Summary
I detta protokoll används tekniken Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) för att bestämma kedjelängdsfördelningen (CLD) och den genomsnittliga kedjelängden (ACL) för glykogen.
Abstract
Glykogenpartiklar är grenade polysackarider som består av linjära kedjor av glukosylenheter kopplade med α-1,4 glukosidbindningar. De senare är fästa vid varandra genom α-1,6 glukosidbindningar, kallade grenpunkter. Bland de olika formerna av kollagring (dvs stärkelse, β-glukan) är glykogen förmodligen en av de äldsta och mest framgångsrika lagringspolysackariderna som finns i hela den levande världen. Glukankedjor är organiserade så att en stor mängd glukos snabbt kan lagras eller drivas i en cell vid behov. Många kompletterande tekniker har utvecklats under de senaste decennierna för att lösa den fina strukturen hos glykogenpartiklar. Denna artikel beskriver fluoroforassisterad kolhydratelektrofores (FACE). Denna metod kvantifierar populationen av glukankedjor som utgör en glykogenpartikel. Även känd som kedjelängdsfördelning (CLD), speglar denna parameter partikelstorleken och procentandelen förgrening. Det är också ett väsentligt krav för matematisk modellering av glykogenbiosyntes.
Introduction
Glykogen, som används som kol- och energilagring, är en homopolymer av glukos bestående av linjära kedjor av glukosylenheter kopplade av (1 → 4) -α bindningar och bundna genom (1 → 6) -α glykosidbindningar eller förgreningspunkter. De förekommer som β- och α partiklar i cytosolen hos ett brett spektrum av organismer. β partiklar är små vattenlösliga partiklar som huvudsakligen observeras i prokaryoter. Deras diameter sträcker sig från 20-40 nm, sannolikt dikterad av glykogenmetaboliserande enzymer och steriskt hinder 1,2.
Först beskrivet i djurceller visar de större α-partiklar upp till 300 nm i diameter med en blomkålliknande form. Denna speciella organisation kan härröra från aggregeringen av flera β-partiklar eller kan uppstå genom att spira ur en enda β-partikel3. Intressant nog har en ny studie rapporterat närvaron av α partiklar i Escherichia coli4. Men till skillnad från α partiklar från djurceller faller de senare snabbt sönder under extraktionsprocessen, vilket kan förklara bristen på data i litteraturen4. Utseendet av α partiklar i eukaryoter och prokaryoter involverar fylogenetiskt orelaterade glykogenmetaboliserande enzymer5. Detta väcker frågor om funktionen hos sådana partiklar och arten av potentiella tvärbindningsmedel mellan β-partiklar5.
Även om två motsatta matematiska modeller föreslogs för glykogenmolekylbildning 6,7,8,9, är det allmänt accepterat att β partiklar har utvecklats som svar på deras metaboliska funktion som en mycket effektiv bränslereserv för snabb frisättning av stora mängder glukos. En stor mängd bevis indikerar att glykogenegenskaper som smältbarhet och löslighet i vatten är korrelerade med den genomsnittliga kedjelängden (ACL), som sedan kommer att diktera procentandelen förgreningspunkter och partikelstorleken 2,6,7,8,10,11 . ACL definieras av förhållandet mellan det totala antalet glukosrester och antalet förgreningspunkter. Typiskt varierar ACL-värdena från 11-14 och 7-23 glukosrester i eukaryoter respektive prokaryoter10. Hos människor beror flera glykogensjukdomar på onormal glykogenackumulering. Till exempel är Andersens sjukdom associerad med den bristande aktiviteten hos ett glykogenförgrenande enzym, vilket resulterar i ackumulering av onormalt glykogen11. I prokaryoter tyder kumulativa studier på att ACL är en kritisk faktor som påverkar nedbrytningshastigheten för glykogen och bakterieöverlevnadsförmåga12,13. Det har rapporterats att bakterier som syntetiserar β-partiklar med lågt ACL-värde bryts ned långsammare och därför tål svältförhållanden längre. Således är kunskap om arkitekturen hos β-partiklar avgörande för att förstå bildandet av onormala glykogenpartiklar i mänskliga glykogenlagringssjukdomar och prokaryoter överlevnad i en näringsfattig miljö.
