Summary
כאן אנו מתארים את הבידוד, ההגברה וההתמיינות של תאי אפיתל האף האנושיים העיקריים (HNE) בממשק האוויר-נוזלי ופרוטוקול ביו-בנקאי המאפשר להקפיא בהצלחה ולאחר מכן להפשיר HNE מוגבר. הפרוטוקול מנתח תכונות אלקטרופיזיולוגיות של תאי HNE ממוינים ותיקון הפרשת כלוריד הקשור ל-CFTR בטיפולי אפנון שונים.
Abstract
קל לאסוף תאי אפיתל האף האנושיים (HNE) על ידי צחצוח אף פשוט ולא פולשני. ניתן להגביר ולהבדיל תאי HNE ראשוניים שמקורם בחולה לאפיתל פסאודו-מרובד בתנאי ממשק אוויר-נוזל כדי לכמת הובלה מחזורית של כלוריד בתיווך AMP (Cl-) כמדד לתפקוד מווסת ההולכה של סיסטיק פיברוזיס טרנס-ממברנה (CFTR). אם שלבים קריטיים כגון איכות צחצוח האף וצפיפות התאים בעת שמירת ההקפאה מבוצעים ביעילות, תאי HNE יכולים להיות ביו-בנקאיים בהצלחה. יתר על כן, מחקרי זרם קצר-חשמלי מראים כי הפשרה בהקפאה אינה משנה באופן משמעותי את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תאי HNE ואת התגובה לאפנוני CFTR. בתנאי התרבית המשמשים במחקר זה, כאשר פחות מ-2 x 106 תאים מוקפאים לכל קריוביאל, שיעור הכשל גבוה מאוד. אנו ממליצים להקפיא לפחות 3 x 106 תאים לכל קריוביאל. אנו מראים שלטיפולים כפולים המשלבים מתקן CFTR עם פוטנציאטור CFTR יש יעילות תיקון דומה לפעילות CFTR בתאי HNE F508del-homozygous. טיפול משולש VX-445 + VX-661 + VX-770 הגדיל באופן משמעותי את התיקון של פעילות CFTR בהשוואה לטיפול כפול VX-809 + VX-770. המדד של פעילות CFTR בתאי HNE הוא סמן ביולוגי פרה-קליני מבטיח המשמש להנחיית טיפול במודולטור CFTR.
Introduction
סיסטיק פיברוזיס (CF) היא הפרעה אוטוזומלית רצסיבית הנובעת ממוטציות בגן ויסות ההולכה של סיסטיק פיברוזיס טרנס-ממברנה (CFTR) המובילות להיעדר או תפקוד לקוי של חלבון CFTR, תעלת אניון הממוקמת במשטח האפיקלי של אפיתליה 1,2. ההתקדמות האחרונה בטיפול ב- CFTR שיפרה את הפרוגנוזה של המחלה, והתרופות המאושרות האחרונות המשלבות מתקנים של CFTR ופוטנציאטורים של CFTR הובילו לשיפורים משמעותיים בתפקוד הריאות ובאיכות החיים של חולי CF הנושאים את המוטציה השכיחה ביותר p.Phe508del מוטציה (F508del)3,4. למרות ההתקדמות הטיפולית המבטיחה הזו, כ-10% מחולי ה-CF אינם כשירים מכיוון שהם נושאים מוטציות שאינן ניתנות להסרה על ידי מודולטורים אלה של CFTR. עבור חולים אלה, יש צורך לבדוק תרופות אחרות או שילובי תרופות כדי למצוא את השילוב היעיל ביותר עבור מוטציות ספציפיות, מה שמדגיש את החשיבות של טיפולים מותאמים אישית.
קל לאסוף תאי אפיתל אף אנושיים (HNE) על ידי צחצוח אף פשוט ולא פולשני ומאפשרים כימות של הובלת כלוריד מחזורית בתיווך AMP (Cl−) כמדד לתפקוד CFTR. תאי HNE מניבים מודל מדויק של דרכי הנשימה האנושיות, אך תוחלת החיים שלהם מוגבלת בתרבית. הודות לאופטימיזציה של טכניקות תרבית, תאי HNE ראשוניים שמקורם בחולה ניתנים לתכנות מחדש באופן מותנה עם מעכב קינאז הקשור ל-Rho (ROCKi), להגבירם ולהבדילם לאפיתל פסאודו-מרובד בתנאי ממשק אוויר-נוזל (ALI) על מסננים מיקרו-נקבוביים 5,6. קיימים פרוטוקולי תרביות רבים לתרבית HNE (זמינים מסחרית, ללא סרום, "תוצרת בית", תרבית משותפת עם תאי הזנה וכו'), ובחירת תנאי המדיה והתרבית תוארו כמשפיעים על הגדילה, התמיינות אוכלוסיית התאים ותפקוד האפיתל 7,8. הפרוטוקול כאן מציג שיטת הגברה פשוטה, נטולת מזינים, ROCKi המאפשרת להשיג בהצלחה מספר רב של תאי HNE שמתמיינים לאחר מכן ב- ALI עבור מבחני תפקוד CFTR.
הראינו כי בתאי HNE ממוינים, טיפול של 48 שעות עם מודולטורים של CFTR מספיק כדי לגרום לתיקון אלקטרופיזיולוגי של זרם Cl- תלוי CFTR, וכי התיקון שנצפה במבחנה עשוי להיות בקורלציה עם השיפור הקליני של המטופל9. תאי HNE, אם כן, מייצגים מודל מתאים לא רק למחקרי CF בסיסיים אלא למחקרים פרה-קליניים עם בדיקות אפנון CFTR ספציפיות למטופל. בהקשר זה של טיפול מותאם אישית, מטרת הפרוטוקול הייתה לאמת שתאי HNE בהקפאה מחולי CF, שגדלו בתנאים שלנו, היו מודל מתאים למחקרי תיקון CFTR, וניתן היה לצפות לתוצאות דומות כאשר משווים את הובלת Cl התלויה ב- CFTR מתאים טריים ומופשרים קפואים. המחקר גם העריך את היעילות של אפנון CFTR שונים בעת שימוש בטיפולים כפולים ומשולשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות שתוארו על ידי הצהרת הלסינקי וחוק Huriet-Serusclat על אתיקה של מחקר אנושי.
