。此外，可以采用重复测量实验设计，其中个体作为自己的控制，这进一步增加了统计能力和检测有意义的生物效应的概率。以下部分：（1）解释该系统的设计和实现的细节，（2）总结迄今为止使用该系统得出的重要结果，以及（3）提出未来可以在山雀和其他动物中追求的研究方向。

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Protocol

该系统在动物实验中的所有应用均已获得安特卫普大学伦理委员会的批准，并根据比利时和佛兰德法律进行。方法符合ASAB / ABS在行为研究中使用动物的指南。比利时皇家自然科学研究所（ Koninklijk Belgisch Instituut voor Natuurwetenschappen;KBIN）为所有研究人员和人员提供许可证。

1. 创建实验系统

  1. 获取用于创建 ALAN 的广谱 LED。从 LED 大灯取出 LED 灯。使用单个 LED 灯或多个（例如 4 个）广谱 LED 灯进行更漫射的照明（图 1）。
    注意：作为修改，可以使用具有不同光谱属性（例如，红色与蓝色）的LED，但必须从不同的来源获得（请参阅Grunst等人的补充材料201915 ，了解使用此系统的过去研究中使用的LED的光谱特性）。
  2. 设计一个系统，将LED与红外摄像头一起安装，以进行行为监控。研究人员可以通过多种方式实现这一目标。
    1. 备选案文1.将单个广谱 LED 分别插入巢箱中，塑料管与红外摄像机相邻，该摄像机用粘合剂安装在适合巢箱内的塑料或金属板上（图 1A、B）。
    2. 备选案文2.将红外摄像机安装在塑料或金属板上的中心位置，然后将LED灯安装在红外摄像机周围板上的固定位置（图1C）。
  3. 设计一种将系统连接到电源（电池）和定时器的方法。
    1. 使用刀或钻头在巢箱的侧面形成小树林，电线连接器可以通过这些小树林将系统连接到Fe电池（12 V;120 Wh）和自制计时器（12 V）。
    2. 设计一个深绿色的木制外壳，在颜色，长度和宽度上与巢箱相匹配（例如，过去研究中使用的巢箱的尺寸：120 mm x 155 mm x 250 mm），并且通过铰链的一侧开口来容纳电池，视频录像机和LED的定时器系统（图2; 补充图 1 和 补充图 2）。
  4. 设计一种调整 ALAN 强度的方法。
    1. 获取电阻（值取决于电池电压和照明），并将其与LED串联。
  5. 设计“虚拟”盒子，其尺寸与容纳计时器和电池的外壳相同，用于使鸟类习惯于系统（即如图 2A所示，但没有内部电子设备）。
    注意：第2节和第3节讨论了用于研究ALAN对局灶性生物体影响的分步方法。

Figure 1
图 1：由红外摄像机和 LED 灯组成的两个系统，用于操作巢箱内的 ALAN。 （A） 巢箱的顶视图，带有将旧系统固定到位的板。（B） 较旧的系统，带有 1 个广谱 LED，用于操作 ALAN 和中央摄像机，具有 10 个红外 LED （c） 较新的系统，带有 4 个广谱 LED，中央红外摄像机具有 4 个红外 LED。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图 2：自制电池和定时器单元，用于操作 ALAN 和视频录制行为。 （A） 该单元封装在安装在巢箱顶部的木箱内。（B） 设备内部电子设备的视图。连接器从巢箱内部延伸到木制外壳，将电子设备连接到红外摄像机和广谱LED。 请点击此处查看此图的大图。