Sedan den första isoleringen av glykogen från hundlever av den franska fysiologen Claude Bernard i slutet av artonhundratalet14 utvecklades många tekniker för att karakterisera glykogenpartiklar i detalj. Till exempel transmissionselektronmikroskopi för glykogenmorfologi (α- eller β-partiklar)15, proton-NMR-spektrometri för bestämning av procentandelen α-1,6 kopplingar16, storleksuteslutningskromatografi med multidetektorer för att härleda molekylvikten, fluoroforassisterad kolhydratelektrofores (FACE)17 eller högpresterande anjonbyteskromatografi med pulserad amperometrisk detektion (HPAEC-PAD) för både kedjelängdsfördelning (CLD) och ACL bestämning18.
Detta arbete fokuserar på den fluoroforassisterade kolhydratelektroforesmetoden, som bygger på reduktiv aminering av hemiacetalgruppen genom primär aminfunktion. Historiskt sett användes 8-amino-1,3,6-naftalentrisulfonsyra (ANTS) först för märkning. Senare ersattes den av den känsligare fluoroforen, 8-amino 1,3,6 pyrentrisulfonsyra (APTS)19.
Figur 1: Den reduktiva amineringsreaktionen med 8-amino 1,3,6 pyrentrisulfonsyra (APTS). Reduktiv amineringsreaktion av hemiacetalgruppen genom primär aminfunktion av 8-amino 1,3,6 pyrentrisulfonsyra (APTS) under reduktiva förhållanden Klicka här för att se en större version av denna figur.
Som avbildas i figur 1 interagerar den hemiacetala funktionen hos den reducerande änden av en glukankedja med den primära aminen av APTS under reducerande förhållanden. De sulfoniska grupperna av APTS bär negativa laddningar som möjliggör separation av glukankedjor enligt deras polymerisationsgrad (DP). Den reduktiva aminreaktionen är mycket reproducerbar och effektiv. En genomsnittlig effektivitetsmärkning på 80% erhålls för DP3 till DP135 och upp till 88% och 97% för maltos (DP2) respektiveglukos 17,20. Eftersom en molekyl APTS reagerar med den reducerande änden av varje glukankedja, kan enskilda kedjor kvantifieras och jämföras med varandra på molär basis.
Protocol
1. Inkubation med debranching enzymer
- Blanda 200 μl renat glykogen vid 0,5-2 mg / ml med 200 μL 100 mM acetatbuffert (pH 4,8). Tillsätt 2 μl isoamylas (180 U/mg protein) och 1,5 μl pullulas (30 U/mg protein) (se materialtabell), blanda försiktigt genom pipettering uppåt och nedåt och inkubera vid 42 °C i 16 timmar i ett rör på 1,5 ml.
OBS: Nedbrytning eller amylaskontaminering kan inträffa under glykogenreningsprocessen. För att uppskatta närvaron av fria malto-oligosackarider kan prover inkuberas utan den avbrancherande enzymcocktailen parallellt. En standard (t.ex. maltoheptaos) ingår i analysen för att bestämma förhållandet mellan elueringstiden och graden av polymerisation. - Stoppa reaktionerna genom att inkubera vid 95 °C i 5 minuter.
- Centrifugera vid 16 100 x g i 5 min vid rumstemperatur för att pelletera och avlägsna eventuellt olösligt material.
- Ta bort supernatanterna med en pipett och överför dem till nya kommenterade rör. Avsalta supernatanterna genom att tillsätta motsvarande 100 μL anjon-/katjonbytarhartspärlor (AG-501-X8, se materialtabell) och agitera.
- Agitera regelbundet pärlorna i 5 min. Samla in proverna genom pipettering och placera dem i nya kommenterade rör.
- Frystorka eller använd en vakuumindunstare som ställts in (se materialtabell) vid 30 °C för att torka proverna.
- Förvara torkade prover vid rumstemperatur eller vid -20 °C.
OBS: Proverna kan lagras i 1 månad.
2. Reduktiv aminering
- Blanda de torkade proverna med 2 μl 1 M natriumcyanoborhydrid i tetrahydrofuran (THF) och 2 μl APTS (5 mg APTS återsuspenderat i 48 μL 15% ättiksyra) (se materialtabell).
- Inkubera vid 42 °C i 16 timmar i mörker.
