Summary
Här beskriver vi isolering, förstärkning och differentiering av primära humana nasala epitelceller (HNE) vid luft-vätskegränssnittet och ett biobankprotokoll som gör det möjligt att framgångsrikt frysa och sedan tina förstärkt HNE. Protokollet analyserar elektrofysiologiska egenskaper hos differentierade HNE-celler och CFTR-relaterad kloridsekretionskorrigering vid olika modulatorbehandlingar.
Abstract
Mänskliga nasala epitelceller (HNE) är lätta att samla in genom enkel, icke-invasiv näsborstning. Patient-härledda primära HNE-celler kan förstärkas och differentieras till ett pseudo-stratifierat epitel i luft-vätskegränssnittsförhållanden för att kvantifiera cyklisk AMP-medierad kloridtransport (Cl-) som ett index för cystisk fibros Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) -funktion. Om kritiska steg som kvalitet på näsborstning och celltäthet vid kryokonservering utförs effektivt kan HNE-celler framgångsrikt biobankas. Dessutom visar kortslutningsströmstudier att frysning-upptining inte signifikant modifierar HNE-cellernas elektrofysiologiska egenskaper och svar på CFTR-modulatorer. Under odlingsförhållandena som används i denna studie, när mindre än 2 x 106 celler fryses per kryovulium, är felfrekvensen mycket hög. Vi rekommenderar att du fryser minst 3 x 106 celler per kryovial. Vi visar att dubbla terapier som kombinerar en CFTR-korrigerare med en CFTR-potentiator har en jämförbar korrigeringseffekt för CFTR-aktivitet i F508del-homozygota HNE-celler. Trippelterapi VX-445 + VX-661 + VX-770 ökade signifikant korrigeringen av CFTR-aktivitet jämfört med dubbelterapi VX-809 + VX-770. Måttet på CFTR-aktivitet i HNE-celler är en lovande preklinisk biomarkör som är användbar för att vägleda CFTR-modulatorterapi.
Introduction
Cystisk fibros (CF) är en autosomal recessiv störning som härrör från mutationer i genen Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) som leder till frånvaro eller dysfunktion av CFTR-proteinet, en anjonkanal belägen vid den apikala ytan av epitel 1,2. De senaste framstegen inom CFTR-terapi har förbättrat prognosen för sjukdomen, och de sista godkända läkemedlen som kombinerar CFTR-korrigerare och CFTR-potentiatorer ledde till stora förbättringar av lungfunktion och livskvalitet för CF-patienter som bär den vanligaste mutationen p.Phe508del-mutation (F508del)3,4. Trots dessa lovande terapeutiska framsteg är cirka 10% av CF-patienterna inte berättigade eftersom de bär mutationer som inte kan räddas av dessa CFTR-modulatorer. För dessa patienter finns det ett behov av att testa andra läkemedel eller läkemedelskombinationer för att hitta den mest effektiva kombinationen för specifika mutationer, vilket belyser vikten av personliga terapier.
Humana nasala epitelceller (HNE) är lätta att samla in genom enkel, icke-invasiv näsborstning och möjliggör kvantifiering av cyklisk AMP-medierad kloridtransport (Cl−) som ett index för CFTR-funktionen. HNE-celler ger en exakt modell av mänsklig luftväg, men deras livslängd är begränsad i odling. Tack vare optimeringen av odlingstekniker kan patient-härledda primära HNE-celler omprogrammeras villkorligt med Rho-associerad kinashämmare (ROCKi), förstärkas och differentieras till ett pseudo-stratifierat epitel i luft-vätskegränssnitt (ALI) -förhållanden på mikroporösa filter 5,6. Det finns många odlingsprotokoll för HNE-odling (kommersiellt tillgängliga, serumfria, "hemlagade", samodling med matarceller etc.), och val av media och odlingsförhållanden har beskrivits för att påverka tillväxt, cellpopulationsdifferentiering och epitelfunktion 7,8. Protokollet presenterar här en förenklad, matarfri, ROCKi-förstärkningsmetod som gör det möjligt att framgångsrikt erhålla ett stort antal HNE-celler som sedan differentieras vid ALI för CFTR-funktionsanalyser.
Vi har visat att i differentierade HNE-celler är en 48-timmars behandling med CFTR-modulatorer tillräcklig för att inducera elektrofysiologisk korrigering av CFTR-beroende Cl-ström och att den observerade korrigeringen in vitro kan korreleras med patientens kliniska förbättring9. HNE-celler representerar därför en lämplig modell inte bara för grundläggande CF-forskning utan för prekliniska studier med patientspecifik CFTR-modulatortestning. I detta sammanhang av personlig terapi var målet med protokollet att validera att kryokonserverade HNE-celler från CF-patienter, odlade under våra förhållanden, var en lämplig modell för CFTR-korrigeringsstudier, och liknande resultat kunde förväntas när man jämför CFTR-beroende Cl-transport från färska och frysta tinade celler. Studien utvärderade också olika CFTR-modulatorers effekt vid användning av dubbla och tredubbla terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes enligt de riktlinjer och föreskrifter som beskrivs i Helsingforsdeklarationen och Huriet-Serusclat-lagen om etik för mänsklig forskning.
1. Beredning av kolvar och olika medier
- Förbered förstärkning, luftvätska och frysmedium enligt beskrivningen i tabell 1.