2. 规划实验并调整 ALAN 强度和时间

  1. 确定将动物暴露在的所需光强度。
    1. 仔细考虑使用哪种实验光强度，以产生有意义的结果来回答研究问题。一般来说，这将意味着选择与生态相关的光强度，这是自由放养的动物可能遇到的（参见 表1 的指导）。
  2. 将LED灯调整到所需的光强度（例如，1-3勒克斯，如过去的研究中使用的; 表 1 和 表 2）。
    1. 在放置在现场之前，将系统放置在带入实验室的巢箱上以校准光强度。将 LED 连接到电源，如下所述（协议部分 3）。
    2. 通过将测光表放置在巢箱内鸟的水平（距底部约8厘米），同时调整与LED串联的电阻器，将LED发出的光调节到所需的强度（勒克斯）。
      注意：可以实现非常低的光强度（例如，乡村天空辉光水平;0.01勒克斯）。
  3. 确定将动物暴露给 ALAN 的时间范围。
    1. 确定整夜暴露的时间长度和时间。例如，人们可以在整个晚上将动物暴露在ALAN中，只在部分夜晚，或者在半夜留下一段时间的黑暗以减少扰动的程度。
    2. 如果动物必须进入巢箱（或特定区域）才能暴露在ALAN中，还要考虑在可能发生的进入事件之前还是之后是否应该打开灯。
  4. 设置计时器以控制夜间的光照时间。
    1. 设置连接到广谱LED的计时器，以便灯在指定时间段打开和关闭（例如，日落前至少2小时;日出后2小时关闭）。
      注意：红外摄像机允许在光照期间同时记录动物的行为，并且只要连接到充电电池，它就会打开。
  5. 确定用于目标研究问题的适当实验设计。
    注意：对于某些问题，重复测量实验设计将是最有力的选择（例如，暴露于ALAN如何影响睡眠行为？对于其他人，将需要配对的对照组和实验组（例如，暴露于ALAN如何影响发育雏鸟的端粒损失？
源/曝光水平 强度（勒克斯）
充足的阳光 103000
满月光 0.05–1
城市天空辉光 0.2–0.5
自由生活的欧洲黑鸟的暴露 0.2 (0.07–2.2)
过去使用该系统的实验研究 1–3
路灯 ~10
低压钠路灯 ~10
高压钠 ~10
荧光灯 300
金属卤化物 400–2000

表1：环境中的特征光强度3，9，自由放养的鸟类的暴露水平41，以及过去使用该系统的研究中使用的强度（参见表2）。

3. 实现对 ALAN 的公开

  1. 使动物习惯于实验设置。
    1. 如果可能的话，在实验的背景下，通过在实验前至少1天将假盒子放在巢箱的顶部来使动物习惯于设置，以尽量减少新奇厌恶的影响。
  2. 调查焦点个体。
    1. 使用被动综合应答器（PIT）标签为研究种群中的动物安装，以便在巢箱内识别而不会干扰鸟类。
    2. 在涉及ALAN对睡眠行为影响的实验中，在实验前一天晚上访问巢箱，并使用射频识别（RFID）读取器扫描箱子，以确定哪些鸟类在里面栖息。
    3. 在育种季节的实验中，涉及将发育中的雏鸟暴露给ALAN，持续监测（例如，每隔一天）巢箱，并检查巢内容物和成年身份。仔细选择包含具有某些特征（即模态育雏大小，亲本在场和进食）的育雏箱用于实验。
  3. 选择并实施实验。
    1. 对于涉及睡眠行为的实验，实施重复措施设计，首先记录个体在黑暗条件下睡眠至少一晚，以记录在没有ALAN（对照治疗）的情况下不受干扰的睡眠，然后按照步骤3.3.2-3.3.21进行记录。
    2. 为此，请确保在将红外摄像机带入现场之前，将红外摄像机上的时间与本地时间同步。
    3. 将SD卡插入电池旁边的迷你DVR录像机中的SD插槽（图2B; 补充图 2）。检查以确保SD卡为空，如果没有，请擦除它包含的数据。
    4. 在黑暗开始前至少2小时，从巢箱顶部取下假盒。
    5. 打开巢箱盖。
    6. 将装有红外摄像机的板放在巢箱内，摄像机物镜朝下。
    7. 将电子连接器伸出巢箱中的小树林。
    8. 关闭巢箱盖。
    9. 将装有电池、录像机和计时器的存储模块放在巢箱的顶部。
    10. 连接电池电源接头。将录像机上的红色接头连接到照相机的白色接头（音频），将录像机上的黄色接头连接到照相机的黄色接头（视频），将电池的黑色接头连接到照相机的红色接头（电源）（补充图1 和 补充图2）。
    11. 按下录制按钮以启动相机录制。
      注：不会设置计时器和/或电源不会连接到控制 LED 的计时器，因此在控制夜晚不会产生 ALAN。
    12. 使用小tft屏幕进行检查，以确保录制已开始并且图像正确。用于连接TFT屏幕的端口位于录像机下方（补充图2）。
    13. 天黑后约1小时，返回巢箱，通过在巢箱的底部和侧面移动RFID应答器读取器并记录从PIT标签传达的唯一标识号来检查睡在里面的鸟的身份。
    14. 在控制记录后的早晨，日出后至少2小时，返回巢箱并收集电池系统和红外摄像机。
    15. 同样，在巢箱的顶部放置一个虚拟框。
    16. 在实验室或办公室，为电池充电，并从记录仪中取出并下载SD卡以收集行为数据。
      注意：电池在寒冷条件下的使用寿命为约 30 小时，以便整夜录制，但需要在连续几个晚上的录制之间充满电。
    17. 成功下载数据后，从SD卡中删除数据，然后将其重新插入迷你DVR录像机。
    18. 在随后的晚上，实施光照处理（例如，1-3勒克斯，如过去使用该系统的实验中使用的; 表 1 和 表 2）。
    19. 将计时器系统设置为所需的光照时间范围。
    20. 按照上述相同的步骤（3.3.2-3.3.17）进行控制记录，但也要将定时器连接到电源，将LED连接到定时器（补充图1 和 补充图2）。
    21. 如果需要，在第三天晚上重复控制记录（黑暗条件下的睡眠行为，即没有ALAN）。
    22. 对于涉及雏鸟暴露于ALAN的实验，使用步骤3.3.23-3.3.25中描述的对照和实验育雏。
    23. 将假巢箱（缺少电子设备）放在对照育雏的巢箱顶部，并以等效的方式处理对照和实验雏鸟。
    24. 为实验盒实施实验性 ALAN 曝光。在实验期间，如上所述，将LED系统和红外摄像机安装在巢箱内，并设置定时器以控制所需的光照时间。
    25. 为电池充电。对于涉及多个夜晚的光照和视频录制的实验，每天早上收集系统以在白天为电池充电，然后在晚上更换系统。
  4. 收集有关相关响应变量的数据。
    1. 如果巢箱内的行为是感兴趣的变量，则红外摄像机将允许同时记录行为（例如，睡眠行为; 图 3）。
    2. 通过附加监测方法收集任何其他感兴趣的数据，在可变的时间点进行采样（例如，在光照照之前和之后采集的血液样本15）。

