Summary
렌티바이러스 shRNA의 풀을 이용한 고처리량 RNA 간섭(RNAi) 스크리닝은 악성종양에서 치료적으로 관련된 합성 치사적 표적을 검출하는 도구가 될 수 있다. 우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 후성 유전 학적 이펙터를 조사하기 위해 풀링 된 shRNA 스크리닝 접근법을 제공합니다.
Abstract
후천성 화학저항성의 임상적으로 관련된 동인 메커니즘을 이해하는 것은 급성 골수성 백혈병(AML) 환자의 저항성을 우회하고 생존을 향상시키는 방법을 밝히는 데 매우 중요합니다. 화학 요법에서 살아남은 백혈병 세포의 작은 부분은 화학 요법 모욕을 용인 할 수있는 후성 유전 학적 상태를 가지고 있습니다. 화학 요법에 대한 추가 노출은 이러한 약물 지속성 세포가 고정 된 후성 유전 적 상태에 도달 할 수있게하여 유전자 발현을 변경시켜 이러한 약물 내성 집단의 증식을 초래하고 결국 재발 또는 불응성 질환을 초래합니다. 따라서 약물 내성 백혈병 세포의 생존을 필요로하는 후성 유전 적 조절을 확인하는 것이 중요합니다. 우리는 획득된 시타라빈 내성 AML 세포주에서 스크리닝된 풀링된 shRNA 라이브러리를 사용하여 뉴클레오시드 유사체 시타라빈(AraC)에 대한 내성을 매개하는 후성유전학적 조절제를 확인하기 위한 프로토콜을 상세히 기술한다. 이 라이브러리는 407개의 인간 후성유전학적 인자를 표적으로 하는 5,485개의 shRNA 구축물로 구성되며, 이는 고처리량 후성유전학적 인자 스크리닝을 가능하게 한다.
Introduction
급성 골수성 백혈병 (AML)의 치료 옵션은 시타라빈 (AraC)과 안트라 사이클린이 질병 치료의 초석으로 삼아 거의 지난 XNUMX 년 동안 변하지 않았습니다. AML 요법의 성공에 대한 도전 중 하나는 백혈병 줄기 세포가 화학 요법에 저항하여 질병 재발 1,2로 이어지는 것입니다. 후성유전학적 조절은 암 발병기전과 약물 내성에 중요한 역할을 하며, 몇 가지 후성유전학적 요인들이 유망한 치료 표적으로 부상했다 3,4,5. 후성유전학적 조절 기전은 화학요법 약물에 대한 지속적인 노출하에서 증식 및 생존에 영향을 미친다. 비 혈액 학적 악성 종양에 대한 연구에 따르면 약물 효과를 극복 한 세포의 작은 부분이 다양한 후성 유전학 변형을 거쳐 그 세포의 생존 6,7을 초래한다고보고했습니다. 그러나, AML에서 시타라빈에 대한 후천적 내성을 매개하는 후성유전학적 요인의 역할은 탐구되지 않았다.
고처리량 스크리닝은 시간이 지남에 따라 전 세계적으로 중요해진 약물 발견에 대한 접근 방식이며 세포 메커니즘, 경로 프로파일 링 및 분자 수준 8,9에서 잠재적 인 표적을 식별하기위한 다양한 측면에서 표준 방법이되었습니다. 합성 치사율 개념은 두 유전자 사이의 상호작용을 포함하며, 여기서 두 유전자 중 어느 하나의 교란만이 실행 가능하지만 두 유전자의 섭동은 동시에 생존력의 상실을 초래한다(10). 암 치료에서 합성 치사율을 이용하는 것은 강력한 합성 치명적인 유전 적 상호 작용을 식별하고 기계적으로 특성화하는 데 도움이 될 수 있습니다11. 우리는 AML에서 획득 된 시타라빈 내성을 담당하는 후성 유전 적 요인을 확인하기 위해 합성 치사율로 고 처리량 shRNA 스크리닝의 조합 적 접근법을 채택했습니다.
혼합 혈통 백혈병 유전자(MLL 또는 KMT2A)의 염색체 전좌에 의해 구동되는 급성 백혈병은 환자에서 불량한 생존과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. MLL 유전자 재배열의 결과 키메라 산물, 즉 MLL 융합 단백질 (MLL-FPs)은 조혈 줄기 / 전구 세포 (HSPC)를 여러 후성 유전 적 요인의 개입으로 백혈병 폭발로 변형시킬 수 있습니다. 이러한 후성 유전 적 조절자는 백혈병 프로그램의 유지를 지시하는 복잡한 네트워크를 구성하므로 잠재적 인 치료 목표를 형성 할 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 우리는 MV4-11 세포주 (FLT3-ITD 돌연변이를 가진 MLL 융합 유전자 MLL-AF4를 보유하고; MV4-11 P로 불림)를 사용하여 MV4-11 AraC R로 불리는 획득된 시타라빈 내성 세포주를 개발하였다. 세포주는 약물 휴일로 알려진 약물 치료로부터의 간헐적 인 회복과 함께 시타라빈의 증가 된 복용량에 노출되었다. 반-최대 억제 농도(IC50)를 시험관내 세포독성 검정에 의해 평가하였다.
