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Biology

प्राथमिक मानव नाक उपकला कोशिकाएं: प्रेसिजन मेडिसिन के संदर्भ में बायोबैंकिंग

Published: April 22, 2022 doi: 10.3791/63409
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2,3
1Institut Necker Enfants Malades, 2Université de Paris, 3Centre de Référence Maladies Rares Mucoviscidose et Maladies apparentées, Assistance Publique Hôpitaux de Paris

Summary

यहां हम वायु-तरल इंटरफ़ेस पर प्राथमिक मानव नाक उपकला (एचएनई) कोशिकाओं के अलगाव, प्रवर्धन और भेदभाव का वर्णन करते हैं और एक बायोबैंकिंग प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक फ्रीज करने की अनुमति देता है और फिर एचएनई को पिघलाता है। प्रोटोकॉल विभेदित एचएनई कोशिकाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों और विभिन्न मॉड्यूलेटर उपचारों पर सीएफटीआर से संबंधित क्लोराइड स्राव सुधार का विश्लेषण करता है।

Abstract

मानव नाक उपकला (एचएनई) कोशिकाओं को सरल, गैर-आक्रामक नाक ब्रशिंग द्वारा एकत्र करना आसान है। रोगी-व्युत्पन्न प्राथमिक एचएनई कोशिकाओं को सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन कंडक्टेंस रेगुलेटर (सीएफटीआर) फ़ंक्शन के सूचकांक के रूप में चक्रीय एएमपी-मध्यस्थता क्लोराइड (सीएल-) परिवहन को मापने के लिए वायु-तरल इंटरफ़ेस स्थितियों में एक छद्म-स्तरीकृत उपकला में प्रवर्धित और विभेदित किया जा सकता है। यदि नाक ब्रशिंग की गुणवत्ता और क्रायोप्रिजर्वेशन पर सेल घनत्व जैसे महत्वपूर्ण कदम कुशलतासे किए जाते हैं, तो एचएनई कोशिकाओं को सफलतापूर्वक बायोबैंक किया जा सकता है। इसके अलावा, शॉर्ट-सर्किट वर्तमान अध्ययनों से पता चलता है कि फ्रीज-thawing एचएनई कोशिकाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों और सीएफटीआर मॉड्यूलेटर की प्रतिक्रिया को महत्वपूर्ण रूप से संशोधित नहीं करता है। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली संस्कृति की स्थिति में, जब 2 x 106 कोशिकाओं से कम प्रति क्रायोवियल जमे हुए होते हैं, तो विफलता दर बहुत अधिक होती है। हम प्रति क्रायोवियल कम से कम 3 x 106 कोशिकाओं को ठंडा करने की सलाह देते हैं। हम दिखाते हैं कि एक CFTR potentiator के साथ एक CFTR सुधारक के संयोजन दोहरी उपचार F508del-homozygous HNE कोशिकाओं में CFTR गतिविधि के लिए एक तुलनीय सुधार प्रभावकारिता है। ट्रिपल थेरेपी VX-445 + VX-661 + VX-770 दोहरी चिकित्सा VX-809 + VX-770 की तुलना में CFTR गतिविधि के सुधार में काफी वृद्धि हुई है। एचएनई कोशिकाओं में सीएफटीआर गतिविधि का उपाय एक आशाजनक पूर्व-नैदानिक बायोमार्कर है जो सीएफटीआर मॉड्यूलेटर थेरेपी का मार्गदर्शन करने के लिए उपयोगी है।

Introduction

सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) एक ऑटोसोमल रिसेसिव विकार है जो सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन कंडक्टेंस रेगुलेटर (सीएफटीआर) जीन में उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप होता है, जो सीएफटीआर प्रोटीन की अनुपस्थिति या शिथिलता के लिए अग्रणी होता है, एक अनियन चैनल जो एपिथेलिया 1,2 की एपिकल सतह पर स्थित है। CFTR थेरेपी में हाल की प्रगति ने बीमारी के पूर्वानुमान में सुधार किया है, और CFTR correctors और CFTR potentiators के संयोजन वाली अंतिम अनुमोदित दवाओं ने फेफड़ों के कार्य और CF रोगियों के लिए जीवन की गुणवत्ता में प्रमुख सुधार किया है, जो सबसे लगातार उत्परिवर्तन p.Phe508del उत्परिवर्तन (F508del) 3,4 ले जा रहे हैं। इस आशाजनक चिकित्सीय प्रगति के बावजूद, लगभग 10% सीएफ रोगी अयोग्य हैं क्योंकि वे उत्परिवर्तन करते हैं जो इन सीएफटीआर मॉड्यूलेटरों द्वारा अव्यवहार्य हैं। इन रोगियों के लिए, विशिष्ट उत्परिवर्तनों के लिए सबसे कुशल संयोजन खोजने के लिए अन्य दवाओं या दवा संयोजनों का परीक्षण करने की आवश्यकता है, व्यक्तिगत उपचारों के महत्व को उजागर करते हुए।

मानव नाक उपकला (एचएनई) कोशिकाओं को सरल, गैर-इनवेसिव नाक ब्रशिंग द्वारा एकत्र करना आसान है और सीएफटीआर फ़ंक्शन के सूचकांक के रूप में चक्रीय एएमपी-मध्यस्थता क्लोराइड (सीएल-) परिवहन के परिमाणीकरण की अनुमति देता है। एचएनई कोशिकाएं मानव वायुमार्ग का एक सटीक मॉडल उत्पन्न करती हैं, लेकिन उनका जीवनकाल संस्कृति में सीमित है। संस्कृति तकनीकों के अनुकूलन के लिए धन्यवाद, रोगी-व्युत्पन्न प्राथमिक एचएनई कोशिकाओं को सशर्त रूप से Rho-संबद्ध किनेज अवरोधक (ROCKi) के साथ फिर से प्रोग्राम किया जा सकता है, प्रवर्धित किया जा सकता है, और माइक्रोपोरस फिल्टर 5,6 पर हवा-तरल इंटरफ़ेस (ALI) स्थितियों में एक छद्म-स्तरीकृत उपकला में विभेदित किया जा सकता है। एचएनई संस्कृति के लिए कई संस्कृति प्रोटोकॉल मौजूद हैं (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, सीरम-मुक्त, "होममेड", फीडर-कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति, आदि), और मीडिया और संस्कृति की स्थिति की पसंद को विकास, सेल जनसंख्या भेदभाव और उपकला समारोह 7,8 को प्रभावित करने के लिए वर्णित किया गया है। यहां प्रोटोकॉल एक सरलीकृत, फीडर-मुक्त, आरओसीके प्रवर्धन विधि प्रस्तुत करता है जो बड़ी संख्या में एचएनई कोशिकाओं को सफलतापूर्वक प्राप्त करने की अनुमति देता है जो तब सीएफटीआर फ़ंक्शन एसेस के लिए अली में विभेदित होते हैं।

