Summary
Burada, hava-sıvı arayüzünde primer insan nazal epitel (HNE) hücrelerinin izolasyonu, amplifikasyonu ve farklılaşması ve güçlendirilmiş HNE'nin başarılı bir şekilde dondurulmasına ve daha sonra çözülmesine izin veren bir biyobankacılık protokolü açıklanmaktadır. Protokol, farklılaşmış HNE hücrelerinin elektrofizyolojik özelliklerini ve farklı modülatör tedavileri üzerine CFTR ile ilişkili klorür sekresyon düzeltmesini analiz eder.
Abstract
İnsan nazal epitel (HNE) hücrelerinin basit, invaziv olmayan nazal fırçalama ile toplanması kolaydır. Hasta kaynaklı primer HNE hücreleri, Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) fonksiyonunun bir indeksi olarak siklik AMP aracılı Klorür (Cl-) taşınımını ölçmek için hava-sıvı arayüz koşullarında psödo-tabakalı bir epitel haline getirilebilir ve farklılaştırılabilir. Burun fırçalama kalitesi ve kriyoprezervasyonda hücre yoğunluğu gibi kritik adımlar verimli bir şekilde gerçekleştirilirse, HNE hücreleri başarılı bir şekilde biyobankaya yatırılabilir. Ayrıca, kısa devre akım çalışmaları, donarak çözülmenin HNE hücrelerinin elektrofizyolojik özelliklerini ve CFTR modülatörlerine tepkisini önemli ölçüde değiştirmediğini göstermektedir. Bu çalışmada kullanılan kültür koşullarında, kriyov başına 2 x 106'dan az hücre dondurulduğunda, başarısızlık oranı çok yüksektir. Kriyov başına en az 3 x 106 hücre dondurmanızı öneririz. Bir CFTR düzelticisini bir CFTR güçlendiricisi ile birleştiren ikili tedavilerin, F508del-homozigot HNE hücrelerinde CFTR aktivitesi için karşılaştırılabilir bir düzeltme etkinliğine sahip olduğunu gösteriyoruz. Üçlü terapi VX-445 + VX-661 + VX-770, ikili terapi VX-809 + VX-770'e kıyasla CFTR aktivitesinin düzeltilmesini önemli ölçüde arttırmıştır. HNE hücrelerinde CFTR aktivitesinin ölçülmesi, CFTR modülatör tedavisine rehberlik etmek için yararlı olan umut verici bir klinik öncesi biyobelirteçtir.
Introduction
Kistik Fibrozis (KF), Epitel 1,2'nin apikal yüzeyinde bulunan bir anyon kanalı olan CFTR proteininin yokluğuna veya işlev bozukluğuna yol açan Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) genindeki mutasyonlardan kaynaklanan otozomal resesif geçişli bir hastalıktır. CFTR tedavisindeki son gelişmeler hastalığın prognozunu iyileştirmiş ve CFTR düzelticileri ile CFTR güçlendiricilerini birleştiren son onaylanmış ilaçlar, en sık görülen p.Phe508del mutasyonu (F508del)3,4 mutasyonunu taşıyan KF hastalarında akciğer fonksiyonlarında ve yaşam kalitesinde önemli iyileşmelere yol açmıştır. Bu umut verici terapötik ilerlemeye rağmen, KF hastalarının yaklaşık% 10'u, bu CFTR modülatörleri tarafından kurtarılamayan mutasyonlar taşıdıkları için uygun değildir. Bu hastalar için, spesifik mutasyonlar için en etkili kombinasyonu bulmak için diğer ilaçları veya ilaç kombinasyonlarını test etmeye ihtiyaç vardır ve kişiselleştirilmiş tedavilerin önemini vurgulamaktadır.
İnsan nazal epitel (HNE) hücrelerinin basit, invaziv olmayan nazal fırçalama ile toplanması kolaydır ve CFTR fonksiyonunun bir indeksi olarak siklik AMP aracılı Klorür (Cl−) transportunun nicelleştirilmesine izin verir. HNE hücreleri, insan hava yolunun doğru bir modelini verir, ancak ömürleri kültürde sınırlıdır. Kültür tekniklerinin optimizasyonu sayesinde, hasta kaynaklı primer HNE hücreleri, Rho ile ilişkili kinaz inhibitörü (ROCKi) ile şartlı olarak yeniden programlanabilir, çoğaltılabilir ve mikro gözenekli filtrelerüzerindeki hava-sıvı arayüzü (ALI) koşullarında psödo-tabakalaşmış bir epitel haline getirilebilir 5,6. HNE kültürü için çok sayıda kültür protokolü mevcuttur (ticari olarak temin edilebilir, serumsuz, "ev yapımı", besleyici hücrelerle ortak kültür, vb.) ve büyümeyi, hücre popülasyonu farklılaşmasını ve epitel fonksiyonunu etkileyecek şekilde medya ve kültür koşullarının seçimi tanımlanmıştır 7,8. Buradaki protokol, CFTR fonksiyon tahlilleri için ALI'de farklılaştırılan çok sayıda HNE hücresinin başarılı bir şekilde elde edilmesini sağlayan basitleştirilmiş, besleyicisiz, ROCKi amplifikasyon yöntemi sunar.
Diferansiye HNE hücrelerinde, CFTR modülatörleri ile 48 saatlik bir tedavinin, CFTR'ye bağımlı Cl- akımının elektrofizyolojik düzeltmesini indüklemek için yeterli olduğunu ve in vitro olarak gözlenen düzeltmenin hastanın klinik iyileşmesi ile ilişkili olabileceğini gösterdik9. Bu nedenle HNE hücreleri, sadece temel KF araştırmaları için değil, hastaya özgü KFTR modülatör testi ile klinik öncesi çalışmalar için de uygun bir modeli temsil etmektedir. Bu kişiselleştirilmiş tedavi bağlamında, protokolün amacı, koşullarımızda yetiştirilen KF hastalarından kriyokorunmuş HNE hücrelerinin CFTR düzeltme çalışmaları için uygun bir model olduğunu doğrulamaktı ve taze ve dondurulmuş çözülmüş hücrelerden CFTR'ye bağımlı Cl-transportunu karşılaştırırken benzer sonuçlar beklenebilirdi. Çalışma ayrıca ikili ve üçlü tedaviler kullanırken farklı CFTR modülatörlerinin etkinliğini de değerlendirdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler, Helsinki Deklarasyonu ve insan araştırma etiği ile ilgili Huriet-Serusclat yasası tarafından açıklanan kılavuz ilkeler ve düzenlemeler uyarınca gerçekleştirilmiştir.