VARNING: Natriumcyanoborhydrid hanteras med anpassad personlig skyddsutrustning och under en kemisk huva. Inandning och kontakt med huden är mycket giftiga och kan vara dödliga och orsaka allvarliga hudbrännskador och ögonskador. Mycket giftiga gaser kan genereras vid blandning av natriumcyanoborhydrid med ättiksyra. Vid kontakt med vatten släpper natriumcyanoborhydrid brandfarliga gaser, som kan antändas spontant. Koncentrerade prover hanteras under en kemisk huva och med anpassad personlig skyddsutrustning från och med detta steg.
3. Face-analys
- Tillsätt 46 μl ultrarent vatten till varje prov.
- Späd proverna direkt till 1/50 i mikroflaskor på 100 μl genom att tillsätta 1 μl av provet till 49 μl ultrarent vatten. Håll proverna i mörker medan du ställer in FACE (5-10 min).
- Utför elektrofores med omvänd polaritet med ett kapillärelektroforesinstrument med en laserinducerad fluorescensdetektor (LIF) (se materialtabell). Ställ in polariteten på "omvänd läge" för separation, ställ in LIF på 488 nm emissionsvåglängd och detektorn på 512 nm.
- Ställ in injektionstiden på 10 s och insprutningstrycket på 0,5 psi.
- Utför den APTS-märkta glukanseparationen vid 30 kV i en bare smält kiseldioxidkapillär på 60,2 cm i längd med en innerdiameter på 50 μm (375 μm ytterdiameter) i den N-länkade kolhydratseparationsbufferten utspädd till 1/3 i ultrarent vatten (se materialtabell).
OBS: Den N-länkade kolhydratseparationsbufferten byts ut var 20: e körning.
4. Databehandling
- Exportera ". ASC "och ". CDF "-filer som innehåller elektroferogramprofilen respektive integrationsdata.
- Öppna . ASC-fil och rita den relativa fluorescensenheten enligt tidsschemat.
- Öppna . CDF-fil , fortsätt med en första automatisk integration och justera följande parametrar: bredd; dal till dal integration; minsta yta.
- Kontrollera och korrigera eventuella felaktiga integrationshändelser manuellt.
Representative Results
Bestämning av den genomsnittliga kedjelängden för glykogen
Figur 2 representerar det arbetsflöde som krävs för att härleda kedjelängdsfördelningen och den genomsnittliga kedjelängden (ACL) för glykogen.
Figur 2: Arbetsflöde för att bestämma kedjelängdsfördelning (CLD) och genomsnittlig kedjelängd.
Figur 3 visar elektroferogrammen för kommersiell maltohexaos och avgrenad bovin leverglykogen. Fluorescenssignalerna som observerades mellan 4,13-4,67 min i alla experiment härstammar från den oreagerade APTS. Elueringstiden för märkt maltohexaose (DP6) uppskattades till 8,49 min (figur 3A). De APTS-märkta glukanerna av bovint glykogen identifierades baserat på elueringstiden för DP6 (figur 3B). Inga spår av fri malto-oligosackarid påvisades i kontrollprovet (glykogen som inte inkuberades med debrancherande enzymer) (figur 3C).
Figur 3: Elektroferogram av en standard och bovint leverglykogen (A) Tidselutionen (8,49 min) av en glukanstandard, maltohexaose (DP6), användes som referens för att bestämma graden av polymerisation (DP) av APTS-märkta glukaner frisatta från bovint leverglykogen efter verkan av debrancherande enzymaktiviteter (B) ). Infälld panel visar en separation av glukankedjor upp till 44 DP. Parallellt märktes obehandlat bovint glykogen med APTS för att detektera möjliga spår av fria malto-oligosackarider i prov (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Man kan dra slutsatsen att frisättningen av APTS-märkt glukan beror på klyvning av förgreningspunkter av både isoamylas- och pullulanasaktiviteter. Det bör noteras att kapillärelektroforesprofilen kan ritas om i ett mer lämpligt format för att skapa en mosaikfigur som innehåller flera profiler. För att göra detta genereras DATA-filer som innehåller fluorescensvärden med tillägget "asc" och öppnas i kalkylprogrammet genom att välja CSV-format (kommaseparerat värde). Tyvärr är de exporterade fluorescensvärdena inte associerade med motsvarande elueringstid. Följaktligen måste de läggas till manuellt enligt upptagningsfrekvensinställningen på FACE-apparaten (4 Hz betyder ett värdeförvärv var 0,25 s).