हमने प्रदर्शित किया है कि, विभेदित एचएनई कोशिकाओं में, सीएफटीआर मॉड्यूलेटर के साथ 48 एच उपचार सीएफटीआर निर्भर सीएल-करंट के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सुधार को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है और विट्रो में मनाया गया सुधार रोगी के नैदानिक सुधार9 के साथ सहसंबद्ध हो सकता है। एचएनई कोशिकाएं, इसलिए, न केवल मौलिक सीएफ अनुसंधान के लिए बल्कि रोगी-विशिष्ट सीएफटीआर मॉड्यूलेटर परीक्षण के साथ पूर्व-नैदानिक अध्ययन के लिए एक उपयुक्त मॉडल का प्रतिनिधित्व करती हैं। व्यक्तिगत चिकित्सा के इस संदर्भ में, प्रोटोकॉल का लक्ष्य यह सत्यापित करना था कि सीएफ रोगियों से क्रायोप्रिजर्व्ड एचएनई कोशिकाएं, हमारी स्थितियों में उगाई गई, सीएफटीआर सुधार अध्ययनों के लिए एक उपयुक्त मॉडल थीं, और इसी तरह के परिणामों की उम्मीद की जा सकती है जब सीएफटीआर निर्भर सीएल- ताजा और जमे हुए-पिघले हुए कोशिकाओं से परिवहन की तुलना की जा सकती है। अध्ययन ने दोहरे और ट्रिपल उपचारों का उपयोग करते समय विभिन्न सीएफटीआर मॉड्यूलेटरों की प्रभावकारिता का भी मूल्यांकन किया।

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Protocol

सभी प्रयोगों को हेलसिंकी की घोषणा और मानव अनुसंधान नैतिकता पर हुरिएट-सेरुस्कलेट कानून द्वारा वर्णित दिशानिर्देशों और नियमों का पालन करते हुए किया गया था।

1. फ्लास्क और विभिन्न मीडिया की तैयारी

  1. प्रवर्धन, वायु-तरल, और ठंड माध्यम तैयार करें जैसा कि तालिका 1 में वर्णित है।
  2. 0.2% ग्लेशियल एसिटिक एसिड के 100 मिलीलीटर में कोलेजन के 50 मिलीग्राम को भंग करके मानव कोलेजन IV का एक स्टॉक समाधान तैयार करें। कम से कम 1 घंटे के लिए एक चुंबकीय हलचल पर मिश्रण करें, और समाधान को निष्फल करें। एक कांच की बोतल में 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, जो प्रकाश से संरक्षित है।
  3. डबल-आसुत पानी में स्टॉक समाधान 1: 5 को पतला करके कोलेजन IV का एक कामकाजी समाधान तैयार करें। 6 महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. कोलेजन काम समाधान के साथ प्लास्टिक सेल संस्कृति फ्लास्क या ट्रांसवेल फिल्टर कोट करें। समान रूप से 0.33 सेमी2 ट्रांसवेल फिल्टर के लिए 100 μL वितरित करें, 25सेमी 2 फ्लास्क के लिए 500 μL, और फ्लास्क की पूरी विकास सतह पर 75 सेमी2 फ्लास्क के लिए 1 मिलीलीटर।
    नोट: यह धीरे से पक्ष से पक्ष करने के लिए फ्लास्क झुकाव द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, फ्लास्क कोटिंग की सुविधा के लिए, एक बढ़ी हुई मात्रा का उपयोग किया जा सकता है, और जब पूरी सतह समान रूप से कवर की जाती है, तो कोलेजन समाधान को केवल इंगित मात्रा को छोड़ने के लिए एस्पिरेटेड किया जाता है। एस्पिरेटेड कोलेजन समाधान का उपयोग अगले फ्लास्क को कोट करने के लिए तुरंत किया जा सकता है (यानी, तीन 75 सेमी2 फ्लास्क के लिए, पहले फ्लास्क में समान रूप से कोलेजन समाधान के 3 एमएल वितरित करें, एस्पिरेट 2 एमएल, जो तब अगले फ्लास्क के लिए उपयोग किया जाता है, और इसी तरह)।
  5. सेल संस्कृति फ्लास्क को इनक्यूबेटर में कम से कम 2 घंटे या रात भर के लिए छोड़ दें। कोलेजन को अच्छी तरह से एस्पिरेट करें और फ्लास्क को इनक्यूबेटर में या हुड के नीचे कम से कम 20 मिनट या रात भर के लिए सूखने के लिए छोड़ दें।
  6. एमजी2 + के 10 मिलीलीटर के साथ धोएं - और सीए2 + मुक्त डीपीबीएस, इनक्यूबेटर में सूखने की अनुमति दें, और प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में स्टोर करें। फ्लास्क को कमरे के तापमान (आरटी) पर 6 महीने तक स्टोर करें।

2. नाक ब्रश

नोट: सुनिश्चित करें कि नाक ब्रशिंग किया जाता है, जबकि प्रतिभागी को तीव्र संक्रमण नहीं होता है। यदि सीएफ रोगी एक फुफ्फुसीय संक्रमण पेश करते हैं, तो रोगी के एंटीबायोग्राम को देखें और प्रवर्धन माध्यम में अतिरिक्त एंटीबायोटिक्स जोड़ें। मानव नाक उपकला कोशिकाओं F508del / F508del रोगियों से नाक ब्रशिंग द्वारा एकत्र किए गए थे जैसा कि पहले वर्णित9 था।

  1. रोगी को अपनी नाक उड़ाने के लिए कहें, फिर दोनों नथुने के म्यूकोसा को शीर्ष रूप से एनास्थेटाइज़ करें, जिसमें कपास के meshes का उपयोग करके 5% नेफाज़ोलाइन समाधान के साथ xylocaine 5% में भिगोया जाता है।
  2. धीरे से एक साइटोलॉजी ब्रश का उपयोग कर औसत दर्जे की दीवार और दोनों नथुने के अवर turbinate ब्रश. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लशिंग माध्यम के 2 एमएल के साथ एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में ब्रश को भिगोएं; कोशिकाओं को अलग करने के लिए धीरे से हिलाएं। दूसरी नासिका में ब्रश करना दोहराएं।
  3. फ्लशिंग माध्यम में निम्नलिखित एंटीबायोटिकदवाओं को जोड़ें: पेनिसिलिन (100 यू / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg / mL), टैज़ोसिलिन (10 μg / mL), एम्फोटेरिसिन बी (2.5 μg / mL) और कोलिमिसिन (16 μg / mL)।
    नोट: नाक brushings विस्तार और संस्कृति के लिए समर्पित प्रयोगशालाओं के लिए आरटी पर भेजा जा सकता है और ब्रश करने के बाद 72 ज तक seeded किया जा सकता है.

3. एचएनई का अलगाव

नोट: एचएनई को साइटोलॉजी ब्रश से अलग किया गया था, एमजी2 + - और सीए2 + मुक्त डीपीबीएस के साथ धोया गया था, 0.25% ट्रिप्सिन के साथ अलग किया गया था, और 25 सेमी2 प्लास्टिक फ्लास्क पर बीज दिया गया था जैसा कि पहले10 वर्णित था।

  1. कोशिकाओं को साइटोलॉजी ब्रश से अलग करें बार-बार ब्रश को 1000 μL पिपेट शंकु के माध्यम से पारित करके और Mg 2 +और Ca 2 + मुक्त DPBS के 2 mL के साथ rinsing। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant को त्याग दें।
  2. कोशिकाओं को अलग करने के लिए 8-12 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन में गोली को फिर से निलंबित करें। प्रवर्धन माध्यम के 5 एमएल जोड़कर एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया को रोकें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant को त्याग दें। प्रवर्धन माध्यम के 8 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें और 25 सेमी2 कोलेजन-लेपित फ्लास्क पर बीज। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर बढ़ो। यह मार्ग 0 से मेल खाता है।
  4. अगले दिन, माध्यम को 5 मिलीलीटर ताजा प्रवर्धन माध्यम के साथ बदलें और अनुलग्नक, आकृति विज्ञान (कोशिकाओं में एक एकजुट कोबलस्टोन उपस्थिति होनी चाहिए) के लिए दैनिक कोशिकाओं की निगरानी करें, और संख्या।
    नोट: प्रारंभिक सीडिंग घनत्व नाक ब्रशिंग की गुणवत्ता और उपकला कोशिकाओं के अनुपात के आधार पर भिन्न होता है। ताजा अलग-थलग एचएनई कोशिकाएं आमतौर पर 3-10 दिनों के भीतर 80% -90% confluency तक पहुंच जाती हैं। एक धीमी विकास दर नमूने में अपर्याप्त उपकला कोशिकाओं का विचारोत्तेजक है और इसे छोड़ दिया जाना चाहिए।