1. Şişelerin ve farklı ortamların hazırlanması
- Amplifikasyon, hava-sıvı ve dondurma ortamını Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
- 50 mg kolajenin% 0.2 buzul asetik asidin 100 mL'sinde çözündürülerek bir insan kollajen IV stok çözeltisi hazırlayın. Manyetik bir karıştırıcı üzerinde en az 1 saat karıştırın ve filtreleyerek çözeltiyi sterilize edin. Işıktan korunan bir cam şişede 6 aya kadar 4 ° C'de saklayın.
- Stok çözeltisini çift damıtılmış suda 1:5 oranında seyrelterek çalışan bir kollajen IV çözeltisi hazırlayın. 4 °C'de 6 aya kadar saklayın.
- Plastik hücre kültürü şişelerini veya transwell filtrelerini kollajen çalışma çözeltisi ile kaplayın. 0,33 cm2 transwell filtreler için 100 μL,25 cm2 şişeler için 500 μL ve şişenin tüm büyüme yüzeyine 75cm2 şişeler için 1 mL eşit olarak dağıtın.
NOT: Bu, şişenin bir yandan diğer yana hafifçe eğilmesiyle sağlanabilir. Alternatif olarak, şişelerin kaplanmasını kolaylaştırmak için, artan bir hacim kullanılabilir ve tüm yüzey eşit şekilde kaplandığında, sadece belirtilen hacmi bırakmak için kollajen çözeltisi aspire edilir. Aspire edilmiş kollajen çözeltisi daha sonra bir sonraki şişeyi kaplamak için hemen kullanılabilir (yani, üç adet 75cm2 şişe için, ilk şişede 3 mL kollajen çözeltisini eşit olarak dağıtın, 2 mL'yi aspire edin, daha sonra bir sonraki şişe için kullanılır, vb.). - Hücre kültürü şişelerini inkübatörde en az 2 saat veya bir gece boyunca bırakın. Kollajeni iyice aspire edin ve şişeleri inkübatörde veya kaputun altında en az 20 dakika veya gece boyunca kurumaya bırakın.
- 10 mL Mg2 + - ve Ca2 + içermeyen DPBS ile yıkayın, inkübatörde kurumaya bırakın ve ışıktan korumak için alüminyum folyoda saklayın. Şişeleri oda sıcaklığında (RT) 6 aya kadar saklayın.
2. Burun fırçalama
NOT: Burun fırçalamanın, katılımcının akut enfeksiyonu yokken yapıldığından emin olun. KF hastaları pulmoner enfeksiyon gösteriyorsa, hastanın antibiyogramına bakın ve amplifikasyon ortamına ek antibiyotikler ekleyin. İnsan burun epitel hücreleri, daha önce tarif edildiği gibi F508del/F508del hastalarından burun fırçalama ile toplandı9.
- Hastadan burnunu üflemesini isteyin, daha sonra naphazolin çözeltisi ile% 5 ksilokaine batırılmış pamuklu ağlar kullanarak her iki burun deliğinin mukozasını topikal olarak anestezi altına alın.
- Medial duvarı ve her iki burun deliğinin inferior konkasını bir sitoloji fırçası kullanarak nazikçe fırçalayın. Fırçayı, ticari olarak temin edilebilen 2 mL yıkama ortamına sahip 15 mL'lik bir tüpe batırın; hücreleri ayırmak için hafifçe sallayın. İkinci burun deliğinde fırçalamayı tekrarlayın.
- Yıkama ortamına aşağıdaki antibiyotikleri ekleyin: Penisilin (100 U / mL), Streptomisin (100 μg / mL), Tazosilin (10 μg / mL), Amfoterisin B (2.5 μg / mL) ve Kolimisin (16 μg / mL).
NOT: Burun fırçalamaları RT'de genişleme ve kültür için özel laboratuvarlara gönderilebilir ve fırçalamadan sonra 72 saate kadar tohumlanabilir.
3. HNE izolasyonu
NOT: HNE sitoloji fırçasından izole edildi, Mg2 + ve Ca2 + içermeyen DPBS ile yıkandı,% 0.25 Tripsin ile ayrıştırıldı ve daha önce tarif edildiği gibi25 cm2 plastik şişe üzerine tohumlandı10.
- Fırçayı tekrar tekrar 1000 μL'lik bir pipet konisinden geçirerek ve 2 mL Mg 2 +ve Ca 2 + içermeyen DPBS ile durulayarak hücreleri sitoloji fırçasından ayırın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
- Hücreleri ayırmak için peleti% 0.25 Tripsin içinde 8-12 dakika boyunca yeniden askıya alın. 5 mL amplifikasyon ortamı ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun.
- 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Peleti amplifikasyon ortamının 8 mL'sinde yeniden askıya alın ve 25 cm2 kollajen kaplı birşişeye tohumlayın. 37 °C'de ve% 5 CO2'de büyüyün. Bu, 0 numaralı pasaja karşılık gelir.
- Ertesi gün, ortamı 5 mL taze amplifikasyon ortamı ile değiştirin ve hücreleri günlük olarak bağlanma, morfoloji (hücreler yapışkan bir parke taşı görünümüne sahip olmalıdır) ve sayı açısından izleyin.
NOT: İlk tohumlama yoğunluğu, burun fırçalamanın kalitesine ve epitel hücrelerinin oranına bağlı olarak değişir. Yeni izole edilmiş HNE hücreleri genellikle 3-10 gün içinde% 80-90 oranında akıcılığa ulaşır. Daha yavaş bir büyüme hızı, numunedeki yetersiz epitel hücrelerinin göstergesidir ve atılmalıdır.
4. İnsan burun epitel hücrelerinin amplifikasyonu ve pasajı
- İnsan burun epitel hücrelerini amplifikasyon ortamında 37 °C'de ve kollajen kaplı şişelerde% 80-90 akıcılığa kadar% 5 CO2'de büyütün, her 48-72 saatte bir ortam değiştirin. 25cm2 şişeler için 5 mL amplifikasyon ortamı ve 75cm2 şişeler için 10 mL kullanın.
- Hücreler% 80 -% 90 akıcılığa ulaştığında, hücreleri 10 mL Mg 2+ - ve Ca2 + içermeyen DPBS ile yıkayın, aspire edin ve atın.