우리는 pZIP 렌티바이러스 백본을 갖는 hEF1a 프로모터에 의해 구동되는 풀링된 후성유전학적 shRNA 라이브러리(표 문헌 참조)를 사용하였다. 이 라이브러리는 407개의 후성유전학적 인자를 표적화하는 shRNA를 포함한다. 각 인자에는 5-24개의 shRNA가 있으며, 5개의 비표적화 대조군 shRNA를 포함하여 총 5,485개의 shRNA가 있다. 변형된 "UltrmiR" miR-30 스캐폴드는 효율적인 일차 shRNA 생물발생 및발현 12,13을 위해 최적화되었다.
이 실험의 개요는 그림 1A에 설명되어 있습니다. 현재의 프로토콜은 현탁 세포주인 MV4-11 AraC R 세포주(도 1B)에서 후성유전학적 인자 shRNA 라이브러리를 이용한 RNAi 스크리닝에 초점을 맞추고 있다. 이 프로토콜은 자신이 선택한 임의의 약물 내성 세포주에서 임의의 표적화된 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 형질도입 프로토콜은 부착성 세포에 대해 상이할 것이라는 점에 유의해야 한다.
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Protocol
IBSC(Institutional Biosafety Committee) 지침을 따르고 렌티바이러스(BSL-2)를 처리하기 위해 적절한 시설을 사용하십시오. 직원은 렌티 바이러스의 취급 및 처분에 대해 적절하게 훈련되어야합니다. 이 프로토콜은 Vellore의 Christian Medical College의 생물 안전 지침을 따릅니다.
1. shRNAs의 지속적이고 장기간의 발현을 얻기 위한 가장 강력한 프로모터의 선택
참고: 실험을 위해 선택된 세포주에서 shRNAs의 안정적이고 장기적인 발현을 제공하는 프로모터를 확인하기 위해 형광 단백질을 발현하는 상이한 프로모터를 갖는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 형질도입 실험을 수행하는 것이 필수적이다. 이러한 목적을 위해 가장 일반적으로 사용되는 프로모터는 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 hEF1α (인간 신장 인자 1α), hCMV (인간 거대 세포 메갈로바이러스) 및 SSFV (비장 초점 형성 바이러스) 프로모터입니다 (도 2A).
- 트리판 블루 제외 방법을 사용하여 셀 카운트를 수행하십시오. MV4-11 AraC R 세포를 8 μg/mL 폴리브렌을 함유하는 10% RPMI 배지(100 U/mL 페니실린과 100 U/mL 스트렙토마이신으로 보충된 10% FBS가 있는 RPMI)에 현탁시킨다. 시드 1 x 106 세포를 6 -웰 플레이트의 배지/웰 1.5 mL에 삼중으로 시드한다.
- 상이한 부피의 농축된 렌티바이러스(예를 들어, 렌티바이러스의 역가에 따라 10 μL, 20 μL 및 40 μL)를 각 웰에 첨가한다. 접시를 부드럽게 소용돌이 치며 내용물을 섞는다.
- 90분 동안 37°C에서 920 x g 에서 원심분리에 의한 스펜싱을 수행한다.
- 플레이트를 즉시 CO2 인큐베이터(37°C에서 5%CO2)에서 인큐베이션한다.
- 성공적인 형질도입을 보장하기 위해 형광 현미경 하에서 48시간 후에 GFP 발현을 관찰하였다.
- GFP 발현을 72 h 후에 유세포 분석기로 정량화하여 형질도입 효율을 평가하였다.
- 세포를 총 2주 동안 배양하고 유세포 분석기에 의해 주기적으로 GFP 발현을 모니터링한다. GFP+ 세포의 평균 형광 강도 및 백분율에 의해 측정된 GFP 발현의 감소는 프로모터 침묵을 나타낸다.
- GFP+ 세포를 10일째에 분류하고 분류 후 1주일 동안 세포를 배양하였다. 배양 동안 주기적으로 GFP 발현을 확인한다.
- 트랜스듀싱되지 않은 셀을 사용하여 게이트를 설정합니다. x축에서 오른쪽으로 향하는 1 x10 1 스케일을 초과하는 모집단은 GFP에 대한 양성 집단으로 간주됩니다.
- 세포의 장기간의 배양에서 GFP의 지속적인 발현을 나타내는 프로모터를 선택하십시오.
2. 풀링된 렌티바이러스 인간 후성유전학적 인자 shRNA 라이브러리의 제조
- 각 플레이트에서 293T 세포를 10% DMEM 배지 8mL(100U/ml 페니실린과 100U/ml 스트렙토마이신을 함유하는 10% FBS가 있는 DMEM)와 함께 세 개의 10cm 세포 배양 접시에서 배양한다.
- 일단 세포가 60% 컨플루언시를 달성하면, 배지를 완전한 배지로 교체한다.