4. प्रवर्धन और मानव नाक उपकला कोशिकाओं के passaging

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रवर्धन माध्यम में मानव नाक उपकला कोशिकाओं को विकसित करें औरकोलेजन-लेपित फ्लास्क पर 5% सीओ 2 80% -90% कन्फ्लुएंसी तक, हर 48-72 घंटे में माध्यम बदलते हुए। 25 सेमी2 फ्लास्क के लिए, 75 सेमी2 फ्लास्क के लिए 5 मिलीलीटर प्रवर्धन माध्यम और 10 मिलीलीटर का उपयोग करें।
  2. जब कोशिकाएं 80% -90% confluency तक पहुंचती हैं, तो कोशिकाओं को Mg 2 + - और Ca2 + - मुक्त DPBS, aspirate, और त्यागके 10 mL के साथ धोएं।
  3. 25 सेमी 2 फ्लास्क (या 75 सेमी 2 फ्लास्क के लिए ट्रिप्सिन के 2 एमएल) के लिए0.25% ट्रिप्सिन का 1 एमएल जोड़ें और 8-12 मिनट के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) पर लौटें।
  4. फ्लास्क को हाथ की हथेली के साथ दृढ़ता से टैप करें, ताकि कोशिकाओं को अलग करने में मदद मिल सके।
  5. एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया को रोकने के लिए प्रवर्धन माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें। सख्ती से फ्लास्क कुल्ला, 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करने के लिए तैयार करने के लिए और फ्लास्क सतह पर प्रवर्धन माध्यम को कुल्ला और कोशिकाओं को अलग करने के लिए निष्कासित करने के लिए।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant को त्याग दें।
  7. प्रवर्धन माध्यम के 5-10 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित कर दिया।
  8. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
    नोट:: कक्षों को इस बिंदु पर जमे हुए किया जा सकता है (चरण 5.1-5.3 देखें)। यदि आगे प्रवर्धन की आवश्यकता होती है, तो कोलेजन-लेपित फ्लास्क पर फिर से बीज (एक 25 सेमी2 फ्लास्क को तीन 75 सेमी2 फ्लास्क में विस्तारित किया जा सकता है, एक अधिक कमजोर पड़ने की सिफारिश नहीं की जाती है)।

5. प्राथमिक नाक उपकला कोशिकाओं के क्रायोप्रिजर्वेशन

नोट: बायोबैंकिंग से पहले पारित होने तक एचएनई कोशिकाओं को बढ़ाएं ताकि पिघलने पर सेल विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त किया जा सके। बायोबैंकिंग, हालांकि, प्रारंभिक मार्ग 0 या मार्ग 2 पर संभव है। निम्नलिखित क्रायोप्रिजर्वेशन चरण सभी मार्गों के लिए अनुकूलित हैं।

  1. सेल की गिनती के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज, और supernatant को छोड़ दें
  2. समृद्ध ठंड माध्यम (तालिका 1) में छर्रे को फिर से निलंबित करने के लिए 3 x 106-5 x 106 कोशिकाओं प्रति एमएल और प्रति क्रायोवियल प्राप्त करने के लिए।
  3. धीरे-धीरे -80 डिग्री सेल्सियस पर एक उपयुक्त क्रायो-फ्रीजिंग कंटेनर में ~ 1 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट पर तापमान को कम करके कोशिकाओं को फ्रीज करें। अगले दिन, संरक्षित नमूने को दीर्घकालिक भंडारण के लिए नाइट्रोजन भंडारण कंटेनर में ले जाएं (वर्तमान अध्ययन 17 महीने के भंडारण तक सीमित है)।

6. Thawing जमे हुए प्रवर्धित एचएनई कोशिकाओं

  1. पानी के स्नान को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। तालिका 1 में वर्णित प्रवर्धन माध्यम तैयार करें और माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  2. नाइट्रोजन भंडारण टैंक से क्रायोवल्स को हटा दें और तेजी से उन्हें पानी के स्नान में रखें, ध्यान रखें कि पूरी शीशी को पानी में डुबोया न जाए। पानी के स्नान से क्रायोवियल्स को हटा दें जब केवल एक छोटी सी जमे हुए बूंद बनी रहती है। 70% अल्कोहल के साथ शीशी को पोंछें, सूखी पोंछें, और हुड के नीचे रखें।
  3. एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके, पिघली हुई कोशिकाओं को एक खाली 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. ड्रॉप-वार तरीके से, गर्म प्रवर्धन माध्यम के 1 एमएल जोड़ें। 1 मिनट के बाद, प्रवर्धन माध्यम का एक और 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक अतिरिक्त मिनट प्रतीक्षा करें।
  5. 500 x g पर 2 मिनट के लिए प्रवर्धन माध्यम और सेंट्रीफ्यूज के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. एस्पिरेट करें और supernatant को छोड़ दें। कम से कम 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल के सेल घनत्व को प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्रवर्धन माध्यम की मात्रा में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें।
  7. प्रवर्धन माध्यम युक्त कोलेजन-लेपित फ्लास्क पर कोशिकाओं को बीज दें।
    1. यदि क्रायोवियल में 4 x 106 से अधिक कोशिकाएं होती हैं, तो प्रवर्धन माध्यम के 10 मिलीलीटर में 75 सेमी2 फ्लास्क पर बीज
    2. यदि क्रायोवियल में 4 x 106 से कम कोशिकाएं होती हैं, तो प्रवर्धन माध्यम के 5 मिलीलीटर में25 सेमी 2 फ्लास्क पर बीज कोशिकाएं
  8. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेटकरें, और अगले 2-3 दिनों में सेल विस्तार का नेत्रहीन निरीक्षण करें।
  9. फिर, अनुभाग 4 में विस्तृत के रूप में सेल प्रवर्धन निष्पादित करें।
    नोट:: यदि कुछ कक्षों चरण 4.7 में काटा गया था। (यानी, यदि विस्तार से पहले मार्ग 0 पर ठंड), चरण 6.5। और 6.6। छोड़ा जा सकता है, और कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूजेशन के बिना 25 सेमी2 कोलेजन-लेपित फ्लास्क पर सीधे बीज दिया जा सकता है। डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) को हटाने के लिए अगले दिन माध्यम को बदलना होगा।

7. वायु-तरल इंटरफ़ेस पर मानव नाक उपकला कोशिकाओं का भेदभाव

नोट: HNE को वायु-तरल इंटरफ़ेस पर विभेदित किया गया था जैसा कि पहले10 वर्णित किया गया था।

  1. 0.33 सेमी2 कोलेजन-लेपित झरझरा फिल्टर पर 330,000 कोशिकाओं / फिल्टर के घनत्व पर कोशिकाओं को बीज दें और एपिकल साइड में प्रवर्धन माध्यम के 300 μL और बेसोलेटरल पक्ष में हवा-तरल माध्यम के 900 μL के साथ पूरक।
  2. 3 दिनों के बाद, एपिकल माध्यम को एस्पिरेट करें और एक विभेदित उपकला स्थापित करने के लिए हवा-तरल माध्यम में 3-4 सप्ताह के लिए हवा-तरल इंटरफ़ेस पर कोशिकाओं को संस्कृति करें। बेसल माध्यम को हर 48-72 घंटे में बदलें।