- 25 cm2'lik bir şişe için 1 mL%0.25 Tripsin (veya 75 cm2'lik bir şişe için 2 mL Tripsin) ekleyin ve 8-12 dakika boyunca inkübatöre (37 ° C, % 5 CO2) geri dönün.
- Hücrelerin ayrılmasına yardımcı olmak için şişeye elinizin avucuyla sıkıca dokunun.
- Enzimatik reaksiyonu durdurmak için amplifikasyon ortamının 10 mL'sini ekleyin. Hücreleri durulamak ve ayırmak için amplifikasyon ortamını şişe yüzeyine çekmek ve dışarı atmak için 10 mL pipeti kullanarak şişeyi kuvvetlice durulayın.
- 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
- Pelet, amplifikasyon ortamının 5-10 mL'sinde yeniden askıya alın.
- Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
NOT: Hücreler bu noktada dondurulabilir (bkz. adım 5.1-5.3). Daha fazla amplifikasyon gerekirse, kollajen kaplı şişelere yeniden tohumlayın (25cm2'lik bir şişe üç adet 75cm2'lik şişeye genişletilebilir, daha büyük bir seyreltme önerilmez).
5. Primer nazal epitel hücrelerinin kriyoprezervasyonu
NOT: Çözüldüğünde hücre büyümesini kolaylaştırmak için yeterli hücre elde etmek için biyobankacılıktan önce HNE hücrelerini 1. geçişe kadar büyütün. Bununla birlikte, biyobankacılık, ilk pasaj 0 veya pasaj 2'de mümkündür. Aşağıdaki kriyoprezervasyon adımları tüm pasajlara uyarlanmıştır.
- Hücre sayımından sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı atın
- mL başına ve kriyov başına 3 x 10 6-5 x 10 6 hücre elde etmek için peleti zenginleştirilmiş dondurucu ortamda (Tablo 1) yeniden askıya alın.
- Sıcaklığı -80 ° C'de uygun bir kriyo-dondurma kabında dakikada ~ 1 ° C'de düşürerek hücreleri yavaşça dondurun. Ertesi gün, korunan numuneyi uzun süreli depolama için bir azot depolama kabına taşıyın (mevcut çalışma 17 aylık depolama ile sınırlıdır).
6. Dondurulmuş güçlendirilmiş HNE hücrelerinin çözülmesi
- Su banyosunu 37 ° C'ye ısıtın. Amplifikasyon ortamını Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın ve ortamı 37 ° C'ye ısıtın.
- Kriyovalleri azot depolama tankından çıkarın ve tüm şişeyi suya batırmamaya dikkat ederek hızlı bir şekilde su banyosuna yerleştirin. Sadece küçük bir donmuş damlacık kaldığında kriovialleri su banyosundan çıkarın. Şişeyi% 70 alkolle silin, kurutun ve kaputun altına yerleştirin.
- 1 mL'lik bir pipet kullanarak, çözülmüş hücreleri boş bir 15 mL tüpe aktarın.
- Damla yönünde bir şekilde, 1 mL ılık amplifikasyon ortamı ekleyin. 1 dakika sonra, 1 mL amplifikasyon ortamı daha ekleyin ve bir dakika daha bekleyin.
- 10 mL amplifikasyon ortamı ekleyin ve 500 x g'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Süper natantı aspire edin ve atın. Hücre peletini, en az 1 x 106 hücre / mL'lik bir hücre yoğunluğu elde etmek için gereken bir amplifikasyon ortamında yeniden askıya alın.
- Hücreleri, amplifikasyon ortamını içeren kollajen kaplı bir şişeye tohumlayın.
- Kriyoval 4 x 106'dan fazla hücre içeriyorsa, amplifikasyon ortamının 10 mL'sinde 75cm2'lik bir şişeye tohumlayın.
- Kriyoval 4 x 106 hücreden daha azını içeriyorsa, tohum hücreleri, amplifikasyon ortamının 5 mL'sinde25 cm2'lik bir şişe üzerine yerleştirin.
- 37 ° C'de,% 5 CO 2'de inkübe edin ve önümüzdeki2-3 gün boyunca hücre genişlemesini görsel olarak gözlemleyin.
- Ardından, bölüm 4'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi hücre amplifikasyonu gerçekleştirin.
NOT: Adım 4.7'de az sayıda hücre toplandıysa. (yani, genişlemeden önce 0 pasajında donuyorsa), adım 6.5. ve 6.6. atlanabilir ve hücreler santrifüjleme olmadan doğrudan 25cm2 kollajen kaplı şişeye ekilebilir. Daha sonra dimetil sülfoksiti (DMSO) çıkarmak için ortam ertesi gün değiştirilmelidir.
7. İnsan burun epitel hücrelerinin hava-sıvı arayüzünde farklılaşması
NOT: HNE hava-sıvı arayüzünde daha önce tarif edildiği gibi farklılaştırılmıştır10.
- Hücreleri 0.33cm2 kollajen kaplı gözenekli filtreler üzerine 330.000 hücre / filtre yoğunluğunda tohumlayın ve apikal tarafta 300 μL amplifikasyon ortamı ve bazolateral tarafta 900 μL hava-sıvı ortam ile takviye edin.
- 3 gün sonra, apikal ortamı aspire edin ve farklılaşmış bir epitel oluşturmak için hava-sıvı ortamdaki hücreleri hava-sıvı ortamında 3-4 hafta boyunca kültürleyin. Bazal ortamı her 48-72 saatte bir değiştirin.
8. CFTR modülatörleri
- CFTR modülatörleri içeren hava-sıvı ortam hazırlayın. VX-445, VX-661 ve VX-809'u 3 μM nihai konsantrasyonda ve VX-770'i 100 nM'de kullanın. 1 μM nihai konsantrasyonda düzeltici ABBV-2222 ve 10 μM'de güçlendirici ABBV-974 kullanın.
- Düzeltici ortamdakiyle aynı miktarda% 100 DMSO içeren hava-sıvı ortam hazırlayın.
- Ortam içeren ilaçları veya DMSO'yu bir hava-sıvı arayüzünde yetiştirilen polarize HNE hücrelerinin bazolateral tarafına ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO2'de 24 saat boyunca inkübe edin.
- 24 saat sonra, ortamı aspire edin ve atın ve 8.1-8.2. adımlarında olduğu gibi hazırlanmış taze ortamla değiştirin ve 37 ° C'de% 5 CO 2'de24 saatlik bir süre boyunca inkübe edin.