1. הכנת צלוחיות ומדיה שונה
- הכן הגברה, אוויר-נוזל ואמצעי הקפאה כמתואר בטבלה 1.
- הכינו תמיסת מלאי של קולגן IV אנושי על ידי המסת 50 מ"ג קולגן ב-100 מ"ל של 0.2% חומצה אצטית קרחונית. מערבבים על מערבל מגנטי למשך שעה לפחות, ומסננים מעקרים את התמיסה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים בבקבוק זכוכית, המוגן מפני אור.
- הכינו תמיסת עבודה של קולגן IV על ידי דילול תמיסת המלאי 1:5 במים מזוקקים כפולים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
- מצפים צלוחיות תרבית תאי פלסטיק או מסנני טרנסוול בתמיסת העבודה של הקולגן. פיזור שווה של 100 μL עבור 0.33 ס"מ2 מסנני טרנסוול, 500 μL עבור 2 צלוחיות 2 ס"מ2 ס"מ, ו-1 מ"ל עבור 75 ס"מ2 צלוחיות על כל משטח הצמיחה של הבקבוקון.
הערה: ניתן להשיג זאת על ידי הטיה עדינה של הבקבוקון מצד לצד. לחלופין, כדי להקל על ציפוי הצלוחיות, ניתן להשתמש בנפח מוגבר, וכאשר כל המשטח מכוסה באופן שווה, תמיסת הקולגן שואפת להשאיר רק את הנפח המצוין. לאחר מכן ניתן להשתמש בתמיסת הקולגן השואפת באופן מיידי כדי לצפות את הבקבוקון הבא (כלומר, עבור שלושה צלוחיות 75 ס"מ2 , לפזר 3 מ"ל של תמיסת קולגן באופן שווה בבקבוק הראשון, לשאוף 2 מ"ל, אשר משמשים לאחר מכן עבור הבקבוקון הבא, וכן הלאה). - השאירו את צלוחיות תרבית התאים באינקובטור למשך שעתיים לפחות או לילה. שאפו את הקולגן ביסודיות והשאירו את הצלוחיות לייבוש באינקובטור או מתחת למכסה המנוע למשך 20 דקות לפחות או לילה.
- יש לשטוף עם 10 מ"ל של Mg2+- ו-Ca2+DPBS ללא DPBS, לאפשר ייבוש באינקובטור ולאחסן בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור. אחסנו את הצלוחיות למשך עד 6 חודשים בטמפרטורת החדר (RT).
2. צחצוח אף
הערה: ודא כי צחצוח האף מבוצע בזמן שלמשתתף אין זיהום חריף. אם חולי CF מציגים זיהום ריאתי, יש לעיין באנטיביוגרמה של המטופל ולהוסיף אנטיביוטיקה נוספת למדיום ההגברה. תאי אפיתל האף האנושיים נאספו על ידי הברשה באף מחולי F508del/F508del כפי שתואר קודם לכן9.
- בקשו מהמטופל לפוצץ את האף, ואז להרדים באופן מקומי את הרירית של שני הנחיריים באמצעות רשתות כותנה ספוגות בקסילוקאין 5% עם תמיסת נפאזולין.
- מברישים בעדינות את הדופן המדיאלית ואת הטורבינאט הנחות של שני הנחיריים באמצעות מברשת ציטולוגיה. השרו את המברשת בצינור 15 מ"ל עם 2 מ"ל של מדיום שטיפה זמין מסחרית; לנער בעדינות כדי לנתק תאים. חוזרים על צחצוח בנחיר השני.
- הוסיפו את האנטיביוטיקה הבאה למדיום ההדחה: פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל), טזוצילין (10 מיקרוגרם/מ"ל), אמפוטריצין B (2.5 מיקרוגרם/מ"ל) וקולימיצין (16 מיקרוגרם/מ"ל).
הערה: ניתן לשלוח מברשות לאף ב-RT למעבדות ייעודיות להרחבה ולתרבית, וניתן לזרוע אותן עד 72 שעות לאחר הצחצוח.
3. בידוד של HNE
הערה: HNE בודדו מהמברשת הציטולוגית, נשטפו עם Mg2+- ו-Ca2+-ללא DPBS, נותקו עם 0.25% טריפסין, ונזרעו על בקבוקון פלסטיק בגודל 25 ס"מ2 כפי שתואר קודם לכן10.
- נתקו את התאים ממברשת הציטולוגיה על ידי העברה חוזרת ונשנית של המברשת דרך חרוט פיפטה של 1000 μL ושטיפה עם 2 מ"ל של Mg2+- ו-Ca2+ללא DPBS. צנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant.
- החייאת הכדור ב-0.25% טריפסין במשך 8-12 דקות כדי לנתק תאים. עצרו את התגובה האנזימטית על ידי הוספת 5 מ"ל של מדיום ההגברה.
- צנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant. משחזרים את הכדור ב-8 מ"ל של מדיום ההגברה וזורעים על בקבוקון מצופה קולגן בקוטר 25 ס"מ. הגדל ב-37 °C (84 °F) ו-5% CO2. זה מתאים לקטע 0.
- למחרת, החליפו את המדיום ב-5 מ"ל של מדיום הגברה טרייה ועקבו אחר התאים מדי יום לצורך התקשרות, מורפולוגיה (לתאים צריכה להיות מראה מרוצף מלוכד) ומספר.
הערה: צפיפות הזריעה הראשונית משתנה בהתאם לאיכות צחצוח האף ולשיעור תאי האפיתל. תאי HNE מבודדים טריים מגיעים בדרך כלל למפגש של 80%-90% תוך 3-10 ימים. קצב גדילה איטי יותר מרמז על כך שאין מספיק תאי אפיתל בדגימה ויש להשליך אותם.
4. הגברה ומעבר של תאי אפיתל האף האנושיים
- לגדל תאי אפיתל אף אנושיים במדיום ההגברה ב-37°C ו-5% CO2 על צלוחיות מצופות קולגן עד למפגש של 80%-90%, תוך שינוי מדיום כל 48-72 שעות. עבור 25 ס"מ2 צלוחיות, השתמש 5 מ"ל של אמצעי הגברה ו 10 מ"ל עבור 75 ס"מ2 צלוחיות.
- כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%-90%, שטפו את התאים ב-10 מ"ל של Mg2+- ו-Ca2+-ללא DPBS, שאפו והשליכו.
- הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין עבור בקבוקון 25 ס"מ2 (או 2 מ"ל של טריפסין עבור צלוחית 75 ס"מ2 ) וחזור לאינקובטור (37 °C , 5% CO2) למשך 8-12 דקות.
- הקש על הבקבוקון בחוזקה, עם כף היד, כדי לעזור לתאים להתנתק.
- הוסף 10 מ"ל של מדיום ההגברה כדי לעצור את התגובה האנזימטית. שוטפים במרץ את הבקבוקון, ומשתמשים בפיפטה של 10 מ"ל כדי למשוך ולגרש את מדיום ההגברה מעל משטח הבקבוקון כדי לשטוף ולנתק תאים.
- צנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant.
- Resuspend את הכדור ב 5-10 מ"ל של מדיום ההגברה.
- ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר.
הערה: ניתן להקפיא תאים בנקודה זו (ראה שלבים 5.1-5.3). אם נדרשת הגברה נוספת, זרעו מחדש על צלוחיות מצופות קולגן (ניתן להרחיב צלוחית25 ס"מ 2 לשלוש צלוחיות 75 ס"מ2 , לא מומלץ דילול גדול יותר).
5. שימור בהקפאה של תאי אפיתל ראשוניים באף
הערה: לגדל תאי HNE עד מעבר 1 לפני הביו-בנק כדי להשיג מספיק תאים כדי להקל על צמיחת התאים בעת הפשרתם. עם זאת, ביובנקינג אפשרי במעבר ראשוני 0 או במעבר 2. שלבי ההקפאה הבאים מותאמים לכל הקטעים.
- לאחר ספירת התאים, צנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 °C ,ו להשליך את supernatant
- יש לבצע החייאה של הכדור בתווך ההקפאה המועשר (טבלה 1) כדי לקבל 3 x 106-5 x 106 תאים למ"ל ולכל קריוביאל.
- הקפיאו באיטיות את התאים על ידי הפחתת הטמפרטורה בטמפרטורה של כ-1 מעלות צלזיוס לדקה במיכל מקפיא קריו מתאים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את הדגימה המשומרת למיכל אחסון חנקן לאחסון לטווח ארוך (המחקר הנוכחי מוגבל ל-17 חודשי אחסון).
6. הפשרת תאי HNE מוגברים קפואים
- חממו את אמבט המים ל-37 מעלות צלזיוס. הכינו את מדיום ההגברה כמתואר בטבלה 1 וחממו את המדיום ל-37 מעלות צלזיוס.
- מוציאים את הקריוביציאלים ממיכל אחסון החנקן ומניחים אותם במהירות באמבט המים, תוך הקפדה שלא להטביע את כל הבקבוקון במים. מוציאים את הקריוביצ'ים מאמבטיית המים כאשר נותרה רק טיפה קפואה קטנה. נגבו את הבקבוקון ב-70% אלכוהול, נגבו את הייבוש והניחו מתחת למכסה המנוע.
- באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, מעבירים את התאים המופשרים לצינור ריק של 15 מ"ל.
- באופן טיפתי, הוסיפו 1 מ"ל של מדיום הגברה חמה. לאחר דקה אחת, מוסיפים עוד 1 מ"ל של מדיום הגברה ומחכים דקה נוספת.
- הוסף 10 מ"ל של מדיום ההגברה וצנטריפוגה למשך 2 דקות ב 500 x g.
- לשאוף ולהשליך את ה-supernatant. בצעו החייאה של כדור התא בנפח של מדיום הגברה הנדרש כדי להשיג צפיפות תאים של לפחות 1 x 106 תאים/מ"ל.
- זרעו את התאים על גבי בקבוקון מצופה קולגן המכיל את מדיום ההגברה.
- אם הקריוביט מכיל יותר מ-4 x 106 תאים, זרע על בקבוקון 75 ס"מ2 , ב-10 מ"ל של מדיום ההגברה
- אם cryovial מכיל פחות מ-4 x 106 תאים, תאי זרעים על בקבוקון 25 ס"מ2 , ב-5 מ"ל של מדיום ההגברה
- דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, וצפו באופן חזותי בהתפשטות התאים במהלך 2-3 הימים הבאים.
- לאחר מכן, בצע הגברה של התא כמפורט בסעיף 4.
הערה: אם מעט תאים נקטפו בשלב 4.7. (כלומר, אם מקפיאים במעבר 0 לפני ההרחבה), שלבים 6.5. ו-6.6. ניתן להשמיט, וניתן לזרוע תאים ישירות על בקבוקון מצופה קולגן בגודל25 ס"מ 2 ללא צנטריפוגה. לאחר מכן יש לשנות את המדיום למחרת כדי להסיר את דימתיל סולפוקסיד (DMSO).
7. התמיינות של תאי אפיתל האף האנושיים בממשק אוויר-נוזל
הערה: HNE נבדלו בממשק האוויר-נוזל כפי שתואר קודם לכן10.
- זרעו את התאים בצפיפות של 330,000 תאים/מסנן על מסננים נקבוביים מצופים קולגןבקוטר 0.33 ס"מ 2 ותוספילים עם 300 μL של מדיום ההגברה בצד האפי ו-900 μL של התווך הנוזלי-אוויר בצד הבזולטרלי.
- לאחר 3 ימים, שאפו את המדיום האפיקלי ותרבו את התאים בממשק אוויר-נוזל למשך 3-4 שבועות בתווך האוויר-נוזלי כדי ליצור אפיתל ממוין. שנה את המדיום הבסיסי כל 48-72 שעות.
8. מודולטורים של CFTR
- הכן מדיום אוויר-נוזלי המכיל אפנני CFTR. השתמש ב- VX-445, VX-661 ו- VX-809 בריכוז סופי של 3 μM ו- VX-770 ב- 100 ננומטר. השתמש במתקן ABBV-2222 בריכוז סופי של 1 μM ובפוטנציאטור ABBV-974 ב- 10 μM. השתמש ב- 100% DMSO כדי להמיס את כל אפנן CFTR.
- הכן מדיום נוזלי-אוויר המכיל את אותה כמות של 100% DMSO כמו במדיום מתקן.