8. CFTR modulators

  1. CFTR modulators युक्त वायु-तरल माध्यम तैयार करें। VX-445, VX-661, और VX-809 का उपयोग 100 nM पर 3 μM और VX-770 की अंतिम सांद्रता पर करें। 1 μM अंतिम सांद्रता पर corrector ABBV-2222 और potentiator ABBV-974 पर 10 μM पर उपयोग करें। सभी CFTR मॉड्यूलेटर को भंग करने के लिए 100% DMSO का उपयोग करें।
  2. 100% DMSO की समान मात्रा वाले वायु-तरल माध्यम को तैयार करें जैसा कि corrector माध्यम में होता है।
  3. एक हवा-तरल इंटरफ़ेस पर उगाए गए ध्रुवीकृत एचएनई कोशिकाओं के बेसोलेटरल पक्ष में दवाओं या डीएमएसओ युक्त माध्यम को जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 में 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. 24 घंटे के बाद, एस्पिरेट करें और माध्यम को छोड़ दें और चरण 8.1-8.2 के रूप में तैयार किए गए ताजा माध्यम के साथ बदलें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 में 24 घंटे की अवधि के लिए आगे इनक्यूबेट करें।

9. Ussing कक्ष अध्ययन

  1. वोल्टेज-क्लैंप स्थितियों के तहत शॉर्ट-सर्किट वर्तमान माप (आईएससी) को मापें जैसा कि पहलेवर्णित 9 था।
    नोट: संस्कृतियों के Transepithelial विद्युत प्रतिरोध (TEER) को एक चॉपस्टिक वोल्टमीटर के साथ मापा गया था, और निम्नलिखित प्रयोगों के लिए कम से कम 200 Ω · सेमी2 तक पहुंचने वाली संस्कृतियों पर विचार किया गया था। ध्रुवीकृत एचएनई कोशिकाओं के फिल्टर को यूएसिंग कक्षों में रखा गया था, और शॉर्ट-सर्किट वर्तमान माप (आईएससी) को वोल्टेज-क्लैंप स्थितियों के तहत मापा गया था।

10. Immunocytochemistry

  1. Immuno-detection प्रदर्शन के रूप में पहले वर्णित9.
    नोट: CFTR immuno-detection एंटी-CFTR C-टर्मिनल (24-1) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके 1/100 कमजोर पड़ने पर रात भर किया गया था। Zona-occludens-1 (ZO-1) (1/500 कमजोर पड़ने), अल्फा-ट्यूबुलिन (1/300 कमजोर पड़ने), Muc 5AC (1/250 कमजोर पड़ने) और साइटोकेराटिन 8 (1/250 कमजोर पड़ने) धुंधला अतिरिक्त फिल्टर पर किया गया था। PBS-Triton-X100 0.1% के साथ धोने के बाद, एलेक्सा 488 या 594 के लिए संयुग्मित बकरी माध्यमिक एंटीबॉडी को 10% बकरी सीरम (1/1000 कमजोर पड़ने) में 30 मिनट के लिए जोड़ा गया था। अंतिम धोने के बाद, फिल्टर को समर्थन से काट दिया गया था और DAPI युक्त Vectashield बढ़ते माध्यम के साथ घुड़सवार किया गया था। एक confocal माइक्रोस्कोप (63x / 1.4 तेल विभेदक हस्तक्षेप इसके विपरीत नीले PL APO उद्देश्य) का उपयोग छवियों को कैप्चर करने के लिए किया गया था, जिसका विश्लेषण ImageJ सॉफ़्टवेयर के साथ किया गया था।

11. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें.
    नोट:: सांख्यिकीय विश्लेषण S.A.S सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर किया गया था। चूंकि कई एचएनई फिल्टर प्रति रोगी और प्रति शर्त प्राप्त किए गए थे, मात्रात्मक मापदंडों को प्रति रोगी माध्यिका मूल्यों (± SEM) के रूप में व्यक्त किया गया था। तुलना (एसडी ± मतलब) विलकॉक्सन मिलान जोड़े रैंक परीक्षण या unpaired टी-परीक्षण पर हस्ताक्षर किए गए का उपयोग करके किया गया था।

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Representative Results

हवा-तरल इंटरफ़ेस पर सुसंस्कृत ताजा एचएनई कोशिकाएं ध्रुवीकृत और विभेदित श्वसन उपकला की विशिष्ट विशेषताओं को प्रदर्शित करती हैं जैसा कि इम्युनोस्टेनिंग (चित्रा 1) द्वारा मूल्यांकन किया गया है। एचएनई कोशिकाएं उपकला कोशिकाओं की एक विषम परत (सकारात्मक केराटिन 8 इम्युनोस्टेनिंग) में फिर से अंतर करती हैं जो एक छद्म-स्तरीकृत श्वसन उपकला की विवो स्थिति की नकल करती हैं जो सिलिएटेड (सकारात्मक अल्फा-ट्यूबुलिन स्टेनिंग) और गैर-सिलिएट बलगम-उत्पादक गोब्लेट कोशिकाओं (सकारात्मक Muc5Ac इम्युनोस्टेनिंग) से बना होता है। समग्र उपकला तंग जंक्शनों को प्रस्तुत करता है (ZO-1, zona-occludens-1 धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया गया)। मजबूत एपिकल सीएफटीआर धुंधला जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) एचएनई कोशिकाओं में दिखाई देता है, और एपिकल सतह पर और साइटोप्लाज्म दोनों में सीएफटीआर धुंधला हो जाता है, एफ 508डेल / एफ 508डेल एचएनई में देखा जाता है।

हमने सकारात्मक परिणामों पर विचार किया क्योंकि नमूने न केवल सफलतापूर्वक विस्तार कर रहे हैं, बल्कि हवा-तरल इंटरफ़ेस पर 3 सप्ताह के बाद एक छद्म-स्तरीकृत उपकला में सफलतापूर्वक अंतर करते हैं और 200 Ω · सेमी 2 से अधिक टीईईआर पेश करते हैं, जिससे शॉर्ट-सर्किट वर्तमान मापकी अनुमति मिलती है। चूंकि केवल कुछ समर्पित प्रयोगशालाएं सीएफटीआर से संबंधित सीएल-स्राव को शॉर्ट-सर्किट वर्तमान माप द्वारा निष्पादित करती हैं, इसलिए नमूनों को अक्सर अस्पतालों से समर्पित सुविधाओं तक परिवहन की आवश्यकता होती है।

78 ताजा एचएनई सेल नमूनों में, सफलता की दर की तुलना नाक ब्रशिंग में की गई थी, जो तुरंत सीडेड की गई थी और कमरे के तापमान पर फ्लशिंग माध्यम में परिवहन के 1-7 दिनों के बाद सीडेड ब्रशिंग में। अधिकांश नमूनों (55%) को ब्रश करने के 1 दिन बाद बीज दिया गया था, और 82% नमूनों को 48 घंटे के भीतर बीज दिया गया था। सभी 78 नमूनों में सफल संस्कृतियों का औसत प्रतिशत 82% था और दिन 0 और दिन 5 (तालिका 2) के बीच बीज वाले नमूनों में 87% तक पहुंच गया।

ताजा और फ्रीज-पिघले हुए दोनों स्थितियों में विभेदित समान नमूनों के लिए सफलता और विफलता दर की तुलना की गई थी। 83% नमूने जो ताजा परिस्थितियों में सफलतापूर्वक विभेदित होते हैं, वे भी क्रायोप्रिजर्व्ड नमूनों में सफल रहे। इसी तरह, उन नमूनों में जो ताजा परिस्थितियों में अंतर करने में विफल रहे, 71% फ्रीज-पिघलने की स्थिति (तालिका 2) में भी असफल रहे। इन सभी आंकड़ों से पता चलता है कि नाक ब्रशिंग की गुणवत्ता एक सफल संस्कृति के लिए महत्वपूर्ण कारक है।