9. Ussing odası çalışmaları
- Kısa devre akımı ölçümlerini (Isc) daha önce açıklandığı gibi voltaj kelepçesi koşulları altında ölçün9.
NOT: Kültürlerin transepitelyal elektrik direnci (TEER) bir çubuk voltmetre ile ölçülmüştür ve aşağıdaki deneyler için sadece en az 200 Ω · cm2'ye ulaşan kültürler dikkate alınmıştır. Polarize HNE hücrelerinin filtreleri Ussing odalarına monte edildi ve voltaj kelepçesi koşulları altında kısa devre akım ölçümleri (Isc) ölçüldü.
10. İmmünositokimya
- Daha önce tarif edildiği gibi İmmüno-tespiti gerçekleştirin9.
NOT: CFTR immüno-tespiti, anti-CFTR C-terminali (24-1) monoklonal antikoru kullanılarak gece boyunca 1/100 seyreltmede gerçekleştirildi. Zona-oklüdenler-1 (ZO-1) (1/500 seyreltme), alfa-tübülin (1/300 seyreltme), Muc 5AC (1/250 seyreltme) ve sitokeratin 8 (1/250 seyreltme) boyama ek filtrelerde yapıldı. PBS-Triton-X100% 0.1 ile yıkandıktan sonra,% 10 keçi serumunda Alexa 488 veya 594'e konjuge edilmiş keçi sekonder antikorları% 10 keçi serumunda (1/1000 seyreltme) 30 dakika boyunca ilave edildi. Son bir yıkamadan sonra, filtreler destekten kesildi ve DAPI içeren Vectashield montaj ortamı ile monte edildi. ImageJ yazılımı ile analiz edilen görüntüleri yakalamak için bir konfokal mikroskop (63x/1.4 yağ diferansiyel girişim kontrastı λ mavi PL APO hedefi) kullanıldı.
11. İstatistiksel analiz
- Uygun yazılımı kullanarak istatistiksel analiz yapın.
NOT: İstatistiksel analiz S.A.S yazılımı kullanılarak yapılmıştır. Hasta başına ve duruma göre birkaç HNE filtresi elde edildiğinden, kantitatif parametreler hasta başına medyan değerler (± SEM) olarak ifade edildi. Karşılaştırmalar (ortalama ± SD) Wilcoxon eşleştirilmiş çiftler işaretli sıralama testi veya eşlenmemiş t-testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hava-sıvı arayüzünde kültürlenen taze HNE hücreleri, immün boyama ile değerlendirildiği gibi polarize ve diferansiye solunum epitelinin tipik özelliklerini göstermektedir (Şekil 1). HNE hücreleri, siliyer (pozitif alfa-tübülin boyaması) ve siliye olmayan mukus üreten goblet hücrelerinden (pozitif Muc5Ac immün boyama) oluşan psödo-tabakalaşmış bir solunum epitelinin in vivo durumunu taklit eden heterojen bir epitel hücresi tabakasına (pozitif keratin 8 immünoboyama) yeniden farklılaşır. Genel epitel sıkı kavşaklar sunar (ZO-1, zona-oklüdenler-1 boyama ile değerlendirilir). Güçlü apikal CFTR boyaması vahşi tip (WT) HNE hücrelerinde görülebilir ve F508del / F508del HNE'de hem apikal yüzeyde hem de sitoplazmada azalmış CFTR boyaması gözlenir.
Pozitif sonuçları, numunelerin sadece başarılı bir şekilde genişlediğini değil, aynı zamanda hava-sıvı arayüzünde 3 hafta sonra psödo-tabakalı bir epitelyuma başarılı bir şekilde farklılaştığını ve kısa devre akım ölçümlerine izin veren 200 Ω · cm2'den daha yüksek bir TEER sunduğunu düşündük. Sadece birkaç özel laboratuvar, kısa devre akım ölçümleriyle CFTR ile ilgili Cl-sekresyon tahlilleri gerçekleştirdiğinden, numuneler genellikle hastanelerden özel tesislere nakledilmeyi gerektirir.
78 taze HNE hücre örneğinde, hemen ekilen burun fırçalamalarında ve oda sıcaklığında yıkama ortamında 1-7 gün taşındıktan sonra tohumlanan fırçalamalarda başarı oranları karşılaştırılmıştır. Örneklerin çoğunluğu (% 55) fırçalamadan 1 gün sonra tohumlandı ve örneklerin% 82'si 48 saat içinde tohumlandı. 78 örneğin tamamında başarılı kültürlerin ortalama yüzdesi %82 olup, 0. gün ile 5. gün arasında tohumlanan örneklerde %87'ye ulaşmıştır (Tablo 2).
Aynı numunelerin hem taze hem de dondurarak çözülmüş koşullarda farklılaşan başarı ve başarısızlık oranları karşılaştırıldı. Taze koşullarda başarılı bir şekilde farklılaşan örneklerin% 83'ü kriyokorunmuş örneklerde de başarılı olmuştur. Aynı şekilde, taze koşullarda farklılaşamayan örneklerde,% 71'i donma-çözülme koşullarında da başarısız olmuştur (Tablo 2). Tüm bu veriler, burun fırçalama kalitesinin başarılı bir kültürün anahtar faktörü olduğunu göstermektedir.
Ayrıca kriyov başına en uygun hücre sayısını belirlemek istedik. 0 geçişinde dondurulmuş örnekler, tek bir 25cm2'den genellikle şişe başına sadece 1-1.5 x 106 hücreye ulaşmaya izin verir. Geçiş 1'de dondurulmuş ve üç adet 75cm2 şişeye yükseltilmiş numuneler genellikle 10 x 10 6 hücreye ulaşmasına izin verir, böylece en az 3 x 106 hücre içeren birkaç şişenin dondurulmasına izin verilir. Bu protokolde açıklanan kültür koşullarında, kriyov başına 2 x 10 6 ila 3 x 106 hücre arasında dondurulmuş örneklerin% 50'si çözüldüğünde büyüyememiş, kriyov başına 2 x 106 hücrenin altında olduğunda% 80'e ulaşmıştır (Tablo 2).
CFTR ile ilişkili Cl-sekresyonu CFTR fonksiyonunu yansıtır ve Ussing odalarındaki kısa devre akımı (Isc) deneyleri ile ölçülebilir. Forskolin (ΔIscForskolin) ve CFTR inhibitörü inh172'ye (ΔIscCFTRinh172) yanıt olarak Isc varyasyonu, CFTR düzeltici etkinlik değerlendirmesi için ana son noktalardır.
