Summary
Det korioallantoiska membranet (CAM) hos det aviära embryot är ett mycket användbart och tillämpligt verktyg för olika forskningsområden. En speciell ex ovo-modell av japansk vaktel CAM är lämplig för fotodynamisk behandlingsundersökning.
Abstract
Det korioallantoiska membranet (CAM) hos ett fågelembryo är ett tunt, extraembryoniskt membran som fungerar som ett primärt andningsorgan. Dess egenskaper gör det till en utmärkt in vivo experimentell modell för att studera angiogenes, tumörtillväxt, läkemedelsleveranssystem eller fotodynamisk diagnos (PDD) och fotodynamisk terapi (PDT). Samtidigt tillgodoser denna modell kravet på att försöksdjur ersätts med ett lämpligt alternativ. Ex ovo odlat embryo möjliggör enkel substansapplikation, åtkomst, övervakning och dokumentation. Den mest använda är chick CAM; Denna artikel beskriver dock fördelarna med den japanska vaktel-CAM som en billig och hög genomströmningsmodell. En annan fördel är den kortare embryonala utvecklingen, vilket möjliggör högre experimentell omsättning. Lämpligheten av vaktel CAM för PDD och PDT för cancer och mikrobiella infektioner undersöks här. Som ett exempel beskrivs användningen av fotosensibiliseraren hypericin i kombination med lipoproteiner eller nanopartiklar som ett leveranssystem. Skadepoängen från bilder i vitt ljus och förändringar i fluorescensintensiteten hos CAM-vävnaden under violett ljus (405 nm) bestämdes, tillsammans med analys av histologiska sektioner. Vaktel-CAM visade tydligt effekten av PDT på vaskulaturen och vävnaden. Dessutom kunde förändringar som kapillärblödning, trombos, lys av små kärl och blödning av större kärl observeras. Japansk vaktel CAM är en lovande in vivo-modell för fotodynamisk diagnos och terapiforskning, med tillämpningar i studier av tumörangiogenes samt antivaskulär och antimikrobiell terapi.
Introduction
Kycklingkorioallantoiskt membran (CAM) -modellen är välkänd och används ofta inom olika forskningsområden. Det är ett rikt vaskulärt extraembryoniskt organ som ger gasutbyte och mineraltransport1. På grund av transparensen och tillgängligheten hos detta membran kan enskilda blodkärl och deras strukturella förändringar observeras i realtid2. Trots fördelarna har chick CAM också vissa begränsningar (t.ex. större avelsanläggningar, äggproduktion och foderkonsumtion) som kan undvikas genom att använda andra fågelarter. I detta protokoll beskrivs en alternativ ex ovo CAM-modell med japanskt vaktel (Coturnix japonica) embryo. På grund av sin lilla storlek tillåter den användning av ett mycket större antal experimentella individer än kyckling CAM. Dessutom är den kortare 16-dagars embryonala utvecklingen av vaktelembryon en annan fördel. De första större fartygen på vaktel CAM visas på embryonal dag (ED) 7. Detta kan jämföras direkt med kycklingembryoutveckling (steg 4-35); De senare utvecklingsstadierna är emellertid inte längre jämförbara och kräver mindre tid för vaktelembryot3. Av intresse är den regelbundna förekomsten av mikrovaskulär förgrening som liknar den för kyckling CAMs 4,5,6. Snabb sexuell mognad, hög äggproduktion och lågkostnadsuppfödning är andra exempel som gynnar användningen av denna experimentella modell7.