हम क्रायोवियल प्रति कोशिकाओं की इष्टतम संख्या भी निर्धारित करना चाहते थे। एक एकल 25सेमी 2 से पारित होने पर जमे हुए नमूने, आमतौर पर केवल प्रति फ्लास्क 1-1.5 x 106 कोशिकाओं तक पहुंचने की अनुमति देते हैं। नमूने मार्ग 1 पर जमे हुए हैं और तीन 75 सेमी2 फ्लास्क तक प्रवर्धित होते हैं, आमतौर पर 10 x 106 कोशिकाओं तक पहुंचने की अनुमति देते हैं, इस प्रकार कम से कम 3 x 106 कोशिकाओं वाली कई शीशियों को फ्रीज करने की अनुमति देते हैं। इस प्रोटोकॉल में वर्णित संस्कृति की स्थिति में, 50% नमूने 2 x 106 और 3 x 106 कोशिकाओं के बीच जमे हुए प्रति क्रायोवियल पिघलने पर बढ़ने में विफल रहे, 80% तक पहुंच गए जब 2 x 106 कोशिकाओं प्रति क्रायोवियल (तालिका 2) से नीचे।

CFTR से संबंधित Cl- स्राव CFTR फ़ंक्शन को दर्शाता है और Ussing कक्षों में शॉर्ट सर्किट करंट (Isc) प्रयोगों द्वारा मापा जा सकता है। Forskolin (ΠIscForskolin) और CFTR अवरोधक inh172 (ΠIscCFTRinh172) के जवाब में ISC भिन्नता CFTR सुधारक प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए मुख्य समापन बिंदु हैं।

शॉर्ट-सर्किट-वर्तमान प्रयोगों को या तो ताजा एचएनई पर किया गया था, प्रवर्धन माध्यम में विस्तारित किया गया था और मार्ग 2 पर फिल्टर पर बीज दिया गया था और हवा-तरल माध्यम में 3 सप्ताह के लिए हवा-तरल इंटरफ़ेस पर उगाया गया था, या एचएनई से जो पहले समृद्ध ठंड माध्यम में मार्ग 1 पर जमे हुए थे, पिघले हुए, विस्तारित, और मार्ग 3 पर झरझरा फिल्टर पर बीज दिया गया था। क्रायोप्रिजर्वेशन समय 3 महीने से 16 महीने तक था, जिसमें 9.8 महीने का मतलब था। इस अध्ययन में विस्तृत संस्कृति और क्रायोप्रिजर्वेशन स्थितियों में, विकास या आकृति विज्ञान में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन विभिन्न मार्गों या ताजा या जमे हुए-पिघले हुए F508del / F508del HNE संस्कृतियों के बीच नहीं देखा गया था।

DMSO उपचारित HNE कोशिकाओं में, दोनों का मतलब है कि ΠIscForsk Forskolin (चित्रा 2A) और माध्य ΠIscCFTRinh172 (चित्रा 2B) दोनों के लिए, ताजा या जमे हुए पिघले हुए HNE के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था। यह आकलन करने के लिए कि क्या CFTR का कार्यात्मक सुधार क्रायोप्रिजर्वेशन से प्रभावित था, इसका मतलब है कि आईएससी परिवर्तनों को वीएक्स -809 + वीएक्स -770 उपचारित कोशिकाओं में मापा गया था, जबकि डीएमएसओ ने ताजा में एचएनई कोशिकाओं का इलाज किया था (एन = 78 रोगियों से व्युत्पन्न एचएनई कोशिकाएं) या जमे हुए-पिघले हुए एचएनई (एन = 9 रोगियों से व्युत्पन्न एचएनई कोशिकाएं) (चित्रा 2)। जमे हुए-पिघले हुए और ताजा कोशिकाओं दोनों ने उपचार पर महत्वपूर्ण सुधार प्रदर्शित किया, जिसमें ΠIscForskolin (p < 0.05) (चित्रा 2A) में महत्वपूर्ण वृद्धि हुई, और ΠIscCFTRinh172 (p < 0.05) (चित्रा 2B) में एक महत्वपूर्ण कमी आई। के लिए माध्य गुना वृद्धि ΠIscForskolin (ΠIscForskolin VX-809 + VX-770/ΠIscForskolin DMSO) जमे हुए पिघले हुए HNE कोशिकाओं में 2.9 ± 1.6 तक पहुंच गई और ताजा HNE कोशिकाओं (2.5 ± 2.0) में गुना वृद्धि से काफी अलग नहीं थी। इसी प्रकार, ΠIscCFTRinh172 (ΠIscCFTRinh172 VX-809 + VX-770/ΠIscCFTRinh172 DMSO) में गुना कमी क्रायोप्रिजर्वेशन से महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं हुई थी: ताजा एचएनई में 2.5 ± 3.7 की तुलना में जमे हुए पिघले हुए एचएनई में 1.49 ± 0.9।

कई मॉड्यूलेटर उपचारों की कार्यात्मक सुधार गतिविधि को यह आकलन करने के लिए आगे की जांच की गई थी कि क्या यह एचएनई सेल मॉडल विभिन्न उपचारों के बीच भेदभाव कर सकता है। यहां परिणाम ताजा और जमे हुए-पिघले हुए दोनों स्थितियों से एचएनई कोशिकाओं को जोड़ते हैं क्योंकि उपचार की प्रतिक्रिया क्रायोप्रिजर्वेशन (चित्रा 2) द्वारा महत्वपूर्ण रूप से नहीं बदली गई थी।

हमने पहली बार 10 F508del / F508del रोगियों (चित्रा 3) से HNE कोशिकाओं में या तो VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) या VX-661 (3 μM) + VX-770 (100 nM) के साथ 48 h उपचार के बाद Cl-परिवहन पर दो अनुमोदित CFTR मॉड्यूलेटर थेरेपी की सुधारक प्रतिक्रिया का आकलन किया। DMSO उपचारित HNE कोशिकाओं की तुलना में, VX-809 + VX-770 और VX-661 + VX-770 दोनों द्वारा ΠIscForskolin (चित्रा 3A) और ΠIscCFTRinh172 (चित्रा 3B) में काफी सुधार किया गया था। दोनों उपचारों ने कार्यात्मक रूप से CFTR से संबंधित Cl-स्राव को एक समान स्तर तक सही किया, जिसमें VX-809 + VX-770 (p < 0.001) के लिए 1.75 ± 1.39 के ΠIscForskolin में एक महत्वपूर्ण माध्य गुना वृद्धि हुई और VX-661 + VX-770 (p < 0.01) के लिए 0.97 ± 0.93)। VX-809 + VX-770 (p < 0.001) के लिए 1.79 ± 2.04 गुना कमी थी और VX-661 + VX-770 (p < 0.001) के लिए 1.16 ± 1.44 की औसत ΠIscCFTRinh172 गुना कमी से काफी अलग नहीं थी।