- Bered en stamlösning av humant kollagen IV genom att lösa upp 50 mg kollagen i 100 ml 0,2% isättika. Blanda på en magnetisk omrörare i minst 1 timme och filtrera sterilisera lösningen. Förvaras vid 4 °C i upp till 6 månader i en glasflaska, skyddad mot ljus.
- Förbered en arbetslösning av kollagen IV genom att späda stamlösningen 1:5 i dubbeldestillerat vatten. Förvaras vid 4 °C i upp till 6 månader.
- Täck plastcellodlingskolvar eller transwellfilter med kollagenarbetslösningen. Fördela jämnt 100 μl för 0,33 cm2 transwellfilter, 500 μl för 25 cm2 kolvar och 1 ml för 75 cm2 kolvar på hela kolvens tillväxtyta.
OBS: Detta kan uppnås genom att försiktigt luta kolven från sida till sida. Alternativt, för att underlätta beläggningen av kolvarna, kan en ökad volym användas, och när hela ytan är jämnt täckt aspireras kollagenlösningen för att lämna endast den angivna volymen. Den aspirerade kollagenlösningen kan sedan användas omedelbart för att belägga nästa kolv (dvs. för tre 75 cm2 kolvar fördela 3 ml kollagenlösning jämnt i den första kolven, aspirera 2 ml, som sedan används för nästa kolv, och så vidare). - Lämna cellodlingskolvarna i inkubatorn i minst 2 timmar eller över natten. Aspirera kollagenet noggrant och låt kolvarna torka i inkubatorn eller under huven i minst 20 minuter eller över natten.
- Tvätta med 10 ml Mg2+- och Ca2+-fri DPBS, låt torka i inkubatorn och förvara i aluminiumfolie för att skydda mot ljus. Förvara kolvarna i upp till 6 månader vid rumstemperatur (RT).
2. Nasal borstning
OBS: Se till att näsborstning utförs medan deltagaren inte har en akut infektion. Om CF-patienter uppvisar en lunginfektion, se patientens antibiogram och tillsätt ytterligare antibiotika till förstärkningsmediet. Humana nasala epitelceller samlades in genom näsborstning från F508del/F508del-patienter som tidigare beskrivits9.
- Be patienten att blåsa näsan och bedöva sedan slemhinnan i båda näsborrarna med bomullsnät som blötläggs i xylocain 5% med nafazolinlösning.
- Borsta försiktigt den mediala väggen och det underlägsna turbinatet i båda näsborrarna med en cytologiborste. Blötlägg borsten i ett 15 ml rör med 2 ml kommersiellt tillgängligt spolmedium; skaka försiktigt för att ta bort celler. Upprepa borstningen i den andra näsborren.
- Tillsätt följande antibiotika till spolmediet: Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 μg/ml), Tazocillin (10 μg/ml), Amfotericin B (2,5 μg/ml) och kolimycin (16 μg/ml).
OBS: Näsborstningar kan skickas på RT till dedikerade laboratorier för expansion och odling och kan sås upp till 72 timmar efter borstning.
3. Isolering av HNE
OBS: HNE isolerades från cytologiborsten, tvättades med Mg2+- och Ca2+-fri DPBS, dissocierades med 0,25% trypsin och såddes på en 25 cm2 plastkolv som tidigare beskrivits10.
- Lösgör celler från cytologiborsten genom att upprepade gånger leda borsten genom en 1000 μL pipettkon och skölja med 2 ml Mg2+- och Ca2+-fri DPBS. Centrifugera vid 500 x g i 5 min vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Resuspend pelleten i 0.25% Trypsin i 8-12 min för att dissociera celler. Stoppa den enzymatiska reaktionen genom att tillsätta 5 ml av förstärkningsmediet.
- Centrifugera vid 500 x g i 5 min vid 4 °C och kassera supernatanten. Resuspendera pelleten i 8 ml av förstärkningsmediet och fröet på en 25 cm2 kollagenbelagd kolv. Växa vid 37 °C och 5 % CO2. Detta motsvarar avsnitt 0.
- Följande dag, byt ut mediet med 5 ml färskt förstärkningsmedium och övervaka cellerna dagligen för fastsättning, morfologi (celler ska ha ett sammanhängande kullerstensutseende) och antal.
OBS: Den initiala sådddensiteten varierar beroende på kvaliteten på näsborstningen och andelen epitelceller. Nyligen isolerade HNE-celler når vanligtvis 80% -90% sammanflöde inom 3-10 dagar. En långsammare tillväxthastighet tyder på otillräckliga epitelceller i provet och bör kasseras.
4. Förstärkning och passering av humana nasala epitelceller
- Odla humana nasala epitelceller i förstärkningsmediet vid 37 °C och 5 %CO2 på kollagenbelagda kolvar tills 80%-90% sammanflöde, byta medium var 48-72:e timme. För 25 cm2 kolvar, använd 5 ml förstärkningsmedium och 10 ml för 75 cm2 kolvar.
- När cellerna når 80% -90% sammanflöde, tvätta cellerna med 10 ml Mg2+- och Ca2+-fri DPBS, aspirera och kassera.
- Tillsätt 1 ml 0,25 % trypsin till en 25 cm2 kolv (eller 2 ml trypsin för en 75 cm2-kolv ) och återgå till inkubatorn (37 °C, 5 %CO2) i 8–12 minuter.