Toppområden härleddes sedan med hjälp av FACE-instrumentets ursprungliga applikation eller exporterades som en DATA-fil med tillägget "cdf" för att använda ett annat program. Areavärdena exporteras i ett kalkylprogram och normaliseras genom att DP uttrycks som en procentandel av den totala ytan (bild 4).
Bild 4: Datanormalisering, fördelning av kedjelängd och genomsnittligt kedjelängdsvärde. Områden med fluorescenstopp importerades och normaliserades i ett kalkylblad. Kedjelängdsfördelningen visas som procentandelen DP för varje DP. Den genomsnittliga kedjelängden (ACL) beräknas genom att summera varje procentkedja gånger motsvarande grad av polymerisation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Slutligen härleds den genomsnittliga kedjelängden (ACL) genom att beräkna summan av varje procentkedja gånger motsvarande grad av polymerisation. Liknande experiment utfördes i tre exemplar på kaninleverglykogen (figur 5A), på bovint leverglykogen (figur 5B) och ostronglykogen (figur 5C).
Figur 5: Kedjelängdsfördelning av kommersiellt glykogen. Kaninlever (A), bovin lever (B) och ostronglykogen (C) inkuberades i närvaro av debrancherande enzymer (isoamylas och pullulanas). De APTS-märkta glukanerna separerades sedan enligt deras polymerisationsgrad (DP) med hjälp av FACE-analys. Maltos (DP2), maltohexaose (DP6) maltoheptaos (DP7) representerar de vanligaste glukanerna i kaninlever, ostron respektive bovin leverglykogen. Standardfelet för medelvärdet (SEM) härleddes från tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kedjelängdsfördelningen av kaninleverglykogen visade tydligt ett högre innehåll av kort malto-oligosackarid (DP2) än bovint leverglykogen (DP7) eller ostronglykogen (DP6). Som ett resultat har kaninleverglykogenet den lägsta genomsnittliga kedjelängden (ACL = 9,8) jämfört med bovint leverglykogen (ACL = 11,9) och ostronglykogen (ACL = 12,6). Det bör noteras att dessa kommersiella glykogener vanligtvis används för att analysera glykogenfosforylas- eller glykogensyntasaktiviteten. Detta tyder på att bestämningen av kinetiska parametrar (Vmax och Km) för glykogenmetaboliserande enzymaktiviteter kommer att variera beroende på glykogenkällan.
Subtraktiva analyser
Den subtraktiva analysen är en enkel metod för att jämföra glukankedjans fördelning av två prover. Till exempel bestämdes CLD av glykogen som produceras av vildtypen (WT) Synechocystis PCC6803-stammen och enstaka isogena glgA1 - och glgA2-mutantstammar (figur 6A).
Figur 6: Jämförelse av kedjelängdsfördelningar med subtraktiv analys( A) Kedjelängdsfördelningarna för glykogen renat från cyanobakteriella stammar: vildtyp (WT) Synechocystis PCC6803 och enstaka isogena glgA1 - och glgA2-mutantstammar bestämdes med hjälp av FACE-analys. Standardfelet för medelvärdet (SEM) härleddes från tre oberoende experiment. (B) Subtraktiva analyser utfördes genom att subtrahera % av varje DP av WT till % av varje DP av ΔglgA1 och subtrahera % av varje DP av WT till % av varje DP av DP ΔglgA2. Denna enkla matematiska manipulation visar förändringen av glukankedjor i mutanta stammar (svarta linjer). (C) De genomsnittliga kedjelängdsfördelningarna av glykogen från vildtyp och mutanter av Synechocystis normaliserades enligt den maximala topp som observerades för varje CLD (DP6 för alla prover). Två komponenter framgår av plottning av den normaliserade CLD på en logaritmisk skala (Nde (DP)). Varje komponent indikerar en annan mekanism för tillväxtstopp (för mer information, se referens2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att komma ihåg har de flesta cyanobakteriestammar två gener som kodar för glykogensyntasaktiviteter: GlgA1 och GlgA221. Båda enzymerna överför restglukosen av ADP-glukos till de icke-reducerande ändarna av linjära glukankedjor. Som visas i figur 6A är det utmanande att jämföra prover genom att bara titta på kedjelängdsfördelningsprofilerna. Den subtraktiva analysen består av att subtrahera procentandelen av varje DP mellan prover (figur 6B). Den subtraktiva analysen av % DP av WT minus % av DP ΔglgA1 mutant avslöjar ett överskott av DP3, 4 och 5 (negativa värden) och ett minskat innehåll av DP 10-20. Däremot indikerar den subtraktiva analysen mellan % DP av WT och % av DP ΔglgA2 mutant en motsatt effekt. Eftersom de subtraktiva analysprofilerna skiljer sig åt mellan GlgA1 och GlgA2, tyder detta på en specifik funktion av varje glykogensyntasisoform i glykogenbiosyntes21.