Kısa devre-akım deneyleri, taze HNE üzerinde gerçekleştirildi, amplifikasyon ortamında genişletildi ve geçiş 2'deki filtrelere tohumlandı ve hava-sıvı ortamında 3 hafta boyunca hava-sıvı arayüzünde yetiştirildi veya daha önce zenginleştirilmiş dondurucu ortamda 1. pasajda dondurulmuş, çözülmüş, genişlemiş ve geçiş 3'teki gözenekli filtreler üzerine tohumlanmış HNE'den. Kriyoprezervasyon süreleri ortalama 9.8 ay olmak üzere 3 ay ile 16 ay arasında değişmiştir. Bu çalışmada detaylandırılan kültür ve kriyoprezervasyon koşullarında, farklı pasajlar veya taze veya dondurulmuş çözülmüş F508del/F508del HNE kültürleri arasında büyüme veya morfolojide anlamlı bir değişiklik gözlenmemiştir.
DMSO ile tedavi edilen HNE hücrelerinde hem ortalama ΔIscForskolin (Şekil 2A) hem de ortalama ΔIscCFTRinh172 (Şekil 2B) için, taze veya dondurulmuş çözülmüş HNE arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. CFTR'nin fonksiyonel düzeltmesinin kriyoprezervasyondan etkilenip etkilenmediğini değerlendirmek için, ortalama Isc değişiklikleri, taze (n = 78 hastadan türetilen HNE hücreleri) veya dondurulmuş çözülmüş HNE (n = 9 hastadan türetilen HNE hücreleri) DMSO ile tedavi edilen HNE hücrelerine kıyasla VX-809 + VX-770 ile tedavi edilen hücrelerde ölçülmüştür (Şekil 2). Hem dondurulmuş çözülmüş hem de taze hücreler, tedavi sırasında ΔIscForskolin'de (p < 0.05) anlamlı bir artış (Şekil 2A) ve ΔIscCFTRinh172'de (p < 0.05) anlamlı bir azalma ile önemli bir düzeltme göstermiştir (Şekil 2B). ΔIsc Forskolin (ΔIscForskolin VX-809 + VX-770 / ΔIscForskolin DMSO) için ortalama kıvrım artışı, dondurulmuş çözülmüş HNEhücrelerinde 2.9 ± 1.6'ya ulaştı ve taze HNE hücrelerindeki kıvrım artışından anlamlı olarak farklı değildi (2.5 ± 2.0). Benzer şekilde, ΔIsc CFTRinh172'deki (ΔIsc CFTRinh172 VX-809 + VX-770 / ΔIscCFTRinh172 DMSO) kıvrım azalması kriyoprezervasyondan önemli ölçüde etkilenmedi: dondurulmuş çözülmüş HNE'de 1.49 ± 0.9, taze HNE'de 2.5 ± 3.7.
Bu HNE hücre modelinin farklı tedaviler arasında ayrım yapıp yapamayacağını değerlendirmek için çeşitli modülatör terapilerin fonksiyonel düzeltme aktivitesi daha fazla araştırılmıştır. Buradaki sonuçlar, hem taze hem de dondurulmuş çözülmüş koşullardan HNE hücrelerini birleştirir, çünkü tedaviye yanıt kriyoprezervasyon ile anlamlı olarak değişmemiştir (Şekil 2).
İlk olarak, 10 F508del/F508del hastasından HNE hücrelerinde VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) veya VX-661 (3 μM) + VX-770 (100 nM) ile 48 saatlik bir tedaviden sonra Cl- transportta iki onaylanmış CFTR modülatör tedavisinin düzeltici yanıtını değerlendirdik (Şekil 3). DMSO ile tedavi edilen HNE hücreleri ile karşılaştırıldığında, ΔIscForskolin (Şekil 3A) ve ΔIscCFTRinh172 (Şekil 3B) hem VX-809 + VX-770 hem de VX-661 + VX-770 tarafından anlamlı derecede iyileştirilmiştir. Her iki tedavi de fonksiyonel olarak CFTR ile ilişkili Cl-sekresyonunu benzer bir seviyeye düzeltti, ΔIscForskolin'de VX-809 + VX-770 için 1.75 ± 1.39 (p < 0.001) ve VX-661 + VX-770 için 0.97 ± 0.93 (p < 0.01) anlamlı bir ortalama katlama artışı oldu. Ortalama ΔIsc CFTRinh172 kat düşüşü, VX-809 + VX-770 için 1.79 ± 2.04 idi (p < 0.001) ve VX-661 + VX-770 için ortalama ΔIsc CFTRinh172 kat düşüş 1.16 ± 1.44 olan ortalama ΔIscCFTRinh172 kat düşüşünden anlamlı olarak farklı değildi (p < 0.001'e karşı DMSO).
HNE'de altı F508del/F508del hastasından üç farklı CFTR modülatör tedavisi (Şekil 4) daha da karşılaştırıldı. Buradaki sonuçlar, hem taze hem de dondurulmuş çözülmüş koşullardan HNE hücrelerini birleştirir. Hem Vertex hem de Abbvie CFTR modülatörleri, bir CFTR düzeltici ve bir CFTR güçlendiricisinin bir kombinasyonu olarak kullanıldığında, ΔIscForskolin (Şekil 4A) ve ΔIscCFTRinh172'yi (Şekil 4B) benzer ölçüde düzeltmiştir. Şekil 3'te VX-809 + VX-770 ile gözlenen kısmi düzeltme, bu HNE hücrelerinde ortalama ΔIscForskolin kıvrım artışı 2.87 ± 1.67 ile doğrulandı (p < 0.05). ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM) tedavisi, ΔIsc Forskolin için VX-809 + VX-770 düzeltmesinin% 91'ini temsil eden benzer bir düzeltmeye neden olmuştur (ortalama ΔIscForskolin kıvrım artışı 2.6 ± 1.4, p < 0.05'e karşı DMSO) ve VX-809 + VX-770'in%85'i ΔIsc CFTRinh172 (ortalama ΔIsc CFTRinh172 kat azalma 4.2 ± 5.7, p < 0.05 vs DMSO).