- 무혈청 배지, 렌티바이러스 패키징 (psPAX2) 및 엔벨로프 플라스미드 (pMD2.G), 풀링된 라이브러리 플라스미드, 및 마지막으로 형질감염 시약을 함유하는 형질감염 믹스 ( 표 1에 요약된 바와 같이)를 제조한다.
- 혼합물을 탭하여 잘 혼합하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 형질감염 혼합물을 293T 세포에 첨가하고, 플레이트를 소용돌이치면서 부드럽게 혼합한다. 플레이트를 CO2 인큐베이터(37°C에서 5%CO2)에서 인큐베이션한다. 24 시간 후에 배지를 변경하십시오.
- 48시간 후, 293T 세포에서 높은 형질감염 효율을 보장하기 위해 형광 현미경 하에서 GFP 발현을 확인한다.
- 48 h, 60 h, 및 72 h 후에 바이러스 상청액을 수집하고 이를 4°C에서 보관한다. 바이러스를 수집 한 후 각 시점에 신선한 배지 (8 mL)를 추가하십시오.
- 바이러스 상청액을 풀링하십시오. 풀링된 바이러스의 총 부피는 다음과 같다: ~8 mL/플레이트 x 3 콜렉션= ~24 mL/플레이트; ~ 24 mL / 플레이트 x 3 플레이트 = 3 플레이트에서 ~ 72 mL.
- 풀링된 바이러스를 0.4 μm 필터로 필터링합니다.
- 바이러스의 높은 역가를 얻기 위해, 초원심분리에 의해 풀링된 바이러스를 농축시킨다. 여과된 바이러스 상청액을 두 개의 70Ti 튜브(32mL/튜브)에 옮기고 18,000x g 에서 2시간 동안 원심분리하여 느린 가속 및 감속으로 전환합니다. 로터를 사용하여 4°C로 미리 냉각된 원심분리기.
- 원심 분리기에서 튜브를 부드럽게 꺼내어 상층액을 완전히 제거하십시오.
- 마이크로피펫을 사용하여, 펠렛을 400 μL의 DMEM(FBS 및 항생제 없이)에 부드럽게 재현탁시킨다. 얼음 위에서 1 시간 동안 인큐베이션하고 두 튜브에서 펠렛을 혼합하십시오.
- 바이러스를 분취하여 -80°C에서 동결시킨다.
참고: 튜브와 바이러스는 2.10.-2.13 단계에서 얼음 위에 보관해야 합니다. 일반 배지로 바이러스를 재현탁하는 동안 얼어붙지 마십시오. 배지는 4°C에서 유지되어야 한다. - 다음과 같이 바이러스의 농도 (x)를 계산하십시오.
전 농도의 총 부피 = 72 mL (72,000 μL)
농축 후 부피 = 400 μL
농도 = 72,000/400= 180x
3. 렌티바이러스의 형질도입 효율 추정
- 농축된 바이러스로 293T 세포를 상이한 부피 (2 μL, 4 μL, 8 μL)로 형질도입하여 렌티바이러스의 성공적인 제조를 확인한다.
참고: 농축된 바이러스가 소량(1-2μL)에서 높은 형질도입 효율(>50%)을 보이는 경우, 농축된 바이러스를 원하는 양(100x ~ 75배)으로 희석하는 것이 좋습니다. - 농축된 바이러스를 DMEM(FBS 및 항생제 없이)으로 100x로 희석하여 MV4-11 AraC R 세포주에서 적정 실험을 수행하였다.
- 시드 1 x 10 6 세포 (8 μg/mL 폴리브렌을 함유하는 10% RPMI 배지 중 1.5 mL의 MV4-11 AraC R 세포주)를6 웰 플레이트의 한 웰에 넣는다. 서로 다른 양의 바이러스로 형질도입을 위해 네 개의 우물을 준비하십시오.
- 100x 바이러스의 네 가지 다른 부피(예: 1μL, 1.5μL, 2μL 및 2.5μL)를 추가합니다.
- 플레이트를 37°C에서 90분 동안 920 x g 에서 원심분리하여 스파이싱을 수행한다.
- 72시간 후, 유세포 분석기로 GFP+ 세포의 백분율을 측정하였다.
- 바이러스의 부피를 결정하여 30% 형질도입 효율을 얻습니다. 이러한 낮은 형질도입 효율은 세포당 단일 shRNA 통합을 보장하기 위한 것이다.
4. 약물 내성 세포주에서 풀링된 후성유전학적 shRNA 라이브러리의 형질도입
- 표적 세포주 MV4-11 AraC R을 0.5 x 106 세포/mL 밀도로 유지하십시오. 세포가 배양물에서 기하 급수적 인 성장 단계에 있는지 확인하십시오.
- 바이러스 적분의 수를 기준으로 아래와 같이 실험을 위해 취해질 세포의 수를 계산한다.
형질도입에 필요한 세포 수 = 5,485 (shRNA 수) × 500 (접이식 shRNA 표현) / 0.25 (MOI) = 10,982,000 ~ 11 x 106 세포 - 1.1 x 107 세포를 16 mL의 10% RPMI 배지에 재현탁시킨다.