- הוסיפו את המדיום המכיל תרופות או DMSO לצד הבזולטרלי של תאי HNE מקוטבים הגדלים בממשק אוויר-נוזל ודגרו במשך 24 שעות ב-5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס.
- לאחר 24 שעות, שאפו והשליכו את המדיום והחליפו במדיום טרי שהוכן כמו בשלבים 8.1-8.2., ודגירה נוספת לתקופה של 24 שעות ב-5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס.
9. לימוד חדרים
- מדוד מדידות זרם קצר חשמלי (Isc) בתנאי מהדק מתח כפי שתואר קודם לכן9.
הערה: התנגדות חשמלית טרנס-פיתלית (TEER) של תרביות נמדדה באמצעות מד מתח של מקלות אכילה, ורק תרביות שהגיעו לפחות ל-200 Ω·cm2 נחשבו לניסויים הבאים. מסננים של תאי HNE מקוטבים הותקנו בתאי Ussing, ומדידות זרם קצר חשמלי (Isc) נמדדו בתנאי מהדק מתח.
10. אימונוציטוכימיה
- בצע זיהוי חיסוני כפי שתואר קודם לכן9.
הערה: זיהוי חיסוני CFTR בוצע באמצעות הנוגדן החד-שבטי נגד CFTR C-terminal (24-1) במהלך הלילה בדילול של 1/100. Zona-occludens-1 (ZO-1) (דילול 1/500), אלפא-טובולין (דילול 1/300), Muc 5AC (דילול 1/250) וצביעת ציטוקראטין 8 (דילול 1/250) נעשו על מסננים נוספים. לאחר שטיפה עם PBS-Triton-X100 0.1%, נוספו נוגדנים משניים לעזים שהוצמדו לאלקסה 488 או 594 במשך 30 דקות בסרום עיזים של 10% (1/1000 דילול). לאחר שטיפה אחרונה, מסננים נחתכו מתמיכה והותקנו עם מדיום הרכבה Vectashield המכיל DAPI. מיקרוסקופ קונפוקלי (63x/1.4 ניגוד הפרעות דיפרנציאליות שמן λ כחול PL APO המטרה) שימש ללכידת תמונות, אשר נותחו באמצעות תוכנת ImageJ.
11. ניתוח סטטיסטי
- בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה מתאימה.
הערה: ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות תוכנת S.A.S. מכיוון שהתקבלו מספר מסנני HNE לכל מטופל ולכל מצב, פרמטרים כמותיים התבטאו כערכים חציוניים (± SEM) לכל מטופל. ההשוואות (ממוצעות ± SD) בוצעו באמצעות מבחן דירוג של זוגות תואמי Wilcoxon או מבחן t לא מזווג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאי HNE טריים בתרבית בממשק אוויר-נוזל מציגים תכונות אופייניות של אפיתל הנשימה המקוטב והמובחנות כפי שהוערכו על ידי חיסון(איור 1). תאי HNE מתמיינים מחדש לשכבה הטרוגנית של תאי אפיתל (חיסון קרטין חיובי 8) המחקים את המצב in vivo של אפיתל נשימתי מדומה-מרובד המורכב מכתם ציליאטי (צביעת אלפא-טובולין חיובית) ותאי גביע שאינם מייצרי ריר (Muc5Ac חיסון חיובי). האפיתל הכולל מציג צמתים הדוקים (הוערך על ידי ZO-1, zona-occludens-1 צביעה). צביעת CFTR אפית חזקה נראית בתאי HNE מסוג פרא (WT), והפחתת צביעת CFTR הן במשטח האפי והן בציטופלסמה נצפתה ב-F508del/F508del HNE.
שקלנו תוצאות חיוביות כדגימות שלא רק מתרחבות בהצלחה, אלא גם מתמיינות בהצלחה לאפיתל פסאודו-מרובד לאחר 3 שבועות בממשק אוויר-נוזל ומציגות TEER גבוה מ-200 Ω·cm2, מה שמאפשר מדידות זרם קצר חשמלי. מכיוון שרק מעבדות ייעודיות מעטות מבצעות בדיקות הפרשת Cl הקשורות ל-CFTR על ידי מדידות זרם קצר חשמלי, דגימות דורשות לעתים קרובות הובלה מבתי חולים למתקנים ייעודיים.
ב-78 דגימות תאי HNE טריות, הושוו שיעורי ההצלחה במברשות האף שנזרעו מיד ובמברשות שנזרעו לאחר 1-7 ימים של הובלה במדיום שטיפה בטמפרטורת החדר. רוב הדגימות (55%) נזרעו יום אחד לאחר הצחצוח, ו-82% מהדגימות נזרעו תוך 48 שעות. האחוז הממוצע של תרביות מוצלחות בכל 78 הדגימות היה 82% והגיע ל-87% בדגימות שנזרעו בין היום ה-0 ליום ה-5 (טבלה 2).
הושוו שיעורי ההצלחה והכישלון של דגימות זהות שנבדלו הן בתנאים טריים והן בתנאים מופשרים בהקפאה. 83% מהדגימות שהתמיינו בהצלחה בתנאים חדשים היו מוצלחות גם בדגימות בהקפאה. כמו כן, בדגימות שלא הצליחו להתמיין בתנאים חדשים, 71% גם לא הצליחו בתנאי הפשרה בהקפאה (טבלה 2). כל הנתונים הללו מצביעים על כך שאיכות צחצוח האף היא גורם המפתח לתרבות מוצלחת.
רצינו גם לקבוע את מספר התאים האופטימלי לכל קריוביאל. דגימות שהוקפאו במעבר 0, מתוך יחיד 25 ס"מ2 בדרך כלל מאפשרות להגיע רק ל-1-1.5 x 106 תאים לכל בקבוקון. דגימות שהוקפאו במעבר 1 והוגברו לשלושה צלוחיות 75 ס"מ2 בדרך כלל אפשרו להגיע ל-10 x 10 106 תאים, ובכך אפשרו להקפיא מספר בקבוקונים המכילים לפחות 3 x 106 תאים. בתנאי התרבית המתוארים בפרוטוקול זה, 50% מהדגימות שהוקפאו בין 2 x 106 ו-3 x 106 תאים לכל קריוביאל לא הצליחו לגדול בעת ההפשרה, והגיעו ל-80% כאשר הם מתחת ל-2 x 106 תאים לכל קריוביאל (טבלה 2).