- Knacka på kolven ordentligt, med handflatan, för att hjälpa cellerna att lossna.
- Tillsätt 10 ml av förstärkningsmediet för att stoppa den enzymatiska reaktionen. Skölj kraftigt kolven med 10 ml pipetten för att dra upp och driva ut förstärkningsmediet över kolvytan för att skölja och lossa celler.
- Centrifugera vid 500 x g i 5 min vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Resuspendera pelleten i 5-10 ml av förstärkningsmediet.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
OBS: Celler kan frysas vid denna tidpunkt (se steg 5.1-5.3). Om ytterligare amplifiering krävs, återsådda på kollagenbelagda kolvar (en 25 cm2-kolv kan expanderas till tre 75 cm 2-kolvar, en större utspädning rekommenderas inte).
5. Kryokonservering av primära nasala epitelceller
OBS: Odla HNE-celler tills passage 1 före biobankning för att få tillräckligt med celler för att underlätta celltillväxt när de tinas. Biobankning är dock möjlig vid första passage 0 eller passage 2. Följande kryokonserveringssteg är anpassade till alla passager.
- Efter cellräkning centrifugerar du vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C och kasserar supernatanten
- Återsuspendera pelleten i det berikade frysmediet (tabell 1) för att erhålla 3 x 106-5 x 106 celler per ml och per kryovial.
- Frys långsamt cellerna genom att sänka temperaturen vid ~ 1 ° C per min i en lämplig kryofrysningsbehållare vid -80 ° C. Nästa dag, flytta det konserverade provet till en kväveförvaringsbehållare för långvarig lagring (den nuvarande studien är begränsad till 17 månaders lagring).
6. Tina frysta förstärkta HNE-celler
- Värm upp vattenbadet till 37 °C. Bered förstärkningsmediet enligt beskrivningen i tabell 1 och värm mediet till 37 °C.
- Ta bort kryomedialer från kvävelagringstanken och placera dem snabbt i vattenbadet, var noga med att inte sänka ner hela injektionsflaskan i vattnet. Ta bort kryotyperna från vattenbadet när endast en liten frusen droppe kvarstår. Torka av injektionsflaskan med 70% alkohol, torka av och placera under huven.
- Använd en 1 ml pipett och överför de tinade cellerna till ett tomt 15 ml rör.
- På ett droppvis sätt, tillsätt 1 ml varmt förstärkningsmedium. Efter 1 min, tillsätt ytterligare 1 ml förstärkningsmedium och vänta ytterligare en minut.
- Tillsätt 10 ml av förstärkningsmediet och centrifugera i 2 min vid 500 x g.
- Aspirera och kassera supernatanten. Återsuspendera cellpelleten i en volym förstärkningsmedium som krävs för att uppnå en celltäthet på minst 1 x 106 celler/ml.
- Frö cellerna på en kollagenbelagd kolv som innehåller förstärkningsmediet.
- Om kryomedialen innehåller mer än 4 x 106 celler, frö på en 75 cm2-kolv i 10 ml av förstärkningsmediet
- Om kryokapitalet innehåller mindre än 4 x 106 celler, fröceller på en 25 cm2-kolv i 5 ml av förstärkningsmediet
- Inkubera vid 37 °C, 5% CO2 och observera visuellt cellexpansion under de kommande 2-3 dagarna.
- Utför sedan cellförstärkning enligt beskrivningen i avsnitt 4.
OBS: Om få celler skördades i steg 4.7. (dvs. om det fryser vid passage 0 före expansion), steg 6.5. och 6.6. kan utelämnas och celler kan sås direkt på en 25 cm2 kollagenbelagd kolv utan centrifugering. Mediet måste sedan bytas följande dag för att avlägsna dimetylsulfoxid (DMSO).
7. Differentiering av humana nasala epitelceller vid luft-vätskegränssnittet
OBS: HNE differentierades vid luft-vätskegränssnittet som tidigare beskrivits10.
- Frö cellerna med en densitet av 330 000 celler / filter på 0,33 cm2 kollagenbelagda porösa filter och komplettera med 300 μL av förstärkningsmediet vid apikal sida och 900 μL av luft-vätskemediet vid basolateralsidan.
- Efter 3 dagar, aspirera det apikala mediet och odla cellerna vid luft-vätskegränssnittet i 3-4 veckor i luft-vätskemediet för att upprätta ett differentierat epitel. Byt basalmediet var 48-72: e timme.
8. CFTR-modulatorer
- Förbered luft-vätskemedium som innehåller CFTR-modulatorer. Använd VX-445, VX-661 och VX-809 vid en slutlig koncentration av 3 μM och VX-770 vid 100 nM. Använd korrigerare ABBV-2222 vid 1 μM slutkoncentration och potentiator ABBV-974 vid 10 μM. Använd 100% DMSO för att lösa upp alla CFTR-modulatorer.
- Förbered luft-vätskemedium som innehåller samma mängd 100% DMSO som i korrigerande medium.
- Tillsätt mediet som innehåller läkemedel eller DMSO till den basolaterala sidan av polariserade HNE-celler som odlas vid ett luft-vätskegränssnitt och inkubera i 24 timmar i 5%CO2 vid 37 °C.
- Efter 24 timmar ska du aspirera och kasta mediet från sängen och ersätta med ett färskt medium som beretts enligt steg 8.1–8.2 och inkubera ytterligare under en 24-timmarsperiod i 5 %CO2 vid 37 °C.