- 폴리브렌(8μg/mL)을 넣고 잘 섞는다. 그런 다음 필요한 바이러스 부피를 추가하여 이전 섹션에서 계산 된 30 % 형질 도입 효율을 얻으십시오.
- 모든 세포를 웰 당 1 x 10 6 세포/1.5 mL의 10% RPMI 배지의 밀도로6 -웰 플레이트에 시드한다.
- 플레이트를 37°C에서 920 x g 에서 90분 동안 원심분리한다.
- 플레이트를 CO2 인큐베이터(37°C에서 5%CO2)에서 밤새 인큐베이션한다.
- 24시간 후, 배지를 변경하고 형질도입된 세포를 T-75 플라스크로 옮긴다.
- 48시간 후, GFP를 형광 현미경으로 확인하여 성공적인 형질도입을 보장한다.
- 72시간 후, 유세포 분석기에 의해 GFP+ 세포의 백분율을 정량화한다.
5. GFP 양성 세포의 농축
참고: 형질도입된 세포를 5-7일 동안 0.5 x 106 세포/mL의 밀도로 배양하여 확장하십시오. 이들 세포는 형질도입된 것과 형질도입되지 않은 혼합된 집단이며, 다음 단계에서 언급된 바와 같이 분류에 의해 GFP에 기초하여 선택된다.
- GFP+ 트랜스듀싱된 셀의 흐름 정렬을 고순도 및 저수율로 설정된 흐름 정렬 설정으로 수행합니다. 트랜스듀싱되지 않은 셀을 사용하여 게이트를 설정합니다. 오른쪽으로 1 x 102를 초과하는 인구는 긍정적 인 인구로 간주됩니다.
- 정렬 된 세포를 5 % RPMI (100 U / mL 페니실린과 100 U / mL 스트렙토 마이신으로 보충 된 5 % FBS가있는 RPMI)로 수집하십시오.
- 분류된 세포를 10% RPMI 배지에서 배양한다.
- 72시간 후, GFP+ 세포의 백분율에 대한 사후 분류 추정을 수행하여 >95% 분류 효율을 보장한다.
참고 : shRNA 라이브러리의 450x ~ 500x 표현을 얻기 위해 정렬 한 후 ~ 3-5 x 106 GFP 양성 세포를 얻어야합니다.
6. 약물 내성을 매개하는 후성유전학적 요인을 확인하기 위한 탈락 스크리닝
- 형질도입된 shRNA 라이브러리 세포를 최대 5일 동안 10% RPMI에서 배양한다. 필요한 경우 약물 치료 전에 향후 실험을 위해 형질도입된 세포를 동결보존한다.
- 1 x 107 세포를 25°C에서 5분 동안 280 x g에서 중복된 원심분리한다. 상청액을 버리고, 펠렛을 -80°C에서 저장한다. 이들 샘플은 후성유전학적 shRNA 라이브러리에 대한 기준선 참조로서 기능할 것이다.
- 나머지 형질도입된 세포를 중복(R1 및 R2)으로 배양하고, 각각은 라이브러리의 500x 표현을 제공하는 세포 카운트로 유지한다.
- 중복된 약물 중 하나를 약물 (10 μM 시타라빈) (R2)으로 치료하고 다른 하나는 약물 처리 없이 (R1) 치료한다.
- 72 시간마다 약물 유무에 관계없이 플라스크의 배지를 교체하십시오. 9 일의 누적 약물 노출에 대해 배지 변화를 3x 반복하십시오.
- 약물 치료 9일 후, 트리판 블루 배제 방법으로 세포의 생존율을 확인하였다.
- 나머지 세포를 실온에서 5분 동안 280 x g 에서 원심분리한다. 세포를 멸균 PBS에 재현탁시키고 세포를 세척한다. 실온에서 5분 동안 280 x g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 버리고 펠렛을 DNA 추출을 위해 -80°C에서 보관한다.
7. PCR에 의한 통합된 shRNA의 증폭
- 형질도입된 기준선 세포(T)로부터 DNA를 추출하고(단계 6.2.) 약물(R2)로 처리하고 약물(R1)로 처리하지 않은 세포이다.
- 플루오로미터를 이용하여 시료의 농도를 확인하였다.
- 다음과 같이 PCR에 필요한 DNA의 양을 계산하십시오.
5,485명(아니요. shRNAs) × 500 (shRNA 표현) × 1 x 6.6-12 (g/이배체 게놈) = 15 μg의 DNA - 샘플을 PCR의 첫 번째 라운드에 적용하십시오.
주: PCR 반응 혼합물은 열 사이클러 조건을 갖는 표 2 에 묘사되어 있다. 프라이머의 세부사항은 보충 표 1에 제공된다. - 튜브 당 850ng의 DNA를 포함하는 여러 반응을 설정하십시오 (총 43 회 반응).
참고: PCR의 첫 번째 라운드는 shRNA의 플랭킹 영역을 증폭하여 397 bp의 앰플리콘 크기를 생성합니다. - PCR 산물을 풀링하고 표준 겔/PCR 정제 키트의 3-4 컬럼을 사용하여 PCR 산물을 정제합니다.