הפרשת Cl הקשורה ל-CFTR משקפת את פונקציית CFTR וניתן למדוד אותה על ידי ניסויי זרם קצר חשמלי (Isc) בתאי Ussing. וריאציית Isc בתגובה לפורסקולין (ΔIscForskolin) ומעכב CFTR inh172 (ΔIscCFTRinh172) הן נקודות הקצה העיקריות להערכת יעילות מתקן CFTR.
ניסויים בזרם קצר-חשמלי בוצעו על HNE טרי, הורחב במדיום הגברה ונזרע על מסננים במעבר 2 וגדל בממשק אוויר-נוזל במשך 3 שבועות במדיום אוויר-נוזל, או מ-HNE שקודם לכן הוקפא במעבר 1 במדיום הקפאה מועשר, הופשר, הורחב, הורחב ונזרע על פילטרים נקבוביים במעבר 3. זמני השמירה על ההקפאה נעו בין 3 חודשים ל-16 חודשים, עם ממוצע של 9.8 חודשים. בתנאי התרבות וההקפאה המפורטים במחקר זה, לא נצפו שינויים משמעותיים בגדילה או במורפולוגיה בין מעברים שונים או בין תרבויות F508del/F508del/F508del HNE טריות או קפואות.
גם עבור ΔIscForskolin (איור 2A) וגם עבור ממוצע ΔIscCFTRinh172 (איור 2B) בתאי HNE שטופלו ב-DMSO, לא נצפה הבדל משמעותי בין HNE טרי או קפוא. כדי להעריך אם תיקון תפקודי של CFTR הושפע מהקפאה, נמדדו שינויים ממוצעים ב-Isc בתאים שטופלו ב-VX-809 + VX-770 בהשוואה לתאי HNE שטופלו ב-DMSO בטרנים (תאי HNE שמקורם ב-n =78 חולים) או בתאי HNE קפואים-מופשרים (תאי HNE שמקורם ב-n = 9 חולים) (איור 2). גם תאים קפואים-מופשרים וגם תאים טריים הראו תיקון משמעותי עם הטיפול, עם עלייה משמעותית ב-ΔIscForskolin (p < 0.05) (איור 2A), וירידה משמעותית ב-ΔIscCFTRinh172 (p < 0.05) (איור 2B). העלייה הממוצעת בקיפול עבור ΔIscForskolin (ΔIscForskolin VX-809 + VX-770/ΔIscForskolin DMSO) הגיעה ל-2.9 ± 1.6 בתאי HNE קפואים-מופשרים ולא הייתה שונה באופן משמעותי מהגידול בקיפול בתאי HNE טריים (2.5 ± 2.0). באופן דומה, הירידה בקיפול ב- ΔIscCFTRinh172 (ΔIscCFTRinh172 VX-809 + VX-770/ΔIscCFTRinh172 DMSO) לא הושפעה באופן משמעותי על ידי שימור בהקפאה: 1.49 ± 0.9 ב- HNE מופשר קפוא לעומת 2.5 ± 3.7 ב- HNE טרי.
פעילות התיקון התפקודי של מספר טיפולים אפננים נחקרה עוד יותר כדי להעריך אם מודל תאי HNE זה יכול להבחין בין טיפולים שונים. התוצאות כאן משלבות תאי HNE הן ממצבים טריים והן ממצבים קפואים-מופשרים, שכן התגובה לטיפול לא השתנתה באופן משמעותי על-ידי שימור בהקפאה (איור 2).
הערכנו לראשונה את התגובה המתקנת של שני טיפולים מאוננים מאושרים של CFTR בהובלת Cl לאחר טיפול של 48 שעות עם VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 ננומטר) או VX-661 (3 μM) + VX-770 (100 ננומטר) בתאי HNE מ-10 חולי F508del/F508del (איור 3). בהשוואה לתאי HNE שטופלו ב-DMSO, ΔIscForskolin (איור 3A) ו-ΔIscCFTRinh172 (איור 3B) שופרו באופן משמעותי הן על-ידי VX-809 + VX-770 והן על-ידי VX-661 + VX-770. שני הטיפולים תיקנו באופן פונקציונלי את הפרשת Cl- הקשורה ל-CFTR לרמה דומה, עם עלייה משמעותית בקיפול הממוצע ב-ΔIscForskolin של 1.75 ± 1.39 עבור VX-809 + VX-770 (p < 0.001) ו-0.97 ± 0.93 עבור VX-661 + VX-770 (עמ' < 0.01). הירידה הממוצעת של ΔIscCFTRinh172 הייתה 1.79 ± 2.04 עבור VX-809 + VX-770 (p < 0.001) ולא הייתה שונה באופן משמעותי מהירידה הממוצעת של ΔIscCFTRinh172 פי 1 של 1.16 ± 1.44 עבור VX-661 + VX-770 (p < 0.001 לעומת DMSO).
שלושה טיפולים שונים במודולטור CFTR ב-HNE משישה חולי F508del/F508del (איור 4) הושוו עוד יותר. התוצאות כאן משלבות תאי HNE הן מתנאים טריים והן מתנאים קפואים שהופשרו. גם מודולטורים של קודקוד וגם מודולטורים של Abbvie CFTR, כאשר הם משמשים כשילוב של מתקן CFTR ופוטנציאטור CFTR, תיקנו את ΔIscForskolin (איור 4A) ואת ΔIscCFTRinh172 (איור 4B) במידה דומה. התיקון החלקי שנצפה באיור 3 על ידי VX-809 + VX-770 אושר בתאי HNE אלה עם עלייה ממוצעת של ΔIscForskolin fold של 2.87 ± 1.67 (p < 0.05). טיפול ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM) גרם לתיקון דומה המייצג 91% מ- VX-809 + תיקון VX-770 עבור ΔIscForskolin (ממוצע ΔIscForskolin עלייה של 2.6 ± 1.4, p < 0.05 לעומת DMSO) ו- 85% של VX-809 + VX-770 עבור ΔIscCFTRinh172 (ממוצע ΔIscCFTRinh172 ירידה של 4.2 ± 5.7, p < 0.05 לעומת DMSO).