Det är viktigt att notera att subtraktiv analys endast är tillämplig på experiment som involverar ett referensprov som utförs parallellt med proverna. Annars kan subtraktiv analys vara empirisk eftersom den ligger på referensens normaliserade CLD. År 2015 föreslog Deng och medarbetare, som undersökte stoppmekanismer för glykogentillväxt hos möss och människor, en alternativ plottning och tolkning av glykogen-CD för att ta itu med denna fråga. Det här diagrammet använder det maximala toppområdet för att normalisera varje CLD. Data plottas sedan på en logaritmisk skala som markerar två komponenter. Den senare illustrerar två olika mekanismer för kedjeförlängning som stoppar2. Genom att rita linjer som passar den högre DP-komponenten kan absoluta parametrar (dvs. lutningar och skärningspunkter av linjerna) användas för CLD-jämförelse utan normalisering till en referensprofil. CLDs av vildtyp (WT) Synechocystis PCC6803-stammen och de enda isogena glgA1 - och glgA2-mutanterna plottades på en loggskala och passande linjer bestämdes för varje profil (figur 6C). Den första komponenten var mycket lik mellan proverna och toppade med ett maximum vid DP 6. Detta illustrerar att förgreningsenzymet uttryckligen producerar maximalt sådana kedjor. Den andra komponenten framträdde som en bred axel, som redan beskrivits för möss och humana glykogener2. Lutningen för den andra komponenten uppstod vid en högre DP i ΔglgA1 och lutningen för motsvarande monteringslinje (röd linje) var lägre än vildtypprofilen. Således bromsar bristen på GlgA1 arresteringen av kedjeförlängning under biosyntes som föreslogs inträffa genom steriskt hinder för möss och humant glykogen2. Dessa data tyder på att det återstående töjningsenzymet (dvs GlgA2) producerar längre kedjor innan kedjan trängs. I ΔglgA2 observerades motsatt effekt med en mer dramatisk minskning av monteringslinjen, vilket bekräftar att kedjorna som produceras av den återstående GlgA1 totalt sett är kortare än de som syntetiserades av GlgA2 ensam före steriskt hinder. Denna analys tyder på att båda isoformerna har distinkt kinetik och/eller att deras respektive samordning med förgreningsenzymaktivitet skiljer sig åt.
Discussion
De fysikalisk-kemiska egenskaperna hos glykogenpartiklar (t.ex. storlek, morfologi, löslighet) är direkt associerade med längden på glukaner som utgör partiklarna. Varje obalans mellan biosyntetiska och katabola enzymer resulterar i förändring av kedjelängdfördelningen och i sig ackumulering av onormalt glykogen som kan vara farligt för cellen11. FACE-analysen är en metod som valts för att bestämma glykogenets kedjelängdsfördelning (CLD). Som avbildas i figur 2 tillåter bestämningen av CLD inferensen av det genomsnittliga kedjelängdsvärdet för glykogen (ACL), vilket speglar strukturen hos glykogenpartiklar. Djurglykgener med höga ACL-värden är förknippade med utseendet av onormala partiklar. Den subtraktiva analysen är en användbar metod för att jämföra två glykogenprover från olika genetiska bakgrunder (mutant kontra vildtyp). Genom att plotta på en logaritmisk skala har CLD: er normaliserade till maximal topp, å andra sidan, fördelen att jämföra CLD oberoende av en referens och gav oss information om den växande glykogenmekanismen.
Dessutom är FACE-analys en kraftfull teknik för att karakterisera de katalytiska egenskaperna hos glykogenmetaboliserande enzymer. Till exempel klyver alla glykogenförgrenande enzymer (1 → 4) -α kopplingar och överför oligomaltosylgrupper till en (1 → 6) -α position eller förgreningspunkter. Förgreningsenzymer kan särskiljas på grund av deras affinitet för polysackarider (t.ex. amylopektin, glykogen) och längden på överförda glukaner trots den liknande katalytiska mekanismen22. Således kan olika källor till förgreningsenzymer (människa, växt, bakterier) karakteriseras och klassificeras genom en serie inkubationsexperiment och CLD-jämförelser med face-analys23.