참고: 자세한 내용은 표 3에 나와 있습니다. - 생성물을 각 컬럼으로부터 50 μL의 완충액으로 에루팅하고 용출물을 풀링한다.
- DNA를 정량화하고 -20°C에서 저장한다.
참고: 시약은 열 사이클러 조건과 함께 표 4에 표 로 표로 작성되어 있습니다. 두 번째 라운드 PCR은 단일 유동 세포에서 NGS에서 멀티플렉싱에 필요한 INDEX 서열을 갖는 프라이머를 이용한다. 따라서 각 샘플에는 다른 인덱스로 태그가 지정되어야 합니다. 프라이머 서열은 보충 표 1에 제공된다. - 각 샘플 및 음성 대조군에 대해 50 μL의 총 반응 부피에서 500 ng의 일차 PCR 산물로 네 개의 반응을 설정한다.
- 전기영동을 위해 전체 생성물을 2% TBE 아가로스 겔을 사용하여 로딩하고 1 kb 분자 사다리를 이용하여 밴드 크기를 확인하였다. 앰플리콘의 크기는 399 bp이다.
- 겔 문서화 시스템에서 PCR 산물을 시각화합니다.
- 특정 밴드를 절제하고 겔 정제 키트를 사용하여 정제하십시오.
참고: 키트를 사용한 정제를 위한 계산은 표 3에 제공된다. - 용출 완충액의 30 μL의 최종 부피에서 용출한다. 각 용리액의 대략적인 농도는 약 80-90 ng / μL이며 총 부피는 30 μL입니다.
8. 차세대 시퀀싱 및 데이터 분석
- 겔-정제된 생성물을 단계 7.13으로부터 서열화한다. 차세대 시퀀서(예를 들어, 일루미나) 상에서 고갈된 shRNAs에 대한 판독 카운트를 획득한다.
- Fastx-tool 키트(버전 0.7)를 사용하여 생성된 FastQ 판독의 어댑터 시퀀스를 트리밍합니다.
- Bowtie 얼라이너를 사용하여 필터링된 읽기를 두 개의 불일치를 허용하는 매개 변수와 함께 참조 시퀀스에 정렬합니다. 어댑터 트리밍 후 읽기 길이가 약 21bp인지 확인합니다.
- Samtools (버전 1.9) 프로그램을 사용하여 파일을로드하십시오. Flagstat 옵션을 사용하고 정렬 요약을 계산합니다.
- 트리밍된 fastQ 파일을 CRISPRCloud2(CC2) 소프트웨어(https://crispr.nrihub.org/)에 FASTA 파일 형태의 참조 shRNA 서열과 함께 로드하고 지침에 따라 분석을 수행합니다.
- CC2에서 분석 시작 링크를 클릭합니다.
- 화면 유형을 생존 및 드롭아웃 화면으로 선택합니다. 그룹 수를 설정하고 각 그룹의 이름을 입력합니다.
- 참조 라이브러리를 FASTA 파일 형식으로 업로드합니다. 업로드된 데이터가 처리됩니다. 출력 URL을 클릭하여 결과를 얻습니다.
참고: 이 소프트웨어는 sgRNA/shRNA 수준의 차이를 측정하기 위해 수정된 스튜던트 t-검정이 있는 베타-이항 모델을 사용하고, 피셔의 결합 확률 검정을 통해 유전자 수준의 유의성을 추정합니다. 처리된(농축/고갈된) 및 처리되지 않은 샘플(기준선) 사이의 후성유전학적 요인에 대한 shRNAs의 추정된 전체 로그2배 변화(Log2Fc)를 "p-값" 및 "FDR 값"으로 계산한다.
- 드롭아웃 화면의 경우 FDR 값이 "음수"이고 생존 화면의 경우 "양수"인지 확인합니다.
참고: CC2는 판독값을 계산하고 샘플 간의 shRNA의 폴드 표현(농축 또는 고갈)을 계산하기 위한 분석 플랫폼입니다. - CC2 결과로부터 유의하게 농축되고 고갈된 shRNA (FDR <0.05)를 확인한다.
참고: 각 인자에 대해 5-24개의 shRNA가 있습니다. 각각의 shRNAs에 대한 FDR 값을 확인; <0.01 인 FDR을 고려하고 선택된 shRNA에 대한 평균을 취하십시오. 상위 40 개의 히트를 고려하십시오. Log2Fc 또는 FDR 음수 값을 기반으로 선택된 요인에 대한 그래프를 플로팅합니다. 비표적화 shRNA가 대조군 shRNA로 사용될 때 데이터의 신뢰성을 보장하기 위해 또한 유의한 FDR 값을 가지고 있는지 확인하십시오.
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Representative Results
전체 스크리닝 워크플로우는 도 1A에 묘사되어 있다. MV4-11의 시험관내 세포독성은 AraC R(48h)이 MV4-11 AraCR에서 시타라빈에 대한 IC50이 MV4-11P보다 높은 것으로 나타났다(도 1B). 이 세포주는 시타라빈 내성을 담당하는 후성유전학적 인자를 스크리닝하기 위한 모델로서 연구에 사용되었다.