באופן מעניין, כאשר HNE טופלו בשילוב המשולש VX-445 (3 μM) + VX-661 (3 μM) + VX-770 (100 ננומטר), יעילות התיקון השתפרה באופן משמעותי, והגיעה ל-312% מ-VX-809 + VX-770 ΔIscForskolin תיקון (ממוצע ΔIscForskolin עלייה של 9.0 ± 4.1, p < 0.05 לעומת VX-809 + VX-770) ו-372% מ-ΔIscCFTRinh172 (ממוצע ΔIscCFTRinh172 ירידה של 15.5 ± 10.5, עמ ' < 0.05 לעומת VX-809 + VX-770).
איור 1: סמני הבחנה בתרבויות HNE. תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית מייצגות של כתמים חיסוניים-פלואורסצנטיים של CFTR (ירוק), Zona-Occludens-1 (ZO-1, אדום), אלפא-טובולין (ירוק), Muc5AC (אדום) וציטוקראטין 8 (K8, ירוק) בתאי מסוג בר (WT) (פאנל ראשון) ו-F508del (פאנלים 2 -4) HNE הגדלים בממשק אוויר-נוזל במשך 3 שבועות. הגרעינים היו מוכתמים בכחול עם DAPI. הקרנות של תמונות מיקרוסקופיה קונפוקליות, תצוגה עליונה (לוחות עליונים) ותצוגה צדדית (לוחות תחתונים) של ערימות Z תלת-ממדיות (3D) משחזרות. סרגל קנה מידה (20 מיקרומטר) חל על לוחות עליונים ותחתונים כאחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: השפעת הפשרה קפואה על הפרשת Cl הקשורה ל-CFTR בתאי HNE. סיכום של הקלטות זרם קצר חשמלי (Isc) (ממוצע ± SD) בתרביות HNE שמקורן בחולי F508del/F508del וגדלו בממשק אוויר-נוזלי במשך 3 שבועות. התאים טופלו במשך 48 שעות עם רכב בלבד (DMSO) או VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 ננומטר) ב-Fresh (אפור בהיר, תאי HNE שמקורם בחולה מ-78 חולים) או קפואים-מופשרים (אפור כהה, תאי HNE שמקורם בחולה מ-9 חולים). הנתונים מייצגים את התגובה הממוצעת (± SD) לפורסקולין (10 μM) שנוסף באופן חריף (A) פורסקולין (10 μM)/3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין (IBMX, 100 μM), ΔIscForskolin או (B) מעכב CFTR inh172 (5 μM) ΔIscCFTRinh172. לפחות שני מסננים נותחו לכל חולה ולכל מצב. כוכביות מציינות את ההבדל הסטטיסטי בין מתקנים לבקרה (מטופלים ב-DMSO) * p < 0.05 (t-test לא מזווג). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תיקון תפקוד CFTR על ידי טיפולים כפולים. סיכום הקלטות זרם קצר חשמלי (Isc) (ממוצע ± SD) בתרביות HNE הנגזרות מ-10 חולי F508del/F508del וגדלו בממשק אוויר-נוזל במשך 3 שבועות (תוצאות משולבות מתרביות טריות וקפואות כאחד). התאים טופלו במשך 48 שעות באמצעות רכב בלבד (DMSO); VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 ננומטר) או VX-661 (3μM) + VX-770 (100 ננומטר). הנתונים מייצגים את התגובה הממוצעת (± SD) לתוספת חריפה (A) פורסקולין (10 μM)/IBMX (100 μM), ΔIscForskolin או (B) מעכב CFTR inh172 (5 μM), ΔIscCFTRinh172. לפחות שני מסננים נותחו לכל חולה ולכל מצב. כוכביות מצביעות על הבדל סטטיסטי בין מתקנים לבקרה (מטופלים ב-DMSO) ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 (Wilcoxon תואם זוגות חתומים מבחן דירוג). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: יעילות של טיפול משולש לעומת טיפולים כפולים בתיקון CFTR. סיכום של הקלטות זרם קצר (Isc) (ממוצע ± SD) בתרביות HNE שמקורן ב-6 חולי F508del/F508del וגדלו בממשק אוויר-נוזל במשך 3 שבועות (תוצאות משולבות של תאים טריים וקפואים שהופשרו). התאים טופלו במשך 48 שעות באמצעות רכב בלבד (DMSO); VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 ננומטר); ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM); או VX-661 (3 μM) + VX-445 (3 μM) + VX-770 (100 ננומטר). הנתונים מייצגים את התגובה הממוצעת (± SD) לתוספת חריפה (A) פורסקולין (10 μM)/IBMX (100 μM), ΔIscForskolin או (B) מעכב CFTR inh172 (5 μM), ΔIscCFTRinh172. לפחות שני מסננים נותחו לכל חולה ולכל מצב. כוכביות מצביעות על הבדל סטטיסטי בין הטיפולים. * p < 0.05 (וילקוקסון תאם זוגות חתומים במבחן הדירוג). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| רכיב מדיה | ריכוז סופי |
| מדיום הגברה | |
| תערובת חומרים מזינים מתקדמת של DMEM/F-12 | 86% |
| סרום בקר עוברי | 10% |
| פניצילין | 100 U/mL |
| סטרפטומיצין | 100 מיקרוגרם/מ"ל |
| טזוצילין | 10 מיקרוגרם/מ"ל |
| אמפוטריצין ב' | 2.5 מיקרוגרם/מ"ל |
| קולימיצין | 16 מיקרוגרם/מ"ל |
| ציפרופלוקסצין | 3 מיקרוגרם/מ"ל |
| הידרוקורטיזון | 0.2 מיקרומטר |
| אינסולין | 5 מיקרוגרם/מ"ל |
| אפינפרין | 0.5 מיקרוגרם/מ"ל |
| EGF | 10 ננוגרם/מ"ל |
| Y-27632 (מעכב קינאז הקשור ל-Rho) | 10 מיקרומטר |
| בינוני אוויר-נוזלי | |
| תערובת חומרים מזינים מתקדמת של DMEM/F-12 | 94% |
| אולטרוזרג | 2% |
| פניצילין | 100 U/mL |
| סטרפטומיצין | 100 מיקרוגרם/מ"ל |
| טזוצילין | 10 מיקרוגרם/מ"ל |
| אמפוטריצין ב' | 2.5 מיקרוגרם/מ"ל |
| קולימיצין | 16 מיקרוגרם/מ"ל |
| מדיום הקפאה מועשר | |
| תערובת חומרים מזינים F12 | 77% |
| HEPES | 3% |
| סרום בקר עוברי | 10% |
| DMSO | 10% |
טבלה 1: הגברה, אוויר-נוזל והרכב בינוני קפוא מועשר. רשימת ריאגנטים וריכוזים סופיים תואמים.