En aviär CAM-modell används ofta i fotodynamisk terapi (PDT) studier8. PDT används för att behandla flera former av cancer (små lokaliserade tumörer) och andra icke-onkologiska sjukdomar. Dess princip är vid leverans av ett fluorescerande läkemedel, en fotosensibiliserare (PS), till den skadade vävnaden och dess aktivering med ljus med lämplig våglängd. En prospektiv PS som används i forskning är hypericin, ursprungligen isolerad från den medicinska växten Johannesört (Hypericum perforatum)9. De starka fotosensibiliserande effekterna av denna förening är baserade på dess fotokemiska och fotofysiska egenskaper. Dessa kännetecknas av flera fluorescensexcitationstoppar i intervallet 400-600 nm, vilket inducerar utsläpp av fluorescens vid ca 600 nm. Absorptionsmaxima för hypericin inom spektralbandet ligger i intervallet 540-590 nm, och fluorescensmaxima liggeri intervallet 590-640 nm 9. För att uppnå dessa fotosensibiliserande effekter exciteras hypericin av laserljus vid en våglängd på 405 nm efter lokal administration10. I närvaro av ljus kan hypericin uppvisa virucida, antiproliferativa och cytotoxiska effekter11, medan det inte finns någon systemisk toxicitet, och det frigörs snabbt från organismen. Hypericin är en lipofil substans som bildar vattenolösliga, icke-fluorescerande aggregat, varför flera typer av nanobärare, såsom polymera nanopartiklar 12,13 eller lipoproteiner med hög och låg densitet (HDL, LDL)14,15, används för att hjälpa dess leverans och penetration i cellerna. Eftersom CAM är ett naturligt immunbristsystem kan tumörceller implanteras direkt på membranytan. Modellen är också väl lämpad för att registrera omfattningen av PDT-inducerad vaskulär skada enligt en definierad poäng16,17. Ljus med lägre intensitet jämfört med PDT kan användas för fotodynamisk diagnos (PDD). Övervakning av vävnaden under violett excitation LED-ljus leder också till fotoaktivering av fotosensibiliserare18,19,20 som resulterar i en utsläpp av fluorescerande ljus, men det ger inte tillräckligt med energi för att starta en PDT-reaktion och skada cellerna. Det gör det till ett bra verktyg för tumörvisualisering och diagnos eller övervakning av farmakokinetiken för använda PSs14,15.
Denna artikel beskriver beredningen av vaktel ex ovo CAM-analysen med överlevnadsnivåer över 80%. Denna ex ovo-kultur tillämpades framgångsrikt i ett stort antal experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer. All utrustning och reagens måste autoklaveras eller steriliseras med 70% etanol eller UV-ljus.
1. Inkubation av ägg
- Förvara befruktade vaktelägg vid 10-15 °C i högst 4-5 dagar innan inkubationen påbörjas. Använd endast rena och oskadade ägg.
- Inkubera äggen i en tvångsdragsinkubator i ~ 53-54 h. Lägg äggen horisontellt med äggrotationen avstängd, vid 50%-60% luftfuktighet och 37,5 °C inkubationstemperatur.
2. Ex ovo odlingsberedning
OBS: Efter initial inkubation är äggen lämpliga för att starta ex ovo-odlingen .
- Desinficera äggytan med 70% etanol utan att rotera ägget.
- I ett sterilt laminärt flödesskåp öppnar du äggskalet med en liten steril kirurgisk sax och överför innehållet till en odlingsplatta med 6 brunnar. Om det är ordentligt gjort kommer embryot att ligga ovanpå en oskadad äggula. Efter varje ägg, desinficera saxen med 70% etanol.
- Tillsätt cirka 5 ml sterilt vatten till luckorna i 6-brunnsplattan, eftersom fuktighet är avgörande för att förhindra att CAM torkar ut.
- Placera embryona i en inkubator tills ytterligare experiment, samtidigt som en temperatur på 37 °C och 80%-90% fuktighet bibehålls.
- När CAM är fullt utvecklad (från ED7), placera en steriliserad silikonring (6 mm i diameter och cirka 1,5 mm i tjocklek) på CAM-ytan, längs de små kapillärerna. Undvik större blodkärl när du placerar ringen.
OBS: Ringen definierar arbetsytan, hjälper till att markera platsen för ämnesapplikation och förhindrar att vätskeinnehållet läcker ut. - Avsluta odlingen av embryona enligt landets lagstiftning.
- Det är viktigt att bära handskar eller hålla händerna desinficerade med 70% etanol under arbetet. Aspirera felaktigt tippade embryon eller obefruktade ägg med vakuumsug.
Figur 1: Ex ovo odlingsberedning. A) Japanska vaktelägg när de lagras och inkuberas. B) Desinfektion av äggytan med etanol. (C) Äggskal skärs med sax. (D) Äggets innehåll töms i brunnen. (E) Korrekt preparerat 3-dagars gammalt embryo, med utvecklande CAM-vaskulatur. F) Odlingsplattor som förvaras i en ruvös. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: 6-brunns odlingsplatta med embryon och silikonringar placerade ovanpå. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Inokulering av tumörceller
OBS: Alla procedurer kräver användning av ett sterilt laminärt flödesskåp.
- Odla olika typer av vidhäftande celler i kolvar enligt respektive odlingsprotokoll.
- Ta bort det gamla mediet från kolvarna och skölj cellskiktet med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att ta bort spår av mediet.
- Efter trypsinisering, hämma trypsin genom att tillsätta odlingsmediet och skörda cellerna i centrifugrör. Centrifugera cellerna och återsuspendera cellpelleten i ett färskt odlingsmedium. Räkna cellerna och återsuspendera dem i ett cellodlingsmedium vid önskad koncentration.