Figure 3
图3：暴露在ALAN的巢箱内大山雀的红外图像。 （A）睡觉和（B）警报大山雀 请点击这里查看此图的放大版本。

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Representative Results

使用该系统发表的同行评审研究文章总结在 表2中。其他几份手稿正在编写中。这些研究解决了三个主要的研究问题。首先，该系统已被用于研究光照对成人睡眠行为和活动水平的影响。为此，采用了重复的测量实验设计，其中首先记录同一个体在自然条件下睡觉，然后记录在点燃的巢箱中睡觉。这些研究中使用的所有个体都装有PIT标签，允许研究人员使用手持式应答器阅读器验证同一个体在随后的夜晚之间睡在巢箱中而不会打扰鸟类。

已经记录了ALAN暴露对睡眠行为的巨大影响。例如，大山雀以1.6勒克斯的强度暴露于ALAN，这是自由放养的动物可能经历的相对较低的强度，提前半小时醒来，提前20分钟离开巢箱，比对照鸟少睡40分钟（图4）16。有趣的是，ALAN对睡眠的影响可能取决于其他变量，例如光强度和季节。根据这一假设，ALAN在雏鸟时期对雌性大奶子睡眠行为的影响比在冬季大得多，对睡眠不足的影响是其两倍以上，对清醒时间的影响是17的四倍以上。另一方面，在1.6与3勒克斯的强度下，光照的效果几乎没有差异，这表明即使是低强度的ALAN也可能具有有害影响12。该系统还被用于记录ALAN中断后的睡眠反弹，其中个体通过在第二天晚上睡得更多来应对ALAN诱导的睡眠剥夺17。此外，已经观察到ALAN扰乱睡眠程度的显着个体差异，这对于预测人群反应和选择范围17可能很重要，尽管ALAN对睡眠的影响没有被探索性人格类型18改变。ALAN对睡眠的实质性影响可能对清醒行为，生理和健康产生级联效应。然而，迄今为止的研究持续时间相对较短。研究更广泛的影响和长期影响对于阐明ALAN对自由放养动物的影响至关重要，并且是进一步研究的重要领域（见下文）。