| משך שימור צחצוח האף לפני הזריעה (n = 78) | |
| ימים לפני הזריעה | שיעורי הצלחה (%) |
| 0 | 83 |
| 1 | 84 |
| 2 | 67 |
| 3 | 100 |
| 4 | 89 |
| 5 | 100 |
| 7 | 0 |
| תוצאות מאותו צחצוח אף ראשוני שגדל הן בתנאים טריים והן במצבי הפשרה קפואים (n = 13) | |
| תוצאה בתנאים רעננים | שיעורי הצלחה בהפשרה בהקפאה (%) |
| הצלחה | 83 |
| כישלון | 29 |
| השפעת מספר התא על שיעורי ההצלחה (n = 36) | |
| מספר התאים לכל קריוביאל | שיעורי הצלחה בהפשרה בהקפאה (%) |
| <2 x 106 | 20 |
| 2–3 x 106 | 50 |
| 3–4 x 106 | 67 |
| >4 x 106 | 79 |
טבלה 2: פרמטרים המשפיעים על שיעורי ההצלחה בתרביות תאי HNE טריות ומופשרות קפואות. שיעורי ההצלחה הוגדרו כצחצוחי אף שהתרחבו והתבדלו בהצלחה לאפיתל פסאודו-מרובד לאחר 3 שבועות בממשק האוויר-נוזל והציגו TEER גבוה מ-200 Ω·cm2. לפני הזריעה, דגימות נשלחו בטמפרטורת החדר במדיום שטיפה עם אנטיביוטיקה. התוצאות מייצגות נתונים מ-78 דגימות טריות ומ-36 דגימות קפואות שהופשרו. 13 צחצוחי אף נותחו הן בתנאים טריים והן במצבי הפשרה קפואים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש בתאי אפיתל האף שמקורם בחולה כפונדקאים לתאי אפיתל הסימפונות האנושיים (HBE) למדידת פעילות CFTR בהקשר של רפואה מותאמת אישית הוצע כמאפיינים של תאי שכפול HNE בתרבית 9,11. היתרון החזק של HNE על פני תרביות תאי HBE הוא שהן נדגמות בקלות ובאופן לא פולשני. מדידות זרם קצר חשמלי בתרביות תאי HNE מאפשרות הערכה של הובלת Cl תלוית CFTR על פני האפיתל, אשר הוכחה כמתואמת באופן משמעותי עם פעילות CFTR in vivo המוערכת על ידי הפרש פוטנציאל האף בחולים עם גנוטיפים שונים9. ההצלה של פעילות CFTR בתאי HNE עם טיפול ב-VX-809 גם הייתה קשורה באופן משמעותי לשיפור התוצאה הקלינית FEV1 בחולים הומוזיגוטיים שטופלו בלומקאפטור-איוואקאפטור12.
חשוב לציין שמחקר זה מראה שתאי HNE שזה עתה נקטפו סובלים בקלות מהובלה ומתנאי שילוח סטנדרטיים (כלומר, הם שורדים 72 שעות בטמפרטורת החדר) מה שמאפשר בדיקה של תאי המטופל שמקורם במיקומים גיאוגרפיים שונים. הגורמים הקריטיים לתרבית מוצלחת הם בעיקר איכות צחצוח האף ומספר התאים החיים בדגימה. מספר פרוטוקולים פורסמו על גידול והבחנה של תרביות תאי HNE; חלקם ללא תכנות מחדש מותנה במהלך שלב ההרחבה 13,14,15,16,17,18,19,20, חלקם עם תכנות מחדש מותנה במזין 9,11,12,21,22,23,24,25 ,26 או ללא מזין 5,8,27,28,29 תנאים, וכמה מהשוואת שיטות שונות 7,8. כולם מאפשרים להשיג מספר גדול יחסית של תרבויות ALI עם בידול וקיטוב נכונים, כמו גם ערכי TEER טובים. בדומה למחקר זה, רבים השתמשו בתאי HNE קפואים בהקפאה במעבר 113,28. באופן מעניין, מספר מחברים מדווחים כי ROCKi יכול לשפר את ההישרדות לאחר שימור בהקפאה כאשר הוא מתווסף למדיום התרבית שלאחר ההפשרה ולהגדיל את מספר התאים שנותרו מחוברים 5,29, מה שמרמז על כך שמדיום ההגברה המשמש במחקר זה מתאים במיוחד לשמירת ההקפאה.
כאן, המחקר מראה כי תאי HNE יכולים להיות ביו-בנקאיים בהצלחה, כאשר הגורם הקריטי שוב הוא איכות צחצוח האף. מוצג מתאם טוב בין התוצאות של דגימות טריות לבין אלה שהופשרו קפואות, מה שמרמז על כך שכדי לייעל את איכות תאי ה-HNE שעומדים לעבור ביו-בנק למחקרים נוספים, ניתן יהיה לבצע מחקר ראשוני על דגימות טריות אם הן לא יצליחו להשיג התמיינות נכונה של ALI וערך TEER מקובל; צחצוח אף שני יהיה עדיף על פני תאים קפואים שיש להם סבירות גבוהה לתוצאה גרועה. גורם קריטי שני לשמירת ההקפאה הוא מספר התא; בתנאי התרבית המשמשים במחקר זה, כאשר פחות מ -2 x 106 תאים מוקפאים לכל קריוביאל, שיעור הכישלון גבוה מאוד. הקפאה של לפחות 3 x 106 תאים לכל קריוביאל מומלצת.
התוצאות במחקר זה מצביעות על כך שהפשרה בהקפאה אינה משנה באופן משמעותי את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תאי HNE או את התגובה שלהם לאפנוני CFTR. מגוון האמצעים בתרביות תאי HNE מאותו חולה F508del-homozygous שהתקבלו ללא הקפאה או לאחר הפשרה לא היה שונה בטיפול VX-809 + VX-770. תוצאות דומות דווחו בעבר עבור תאי HBE שבהם Isc מגורה פורסקולין היה יציב לאחר מספר מחזורי הפשרה/תרבית של תאי F508del שאינם מטופלים30. זה מספק ראיות לכך שניתן להקפיא ולאחסן תאי HNE בביו-בנק ולחקור אותם מאוחר יותר.