9. Ussing kammarstudier
- Mät kortslutningsströmmätningar (Isc) under spänningsklämma som tidigare beskrivits9.
OBS: Transepitelial elektrisk resistans (TEER) hos kulturer mättes med en ätpinne voltmeter, och endast kulturer som nådde minst 200 Ω ·cm2 beaktades för följande experiment. Filter av polariserade HNE-celler monterades i Ussing-kamrar och kortslutningsströmmätningar (Isc) mättes under spänningsklämma förhållanden.
10. Immunocytokemi
- Utför immunodetektion enligt tidigare beskrivet9.
OBS: CFTR-immunodetektion utfördes med användning av anti-CFTR C-terminal (24-1) monoklonal antikropp över natten vid en 1/100 utspädning. Zona-occludens-1 (ZO-1) (1/500 utspädning), alfa-tubulin (1/300 utspädning), Muc 5AC (1/250 utspädning) och cytokeratin 8 (1/250 utspädning) färgning gjordes på ytterligare filter. Efter tvättning med PBS-Triton-X100 0,1% tillsattes get sekundära antikroppar konjugerade till Alexa 488 eller 594 i 30 min i 10% getserum (1/1000 utspädning). Efter en sista tvätt klipptes filter från stöd och monterades med Vectashield monteringsmedium innehållande DAPI. Ett konfokalmikroskop (63x / 1,4 oljedifferential interferenskontrast λ blått PL APO-mål) användes för att ta bilder, som analyserades med ImageJ-programvaran.
11. Statistisk analys
- Utför statistisk analys med lämplig programvara.
OBS: Statistisk analys utfördes med hjälp av S.A.S-programvara. Eftersom flera HNE-filter erhölls per patient och per tillstånd uttrycktes kvantitativa parametrar som medianvärden (± SEM) per patient. Jämförelser (medelvärde ± SD) utfördes med wilcoxon matchade par signerade rangtest eller oparade t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Färska HNE-celler odlade vid luft-vätskegränssnittet visar typiska egenskaper hos det polariserade och differentierade andningsepitelet som bedöms genom immunfärgning (figur 1). HNE-celler återdifferentierar till ett heterogent skikt av epitelceller (positiv keratin 8-immunfärgning) som efterliknar in vivo-situationen för ett pseudostratifierat andningsepitel bestående av cilierad (positiv alfa-tubulinfärgning) och icke-cilierade slemproducerande bägare celler (positiv Muc5Ac-immunfärgning). Det övergripande epitelet presenterar täta korsningar (bedömt av ZO-1, zona-occludens-1 färgning). Stark apikal CFTR-färgning är synlig i HNE-celler av vild typ (WT), och minskad CFTR-färgning både vid apikal yta och i cytoplasman observeras i F508del / F508del HNE.
Vi övervägde positiva resultat eftersom prover inte bara framgångsrikt expanderade utan också framgångsrikt differentierades till ett pseudostratifierat epitel efter 3 veckor vid luft-vätskegränssnitt och presenterade en TEER högre än 200 Ω · cm2, vilket möjliggör kortslutningsströmmätningar. Eftersom endast ett fåtal dedikerade laboratorier utför CFTR-relaterade Cl-sekretionsanalyser genom kortslutningsströmmätningar, kräver prover ofta transport från sjukhus till dedikerade anläggningar.
I de 78 färska HNE-cellproverna jämfördes framgångsgraden i näsborstningar som såddes omedelbart och i borstningar såddes efter 1-7 dagars transport i spolmedium vid rumstemperatur. Majoriteten av proverna (55%) såddes 1 dag efter borstning och 82% av proverna såddes inom 48 timmar. Den genomsnittliga andelen framgångsrika kulturer i alla 78 prover var 82% och nådde 87% i prover som såddes mellan dag 0 och dag 5 (tabell 2).
Framgångs- och felfrekvensen för identiska prover differentierade under både färska och frystinade förhållanden jämfördes. 83% av proverna som differentierades framgångsrikt under färska förhållanden var också framgångsrika i kryokonserverade prover. På samma sätt, i prover som inte lyckades differentiera under färska förhållanden, misslyckades 71% också under frys-tina förhållanden (tabell 2). Alla dessa data tyder på att kvaliteten på näsborstning är nyckelfaktorn för en framgångsrik kultur.
Vi ville också bestämma det optimala antalet celler per kryomedialt. Prover som frysts vid passage 0, från en enda 25 cm2 tillåter i allmänhet bara att nå 1-1,5 x 106 celler per kolv. Prover som frysts vid passage 1 och förstärkts till tre 75 cm2-kolvar tillåts i allmänhet nå 10 x 106 celler, vilket gör det möjligt att frysa flera injektionsflaskor som innehåller minst 3 x 106 celler. Under de odlingsförhållanden som beskrivs i detta protokoll misslyckades 50% av proverna frysta mellan 2 x 106 och 3 x 106 celler per kryovin att växa när de tinades och nådde 80% när de var under 2 x 106 celler per kryomedialt (tabell 2).
CFTR-relaterad Cl-utsöndring återspeglar CFTR-funktionen och kan mätas med kortslutningsström (Isc) -experiment i Ussing-kamrar. Isc-variationen som svar på Forskolin (ΔIscForskolin) och CFTR-hämmare inh172 (ΔIscCFTRinh172) är de viktigaste slutpunkterna för CFTR-korrektoreffektbedömning.