Figure 4
图4：效应大小和95%置信区间，比较了大奶子在第一个不受干扰的夜晚和第二个晚上的睡眠行为。 在第二天晚上，鸟类要么再次不受干扰（控制;顶部面板），要么暴露在1.6勒克斯的ALAN（光;底部面板）下。效应大小以分钟为单位给出，但“入口时间”除外，后者以秒为单位。详见Raap et al. （2015）16。这个数字是在Raap等人16的许可下改编的。 请点击此处查看此图的大图。

其次，该系统已被用于使用一系列生理反应变量来检查暴露于ALAN如何影响发育中的雏鸟（表2）。这些实验在雏鸟阶段的一部分将雏鸟暴露给ALAN，范围从2-7天不等，这取决于研究的目的。光照射对雏鸟的有记录的影响包括对体重或状况19，羽毛皮质酮水平20，触珠蛋白浓度21和草酸盐水平22的影响。然而，这项研究还表明，一些参数，如端粒降解速率和氧化应激15，19，可能不受暴露于ALAN的影响（表2）。总而言之，这些研究表明，在生命早期暴露于ALAN可能会改变发育过程，并可能在成年期产生持久影响，但需要更多的研究来确定发育中生物体的特征对光照敏感或有弹性的程度。

第三，该系统已被用于评估对健康的影响，包括生殖成功率和存活率。到目前为止，还没有出现这种影响的有力证据。然而，重要的是，这项工作仍在进行中，因为有效评估健身效果需要对暴露在光线下的个体进行长期监测。

最后，已经比较了暴露于ALAN对大山雀和蓝山雀睡眠行为的影响。与大山雀相比，ALAN对蓝山雀睡眠行为的影响要小得多，这引起了人们对光敏感性的种间差异的可能性的关注，即使在密切相关的物种之间也是如此（表2）23.值得注意的是，其他研究小组最近也开始采用这种操纵巢箱内光照水平的方法，说明了该方法的强度，以及其更广泛应用的潜力24，25。

物种 人生阶段 使用的 ALAN 强度（勒克斯） 响应变量 艾伦的影响 参考
大山雀（帕鲁斯大调） 雏鸟 1 羽毛皮质酮（fCORT），身体状况，端粒长度，初出茅庐的成功，招募 （+） fCORT 18Grunst et al. 2020.环境污染。259：113895. doi： 10.1016/j.envpol.2019.113895
(-)身体状况
（0） 其他响应变量
大山雀 雏鸟 1 端粒长度，身体状况，初出茅庐，一氧化氮 (-)身体状况 13Grunst et al. 2019.Sci Tot Environ.662：266-275. doi： 10.1016/j.scitotenv.2018.12.469
（0） 端粒长度，其他响应变量
大山雀 成人 1.6, 3 睡眠人格（探索行为）依赖性反应？ (-)睡眠行为 18Raap et al. 2018.环境污染。243：1317-1324. doi： 10.1016/j.envpol.2018.09.037
不被个性改变
大山雀 雏鸟 3 草酸盐和反应是否被性别修改 (+)草酸盐，男性 22Raap et al. 2018.保守生理学 6： coy005.doi： 10.1093/conphys/coy005
（0）草酸盐，雌性
大山雀 雏鸟 1.6, 3 睡眠行为以及反应是否因季节或光照强度而改变 (-)睡眠行为 12Raap et al. 2017.行为过程144：13-19。doi： 10.1016/j.beproc.2017.08.011
季节睡眠开始的影响很小，只有高强度的ALAN才能延迟
大山雀/蓝山雀（Cyanistes caeruleus） 成人 3 睡眠行为 对蓝山雀睡眠的影响较小（-） 21Sun et al. 2017.环境污染。231：882-889. doi： 10.1016/j.envpol.2017.08.098
大山雀 成人 1.6 女性的睡眠行为 (-)睡眠行为 艾伦暴露后睡眠反弹 17Raap et al. 2016.环境污染。215：125-134. doi： 10.1016/j.envpol.2016.04.100
在筑巢期效果更大（-）
大山雀 雏鸟 3 体重变化，血液氧化状态，出苗成功 (-)体重 17Raap et al. 2016.科学代表6：35626。doi： 10.1038/srep35626
（0）氧化状态，初出茅庐的成功
大山雀 雏鸟 3 触珠蛋白（Hp），一氧化氮（NO） (+)惠普 21Raap et al. 2016.环境污染。218：909-914. doi： 10.1016/j.envpol.2016.08.024
(-)不
大山雀 成人 1.6 睡眠行为 (-)睡眠行为 14Raap et al. 2015.科学代表5：13557。doi： 10.1038/srep13557
注意：0 = ALAN 对响应变量没有影响。参考文献条目中的数字是指参考文献列表中的顺序。