OBS: Det är också möjligt att producera 3D-cellkulturer, dvs sfäroider med till exempel hängningsmetoden21.
- Implantera 1 x 10 5-1 x 106 tumörceller eller5-15 sfäroider (per CAM) i 30 μL cellmediumlösning i silikonringen ovanpå CAM.
OBS: Volymen beror på storleken på den använda silikonringen. Om en silikonring med större diameter används behövs en större volym för att täcka hela området. Beroende på celltyp, eller för olika typer av experiment, kan olika cellkoncentrationer användas. Ibland används finskrapning av CAM för att förbättra vidhäftningen av de inbäddade cellerna. - Återför CAMs med inokulerade celler till inkubatorn (37 °C och 80%-90% luftfuktighet).
Figur 3: Inokulering av CAM med tumörer . (A) Aspiration av sfäroider med pipett och (B) implantation på CAM-ytan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Applicering av fotosensibiliserare
- Applicering av hypericin
- Under svag belysning, förbered en 2 mM stamlösning av hypericin genom att lösa den i 100% dimetylsulfoxid (DMSO). Förbered en 79 μM arbetslösning av hypericin strax före experimentet med steril PBS eller saltlösning. Se till att den slutliga koncentrationen av DMSO i alla lösningar alltid är under 0,2%, vilket inte påverkar embryonets utveckling.
- Under sterila förhållanden applicera en lämplig volym hypericinlösning på silikonringen. En volym på 30 μL är tillräcklig för att fylla en ring med en diameter av 6 mm.
- Förvara embryon i en inkubator vid 37 °C och 80%-90% luftfuktighet. Hypericin i en vattenlösning är fotoaktiv efter dess monomerisering i vävnaden, ungefär 3 timmar efter applicering på CAM.
- Tillämpning av hypericin med LDL, HDL eller nanopartiklar som transportsystem
OBS: Dessa transportsystem används för att förbättra penetrationen av hypericin i celler och cellstrukturer.- På grund av ljuskänsligheten, utför alla steg, inklusive beredning av lösningar, under svag belysning och lagra lösningarna i mörkret.
- Bered formuleringarna hypericin-LDL och hypericin-HDL genom att blanda lämpliga volymer lipoproteiner och hypericinstamlösningar i PBS enligt referens15. Koncentrationen av LDL eller HDL till hypericin är 20:115.
- Syntetisera polymernanopartiklar genom levande katjonisk ringöppningspolymerisation enligt referenserna12,13. Justera koncentrationen av hypericin i polymernanopartiklar med PBS till 10 μM12,13.
5. PDD och PDT
- Genomföra PDD
- Under sterila förhållanden, applicera fotosensibiliserare (hypericin, hypericinbelastade polymera nanopartiklar eller hypericin med lipoproteinbärare) på CAM-ytan, med eller utan tumörceller (ED 7-9).
- Belys CAM med violett excitationsljus (skräddarsytt cirkulärt LED-ljus med 405 nm våglängd) och registrera fluorescensen av hypericin i CAM-vävnad och tumörceller med en digitalkamera med tidsintervaller på 0, 1, 3, 5, 24 och 48 h efter hypericinadministration.
- Om forskningen kräver en bild av CAM i vitt ljus, registrera CAM före hypericinadministration och i slutet av experimentet, strax före vävnadsfixeringen, eftersom ljuset påverkar fotoaktiveringen av hypericin.
- Utvärdera fluorescensintensiteten med hjälp av ett bildbehandlings- och analysprogram (t.ex. ImageJ22).
- Dela RGB-bildkanaler i separata röda, gröna och blå bilder. Analysera den röda intensitetsbilden i 8-bitarsform. Utvärdera den röda intensiteten från området inuti ringen och approximera den som hypericinfluorescensen. Få hela bildprofildiagram (med ImageJ: s Profile Plot-plugin) med olika tidsintervall efter hypericinadministration (dvs. från 0 h, direkt efter administrering, upp till 48 h).
- Genomföra PDT
- Utför PDT minst 3 timmar efter hypericinapplikation.
- Placera den optiska fibern ovanför ytan på CAM för att laserstrålen ska täcka hela området inom silikonringen.
- Utför bestrålning in vivo (1-2 min) med ett 405 nm laserljus med en flythastighet på 285 mW/cm2.
- Spela in CAM med vitt ljus och 405 nm fluorescerande ljus före och efter fotodynamisk behandling (24 h och 48 h).