도 2A는 UltramiR 서열 내에서 스크램블링된 shRNA와 함께 hEF1α (인간 신장 인자 1α), hCMV (인간 사이토메갈로바이러스) 및 SSFV (비장 초점 형성 바이러스)의 세 가지 상이한 프로모터와 함께 선형화된 pZIP 벡터 맵을 보여준다. 도 2B 는 hEF1a 프로모터에 의해 구동되는 선택가능한 마커로서 Zsgreen 및 퓨로마이신을 갖는 후성유전학적 인자를 표적화하는 shRNA 및 라이브러리 실험에 사용된 pZIP 벡터 맵을 도시한다. 이들 벡터는 가장 유력한 프로모터 실험의 선택에 사용되었다.
표적 세포에서 일관되고 연장된 발현을 얻기 위한 가장 강력한 프로모터의 선택이 도 3에 예시되어 있다. MFI에 의해 측정된 GFP의 정량화는 세 프로모터 모두에 대해 MV4-11 AraC R에서 72시간 말에 90% 이상의 형질도입 효율을 나타냈다. GFP 발현에 대한 히스토그램은 형질도입 3일째에 hEF1a 및 SFFV의 경우에 동질적이지만 hCMV에 대한 이종 집단을 나타낸다(도 3A). 막대 그래프는 MV4-11 AraCR에서의 형질도입의 3일째에 3개의 상이한 프로모터(hEF1α, hCMV, 및 SFFV)에 의해 구동되는 GFP 발현을 보여준다(도 3B). SFFV 구동 GFP는 형질도입 5일째에 MFI의 감소를 나타냈다(도 3C). MFI의 감소는 hEF1a 구동 GFP 형질도입된 MV4-11 모라인 포스트 분류에서 관찰되지 않았다. 따라서, hEF1a 프로모터는 세포주에 적합한 프로모터로서 확인되었다(도 3D).
도 4A는 형질감염 후 48 h의 293T 세포에서 풀링된 shRNA 라이브러리 플라스미드의 형질감염 효율을 도시한다. GFP 발현은 밝았고, 양호한 형질감염 효율을 나타냈다. 바이러스 수집 후, 제조된 풀링된 바이러스의 형질도입 효율을 293T 세포에서 세 가지 상이한 농도 (2 μL, 4 μL, 및 8 μL)로 체크하였다. 2 μL 바이러스도 8 μL 바이러스와 동일한 효율을 나타냄을 관찰하였고, 이로써 높은 바이러스 역가를 확인하였다(도 4B).
도 5는 MV4-11 AraC R 세포주에서의 풀링된 라이브러리 형질도입 및 렌티바이러스 역가의 결정을 도시한다. 풀링된 shRNA 라이브러리 렌티바이러스를 100x 희석한 다음, MV4-11 AraC R 세포주를 상이한 부피 (1 μL, 1.5 μL, 2 μL, 및 2.5 μL)에 첨가하였다. 효율은 72 h의 끝에서 검사되었다. 형질도입 효율은 바이러스의 2-2.5 μL에 대해 30%였으며, 세포당 하나의 shRNA 통합을 확인하였다(도 5A). 1.1 x 107 MV4-11 AraC R 세포에서 2.5μl의 풀링된 라이브러리 바이러스를 사용한 형질도입은 30% 형질도입 효율을 가져왔다. GFP 양성 세포를 분류하고, 풀링된 shRNA 라이브러리를 나타낸다(도 5B).
MV4-11 AraC R 세포주에서 풀링된 shRNA 후성유전학적 렌티바이러스의 형질도입 후, GFP 양성 세포를 5일째 또는 7일째에 분류하였다(도 6). 이들 분류된 세포는 9일 동안 시타라빈에 장기간 노출을 실시하였다. 생존능은 9일째에 확인되었고, DNA를 위해 세포를 수집하였다. (도 6A). 막대 그래프는 시타라빈의 존재하에 형질도입된 세포의 증식 속도의 감소를 보여준다(도 6B).
샘플로부터 추출된 DNA를 두 차례의 PCR을 실시하고, 최종 겔 용출된 생성물은 NGS에 의해 정량화된 농축된 shRNAs를 나타내었다. 도 7A는 PCR의 1차 및 2차 라운드에 사용된 프라이머의 결합 영역을 보여주며, 여기서 1차 라운드 프라이머는 통합된 shRNA의 플랭킹 영역에 결합하고, 2차 정방향 프라이머는 루프 서열에 결합한다. 역방향 프라이머는 PCR의 1차 라운드에서 증폭된 벡터의 영역에 결합한다. 도 7B 및 도 7C는 NGS 분석을 위해 겔 용출, 정제 및 제출되었던 1차 (397 bp) 및 2차 라운드 PCR (399 bp)의 말기에서의 PCR 산물의 밴드 크기를 도시한다.