İlginçtir ki, HNE üçlü kombinasyon VX-445 (3 μM) + VX-661 (3 μM) + VX-770 (100 nM) ile tedavi edildiğinde, düzeltme etkinliği önemli ölçüde iyileşti ve VX-809 + VX-770 ΔIsc Forskolin düzeltmesinin% 312'sine ulaştı (ortalama ΔIscForskolin kıvrım artışı 9.0 ± 4.1, p < 0.05 vs VX-809 + VX-770) ve ΔIsc CFTRinh172% 372'ye ulaştı (ortalama ΔIscCFTRinh172 kat azalma 15.5 ± 10.5, p < VX-809 + VX-770'e karşı 0,05).
Şekil 1: HNE kültürlerinde farklılaşma belirteçleri. 3 hafta boyunca hava-sıvı arayüzünde yetiştirilen vahşi tip (WT) ve F508del (panel 2-4) HNE hücrelerinde CFTR (yeşil), Zona-Occludens-1 (ZO-1, kırmızı), alfa-tübülin (yeşil), Muc5AC (kırmızı) ve sitokeratin 8 (K8, yeşil) immün-floresan boyamasının temsili konfokal mikroskopi görüntüleri. Çekirdekler DAPI ile maviye boyandı. Konfokal mikroskopi görüntülerinin projeksiyonları, üç boyutlu (3D) Z yığınlarının üstten görünümü (üst paneller) ve yan görünümü (alt paneller) yeniden sulandırılır. Ölçek çubuğu (20 μm) hem üst hem de alt paneller için geçerlidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: HNE hücrelerinde donma-çözülmenin CFTR'ye bağlı Cl-sekresyon üzerine etkisi. F508del/F508del hastalarından türetilen ve 3 hafta boyunca hava-sıvı arayüzünde yetiştirilen HNE kültürlerinde kısa devre akımı (Isc) kayıtlarının (ortalama ± SD) özeti. Hücreler 48 saat boyunca tek başına araç (DMSO) veya VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) ile taze (78 hastadan açık gri, hasta kaynaklı HNE hücreleri) veya dondurulmuş çözülmüş (9 hastadan koyu gri, hasta kaynaklı HNE hücreleri) olarak tedavi edildi. Veriler, akut olarak eklenen (A) Forskolin (10 μM)/3-izobütil-1-metilksantin (IBMX, 100 μM), ΔIscForskolin veya (B) CFTR inhibitörü inh172 (5 μM) ΔIscCFTRinh172'ye verilen ortalama (± SD) yanıtı temsil etmektedir. Hasta başına ve durum başına en az iki filtre analiz edildi. Yıldız işaretleri, düzelticiler ve kontrol (DMSO ile tedavi edilmiş) * p < 0.05 (eşlenmemiş t-testi) arasındaki istatistiksel farkı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İkili tedavilerle CFTR fonksiyonunun düzeltilmesi. 10 F508del/F508del hastasından türetilen ve 3 hafta boyunca hava-sıvı arayüzünde yetiştirilen HNE kültürlerinde kısa devre akımı (Isc) kayıtlarının (ortalama ± SD) özeti (hem taze hem de dondurulmuş çözülmüş kültürlerden elde edilen birleşik sonuçlar). Hücreler 48 saat boyunca sadece araçla (DMSO) tedavi edildi; VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) veya VX-661 (3μM) + VX-770 (100 nM). Veriler, akut olarak eklenen (A) Forskolin (10 μM)/IBMX (100 μM), ΔIscForskolin veya (B) CFTR inhibitörü inh172 (5 μM), ΔIscCFTRinh172'ye verilen ortalama (± SD) yanıtı temsil etmektedir. Hasta başına ve durum başına en az iki filtre analiz edildi. Yıldız işaretleri, düzelticiler ve kontrol (DMSO ile tedavi edilen) arasında istatistiksel bir fark olduğunu gösterir ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 (Wilcoxon uyumlu çiftler işaretli rütbe testi). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Üçlü terapinin KFTR düzeltmesinde ikili tedavilere karşı etkinliği. 6 F508del/F508del hastasından türetilen ve 3 hafta boyunca hava-sıvı arayüzünde yetiştirilen HNE kültürlerinde kısa devre akımı (Isc) kayıtlarının (ortalama ± SD) özeti (hem taze hem de dondurulmuş çözülmüş hücrelerden elde edilen birleşik sonuçlar). Hücreler 48 saat boyunca sadece araçla (DMSO) tedavi edildi; VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM); ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM); veya VX-661 (3 μM) + VX-445 (3 μM) + VX-770 (100 nM). Veriler, akut olarak eklenen (A) Forskolin (10 μM)/IBMX (100 μM), ΔIscForskolin veya (B) CFTR inhibitörü inh172 (5 μM), ΔIscCFTRinh172'ye verilen ortalama (± SD) yanıtı temsil etmektedir. Hasta başına ve durum başına en az iki filtre analiz edildi. Yıldız işaretleri, tedaviler arasında istatistiksel bir fark olduğunu gösterir. * p < 0.05 (Wilcoxon eşleşen çiftler işaretli rütbe testi). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Medya Bileşeni | Son konsantrasyon |
| AMPLIFIKASYON ORTAMI | |
| Gelişmiş DMEM/F-12 besin karışımı | 86% |
| Fetal Sığır Serumu | 10% |
| Penisilin | 100 U/mL |
| Streptomisin | 100 μg/mL |
| Tazosilin | 10 μg/mL |
| Amfoterisin B | 2,5 μg/mL |
| Kolimisin | 16 μg/mL |
| Siprofloksasin | 3 μg/mL |
| Hidrokortizon | 0,2 μM |
| Insülin | 5 μg/mL |
| Adrenalin | 0,5 μg/mL |
| cesaret | 10 ng/mL |
| Y-27632 (Rho ile ilişkili kinaz inhibitörü) | 10 μM |
| HAVA-SIVI ORTAM | |
| Gelişmiş DMEM/F-12 besin karışımı | 94% |
| UltroserG | 2% |
| Penisilin | 100 U/mL |
| Streptomisin | 100 μg/mL |
| Tazosilin | 10 μg/mL |
| Amfoterisin B | 2,5 μg/mL |
| Kolimisin | 16 μg/mL |
| ZENGİNLEŞTİRİLMİŞ DONDURMA ORTAMI | |
| F12 Besin Karışımı | 77% |
| HEPES | 3% |
| Fetal Sığır Serumu | 10% |
| cesaret | 10% |
Tablo 1: Amplifikasyon, hava-sıvı ve zenginleştirilmiş dondurucu ortam bileşimi. Reaktiflerin listesi ve karşılık gelen nihai konsantrasyonlar.