- Upptäck fotoskador 24 h och 48 h efter PDT från bilderna tagna i vitt ljus. Utvärdera vaskulär skada med en semikvantitativ poäng16: 1 - ingen förstörelse; 2 - partiell stängning av kapillärer (diameter ≤10 μm) utan förstöring av medium eller större (diameter ≥50 μm) och mindre kärl (diameter 10-50 μm); 3 - partiell stängning av mindre kärl med kapillärer som försvinner; 4 - partiell stängning av större fartyg med mindre kärl och kapillärer som försvinner; och 5 - total fototrombos med de flesta kärlen som försvinner.
Figur 4: Behandling av CAM med laserljus. Den här bilden togs i illustrativt syfte. För PDD eller PDT måste rummet vara mörkt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
6. Förbereda CAM för vidare utvärdering
- Paraffin inbäddning
- Fixera CAM-vävnaden i en odlingsplatta med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS i minst 2 timmar och högst över natten.
- Ta bort PFA och skär försiktigt ut en del av vävnaden i silikonringen från CAM.
- Torka omedelbart CAM-vävnaden i stigande alkoholserier enligt följande. Placera CAM-vävnaden i 70% etanol i 3 min, eosinlösning i 2 min (för enklare placering av vävnaden i paraffinblocket), 96% etanol i 3 x 5 min (alltid i en ny petriskål) och 100% etanol i 5 min och xylen i 2 x 10 min.
- Överför med en spatel eller tunn borste proverna så snabbt som möjligt till det upplösta paraffinet i petriskålar (59 °C). Efter 24 h, placera vävnaden i histologisk form, fyll den med paraffinbäddningsmedium och låt den stelna i kylskåpet. Skär den stelnade CAM från inbäddningsmediet, vrid den i brickan med 90 °, fyll den igen med inbäddningsmediet och låt den stelna.
- Förbered 5-10 μm sektioner på en mikrotom för histopatologisk analys för att bestämma PDT-inducerad skada.
- Beredning av frysta CAM-sektioner för histologi
OBS: För vissa metoder inklusive histologi är frysta sektioner framställda på kryostatmikrotom mer lämpliga. Följ stegen nedan för att förbereda de frysta CAM-sektionerna.- Montera försiktigt inbyggt eller 4% paraformaldehydfixerat CAM på glasskivan.
- Fyll inbäddningsformen till hälften med optimal skärtemperaturförening (OCT) och frys i flytande kväve eller en blandning av torris och etanol.
- Efter frysning, luta försiktigt och skjut CAM från glasskivan på toppen av det frysta OCT-mediet. Lägg igen i formen, täck med OCT-medium och frys som i steg 6.2.2.
- Fraktal analys av vaktel CAM
OBS: Vaskulaturförändringar orsakade av PDT kan bedömas genom att beräkna fraktaldimensionskoefficienten19.- I det laminära flödesskåpet, överflöde CAM i en odlingsplatta med en förvärmd (37 ° C) fixeringslösning av 4% paraformaldehyd och 2% glutaraldehyd i PBS.
- Ta bort fixeringslösningen efter 48 timmar. Separera försiktigt CAM från embryot med mikrosax och en fin borste och tvätta den i PBS.
- Montera den tvättade CAM på en glasskiva och låt den sakta torka.
- Fotografera bilden med en digitalkamera och en transilluminator som en källa till homogent vitt ljus.
- Bearbeta digitala bilder med ImageJ-programvara22. För analysen väljer du ett kvadratiskt område (512 × 512 pixlar) från området med distala arteriella grenar. Binarisera och skelettisera bilderna och beräkna fraktaldimensionskoefficienten (Df) enligt de procedurer som beskrivs i referens31.
- Molekylär analys av CAM-vävnad
- För molekylär analys, separera försiktigt inbyggt CAM, frys i flytande kväve och förvara vid -80 °C.
- Bestäm genuttryck enligt standardprotokoll för RNA-isolering23, omvänd transkription till cDNA och kvantitativ PCR24.
Figur 5: CAM-vävnad för fraktalanalys. Efter PDT fixeras CAM, monteras på en bild och torkas för fraktalanalys. Bilden togs i vitt ljus med hjälp av en transilluminator. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lokaliseringen av tumören på CAM-ytan är svår i vitt ljus. Fotosensibiliserare (här hypericin) som används i PDD förväntas tas upp selektivt av tumören och hjälper till att visualisera tumören. Tillsatsen av hypericin och användningen av fluorescerande ljus (t.ex. 405 nm) visade att tumören (skivepitelcancer TE1) fungerar mycket bra (figur 6A). Histologisk analys visade vitala tumörceller som invaderade friska vävnader. Koncentriska strukturer av onormala skivepitelceller, som ofta beskrivs i skivepitelcancervävnad (keratinpärlor), var synliga (figur 6B). Tumörens tillväxt åtföljdes av ödem och membranförtjockning.