DNA를 표준 품질 관리 절차에 적용한 후, 샘플을 NGS 분석을 위해 처리하였다. 우리는 풀링된 shRNA 스크리닝에서 풍부 및 고갈된 shRNA를 식별하기 위해 사용자 친화적인 클라우드 기반 분석 플랫폼인 CRISPRCloud2를 사용했습니다. 도 8은 AML에서 시타라빈 내성을 매개할 수 있는 후성유전학적 인자를 표적화하는 농축 또는 고갈된 shRNA의 표현을 도시한다.
그림 1: 연구의 개요 및 모델. (A) 워크플로의 개요 그림. (b) MV4-11 모 및 AraC 내성 세포를 증가된 시타라빈 농도 (0.1 μM 내지 1000 μM)로 처리하고 생존력-MTT 검정에 의해 평가하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 선형화된 벡터의 그림입니다. (A) 세 벡터는 UltramiR 서열 내에서 스크램블링된 shRNA와 함께 hEF1α (인간 신장 인자 1α), hCMV (인간 사이토메갈로바이러스) 및 SSFV (비장 초점 형성 바이러스)의 세 가지 다른 프로모터와 매핑된다. (b) hEF1α 프로모터 및 Zsgreen 및 퓨로마이신을 선택가능한 마커로서 후성유전학적 인자를 표적화하는 shRNA를 사용한 라이브러리 실험에 사용된 벡터 맵의 예시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: shRNAs의 지속적이고 연장된 발현을 얻기 위한 가장 강력한 프로모터의 선택 . (A) hEF1a, hCMV 및 SFFV 프로모터에 대한 72시간의 끝에서 유세포 분석기에 의해 정량화된 GFP에 대한 대표적인 유동 플롯. hCMV는 이종 피크를 나타내는 반면, hEF1a 및 SFFV는 단일 균질 피크를 나타낸다. (b) MV4-11 AraC R 세포주에서의 프로모터 효율. (c) SFFV 구동 GFP는 장기간의 배양에서 GFP의 침묵을 나타낸다. (d) hEF1a-구동 GFP 세포는 세포의 분류 후 지속적인 발현을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 제조된 풀링된 shRNA 렌티바이러스 의 효율 확인. (A) 형광 현미경 이미지는 10x 배율을 사용하여 48시간 말에 293T로 형질감염된 풀링된 shRNA 라이브러리의 형질감염 효율을 보여준다. (b) 풀링된 바이러스의 형질도입 효율은 10x 배율을 사용하여 다양한 바이러스 부피(2μL, 4μL 및 8μL)를 갖는 293T 세포에서 평가되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 표적 세포주에서 라이브러리 형질도입을 풀링하고 렌티바이러스 역가를 결정한다 . (A) MV4-11 다양한 부피의 바이러스로 형질도입된 AraC R 세포주 (1μL, 1.5μL, 2μL, 및 2.5μL). 효율은 72시간 말에 확인되었다. (B) 1 x 107 MV4-11 AraC R 세포에서 풀링된 라이브러리 바이러스의 형질도입은 30% 형질도입 효율을 달성한 다음, GFP 양성 세포를 분류하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 약물 내성을 매개하는 후성유전학적 인자를 확인하기 위한 드롭아웃 스크리닝. (A) 내성 세포의 농축을 위한 약물 치료의 개략적인 그림. 도서관에 감염된 세포를 9일 동안 장기간 시타라빈 노출을 실시한 다음, 생존력을 확인하고 DNA 추출을 위해 세포를 수집하였다. (b) 내성 세포주에서 장기간 시타라빈 노출에 대한 생존력의 감소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: 통합된 shRNA를 나타내는 앰플리콘의 제조 . (A) PCR의 1차 및 2차 라운드에 사용된 프라이머의 결합 영역은, 여기서 1차 라운드 프라이머는 통합된 shRNA의 플랭킹 영역에 결합하고 제2 정방향 프라이머는 루프 서열에 결합한다. 역은 1차 PCR에서 증폭된 벡터 영역의 영역에 결합한다. (b) 1차 라운드 PCR의 말기에서의 PCR 산물의 밴드 크기(397 bp)의 예시. (c) 2차 라운드 PCR 산물(399bp)을 겔-용출, 정제, 및 NGS에 대해 제공하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: AML 세포주(MV-4-11 Ara-C R 세포주)에서의 스크리닝 결과. DNA를 표준 품질 관리 절차에 적용한 후, 샘플을 NGS 분석을 위해 처리하였다. 우리는 사용자 친화적 인 클라우드 기반 분석 플랫폼 인 CRISPRCloud2를 사용하여 풀링 된 shRNA 스크리닝에서 풍부하고 고갈 된 shRNA를 확인했습니다. 이 그림은 AML에서 시타라빈 내성을 매개할 수 있는 후성유전학적 인자를 표적으로 하는 농축되거나 고갈된 shRNA를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 형질감염 플라스미드 믹스의 제조 (10cm 플레이트에 대한 계산) 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 제 1 차 PCR 라운드용 PCR 반응 혼합물은 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3 : PCR의 1 번째 산물의 정제를위한 계산은이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4: PCR 2차 라운드용 PCR 반응 혼합물은 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
RNA 간섭 (RNAi)은 siRNA 및 shRNA 스크리닝을 포함하는 기능적 유전체학 연구에 광범위하게 사용됩니다. shRNA의 이점은 이들이 플라스미드 벡터에 혼입되어 게놈 DNA에 통합될 수 있고, 따라서 표적 mRNA의 안정한 발현 및 따라서 보다 연장된 녹다운을 초래할 수 있다는 것이다. 풀링된 shRNA 라이브러리 스크리닝은 기존의 어레이 스크린(siRNA)에 비해 견고하고 비용 효율적이다. 게놈 전체 스크린에서 특정 부류의 단백질의 본질성을 확인하는 것은 번거로울 수 있다. 표적화된 스크리닝 접근법은 감소된 잡음과 함께 특정 클래스 내에서 암 세포 생존 또는 약물 내성에 대한 개별 단백질의 본질성을 드러낼 수 있다. 이 프로토콜은 후성유전학적 인자의 RNAi 스크린을 강조하여 필수 유전자와 비필수 유전자를 체계적으로 모두 조사하며, AML 약물 내성을 담당하는 표적을 식별할 수 있는 기능적 플랫폼으로서 이 접근법의 사용을 입증한다.