| Tohumlamadan önce burun fırçalamanın korunum süresi (n = 78) | |
| Tohumlamadan günler önce | Başarı oranları (%) |
| 0 | 83 |
| 1 | 84 |
| 2 | 67 |
| 3 | 100 |
| 4 | 89 |
| 5 | 100 |
| 7 | 0 |
| Hem taze hem de dondurulmuş çözülmüş koşullarda yetiştirilen aynı ilk burun fırçalamanın sonuçları (n = 13) | |
| Taze koşullarda sonuç | Donarak çözülme sonrası başarı oranları (%) |
| başarı | 83 |
| başarısızlık | 29 |
| Hücre sayısının başarı oranlarına etkisi (n = 36) | |
| Kriyovyal başına hücre sayısı | Donarak çözülme sonrası başarı oranları (%) |
| <2 x 106 | 20 |
| 2–3 x 106 | 50 |
| 3–4 x 106 | 67 |
| >4 x 106 | 79 |
Tablo 2: Taze ve dondurulmuş çözülmüş HNE hücre kültürlerinde başarı oranlarını etkileyen parametreler. Başarı oranları, hava-sıvı arayüzünde 3 hafta sonra başarılı bir şekilde genişleyen ve psödo-tabakalaşmış bir epitel haline gelen ve 200 Ω· cm 2'den daha yüksek bir TEER sunan burun fırçalamaları olarak tanımlandı. Tohumlamadan önce, numuneler oda sıcaklığında antibiyotiklerle yıkama ortamında sevk edildi. Sonuçlar, 78 taze numuneden ve 36 dondurulmuş çözülmüş numuneden elde edilen verileri temsil etmektedir. 13 burun fırçalaması hem taze hem de dondurulmuş çözülmüş koşullarda analiz edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kişiselleştirilmiş tıp bağlamında CFTR aktivitesini ölçmek için insan bronşiyal epitel (HBE) hücreleri için vekil olarak hasta kaynaklı nazal epitel hücrelerinin kullanılması, HNE üreme hücrelerinin kültür 9,11'deki özellikleri olarak önerilmiştir. HNE'nin HBE hücre kültürlerine göre güçlü avantajı, kolayca ve invaziv olmayan bir şekilde örneklenmeleridir. HNE hücre kültürlerinde kısa devre akım ölçümleri, epitel boyunca CFTR'ye bağımlı Cl- transportunun değerlendirilmesini sağlar; bu, çeşitli genotipleri olan hastalarda burun potansiyeli farkı ile değerlendirilen CFTR in vivo aktivitesi ile anlamlı derecede ilişkili olduğu gösterilmiştir9. VX-809 tedavisi üzerine HNE hücrelerinde CFTR aktivitesinin kurtarılması, lumacaftor-ivacaftor ile tedavi edilen F508del homozigot hastalarda FEV1'in klinik sonucunun iyileşmesi ile de anlamlı derecede korelasyon göstermiştir12.
Önemli olarak, bu çalışma, taze hasat edilmiş HNE hücrelerinin taşıma ve standart nakliye koşullarını kolayca tolere ettiğini (yani, oda sıcaklığında 72 saat hayatta kaldıklarını) göstermektedir, bu da hastanın çeşitli coğrafi konumlardan kaynaklanan hücrelerinin test edilmesine izin vermektedir. Başarılı bir kültür için kritik faktörler esas olarak burun fırçalamanın kalitesi ve örneklemedeki canlı hücrelerin sayısıdır. HNE hücre kültürlerinin büyümesi ve farklılaşması üzerine bir dizi protokol yayınlanmıştır; bazıları genişletme aşamasında koşullu yeniden programlama olmadan 13,14,15,16,17,18,19,20, bazıları besleyici 9,11,12,21,22,23,24,25 ,26 veya besleyicisiz 5,8,27,28,29 koşul ve birkaç farklı yöntemi karşılaştırarak 7,8. Hepsi, doğru farklılaşma ve polarizasyonun yanı sıra iyi TEER değerlerine sahip nispeten çok sayıda ALI kültürünün elde edilmesini sağlar. Bu çalışmaya benzer şekilde, birçok kullanılmış kriyokorunmuş HNE hücresi 113,28 pasajında dondurulmuştur. İlginç bir şekilde, birkaç yazar, ROCKi'nin çözülme sonrası kültür ortamına eklendiğinde kriyoprezervasyondan sonra sağkalımı artırabileceğini ve bağlı kalan hücre sayısını 5,29 artırabileceğini bildirmektedir, bu da bu çalışmada kullanılan amplifikasyon ortamının kriyoprezervasyon için özellikle uygun olduğunu düşündürmektedir.
Burada çalışma, HNE hücrelerinin başarılı bir şekilde biyobankalanabildiğini, kritik faktörün yine burun fırçalamanın kalitesi olduğunu göstermektedir. Taze numunelerin sonucu ile dondurulmuş çözülmüş numunelerin sonuçları arasında iyi bir korelasyon gösterilmiştir, bu da daha ileri çalışmalar için biyobankaya yatırılacak HNE hücrelerinin kalitesini optimize etmek için, doğru ALI farklılaşması ve kabul edilebilir TEER değeri elde edemedikleri takdirde taze numuneler üzerinde bir ön çalışma yapılabileceğini düşündürmektedir; İkinci bir burun fırçalama, kötü sonuç olasılığı yüksek olan hücreleri dondurmak yerine tercih edilir. Kriyoprezervasyon için ikinci bir kritik faktör hücre sayısıdır; Bu çalışmada kullanılan kültür koşullarında, kriyov başına 2 x 106'dan az hücre dondurulduğunda, başarısızlık oranı çok yüksektir. Kriyov başına en az 3 x 106 hücrenin dondurulması önerilir.
Bu çalışmadaki sonuçlar, donarak çözülmenin HNE hücrelerinin elektrofizyolojik özelliklerini veya CFTR modülatörlerine yanıtını önemli ölçüde değiştirmediğini göstermektedir. Aynı F508del-homozigot hastadan donmadan veya çözüldükten sonra elde edilen HNE hücre kültürlerindeki ölçüm aralığı, VX-809 + VX-770 tedavisinde farklı değildi. Benzer sonuçlar daha önce Forskolin ile uyarılmış Isc'nin tedavi edilmemiş F508del hücrelerinin 30 birkaç çözülme / kültür döngüsünden sonra stabil olduğu HBEhücreleri için de bildirilmiştir. Bu, HNE hücrelerinin dondurulup bir biyobankada saklanabileceğine ve daha sonra incelenebileceğine dair kanıt sağlar.