מספר גדל והולך של מחקרים מראים כי ניתן להשתמש בתרביות תאי HNE כדי לבחון את היעילות של טיפולים שונים בהקשר של רפואה מותאמת אישית. הניתוח הראה כי טיפולים כפולים המשלבים מתקן עם פוטנציה הם בעלי יעילות תיקון דומה עבור הפרשת Cl- הפרשת Cl תלוית CFTR בתאי HNE F508del-homozygous. עם זאת, נצפתה שונות בין-אשפוזית חשובה, המאשרת את התוצאות שפורסמו 9,12,20,25. לעומת זאת, VX-445 + VX-661 + VX-770 תיקון משולש של פעילות CFTR בהשוואה ל- VX-809 + VX-770. רמה דומה של תיקון של F508del-CFTR בתאי HNE על שילוב משולש נצפתה גם על ידי Laselva et al.28. כפי שדווח על ידי Veit et al.26, תיקון פונקציית ערוץ Cl על VX-445 + VX-661 + VX-770 טיפול היה אפילו גבוה יותר, והגיע ל -62% מהפעילות הממוצעת של WT-CFTR (טווח של 19-36 μA / cm2 ב- F508del-HNE מתוקן ו- 14-50 μA / cm2 ב- WT-HNE) 26.
תרביות תאי HNE שימשו גם לבדיקת היעילות של אפנני CFTR עבור מוטציות אחרות מסוג II. שיפור חשוב בפעילות CFTR ב-VX-445 + VX-661 + VX-770 נצפה בתרבויות HNE ALI המכילות G85E/G85E, V520F/1717-1G>A, Y569/Y569D, M1101K/M1101K וגנוטיפים N1303K/N1303K26. באופן דומה, Laselva et al.28 הראו תיקון משמעותי של CFTR עם מוטציות M1101K ו-N1303K, אך ללא תיקון משמעותי בתאי G85E HNE. מתקנים של גלפגוס/AbbVie הוערכו עבור המוטנטים העמידים ללומקפטור-איוואקאפטור31. מתקן AbbVie AC2-1 ובמיוחד AC1+AC2-1 דו-מתקן שיפרו ביעילות את הפרשת Cl בתאי M1101K ו-G85E HNE, בעוד שתאים שמקורם ב-N1303K תוקנו על-ידי שילוב של AC1+AC2-2.
מדדים של פעילות CFTR בתאי HNE מבטיחים סמנים ביולוגיים פרה-קליניים המנבאים את תגובת המטופל לטיפול שנבדק. הראיות לכך שמחזורי הקפאה-הפשרה אינם משנים את רמת התיקון מספקות ראיות לכך שניתן לבצע ביו-בנקים של תאים אלה ולהשתמש בהם ככלי רב עוצמה בהקשר של תוכניות רפואה מותאמות אישית. צחצוח אף ייחודי יכול אפוא לאפשר מספיק חומר כדי להשוות את יעילות התרופות, ותאי ה-HNE של המטופל עלולים להיות מופשרים כאשר תרופות חדשות הופכות לזמינות ללא צורך בדגימה מחדש של המטופלים; זה מעניין במיוחד בתינוקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מדווחים על אינטרסים כלכליים מתחרים הקשורים לפרסום זה או להפקת וידאו מדעית.
Acknowledgments
אנו מודים בחום לכל המטופלים ובני משפחותיהם על השתתפותם במחקר. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של האגודה הצרפתית Vaincre la Mucoviscidose; האגודה הצרפתית ABCF 2 ופרסי החדשנות של Vertex Pharmaceuticals.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABBV-2222 | Selleckchem | S8535 | |
| ABBV-974 | Selleckchem | S8698 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies | 12634010 | |
| Alexa 488 goat secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A11012 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290026 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody | Abcam | ab80779 | |
| Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1) | R&D Systems | MAB25031 | |
| Anti-cytokeratin 8 antibody | Progen | 61038 | |
| Anti-Muc5AC antibody | Santa Cruz Biotech | sc-20118 | |
| Anti-ZO-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-10804 | |
| Ciprofloxacin | provided by Necker Hospital Pharmacy | ||
| Colimycin | Sanofi | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Collagen type IV | Sigma-Aldrich Merck | C-7521 | |
| cytology brush | Laboratory GYNEAS | 02.104 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich Merck | D2650 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Epinephrin | Sigma-Aldrich Merck | E4375 | |
| F12-Nutrient Mixture | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Ferticult | Fertipro NV | FLUSH020 | |
| Flasks 25 | Thermo Scientific | 156.367 | |
| Flasks 75 | Thermo Scientific | 156.499 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 20104.298 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Merck | H3375 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich Merck | SLCJ0893 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich Merck | I0516 | |
| Mg2+ and Ca2+-free DPBS | Life Technologies | 14190094 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140130 | |
| Tazocillin | Mylan | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Transwell Filters | Sigma-Aldrich Merck | CLS3470-48EA | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich Merck | T8787 | |
| Trypsin 0,25% | Life Technologies | 25200056 | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| VX-445 | Selleckchem | S8851 | |
| VX-661 | Selleckchem | S7059 | |
| VX-770 | Selleckchem | S1144 | |
| VX-809 | Selleckchem | S1565 | |
| Xylocaine naphazoline 5% | Aspen France | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).
- Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR. The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).
- Griese, M., et al. Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
- Liu, X., et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
- Bukowy-Bieryłło, Z. Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we. Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).
- Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).
- Noel, S., et al. Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells. The Journal of Physiology. , (2021).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Pranke, I., et al. Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).
- McDougall, C. M., et al. Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).
- Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance. PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).
- Schögler, A., et al. Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling. Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).
- Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).
- Awatade, N. T., et al. Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis. EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).
- Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
- Veit, G., et al. Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination. JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).
- Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research. Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).
- Laselva, O., et al. Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator. The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).
- Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods in Molecular Biology. 741, Clifton, N.J. 39-54 (2011).
- Laselva, O., et al. Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).