Kortslutningsströmsexperiment utfördes antingen på färsk HNE, expanderad i förstärkningsmedium och sådd på filter vid passage 2 och odlad vid luft-vätskegränssnitt i 3 veckor i luft-vätskemedium, eller från HNE som tidigare hade frysts vid passage 1 i berikat frysmedium, tinat, expanderat och sådd på porösa filter vid passage 3. Kryokonserveringstiderna varierade från 3 månader till 16 månader, med ett medelvärde på 9,8 månader. I de odlings- och kryokonserveringsförhållanden som beskrivs i denna studie observerades inga signifikanta förändringar i tillväxt eller morfologi mellan olika passager eller färska eller frysta tinade F508del / F508del HNE-kulturer.
För både medelvärdet av ΔIscForskolin (figur 2A) och medelvärdet av ΔIscCFTRinh172 (figur 2B) i DMSO-behandlade HNE-celler observerades ingen signifikant skillnad mellan färsk eller fryst tinad HNE. För att bedöma om funktionell korrigering av CFTR påverkades av kryokonservering mättes genomsnittliga Isc-förändringar i VX-809 + VX-770-behandlade celler jämfört med DMSO-behandlade HNE-celler i färska (HNE-celler härledda från n = 78 patienter) eller fryst tinade HNE (HNE-celler härledda från n = 9 patienter) (Figur 2). Både frysta och tinade celler uppvisade signifikant korrigering vid behandling, med en signifikant ökning av ΔIscForskolin (p < 0,05) (figur 2A) och en signifikant minskning av ΔIscCFTRinh172 (p < 0,05) (figur 2B). Den genomsnittliga vikökningen för ΔIscForskolin (ΔIscForskolin VX-809 + VX-770/ΔIscForskolin DMSO) nådde 2,9 ± 1,6 i frysta tinade HNE-celler och skilde sig inte signifikant från vikökningen i färska HNE-celler (2,5 ± 2,0). På samma sätt påverkades inte vikminskningen i ΔIscCFTRinh172 (ΔIscCFTRinh172 VX-809 + VX-770/ΔIscCFTRinh172 DMSO) signifikant av kryokonservering: 1,49 ± 0,9 i fryst tinad HNE jämfört med 2,5 ± 3,7 i färsk HNE.
Den funktionella korrigeringsaktiviteten hos flera modulatorterapier undersöktes ytterligare för att bedöma om denna HNE-cellmodell kunde skilja mellan olika behandlingar. Resultaten här kombinerar HNE-celler från både färska och frysta tinade tillstånd eftersom svaret på behandlingen inte förändrades signifikant genom kryokonservering (figur 2).
Vi utvärderade först korrektorsvaret för två godkända CFTR-modulatorterapier på Cl-transport efter en 48-timmars behandling med antingen VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) eller VX-661 (3 μM) + VX-770 (100 nM) i HNE-celler från 10 F508del / F508del-patienter (figur 3). Jämfört med DMSO-behandlade HNE-celler förbättrades ΔIscForskolin (figur 3A) och ΔIscCFTRinh172 (figur 3B) signifikant med både VX-809 + VX-770 och VX-661 + VX-770. Båda behandlingarna korrigerade funktionellt CFTR-relaterad Cl-utsöndring till en liknande nivå, med en signifikant genomsnittlig veckökning av ΔIscForskolin på 1,75 ± 1,39 för VX-809 + VX-770 (p < 0,001) och 0,97 ± 0,93 för VX-661 + VX-770 (p < 0,01). Genomsnittlig ΔIscCFTRinh172-faldig minskning var 1,79 ± 2,04 för VX-809 + VX-770 (p < 0,001) och skilde sig inte signifikant från den genomsnittliga ΔIscCFTRinh172-vikminskningen på 1,16 ± 1,44 för VX-661 + VX-770 (p < 0,001 jämfört med DMSO).
Tre olika CFTR-modulatorterapier i HNE från sex F508del/F508del-patienter (figur 4) jämfördes ytterligare. Resultaten här kombinerar HNE-celler från både färska och frysta tinade förhållanden. Både Vertex- och Abbvie CFTR-modulatorer, när de används som en kombination av en CFTR-korrigerare och en CFTR-potentiator, korrigerade ΔIscForskolin (figur 4A) och ΔIscCFTRinh172 (figur 4B) i liknande utsträckning. Den partiella korrigeringen som observerades i figur 3 av VX-809 + VX-770 bekräftades i dessa HNE-celler med en genomsnittlig ΔIscForskolin-veckökning på 2,87 ± 1,67 (p < 0,05). ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM) behandling inducerade en liknande korrigering som representerar 91% av VX-809 + VX-770-korrigering för ΔIscForskolin (genomsnittlig ΔIscForskolin-veckökning på 2,6 ± 1,4, p < 0,05 jämfört med DMSO) och 85% av VX-809 + VX-770 för ΔIscCFTRinh172 (medelvärde ΔIscCFTRinh172 vik minskning på 4,2 ± 5,7, p < 0,05 jämfört med DMSO).