छह F508del / F508del रोगियों (चित्रा 4) से HNE में तीन अलग-अलग CFTR मॉड्यूलेटर उपचारों की तुलना की गई थी। यहां परिणाम ताजा और जमे हुए-पिघले हुए दोनों स्थितियों से एचएनई कोशिकाओं को जोड़ते हैं। वर्टेक्स और Abbvie CFTR मॉड्यूलेटर दोनों, जब एक CFTR corrector और एक CFTR potentiator के संयोजन के रूप में उपयोग किया जाता है, तो एक समान सीमा तक ΠIscForskolin (चित्रा 4A) और ΠIscCFTRinh172 (चित्रा 4B) को ठीक किया। VX-809 + VX-770 द्वारा चित्र 3 में देखे गए आंशिक सुधार की पुष्टि इन HNE कोशिकाओं में 2.87 ± 1.67 (p < 0.05) की औसत ΠIscForskolin गुना वृद्धि के साथ की गई थी। ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM) उपचार ने एक समान सुधार को प्रेरित किया जो VX-809 + VX-770 के 91% सुधार का प्रतिनिधित्व करता है, जिसका अर्थ है कि 2.6 ± 1.4, p < 0.05 बनाम DMSO) और VX-809 + VX-770 का 85% ± 0.05 बनाम DMSO) और VX-809 + VX-7 <70 का 85% ± 0.05 के लिए VX-809 + VX-770 का 85% है।

दिलचस्प बात यह है कि जब एचएनई को ट्रिपल संयोजन VX-445 (3 μM) + VX-661 (3 μM) + VX-770 (100 nM) के साथ इलाज किया गया था, तो सुधार प्रभावकारिता में काफी सुधार हुआ, VX-8 ±09 + VX-770 के 31 ±2% तक पहुंच गया <, VX-809 + VX-770 के 312% तक पहुंच गया। पी < 0.05 बनाम वीएक्स-809 + वीएक्स -770)।

Figure 1
चित्रा 1: एचएनई संस्कृतियों में भेदभाव मार्करों। CFTR (हरे), Zona-Occludens-1 (ZO-1, लाल), अल्फा-ट्यूबुलिन (हरा), Muc5AC (लाल) और साइटोकेराटिन 8 (K8, हरा) जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) (पहला पैनल) और F508del (पैनल 2 -4) HNE कोशिकाओं में 3 सप्ताह के लिए हवा-तरल इंटरफ़ेस पर उगाए गए HNE कोशिकाओं की प्रतिरक्षा-फ्लोरोसेंट धुंधला की प्रतिनिधि कन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां। नाभिक को DAPI के साथ नीले रंग का दाग दिया गया था। confocal माइक्रोस्कोपी छवियों के अनुमानों, शीर्ष दृश्य (ऊपरी पैनलों) और पक्ष दृश्य (निचले पैनलों) तीन आयामी (3 डी) जेड ढेर reconstitutions के. स्केल बार (20 μm) ऊपरी और निचले दोनों पैनलों पर लागू होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एचएनई कोशिकाओं में CFTR से संबंधित Cl-स्राव पर ठंड-पिघलने का प्रभाव। F508del / F508del रोगियों से व्युत्पन्न HNE संस्कृतियों में शॉर्ट-सर्किट करंट (आईएससी) रिकॉर्डिंग (मतलब ± एसडी) रिकॉर्डिंग (मतलब) का सारांश और 3 सप्ताह के लिए एयर-तरल इंटरफ़ेस पर उगाया जाता है। कोशिकाओं को अकेले वाहन (डीएमएसओ) या वीएक्स -809 (3 μM) + वीएक्स -770 (100 एनएम) के साथ 48 घंटे के लिए ताजा (हल्के भूरे, 78 रोगियों से रोगी-व्युत्पन्न एचएनई कोशिकाओं) या जमे हुए-पिघले हुए (गहरे भूरे, रोगी-व्युत्पन्न एचएनई कोशिकाओं से 9 रोगियों से) में इलाज किया गया था। डेटा तीव्र रूप से जोड़े गए (ए) फोर्स्कोलिन (10 μM)/ 3-आइसोब्यूटिल-1-मिथाइलक्सैंथिन (आईबीएमएक्स, 100 μM), ΠIscForskolin या (B) CFTR अवरोधक inh172 (5 μM) के लिए माध्य (± एसडी) प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करताहै। प्रति रोगी और प्रति स्थिति में कम से कम दो फिल्टर का विश्लेषण किया गया था। तारांकन सही करने वालों और नियंत्रण (DMSO-उपचारित) * पी < 0.05 (unpaired t-test) के बीच सांख्यिकीय अंतर को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: दोहरी चिकित्सा द्वारा CFTR समारोह का सुधार. 10 F508del / F508del रोगियों से व्युत्पन्न HNE संस्कृतियों में शॉर्ट-सर्किट करंट (आईएससी) रिकॉर्डिंग (मतलब ± एसडी) रिकॉर्डिंग (मतलब ± एसडी) का सारांश और 3 सप्ताह के लिए एयर-तरल इंटरफ़ेस पर उगाया जाता है (ताजा और जमे हुए-पिघले हुए दोनों संस्कृतियों से संयुक्त परिणाम)। कोशिकाओं को अकेले वाहन (डीएमएसओ) के साथ 48 घंटे के लिए इलाज किया गया था; VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) या VX-661 (3μM) + VX-770 (100 nM). डेटा तीव्र रूप से जोड़े गए (ए) फोर्स्कोलिन (10 μM)/ आईबीएमएक्स (100 μM), ΠIscForskolin या (B) CFTR अवरोधक inh172 (5 μM), ΠIscCFTRinh172 के लिए माध्य (± एसडी) प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है। प्रति रोगी और प्रति स्थिति में कम से कम दो फिल्टर का विश्लेषण किया गया था। तारांकन सही करने वालों और नियंत्रण (DMSO-उपचारित) ** पी < 0.01, *** पी < 0.001, **** पी < 0.0001 (विलकॉक्सन मिलान किए गए जोड़े रैंक परीक्षण) के बीच एक सांख्यिकीय अंतर का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सीएफटीआर सुधार पर ट्रिपल-थेरेपी बनाम दोहरी चिकित्सा की दक्षता। 6 F508del / F508del रोगियों से व्युत्पन्न HNE संस्कृतियों में शॉर्ट-सर्किट करंट (आईएससी) रिकॉर्डिंग (एसडी ± मतलब) का सारांश और 3 सप्ताह के लिए एयर-तरल इंटरफ़ेस पर उगाया जाता है (ताजा और जमे हुए-पिघले हुए कोशिकाओं दोनों से संयुक्त परिणाम)। कोशिकाओं को अकेले वाहन (डीएमएसओ) के साथ 48 घंटे के लिए इलाज किया गया था; VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM); ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM); या VX-661 (3 μM) + VX-445 (3 μM) + VX-770 (100 nM). डेटा तीव्र रूप से जोड़े गए (ए) फोर्स्कोलिन (10 μM)/ आईबीएमएक्स (100 μM), ΠIscForskolin या (B) CFTR अवरोधक inh172 (5 μM), ΠIscCFTRinh172 के लिए माध्य (± एसडी) प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है। प्रति रोगी और प्रति स्थिति में कम से कम दो फिल्टर का विश्लेषण किया गया था। तारांकन उपचार के बीच एक सांख्यिकीय अंतर का संकेत देते हैं। * पी < 0.05 (विलकॉक्सन मिलान जोड़े रैंक परीक्षण पर हस्ताक्षर किए). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मीडिया घटक अंतिम एकाग्रता
प्रवर्धन माध्यम
उन्नत DMEM / F-12 पोषक तत्व मिश्रण 86%
भ्रूण गोजातीय सीरम 10%
पेनिसिलीन 100 U/mL
स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 μg/mL
टैज़ोसिलिन 10 μg/mL
एम्फोटेरिसिन बी 2.5 μg/mL
कोलिमिसिन 16 μg/mL
सिप्रोफ्लोक्सासिन 3 μg/mL
हाइड्रोकार्टिसोन 0.2 μM
इन्सुलिन 5 μg/mL
एपिनेफ्रीन 0.5 μg/mL
EGF 10 ng/mL
Y-27632 (Rho-associated kinase inhibitor) 10 μM
वायु-तरल माध्यम
उन्नत DMEM / F-12 पोषक तत्व मिश्रण 94%
Ultroserg 2%
पेनिसिलीन 100 U/mL
स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 μg/mL
टैज़ोसिलिन 10 μg/mL
एम्फोटेरिसिन बी 2.5 μg/mL
कोलिमिसिन 16 μg/mL
संवर्धित हिमनद माध्यम
F12 पोषक तत्व मिश्रण 77%
HEPES 3%
भ्रूण गोजातीय सीरम 10%
DMSO 10%