Giderek artan sayıda çalışma, HNE hücre kültürlerinin kişiselleştirilmiş tıp bağlamında farklı tedavilerin etkinliğini test etmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Analiz, bir düzelticiyi bir güçlendirici ile birleştiren ikili tedavilerin, F508del-homozigot HNE hücrelerinde CFTR'ye bağımlı Cl-sekresyonu için karşılaştırılabilir düzeltme etkinliğine sahip olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, önemli bir hastalar arası değişkenlik fark edildi ve yayınlanan sonuçları doğruladı 9,12,20,25. Buna karşılık, VX-445 + VX-661 + VX-770, VX-809 + VX-770'e kıyasla CFTR aktivitesinin düzeltilmesini üç katına çıkardı. Üçlü kombinasyon üzerine HNE hücrelerinde F508del-CFTR'nin benzer bir düzeltme seviyesi Laselva ve ark.28 tarafından da gözlenmiştir. Veit ve ark.26 tarafından bildirildiği üzere, VX-445 + VX-661 + VX-770 tedavisi üzerine Cl-kanal fonksiyonunun düzeltilmesi daha da yüksekti ve ortalama WT-CFTR aktivitesinin% 62'sine ulaştı (düzeltilmiş F508del-HNE'de 19-36 μA /cm2 aralığı ve WT-HNE'de 14-50 μA /cm2)26.
HNE hücre kültürleri ayrıca CFTR modülatörlerinin diğer sınıf II mutasyonlar için etkinliğini test etmeye de hizmet etti. G85E/G85E, V520F/1717-1G>A, Y569/Y569D, M1101K/M1101K ve N1303K/N1303K genotip26'yı barındıran HNE ALI kültürlerinde VX-445 + VX-661 + VX-770 üzerinde CFTR aktivitesinde önemli bir iyileşme gözlenmiştir. Benzer şekilde, Laselva ve ark.28 , M1101K ve N1303K mutasyonları ile CFTR'nin anlamlı bir düzeltmesini gösterdi, ancak G85E HNE hücrelerinde anlamlı bir düzeltme olmadı. Galapagos/AbbVie düzelticileri bu lumacaftor-ivacaftor-dirençli mutantlar için değerlendirildi31. AbbVie düzeltici AC2-1 ve özellikle bi-düzeltici AC1 + AC2-1, M1101K ve G85E HNE hücrelerinde Cl- sekresyonunu etkili bir şekilde geliştirirken, N1303K türevi hücreler AC1 + AC2-2'nin bir kombinasyonu ile düzeltildi.
HNE hücrelerinde CFTR aktivitesinin ölçümleri, hastanın test edilmiş tedaviye yanıtı için öngörücü klinik öncesi biyobelirteçler vaat etmektedir. Donma-çözülme döngülerinin düzeltme seviyesini değiştirmediğine dair kanıtlar, bu hücrelerin biyobankalanabileceğine ve kişiselleştirilmiş tıp programları bağlamında güçlü bir araç olarak kullanılabileceğine dair kanıtlar sağlar. Bu nedenle, benzersiz bir burun fırçalaması, ilaç etkinliklerini karşılaştırmak için yeterli materyale izin verebilir ve hastaların HNE hücreleri, hastaları yeniden örneklemeye gerek kalmadan yeni ilaçlar mevcut hale geldikçe çözülebilir; bu özellikle bebeklerde ilginçtir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu yayın veya bilimsel video prodüksiyonu ile ilgili hiçbir rakip finansal çıkar bildirmemektedir.
Acknowledgments
Çalışmaya katıldıkları için tüm hastalara ve ailelerine içtenlikle teşekkür ederiz. Bu çalışma Fransız Derneği Vaincre la Mucoviscidose'den gelen hibelerle desteklendi; Fransız Birliği ABCF 2 ve Vertex İlaç İnovasyon Ödülleri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABBV-2222 | Selleckchem | S8535 | |
| ABBV-974 | Selleckchem | S8698 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies | 12634010 | |
| Alexa 488 goat secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A11012 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290026 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody | Abcam | ab80779 | |
| Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1) | R&D Systems | MAB25031 | |
| Anti-cytokeratin 8 antibody | Progen | 61038 | |
| Anti-Muc5AC antibody | Santa Cruz Biotech | sc-20118 | |
| Anti-ZO-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-10804 | |
| Ciprofloxacin | provided by Necker Hospital Pharmacy | ||
| Colimycin | Sanofi | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Collagen type IV | Sigma-Aldrich Merck | C-7521 | |
| cytology brush | Laboratory GYNEAS | 02.104 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich Merck | D2650 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Epinephrin | Sigma-Aldrich Merck | E4375 | |
| F12-Nutrient Mixture | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Ferticult | Fertipro NV | FLUSH020 | |
| Flasks 25 | Thermo Scientific | 156.367 | |
| Flasks 75 | Thermo Scientific | 156.499 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 20104.298 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Merck | H3375 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich Merck | SLCJ0893 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich Merck | I0516 | |
| Mg2+ and Ca2+-free DPBS | Life Technologies | 14190094 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140130 | |
| Tazocillin | Mylan | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Transwell Filters | Sigma-Aldrich Merck | CLS3470-48EA | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich Merck | T8787 | |
| Trypsin 0,25% | Life Technologies | 25200056 | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| VX-445 | Selleckchem | S8851 | |
| VX-661 | Selleckchem | S7059 | |
| VX-770 | Selleckchem | S1144 | |
| VX-809 | Selleckchem | S1565 | |
| Xylocaine naphazoline 5% | Aspen France | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).
- Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR. The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).
- Griese, M., et al. Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
- Liu, X., et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
- Bukowy-Bieryłło, Z. Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we. Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).
- Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).
- Noel, S., et al. Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells. The Journal of Physiology. , (2021).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Pranke, I., et al. Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).
- McDougall, C. M., et al. Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).
- Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance. PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).
- Schögler, A., et al. Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling. Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).
- Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).
- Awatade, N. T., et al. Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis. EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).
- Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
- Veit, G., et al. Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination. JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).
- Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research. Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).
- Laselva, O., et al. Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator. The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).
- Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods in Molecular Biology. 741, Clifton, N.J. 39-54 (2011).
- Laselva, O., et al. Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).