Intressant nog, när HNE behandlades med trippelkombinationen VX-445 (3 μM) + VX-661 (3 μM) + VX-770 (100 nM), förbättrades korrigeringseffekten signifikant och nådde 312% av VX-809 + VX-770 ΔIscForskolin-korrigering (genomsnittlig ΔIscForskolin-veckökning på 9,0 ± 4,1, p < 0,05 vs. VX-809 + VX-770) och 372% av ΔIscCFTRinh172 (genomsnittlig ΔIscCFTRinh172-faldig minskning på 15,5 ± 10,5, p < 0,05 mot VX-809 + VX-770).
Figur 1: Differentieringsmarkörer i HNE-kulturer. Representativa konfokalmikroskopibilder av immunfluorescerande färgning av CFTR (grön), Zona-Occludens-1 (ZO-1, röd), alfa-tubulin (grön), Muc5AC (röd) och cytokeratin 8 (K8, grön) i vildtyp (WT) (första panelen) och F508del (paneler 2-4) HNE-celler odlade vid luft-vätskegränssnitt i 3 veckor. Kärnor färgades blå med DAPI. Projektioner av konfokalmikroskopibilder, toppvy (övre paneler) och sidovy (nedre paneler) av tredimensionella (3D) Z-staplar rekonstitueringar. Skalstrecket (20 μm) gäller för både övre och nedre paneler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Effekt av frysning-upptining på CFTR-relaterad Cl-utsöndring i HNE-celler. Sammanfattning av kortslutningsströminspelningar (Isc) (medelvärde ± SD) i HNE-kulturer härledda från patienter med F508del / F508del och odlade vid luft-vätskegränssnitt i 3 veckor. Cellerna behandlades i 48 timmar med enbart vehikel (DMSO) eller VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) i färska (ljusgrå, patientderiverade HNE-celler från 78 patienter) eller frysta tinade (mörkgrå, patient-härledda HNE-celler från 9 patienter). Data representerar det genomsnittliga (± SD) svaret på akut tillsatt (A) Forskolin (10 μM)/3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX, 100 μM), ΔIscForskolin eller (B) CFTR-hämmare inh172 (5 μM) ΔIscCFTRinh172. Minst två filter analyserades per patient och per tillstånd. Asterisker anger den statistiska skillnaden mellan korrigerare och kontroll (DMSO-behandlad) * p < 0,05 (oparat t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Korrigering av CFTR-funktionen genom dubbla terapier. Sammanfattning av kortslutningsströminspelningar (Isc) (medelvärde ± SD) i HNE-kulturer härledda från 10 F508del / F508del-patienter och odlade vid luft-vätskegränssnitt i 3 veckor (kombinerade resultat från både färska och frysta tinade kulturer). Cellerna behandlades i 48 timmar med enbart vehikel (DMSO); VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) eller VX-661 (3μM) + VX-770 (100 nM). Data representerar det genomsnittliga (± SD) svaret på akut tillsatt (A) Forskolin (10 μM) / IBMX (100 μM), ΔIscForskolin eller (B) CFTR-hämmare inh172 (5 μM), ΔIscCFTRinh172. Minst två filter analyserades per patient och per tillstånd. Asterisker indikerar en statistisk skillnad mellan korrigerare och kontroll (DMSO-behandlad) ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 (Wilcoxon matchade par signerade rangtest). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Effektivitet för trippelterapi jämfört med dubbla terapier på CFTR-korrigering. Sammanfattning av kortslutningsströminspelningar (Isc) (medelvärde ± SD) i HNE-kulturer härledda från 6 F508del / F508del-patienter och odlade vid luft-vätskegränssnitt i 3 veckor (kombinerade resultat från både färska och frysta tinade celler). Cellerna behandlades i 48 timmar med enbart vehikel (DMSO); VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM); ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM); eller VX-661 (3 μM) + VX-445 (3 μM) + VX-770 (100 nM). Data representerar det genomsnittliga (± SD) svaret på akut tillsatt (A) Forskolin (10 μM)/IBMX (100 μM), ΔIscForskolin eller (B) CFTR-hämmare inh172 (5 μM), ΔIscCFTRinh172. Minst två filter analyserades per patient och per tillstånd. Asterisker indikerar en statistisk skillnad mellan behandlingar. * p < 0,05 (Wilcoxon matchade par signerade rangtest). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Media-komponent | Slutlig koncentration |
| FÖRSTÄRKNING MEDIUM | |
| Avancerad DMEM / F-12 näringsblandning | 86% |
| Fetalt bovint serum | 10% |
| Penicillin | 100 U/ml |
| Streptomycin | 100 μg/ml |
| Tazocillin | 10 μg/ml |
| Amfotericin B | 2,5 μg/ml |
| Kolimycin | 16 μg/ml |
| Ciprofloxacin | 3 μg/ml |
| Hydrokortison | 0,2 μM |
| Insulin | 5 μg/ml |
| Adrenalin | 0,5 μg/ml |
| Egf | 10 ng/ml |
| Y-27632 (Rho-associerad kinashämmare) | 10 μM |
| LUFT-FLYTANDE MEDIUM | |
| Avancerad DMEM / F-12 näringsblandning | 94% |
| UltroserG | 2% |
| Penicillin | 100 U/ml |
| Streptomycin | 100 μg/ml |
| Tazocillin | 10 μg/ml |
| Amfotericin B | 2,5 μg/ml |
| Kolimycin | 16 μg/ml |
| BERIKAT FRYSMEDIUM | |
| F12 Näringsämne Blandning | 77% |
| HEPES | 3% |
| Fetalt bovint serum | 10% |
| DMSO | 10% |
Tabell 1: Förstärkning, luft-vätska och berikad frysmediumkomposition. Förteckning över reagenser och motsvarande slutliga koncentrationer.