तालिका 1: प्रवर्धन, वायु-तरल, और समृद्ध ठंड मध्यम संरचना। अभिकर्मकों और इसी अंतिम सांद्रता की सूची।

सीडिंग से पहले नाक ब्रशिंग के संरक्षण की लंबाई (एन = 78)
बीज बोने से पहले दिन सफलता दर (%)
0 83
1 84
2 67
3 100
4 89
5 100
7 0
एक ही प्रारंभिक नाक ब्रशिंग से परिणाम दोनों ताजा और जमे हुए-पिघले हुए स्थितियों में उगाए जाते हैं (एन = 13)
ताजा परिस्थितियों में परिणाम फ्रीज-thawing पर सफलता की दर (%)
सफलता 83
असफलता 29
सफलता दर पर सेल संख्या का प्रभाव (n = 36)
क्रायोवियल प्रति कोशिकाओं की संख्या फ्रीज-thawing पर सफलता की दर (%)
<2 x 106 20
2–3 x 106 50
3–4 x 106 67
>4 x 106 79

तालिका 2: ताजा और जमे हुए-पिघले हुए एचएनई सेल संस्कृतियों में सफलता दर को प्रभावित करने वाले पैरामीटर। सफलता की दर को नाक ब्रशिंग के रूप में परिभाषित किया गया था जो हवा-तरल इंटरफ़ेस पर 3 सप्ताह के बाद एक छद्म-स्तरीकृत उपकला में सफलतापूर्वक विस्तारित और विभेदित हुआ और 200 Ω · सेमी2 से अधिक टीईईआर प्रस्तुत किया। सीडिंग से पहले, नमूनों को एंटीबायोटिक दवाओं के साथ फ्लशिंग माध्यम में कमरे के तापमान पर भेज दिया गया था। परिणाम 78 ताजा नमूनों और 36 जमे हुए-पिघले हुए नमूनों से डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं। 13 नाक brushings ताजा और जमे हुए-thawed दोनों स्थितियों में विश्लेषण किया गया था।

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Discussion

व्यक्तिगत चिकित्सा के संदर्भ में CFTR गतिविधि को मापने के लिए मानव ब्रोन्कियल उपकला (HBE) कोशिकाओं के लिए surrogates के रूप में रोगी-व्युत्पन्न नाक उपकला कोशिकाओं का उपयोग संस्कृति 9,11 में HNE पुनरुत्पादित कोशिकाओं के गुणों के रूप में प्रस्तावित किया गया है। एचबीई सेल संस्कृतियों पर एचएनई का मजबूत लाभ यह है कि वे आसानी से और गैर-आक्रामक रूप से नमूना लेते हैं। एचएनई सेल संस्कृतियों में शॉर्ट-सर्किट वर्तमान माप सीएफटीआर-निर्भर सीएल-परिवहन के मूल्यांकन को उपकला में सक्षम करते हैं, जिसे विभिन्न जीनोटाइप9 वाले रोगियों में नाक की क्षमता के अंतर द्वारा मूल्यांकन की गई विवो गतिविधि में सीएफटीआर के साथ महत्वपूर्ण रूप से सहसंबंधित दिखाया गया था। VX-809 उपचार पर HNE कोशिकाओं में CFTR गतिविधि का बचाव भी काफी lumacaftor-ivacaftor में नैदानिक परिणाम FEV1 के सुधार के लिए काफी सहसंबद्ध F508del homozygous रोगियों12 इलाज किया.

महत्वपूर्ण रूप से, इस अध्ययन से पता चलता है कि ताजा काटी गई एचएनई कोशिकाएं परिवहन और मानक शिपिंग स्थितियों को आसानी से सहन करती हैं, (यानी, वे कमरे के तापमान पर 72 घंटे तक जीवित रहती हैं) जो विभिन्न भौगोलिक स्थानों से उत्पन्न होने वाली रोगी की कोशिकाओं के परीक्षण की अनुमति देती हैं। सफल संस्कृति के लिए महत्वपूर्ण कारक मुख्य रूप से नाक ब्रशिंग की गुणवत्ता और नमूने पर जीवित कोशिकाओं की संख्या हैं। एचएनई सेल संस्कृतियों को बढ़ाने और अलग करने पर कई प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गए हैं; विस्तार चरण 13,14,15,16,17,18,19,20 के दौरान कोई सशर्त reprogramming के साथ कुछ के साथ कुछ, फीडर 9,11,12,21,22,23,24,25 में सशर्त reprogramming के साथ कुछ , 26 या फीडर-मुक्त 5,8,27,28,29 शर्तें, और कई अलग-अलग तरीकों की तुलना में 7,8। वे सभी सही भेदभाव और ध्रुवीकरण के साथ-साथ अच्छे टीईईआर मूल्यों के साथ अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में अली संस्कृतियों को प्राप्त करने की अनुमति देते हैं। इस अध्ययन के समान, कई लोगों ने क्रायोप्रिजर्व्ड एचएनई कोशिकाओं का उपयोग मार्ग 113,28 पर जमे हुए थे। दिलचस्प बात यह है कि कई लेखकों की रिपोर्ट है कि आरओसीके क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद अस्तित्व में सुधार कर सकता है जब पोस्ट-पिघलने वाले संस्कृति माध्यम में जोड़ा जाता है औरकोशिकाओं की संख्या में वृद्धि होती है जो 5,29 से जुड़ी रहती हैं, यह सुझाव देते हुए कि इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला प्रवर्धन माध्यम विशेष रूप से क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए उपयुक्त है।

यहां, अध्ययन से पता चलता है कि एचएनई कोशिकाओं को सफलतापूर्वक बायोबैंक किया जा सकता है, महत्वपूर्ण कारक फिर से नाक ब्रशिंग की गुणवत्ता है। ताजा नमूनों और जमे हुए पिघले हुए लोगों के परिणाम के बीच एक अच्छा संबंध दिखाया गया है, यह सुझाव देते हुए कि एचएनई कोशिकाओं की गुणवत्ता को अनुकूलित करने के लिए जो आगे के अध्ययन के लिए बायोबैंक होने जा रहे हैं, एक प्रारंभिक अध्ययन ताजा नमूनों पर किया जा सकता है यदि वे सही अली भेदभाव और स्वीकार्य टीईईआर मूल्य प्राप्त करने में विफल रहते हैं; एक दूसरे नाक ब्रशिंग कोशिकाओं है कि खराब परिणाम की एक उच्च संभावना है ठंड के बजाय बेहतर होगा. क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए एक दूसरा महत्वपूर्ण कारक सेल नंबर है; इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली संस्कृति की स्थिति में, जब 2 x 106 कोशिकाओं से कम प्रति क्रायोवियल जमे हुए होते हैं, तो विफलता दर बहुत अधिक होती है। क्रायोवियल प्रति कम से कम 3 x 106 कोशिकाओं को ठंडा करने की सिफारिश की जाती है।