表2：基于使用实验系统暴露于ALAN而发表的研究摘要。注意：0 = ALAN 对响应变量没有影响。

补充图 1：包含红外 （IR） 摄像头和发光二极管 （LED） 灯的板，另外显示了将系统连接到电源的电缆。请点击此处下载此文件。

补充图2：包含电池，记录仪和自制时间系统的腔室的内部视图，另外显示了连接系统各个部分的电缆。请点击此处下载此文件。

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Discussion

这种基于巢箱的LED灯系统和配对的红外摄像机使研究人员能够评估有关ALAN生物效应的一系列有趣问题。此外，该系统还可以追求更多的研究方向。此外，将该系统的使用扩展到其他物种可能有助于促进对ALAN敏感性的种间差异的理解。下面提出了一些未来研究的非详尽可能性，希望本文将有助于激励这一重要领域的研究。结论简要重申了这种实验方法的优势，并解决了该系统的局限性。

该系统可用于回答许多悬而未决的问题，这些问题涉及ALAN如何影响自由放养的动物或半圈养动物。首先，迄今为止的研究涉及相对较短的ALAN暴露期和对生物效应的短期监测。因此，对于短期ALAN暴露的长期影响，或者如果鸟类暴露于ALAN许多天，许多周或整个生命周期会发生什么，人们知之甚少（见26 ，最近的一篇论文证明了长期暴露于ALAN在蟋蟀中的重要性， Gryllus bimaculatus）。例如，短期ALAN暴露是否对健康状况和生物衰老率有长期影响？长期ALAN暴露是否会导致生理应激和加速衰老，并且与短期ALAN暴露的影响相似或不同？该系统可用于解决这些问题。事实上，许多大山雀和蓝山雀（以及其他物种）在其整个生命周期中都使用相同的巢箱。

其次，有必要研究ALAN与其他人为干扰因素的交互效应（例如，采用27中的多应力视角），以及ALAN具有不同性质的差异效应。该系统可以与其他实验操作结合使用，或者与人为干扰水平的自然变化结合使用，以研究不同的人为干扰因素（例如，光，噪声，化学污染）如何相互作用以影响一系列响应变量。例如，雏鸟可以同时暴露于ALAN和人为噪声中，以测试这两种干扰因素是否对皮质酮水平或端粒缩短具有累加或协同效应。该系统还可以通过调整所用LED的特性来检查具有不同特性的ALAN的效果。例如，使用该系统来研究不同波长（例如，红色与蓝色波长）的ALAN如何影响睡眠行为或雏鸟发育将是很有趣的。已经假设和实验支持，不同波长的光可能诱导强度不同的生物反应28，29。例如，在最近的一项研究中，白光和绿光对大山雀的孵化行为有差异影响29。

第三，该系统可用于探索ALAN对迄今为止未被充分探索的反应变量的影响，包括生物能量学，认知过程，社会动态和父母护理（但见30 了解对生物能量学的影响）。为了研究对生物能量学的影响，ALAN暴露可以与呼吸测量相结合以测量静息或基础代谢率（RMR，BMR）31，用于测量现场代谢率（FMR;也称为每日能量消耗）的双标记水法30，32，或加速度测量法以测量活动模式和能量消耗33.ALAN对生物能量学的影响可能对健康产生不小的影响，因为代谢率和能量消耗已被提出是生活史变异和生活节奏的基础34。为了探索ALAN对认知特征的影响，研究人员可以在ALAN暴露后利用基于现场的认知测试，或者在暴露后捕获成年人并在实验室中进行认知测试。该系统旨在允许对自由放养的鸟类进行研究，并且将鸟类转移到圈养中会带来自己的复杂性。因此，对野生鸟类的认知测试特别有吸引力，尽管也具有挑战性。例如，最近的工作使用修改后的巢箱陷阱35检查了巢箱的问题解决能力。暴露于ALAN的育雏雌性可以接受这种认知测试。另一种可能性是使用旨在评估空间记忆或联想学习的“智能喂食器”来探索睡眠成年人暴露于ALAN是否会影响这些认知特征36。最后，为了研究ALAN对社会互动和父母护理的影响，研究人员可以将LED系统与其他技术配对，其中一些技术已经在使用该设置的研究中普遍使用。例如，巢箱中的PIT标签系统允许记录装有PIT标签的成年鸟类的入口和出口37。因此，在繁殖期间，研究人员可以探索育雏雌性和雏鸟暴露于ALAN是否会改变雏鸟的供应率或影响两性之间父母努力的平衡。此外，各种无线电遥测平台已经小型化，便于在小动物中使用，并可用于评估睡眠成人暴露于ALAN是否改变了与同种的相互作用38。