| Längd på bevarande av näsborstning före sådd (n = 78) | |
| Dagar före sådd | Framgångsgrad (%) |
| 0 | 83 |
| 1 | 84 |
| 2 | 67 |
| 3 | 100 |
| 4 | 89 |
| 5 | 100 |
| 7 | 0 |
| Resultat från samma initiala näsborstning som odlats under både färska och frysta tinade förhållanden (n = 13) | |
| Resultat under nya förhållanden | Framgångsgrad vid frysning-upptining (%) |
| framgång | 83 |
| misslyckande | 29 |
| Cellantalets inverkan på framgångsgraden (n = 36) | |
| Antal celler per kryomedialt | Framgångsgrad vid frysning-upptining (%) |
| <2 x 106 | 20 |
| 2–3 x 106 | 50 |
| 3–4 x 106 | 67 |
| >4 x 106 | 79 |
Tabell 2: Parametrar som påverkar framgångsgraden i färska och frysta tinade HNE-cellkulturer. Framgångsgraden definierades som näsborstningar som framgångsrikt expanderade och differentierades till ett pseudo-stratifierat epitel efter 3 veckor vid luft-vätskegränssnittet och presenterade en TEER högre än 200 Ω ·cm2. Före sådd skickades prover vid rumstemperatur i spolmedium med antibiotika. Resultaten representerar data från 78 färska prover och 36 frysta tinade prover. 13 näsborstningar analyserades i både färska och frysta tinade förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av patient-härledda nasala epitelceller som surrogater för humana bronkialepitelceller (HBE) för att mäta CFTR-aktivitet i samband med personlig medicin har föreslagits eftersom HNE reproducerar cellernas egenskaper i odling 9,11. Den starka fördelen med HNE jämfört med HBE-cellkulturer är att de enkelt och icke-invasivt provtas. Kortslutningsströmmätningar i HNE-cellkulturer möjliggör bedömning av CFTR-beroende Cl-transport över epitelet, vilket visade sig signifikant korrelera med CFTR-in vivo-aktivitet bedömd av nasal potentialskillnad hos patienter med olika genotyper9. Räddningen av CFTR-aktivitet i HNE-celler vid VX-809-behandling korrelerade också signifikant till förbättringen av det kliniska resultatet FEV1 i lumacaftor-ivakaftorbehandlade F508del homozygota patienter12.
Viktigt är att denna studie visar att nyskördade HNE-celler lätt tolererar transport- och standardtransportförhållanden (dvs. de överlever 72 timmar vid rumstemperatur) vilket möjliggör testning av patientens celler från olika geografiska platser. De kritiska faktorerna för framgångsrik odling är främst kvaliteten på näsborstning och antalet levande celler vid provtagning. Ett antal protokoll har publicerats om växande och differentierande HNE-cellkulturer; vissa utan villkorad omprogrammering under expansionsfasen 13,14,15,16,17,18,19,20, andra med villkorad omprogrammering i mataren 9,11,12,21,22,23,24,25 ,26 eller matarfri 5,8,27,28,29 villkor, och flera som jämför olika metoder 7,8. De gör det alla möjligt att erhålla ett relativt stort antal ALI-kulturer med korrekt differentiering och polarisering samt goda TEER-värden. I likhet med denna studie använde många kryokonserverade HNE-celler frusna vid passage 113,28. Intressant nog rapporterar flera författare att ROCKi kan förbättra överlevnaden efter kryokonservering när den läggs till odlingsmediet efter upptining och öka antalet celler som förblir fästa 5,29, vilket tyder på att förstärkningsmediet som används i denna studie är särskilt lämpligt för kryokonservering.
Här visar studien att HNE-celler framgångsrikt kan biobankas, den kritiska faktorn är återigen kvaliteten på näsborstningen. En god korrelation mellan resultatet av färska prover och frysta tinade prover visas, vilket tyder på att för att optimera kvaliteten på HNE-celler som kommer att biobankas för vidare studier, kan en preliminär studie utföras på färska prover om de inte uppnår korrekt ALI-differentiering och acceptabelt TEER-värde; en andra näsborstning skulle vara att föredra snarare än att frysa celler som har stor sannolikhet för dåligt resultat. En andra kritisk faktor för kryokonservering är cellnummer; under odlingsförhållandena som används i denna studie, när mindre än 2 x 106 celler fryses per kryovial, är felfrekvensen mycket hög. Frysning av minst 3 x 106 celler per kryovulium rekommenderas.
Resultaten i denna studie tyder på att frys-upptining inte signifikant modifierar HNE-cellernas elektrofysiologiska egenskaper eller svar på CFTR-modulatorer. Åtgärdsområdet i HNE-cellkulturer från samma F508del-homozygota patient som erhölls utan frysning eller efter upptining var inte annorlunda vid behandling med VX-809 + VX-770. Liknande resultat rapporterades tidigare för HBE-celler där Forskolin-stimulerad Isc var stabil efter flera upptinings-/odlingscykler av icke-behandlade F508del-celler30. Detta ger bevis för att HNE-celler kan frysas och lagras i en biobank och studeras senare.