이 강력한 기술은 실험의 설계 및 실행에 특정 예방 조치를 요구합니다. 첫 번째는 shRNAs의 발현을 위해 세포 배양 동안 유의한 침묵을 겪지 않는 프로모터의 선택인데, 이는 그들의 강력한 발현이 표적 유전자의 녹다운에 중요하기 때문이다. 둘째, shRNA 표현의 유지(각 shRNA로 형질도입된 세포의 수)는 특히 중요하다. shRNA 스크린 전체에서, shRNA 구축물 당 >500개의 세포의 평균 표현은 표현형 효과를 야기하는 shRNA를 확인하기 위한 잠재력을 증강시킨다.
RNAi 스크리닝 전략은 경쟁적 성장 스크린이다; 따라서, 표적 세포가 대수 성장 단계에 있고 제한된 성장으로 인한 표현의 손실을 최소화하기 위해 과잉 합류화되지 않도록 하는 것이 중요하다. 실험 변동을 최소화하기 위해 세포를 50 % -70 % 합류로 유지하는 것이 이상적입니다. 우리는 실험 변화를 줄이기 위해 모든 스크린 복제물에 대해 지속적으로 많은 배지, 혈청, 바이러스 상청액, 약물 및 조직 배양 플라스틱 제품을 유지하는 것이 좋습니다.
세포 당 shRNA의 하나의 통합을 달성하는 데 필요한 바이러스의 부피를 계산하기 위해 렌티 바이러스의 형질 도입 효율을 최적화하기 위해 파일럿 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 세포당 하나의 shRNA의 이러한 통합을 달성하기 위해, 형질도입 효율은 30% 미만이어야 한다. 30% 형질도입된 세포를 얻기 위한 바이러스의 양으로서는 실험에 사용되는 세포주마다 다를 수 있으므로, 각 세포주에 대한 표준화 실험이 필요하다. 형질도입 효율은 또한 세포 배양 조건 및 세포 증식 속도에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, 기능적 역가는 스크리닝 실험에 사용된 것과 동일한 조건을 사용하여 파일럿 실험에서 결정되어야 한다. 3-6번의 반복실험을 유지하는 것은 통계적으로 유의미한 히트를 얻기 위해 항상 권장됩니다.
shRNA 스크리닝 접근법의 두 가지 주요 관심사는 shRNAs16의 오프 타겟 효과와 가변 녹다운 효율이다. 이들은 각 유전자의 다중 shRNA를 사용하여 극복 될 수 있습니다. 포유류 세포에 원핵 면역계 CRISPR-Cas9를 적응시키는 것은 배양된 인간 세포에서 쉽고 효율적이며 비용 효율적인 게놈 편집을 가능하게 하였다. 이 시스템은 shRNA를 사용하여 수행되는 것과 유사한 게놈 전체 유전자 스크린을 수행하기 위해 광범위하게 이용되어 왔다. 특정 단일-가이드 RNA (sgRNA) 서열을 보유하는 세포의 운명은 딥 시퀀싱을 사용하여 모니터링될 수 있다. 여기에 설명된 실험 설정은 CRISPR 스크리닝에도 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이없고 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 SRV에 BT / PR8742 / AGR / 36 / 773 / 2013 생명 공학부 보조금에 의해 부분적으로 자금을 지원합니다. 인도 BT/COE/34/SP13432/2015 및 인도 과학기술부: EMR/2017/003880 ~ P.B. RVS 및 P.B.는 Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 및 IA/S/15/1/501842에서 각각 지원합니다. S.D.는 CSIR-UGC 펠로우십의 지원을 받으며, S.I.는 ICMR 선임 연구 펠로우십의 지원을 받습니다. Abhirup Bagchi, Sandya Rani 및 CSCR Flow Cytometry Core Facility 직원에게 도움을 주신 것에 감사드립니다. 또한 고처리량 시퀀싱 및 데이터 분석을 도와준 MedGenome Inc.에게도 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
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