类似于这里描述的系统可用于研究ALAN对任何使用巢箱繁殖的鸟类物种的影响。这包括几种经过充分研究的鹦鹉，如树燕（Tachycineta bicolor），西部和东部蓝鸟（Sialia mexicana 和 Sialia sialis），雏鸟（Poecile sp.），家鹪鹩（穴居人aedon），欧洲鹦鹉（Ficedula hypoleuca）和领子（Ficedula albicollis）捕蝇草，以及家麻雀（Passer domesticus）。欧洲椋鸟（Sturnus vulgaris）也是一个特别合适的物种，因为它们可以在圈养和野外进行研究，并且足够大，可以使用脑电图技术研究睡眠行为39。猛禽，如谷仓猫头鹰（Tyto alba）和美国红隼（Falco sparverius），也利用巢箱，可以作为研究对象。在这些物种中，可以很容易地评估ALAN对雏鸟发育的影响。ALAN对睡眠行为的影响程度取决于成虫在繁殖季节还是非繁殖季节睡在巢箱内，但在孵化阶段，ALAN对雌性睡眠的投资影响可能有很大的空间。

该系统还可以适用于巢箱筑巢鸟类以外的物种。除鸟类外，许多哺乳动物物种也在巢箱中筑巢或睡觉。因此，该系统可用于研究ALAN对这些物种的影响。例如，几种狐猴物种将占据箱子，并且已经使用人工巢箱来研究它们的繁殖行为40。此外，尽管具有挑战性，但该系统有可能被创新科学家采用，以研究ALAN对开杯筑巢鸟类和在裂缝或洞穴中筑巢或睡觉的鸟类或哺乳动物物种的影响。对于开杯筑巢的鸟类，这将涉及创建一种方式，通过该方法可以将LED灯和红外摄像机安装在巢上方。鉴于需要将LED系统和摄像头固定在巢穴上方，对于在地面上或靠近地面筑巢的物种，这种系统可能最容易实现。对于洞穴或裂缝筑巢物种，研究人员需要在空腔内安装LED系统和摄像头。例如，对于一些在岩石裂缝中筑巢的物种，可以移除岩石以创造空间来保护照明系统和相机。

如上所述，这种方法用于操作巢箱内ALAN水平的主要优势是能够在夜间的特定时间范围内将研究对象暴露在预定的光照水平下。精确控制光照水平和持续时间的能力使研究人员能够克服关于ALAN生物影响的非实验研究固有的许多局限性。然而，该方法也有局限性，特别是因为动物只能在巢箱内休息，睡觉或照顾幼崽时暴露在光线下。无法探索ALAN对巢箱外发生的行为的直接影响，例如唱歌和觅食（尽管可以调查巢箱内暴露于ALAN对这些行为的间接影响）。为了探索ALAN在巢箱外的这种直接影响，研究人员将需要采用更大规模的人工照明实验网络或非实验方法。