Ett ökande antal studier visar att HNE-cellkulturer kan användas för att testa effekten av olika terapier i samband med personlig medicin. Analysen visade att dubbla terapier som kombinerar en korrigerare med en potentiator alla har jämförbar korrigeringseffekt för CFTR-beroende Cl-utsöndring i F508del-homozygota HNE-celler. En viktig interpatientvariation noterades dock, vilket bekräftade publicerade resultat 9,12,20,25. Däremot tredubblade VX-445 + VX-661 + VX-770 korrigering av CFTR-aktivitet jämfört med VX-809 + VX-770. En liknande nivå av korrigering av F508del-CFTR i HNE-celler vid trippelkombination observerades också av Laselva et al.28. Som rapporterats av Veit et al.26 var korrigeringen av Cl-kanalfunktionen vid VX-445 + VX-661 + VX-770-behandling ännu högre och nådde 62% av genomsnittlig WT-CFTR-aktivitet (intervall 19-36 μA / cm2 i korrigerad F508del-HNE och 14-50 μA / cm2 i WT-HNE)26.
HNE-cellkulturer tjänade också till att testa effekten av CFTR-modulatorer för andra klass II-mutationer. En viktig förbättring av CFTR-aktiviteten vid VX-445 + VX-661 + VX-770 observerades i HNE ALI-kulturer som hyser G85E / G85E, V520F / 1717-1G>A, Y569 / Y569D, M1101K / M1101K och N1303K / N1303K genotyper26. På samma sätt visade Laselva et al.28 en signifikant korrigering av CFTR med M1101K- och N1303K-mutationer men ingen signifikant korrigering i G85E HNE-celler. Galapagos/AbbVie-korrigerare utvärderades för dessa lumacaftor-ivakaftorresistenta mutanter31. AbbVie-korrigerare AC2-1 och särskilt bi-korrigerare AC1 + AC2-1 förbättrade effektivt Cl-utsöndringen i M1101K- och G85E HNE-celler, medan N1303K-härledda celler korrigerades med en kombination av AC1 + AC2-2.
Mått på CFTR-aktivitet i HNE-celler är lovande prekliniska biomarkörer som är prediktiva för patientens svar på testad behandling. Bevis för att frysnings-upptiningscykler inte förändrar korrigeringsnivån ger bevis för att dessa celler kan biobankas och användas som ett kraftfullt verktyg i samband med personliga läkemedelsprogram. En unik näsborstning kan därför möjliggöra tillräckligt med material för att jämföra läkemedelseffektivitet, och patientens HNE-celler kan tinas när nya läkemedel blir tillgängliga utan att patienterna behöver omsamplas. detta är särskilt intressant hos spädbarn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapporterar inga konkurrerande ekonomiska intressen relaterade till denna publikation eller vetenskaplig videoproduktion.
Acknowledgments
Vi tackar varmt alla patienter och deras familjer för deltagande i studien. Detta arbete stöddes av bidrag från den franska föreningen Vaincre la Mucoviscidose; Franska föreningen ABCF 2 och Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABBV-2222 | Selleckchem | S8535 | |
| ABBV-974 | Selleckchem | S8698 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies | 12634010 | |
| Alexa 488 goat secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A11012 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290026 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody | Abcam | ab80779 | |
| Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1) | R&D Systems | MAB25031 | |
| Anti-cytokeratin 8 antibody | Progen | 61038 | |
| Anti-Muc5AC antibody | Santa Cruz Biotech | sc-20118 | |
| Anti-ZO-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-10804 | |
| Ciprofloxacin | provided by Necker Hospital Pharmacy | ||
| Colimycin | Sanofi | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Collagen type IV | Sigma-Aldrich Merck | C-7521 | |
| cytology brush | Laboratory GYNEAS | 02.104 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich Merck | D2650 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Epinephrin | Sigma-Aldrich Merck | E4375 | |
| F12-Nutrient Mixture | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Ferticult | Fertipro NV | FLUSH020 | |
| Flasks 25 | Thermo Scientific | 156.367 | |
| Flasks 75 | Thermo Scientific | 156.499 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 20104.298 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Merck | H3375 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich Merck | SLCJ0893 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich Merck | I0516 | |
| Mg2+ and Ca2+-free DPBS | Life Technologies | 14190094 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140130 | |
| Tazocillin | Mylan | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Transwell Filters | Sigma-Aldrich Merck | CLS3470-48EA | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich Merck | T8787 | |
| Trypsin 0,25% | Life Technologies | 25200056 | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| VX-445 | Selleckchem | S8851 | |
| VX-661 | Selleckchem | S7059 | |
| VX-770 | Selleckchem | S1144 | |
| VX-809 | Selleckchem | S1565 | |
| Xylocaine naphazoline 5% | Aspen France | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).
- Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR. The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).
- Griese, M., et al. Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
- Liu, X., et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
- Bukowy-Bieryłło, Z. Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we. Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).
- Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).
- Noel, S., et al. Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells. The Journal of Physiology. , (2021).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Pranke, I., et al. Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).
- McDougall, C. M., et al. Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).
- Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance. PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).
- Schögler, A., et al. Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling. Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).
- Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).
- Awatade, N. T., et al. Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis. EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).
- Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
- Veit, G., et al. Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination. JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).
- Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research. Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).
- Laselva, O., et al. Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator. The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).
- Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods in Molecular Biology. 741, Clifton, N.J. 39-54 (2011).
- Laselva, O., et al. Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).