Som nämnts i inledningen är HPAEC-PAD också en alternativ metod för att bestämma kedjelängdsfördelningen18. Båda teknikerna kräver fullständig hydrolys av (1 → 6) -α kopplingar eller förgreningspunkter av isoamylase-typ debranching enzymer innan poolen av linjära glukaner separeras enligt deras polymerisationsgrad (DP). HPAEC-PAD-metoden har emellertid två nackdelar jämfört med FACE: (1) det amperometriska pulssvaret minskar när glukankedjorna ökar, vilket inte ger kvantitativ information. Denna massförspänningsfråga kan kringgås med HPAEC-ENZ-PAD som involverar en enzymreaktor efter kolonnen mellan anjonbyteskolonnen och PAD24. Kolonnenzymreaktorn hydrolyserar malto-oligosackarider till glukosrester vilket möjliggör ett konstant pulsamperometriskt svar. (2) HPAEC-PAD möjliggör separation av glukankedjor med en polymerisationsgrad upp till 70. Även om upplösningen är tillräcklig för att bestämma CLD för glykogenprover, separerar FACE kedjor med DP upp till 150, lämpliga för stärkelseprover17. Det är viktigt att komma ihåg att både HPAEC-PAD och FACE-analys har fördelar och nackdelar. Till exempel kräver aminationsreaktionen en fri hemiacetal grupp för att reagera med APTS primära aminfunktion. Detta innebär att APTS-märkning inte kan användas för glukankedjor som saknar reducerande ändar (t.ex. inulin). HPAEC-PAD-metoden kräver inte närvaro av reducerande ändar. En andra intressant aspekt av HPAEC-PAD-metoden är att anjonbyteskolonnen kan laddas med några milligram linjära glukaner, vilket möjliggör rening av malto-oligosackarid med en specifik DP eller 14C-radiomärkt malto-oligosackarid för enzymatisk analys18,25. Slutligen, även om masspektrometri (t.ex. MALDI-TOF) är en snabb och känslig teknik för att bestämma kedjelängdsfördelning, verkar denna teknik vara mindre reproducerbar. Det överskattar mängden långa glukankedjor26. Ändå kan den senare användas för en specifik applikation såsom MALDI-avbildning för att kartlägga närvaron av glykogen över cellulär vävnad27.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter i samband med detta arbete.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av CNRS, Université de Lille CNRS och ANR-bidragen "MathTest" (ANR-18-CE13-0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AG-501-X8 Resin | BioRad | #1436424 | Storage Room temperature |
| 100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8 | Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature. | ||
| APTS stock solution | Merck | 09341-5MG | Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C. |
| Capillary | Sciex Separations, Les Ulis, France | ||
| Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623 | Thermofisher | select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min. |
|
| Excel | Microsoft | Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph. | |
| Free-Dry apparatus | Christ | alpha 2-4 LO plus | before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h. |
| Isoamylase | Megazyme | E-ISAMY | 180 U/mg of protein |
| Maltoheptaose | Merck | M7753 | |
| N-Linked carbohydrate separation buffer | Sciex Separations, Les Ulis, France | 477623 | Storage at 4 °C |
| Pullulanase | Megazyme | E-PULKP | 30 U/mg of protein |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296813-100ML | 1 M Sodium cyanoborohydride in THF |
| Vaccum-evaporator | Eppendorf | Concentrator 5301 | Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried |
References
- Konkolewicz, D., Thorn-Seshold, O., Gray-Weale, A. Models for randomly hyperbranched polymers: Theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 129 (5), 054901 (2008).
- Deng, B., Sullivan, M. A., Wu, A. C., Li, J., Chen, C., Gilbert, R. G. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
- Besford, Q. A., Sullivan, M. A., Zheng, L., Gilbert, R. G., Stapleton, D., Gray-Weale, A. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
- Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in escherichia coli. BioMacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
- Ball, S., Colleoni, C., Cenci, U., Raj, J. N., Tirtiaux, C. The evolution of glycogen and starch metabolism in eukaryotes gives molecular clues to understand the establishment of plastid endosymbiosis. Journal of Experimental Botany. 62 (6), 1775-1801 (2011).