इस अध्ययन के परिणाम बताते हैं कि फ्रीज-thawing एचएनई कोशिकाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों या सीएफटीआर मॉड्यूलेटर की प्रतिक्रिया को महत्वपूर्ण रूप से संशोधित नहीं करता है। एक ही F508del-homozygous रोगी से HNE सेल संस्कृतियों में उपायों की सीमा ठंड के बिना या thawing के बाद प्राप्त VX-809 + VX-770 उपचार पर अलग नहीं था। इसी तरह के परिणाम पहले एचबीई कोशिकाओं के लिए रिपोर्ट किए गए थे जहां फोर्स्कोलिन-प्रेरित आईएससी गैर-उपचारित F508del कोशिकाओं के कई पिघलने / संस्कृतिचक्रों के बाद स्थिर थे। यह सबूत प्रदान करता है कि एचएनई कोशिकाओं को जमे हुए और बायोबैंक में संग्रहीत किया जा सकता है और बाद में अध्ययन किया जा सकता है।

अध्ययनों की बढ़ती संख्या से पता चलता है कि एचएनई सेल संस्कृतियों का उपयोग व्यक्तिगत चिकित्सा के संदर्भ में विभिन्न उपचारों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। विश्लेषण से पता चला है कि एक potentiator के साथ एक corrector संयोजन दोहरी उपचार सभी CFTR के लिए तुलनीय सुधार प्रभावकारिता है- F508del-homozygous HNE कोशिकाओं में स्राव निर्भर Cl- स्राव. हालांकि, एक महत्वपूर्ण अंतर-रोगी परिवर्तनशीलता देखी गई, प्रकाशित परिणामों की पुष्टि करते हुए 9,12,20,25। इसके विपरीत, VX-445 + VX-661 + VX-770 VX-809 + VX-770 की तुलना में CFTR गतिविधि के तीन गुना सुधार। ट्रिपल संयोजन पर एचएनई कोशिकाओं में F508del-CFTR के सुधार का एक समान स्तर भी Laselva et al.28 द्वारा देखा गया था। जैसा कि Veit et al.26 द्वारा रिपोर्ट किया गया है, VX-445 + VX-661 + VX-770 उपचार पर Cl-चैनल फ़ंक्शन का सुधार और भी अधिक था, जो औसत WT-CFTR गतिविधि के 62% तक पहुंच गया था (सही F508del-HNE में 19-36 μA / cm2 की सीमा और WT-HNE में 14-50 μA / cm2) 26।

एचएनई सेल संस्कृतियों ने अन्य वर्ग II उत्परिवर्तनों के लिए सीएफटीआर मॉड्यूलेटर की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए भी कार्य किया। VX-445 + VX-661 + VX-770 पर CFTR गतिविधि का एक महत्वपूर्ण सुधार HNE ALI संस्कृतियों में G85E / G85E, V520F / 1717-1G>A, Y569 / Y569D, M1101K / M1101K, और N1303K / N1303K जीनोटाइप26 को आश्रय देने में देखा गया था। इसी तरह, Laselva et al.28 ने M1101K और N1303K उत्परिवर्तन के साथ CFTR का एक महत्वपूर्ण सुधार दिखाया, लेकिन G85E HNE कोशिकाओं में कोई महत्वपूर्ण सुधार नहीं हुआ। गैलापागोस / AbbVie correctors इन lumacaftor-ivacaftor-प्रतिरोधी उत्परिवर्ती31 के लिए मूल्यांकन किया गया था। AbbVie corrector AC2-1 और विशेष रूप से द्वि-सुधारक AC1 + AC2-1 प्रभावी रूप से M1101K और G85E HNE कोशिकाओं में Cl-स्राव में सुधार हुआ, जबकि N1303K व्युत्पन्न कोशिकाओं को AC1 + AC2-2 के संयोजन द्वारा सही किया गया था।

एचएनई कोशिकाओं में सीएफटीआर गतिविधि के उपाय परीक्षण किए गए उपचार के लिए रोगी की प्रतिक्रिया के लिए पूर्व-नैदानिक बायोमाकर्स का वादा कर रहे हैं। सबूत है कि ठंड-thawing चक्र सुधार स्तर को नहीं बदलते हैं सबूत प्रदान करता है कि इन कोशिकाओं biobanked किया जा सकता है और व्यक्तिगत चिकित्सा कार्यक्रमों के संदर्भ में एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। एक अद्वितीय नाक ब्रशिंग इसलिए दवा की प्रभावकारिता की तुलना करने के लिए पर्याप्त सामग्री की अनुमति दे सकता है, और रोगी की एचएनई कोशिकाओं को पिघलाया जा सकता है क्योंकि नई दवाएं रोगियों को फिर से तैयार करने की आवश्यकता के साथ उपलब्ध नहीं होती हैं; यह शिशुओं में विशेष रूप से दिलचस्प है।

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Disclosures

लेखकइस प्रकाशन या वैज्ञानिक वीडियो उत्पादन से संबंधित कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की रिपोर्ट नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम अध्ययन में भाग लेने के लिए सभी रोगियों और उनके परिवारों को गर्मजोशी से धन्यवाद देते हैं। इस काम को फ्रांसीसी एसोसिएशन वैंकर ला म्यूकोविसिडोस से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; फ्रेंच एसोसिएशन ABCF 2 और वर्टेक्स फार्मास्यूटिकल्स इनोवेशन अवार्ड्स।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABBV-2222 Selleckchem S8535
ABBV-974 Selleckchem S8698
Advanced DMEM/F-12 Life Technologies 12634010
Alexa 488 goat secondary antibody Invitrogen A11001
Alexa 594 goat secondary antibody Invitrogen A11012
Amphotericin B Life Technologies 15290026
Anti-alpha-tubulin antibody Abcam ab80779
Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1) R&D Systems MAB25031
Anti-cytokeratin 8 antibody Progen 61038
Anti-Muc5AC antibody Santa Cruz Biotech sc-20118
Anti-ZO-1 antibody Santa Cruz Biotech sc-10804
Ciprofloxacin provided by Necker Hospital Pharmacy
Colimycin Sanofi provided by Necker Hospital Pharmacy
Collagen type IV Sigma-Aldrich Merck C-7521
cytology brush Laboratory GYNEAS 02.104
DMSO Sigma-Aldrich Merck D2650
EGF Life Technologies PHG0311
Epinephrin Sigma-Aldrich Merck E4375
F12-Nutrient Mixture Life Technologies 11765054
FBS Life Technologies 10270106
Ferticult Fertipro NV FLUSH020
Flasks 25 Thermo Scientific 156.367
Flasks 75 Thermo Scientific 156.499
Glacial acetic acid VWR 20104.298
HEPES Sigma-Aldrich Merck H3375
Hydrocortisone Sigma-Aldrich Merck SLCJ0893
Insulin Sigma-Aldrich Merck I0516
Mg2+ and Ca2+-free DPBS Life Technologies 14190094
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140130
Tazocillin Mylan provided by Necker Hospital Pharmacy
Transwell Filters Sigma-Aldrich Merck CLS3470-48EA
Triton-X100 Sigma-Aldrich Merck T8787
Trypsin 0,25% Life Technologies 25200056
Vectashield mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
VX-445 Selleckchem S8851
VX-661 Selleckchem S7059
VX-770 Selleckchem S1144
VX-809 Selleckchem S1565
Xylocaine naphazoline 5% Aspen France provided by Necker Hospital Pharmacy
Y-27632 Selleckchem S1049

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References

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Kelly, M., Dreano, E., Hatton, A., Lepissier, A., Golec, A., Sermet-Gaudelus, I., Pranke, I. Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine. J. Vis. Exp. (182), e63409, doi:10.3791/63409 (2022).

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