此外，对操纵巢箱内光照水平的方法的主要批评是，巢箱或自然空腔通常会保护个体免受人为艾伦的外部来源的影响。然而，重要的是要注意，并非所有的大山雀都有巢箱或洞穴可供睡觉，因为它们是有限的资源。因此，城市地区的成年鸟类有可能（如果不是不太可能的话）暴露于过去使用该系统的研究中使用的低水平（1-3勒克斯）的ALAN（表2）。我们种群中的巢箱在巢箱开口13处暴露在0.01-6.4勒克斯之间，这表明在巢箱外睡觉的鸟类可以暴露在与操作中使用的光水平相当的光照水平。事实上，尽管在不同的物种中，Dominoni et al. 201341 使用光记录仪来测量自由放养的欧洲黑鸟（Turdus merula）所经历的ALAN水平，并发现城市鸟类的ALAN水平明显高于农村鸟类，尽管暴露水平变化很大（0.7-2.2勒克斯）41.此外，在使用这些低水平的ALAN（0.3勒克斯）的实验中，他们证明了这些非常低水平的ALAN对繁殖和蜕皮41的时间有显着影响。另一方面，de Jong等人201642 发现，在森林区域内的人工照明横断面上繁殖的雄性大山雀的ALAN水平并不高于对照鸟，这表明回避行为。然而，他们指出，在光照普遍的城市地区，这种逃避可能更难实现42。因此，如果使用生态相关水平的ALAN正确设计实验，则操纵巢箱内光照水平的方法有可能产生与生态相关的结果。最好是，这将首先测量目标研究种群或同一物种的城市种群中自由放养鸟类的ALAN暴露。

关于将雏鸟暴露在巢箱内ALAN的相关性，确实，使用的ALAN水平远高于通常在巢穴内体验到的水平（在研究的人群中，白天巢箱底部的光照水平约为0.08勒克斯，夜间在0至0.01勒克斯之间）。相反，像大山雀和蓝山雀这样的空穴筑巢物种可以作为方便的模型物种，用于开放筑巢物种可能发生的影响，其雏鸟将暴露得更多14，18，20，24。现在迫切需要更多的研究来记录开杯筑巢物种的雏鸟所经历的ALAN水平。基于这样的研究，该系统有可能适应于操纵开放杯巢的ALAN水平，如上所述。

总而言之，在巢箱内操纵光照水平的方法既有其优点也有缺点。然而，如果应用得当，该方法对各种实验和相关方法做出了坚实的贡献，这些方法需要建立对ALAN生物学效应的连贯理解。

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Disclosures

作者声明他们没有利益冲突。

Acknowledgments

我们涉及ALAN对鸟类的生物效应的研究计划已获得FWO法兰德斯（M.E.和R.P.，项目ID：G.0A36.15N），安特卫普大学和欧盟委员会（M.L.G，Marie Skłodowska-Curie奖学金ID：799667）的资助。我们感谢安特卫普大学行为生态学和生态生理学研究小组成员的智力和技术支持，特别是Peter Scheys和Thomas Raap。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Broad spectrum; 15 mm x 5 mm; LED headlight RANEX; Gilze; Nederlands 6000.217 A similar model could also be used
Battery BYD R1210A-C Fe-battery 12 V 120 Wh ( lithium iron phosphate battery)
Dark green paint Optional. To color nest boxes/electronic enclosures
Electrical tape For electronics
Homemade timer system Amazon YP109A 12V A similar model could also be used
Infrared camera Koberts-Goods, Melsungen, DE 205-IR-L Mini camera; a similar model could also be used
Light level meter ISO-Tech ILM; Corby; UK 1335 To calibrate light intensity
Mini DVR video recorder Pakatak, Essex, UK MD-101 Surveillance DVR Recorder Mini SD Car DVR with 32 GB
Passive integrated transponder (PIT) tags Eccel Technology Ltd, Aylesbury, UK EM4102 125 Kh; Provides unique electronic ID
Radio frequency identification (RFID) Reader Trovan, Aalten, Netherlands GR-250 To scan PIT tags and determine bird identity
Resistor RS Components Value depending on voltage battery and illumination
SD card SanDisk 64 GB or larger
SongMeter Wildlife Acoustics; Maynard, MA Optional. Provides a means of monitoring vocalizations outside of nest boxes
TFT Color LED Portable Test Monitor Walmart Allows verification that the camera is on and recording the image correctly
Wood To construct nest boxes/electronic encolsures

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生物学， 第180期，
研究夜间人造光对自由放养动物影响的实验方法：实施，结果和未来研究的方向
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Grunst, M. L., Grunst, A. S., Pinxten, R., Eens, G., Eens, M. An Experimental Approach to Investigating Effects of Artificial Light at Night on Free-Ranging Animals: Implementation, Results, and Directions for Future Research. J. Vis. Exp. (180), e63381, doi:10.3791/63381 (2022).

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