- Zhang, P., Nada, S. S., Tan, X., Deng, B., Sullivan, M. A., Gilbert, R. G. Exploring glycogen biosynthesis through Monte Carlo simulation. International Journal of Biological Macromolecules. 116, 264-271 (2018).
- Melendez-Hevia, E., Waddell, T. G., Shelton, E. D. Optimization of molecular design in the evolution of metabolism: The glycogen molecule. Biochemical Journal. 295 (2), 477-483 (1993).
- Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Cascante, M. How did glycogen structure evolve to satisfy the requirement for rapid mobilization of glucose? A problem of physical constraints in structure building. Journal of Molecular Evolution. 45 (4), 446-455 (1997).
- Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Canela, E. I. The fractal structure of glycogen: A clever solution to optimize cell metabolism. Biophysical Journal. 77 (3), 1327-1332 (1999).
- Wang, L., Wise, M. J. Glycogen with short average chain length enhances bacterial durability. Naturwissenschaften. 98 (9), 719-729 (2011).
- Kanungo, S., Wells, K., Tribett, T., El-Gharbawy, A. Glycogen metabolism and glycogen storage disorders. Annals of Translational Medicine. 6 (24), 474 (2018).
- Wang, L., et al. Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14 (2020).
- Wang, L., et al. Influence of in situ progressive N-terminal is still controversial truncation of glycogen branching enzyme in Escherichia coli DH5α on glycogen structure, accumulation, and bacterial viability. BMC Microbiology. 15 (1), 1-14 (2015).
- Bernard, C. On the physiological mechanism of sugar formation in the liver. Proceedings of the Academy of Sciences. 44 (12), 578-586 (1857).
- Liu, Q. -H., Tang, J. -W., Wen, P. -B., Wang, M. -M., Zhang, X., Wang, L. From prokaryotes to eukaryotes: Insights into the molecular structure of glycogen particles. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 673315 (2021).
- Zang, L. H., Rothman, D. L., Shulman, R. G. 1 H NMR visibility of mammalian glycogen in solution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (5), 1678 (1990).
- O'Shea, M. G., Samuel, M. S., Konik, C. M., Morell, M. K. Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) of oligosaccharides: Efficiency of labelling and high-resolution separation. Carbohydrate Research. 307 (1-2), 1-12 (1998).
- Koizumi, K., Fukuda, M., Hizukuri, S. Estimation of the distributions of chain length of amylopectins by high-performance liquid chromatography with pulsed amperometric detection. Journal of Chromatography A. 585 (2), 233-238 (1991).
- Morell, M. K., Samuel, M. S., Shea, M. G. O.
- Guttman, A., Chen, F. -T. A., Evangelista, R. A., Cooke, N. High-resolution capillary gel electrophoresis of reducing oligosaccharides labeled with 1-Aminopyrene-3,6,8-trisulfonate. Analytical Biochemistry. 233 (2), 234-242 (1996).
- Kadouche, D., et al. Characterization of function of the GlgA2 glycogen/starch synthase in cyanobacterium sp. clg1 highlights convergent evolution of glycogen metabolism into starch granule aggregation. Plant Physiology. 171 (3), 1879-1892 (2016).
- Hayashi, M., Suzuki, R., Colleoni, C., Ball, S. G., Fujita, N., Suzuki, E. Bound substrate in the structure of cyanobacterial branching enzyme supports a new mechanistic model. The Journal of biological chemistry. 292 (13), 5465-5475 (2017).
- Sawada, T., et al. Diversity of reaction characteristics of glucan branching enzymes and the fine structure of α-glucan from various sources. Archives of Biochemistry and Biophysics. 562, 9-21 (2014).
- Wong, K. S., Jane, J. Quantitative analysis of debranched amylopectin by HPAEC-PAD with a post-column enzyme reactor. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 20 (2), 297-310 (1997).
- Colleoni, C., et al. Biochemical Characterization of the chlamydomonas reinhardtii a-1,4 glucanotransferase supports a direct function in amylopectin biosynthesis. Plant Physiology. 120, 9 (1999).
- Broberg, S., Koch, K., Andersson, R., Kenne, L. A comparison between MALDI-TOF mass spectrometry and HPAEC-PAD analysis of debranched starch. Carbohydrate Polymers. 43 (3), 285-289 (2000).
- Sun, R. C., et al. Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation. Cell Metabolism. 33 (7), 1404-1417 (2021).