Figur 6: Skivepitelcancer TE1-tumör som växer på CAM-ytan . (A) Bilden togs med vitt ljus (vänster) och 405 nm LED-ljus (höger) med tillsats av hypericin. Omfattningen av tumörtillväxt visualiseras och definieras bättre. (B) Tvärsnitt av tumören som växer på CAM-ytan, med metastaser (M, keratinpärlor) i CAM-vävnaden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
En fotosensibiliserare och längre exponering av vävnaden med fokuserat ljus med hög intensitet används i PDT. Sådan behandling påverkar CAM-kärl, vilket orsakar trombos, stängning av större kärl och försvinnande av mindre kärl och kapillärer (figur 7). Området där behandling applicerades (inuti silikonringen) påverkades, och det fanns en tydlig skillnad i kärltäthet inuti ringen och i det omgivande området.
Figur 7: Exempel på förändringar i CAM-kärl 24 timmar efter PDT. Behandling med laser orsakade försvinnandet av de flesta kapillärer och jämförde kärltätheten inuti och utanför behandlingsområdet i silikonringen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Laserljuset som användes i PDT utan närvaro av fotosensibiliserare orsakade ingen skada (figur 8, mittlinjen, "endast bestrålning"), jämförbar med kontrollen utan behandling (figur 8, översta raden, "kontroll"). Bildens nedre rad visar förändringar i hypericinfluorescens i tid, orsakad av monomerisering av aggregerat hypericin10. PDT applicerades efter 3 timmars inkubation med hypericin och 2 h senare fanns redan synliga förändringar. Bilden av vitt ljus som tagits 24 timmar efter behandling visar omfattande skador på kärlen.
Figur 8: Förändringar i fluorescensintensitet och CAM-kärltäthet efter hypericinadministration och laserbestrålning (PDT). Bilderna togs vid 0, 1, 3, 5 och 24 h med 405 nm ljus och vitt ljus. Den översta raden av bilder motsvarar kontroll utan behandling. Den mellersta raden av bilder motsvarar endast laserbestrålning (dvs utan hypericin); laserbestrålning (2 min, 405 nm laserljus, fluenshastighet 285 mW/cm2) applicerades 3 h efter hypericinadministrering. Bildernas nedersta rad motsvarar behandling med hypericin och laserbestrålning (PDT); Laserbestrålning applicerades efter 3 timmars inkubation med Hypericin. Bilderna visar tydligt skador på CAM-kärlen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
PDT påverkade CAM-vävnadsstrukturen negativt. Histologisk analys (figur 9) avslöjade att obehandlad kontroll CAM hade relativt jämn tjocklek; PDT-behandling gjorde dock att CAM blev tunnare och skörare.
Figur 9: Histologisk analys av kontroll- och PDT-behandlade CAM-vävnader . (A) Tvärsnitt av obehandlad kontroll-CAM. Tjockleken på CAM är relativt jämn. B) Tvärsnitt av CAM efter PDT-behandling. Jämfört med kontrollen är CAM tunnare och mer ömtålig. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För framgångsrik ex ovo-odling är det viktigt att följa protokollet ovan. Dessutom, om äggen inte öppnas tillräckligt noggrant eller det inte finns tillräcklig fuktighet under odlingen, fastnar äggula säcken på skalet och brister ofta. Starten av en ex ovo-odling vid tidpunkten för cirka 60 timmars ägginkubation säkerställer embryonas höga överlevnad, eftersom de redan är tillräckligt stora för att överleva hanteringen. Vid de senare utvecklingsstadierna blir CAM tunnare och fäster vid äggskalet, vilket leder till membranbrott.
Från inkubationsdag 7 och framåt är embryona mindre känsliga för agitation; CAM-zonen täcker nästan hela ytan av brunnen och är redo för ytterligare experiment. Även om de döda embryona kan utgöra en infektionsrisk, med rätt arbetsmetoder under åtminstone halvsterila förhållanden, påverkar de inte de andra embryona som lever i 6-brunnsplattan. Överlevnadsgraden för vaktel ex ovo-embryot i de aktuella experimenten var cirka 80%, vilket är jämförelsevis bättre än i kyckling ex ovo-experiment 25,26,27.
I de aktuella experimenten användes en silikonring för att avgränsa arbetsytan. Hittills finns inga bevis för att ringarna ensamma har någon effekt på utveckling, tillväxt eller angiogenes av CAM-vävnaden28. testade användningen av biomaterial av olika strukturer och kompositioner i en kyckling CAM-modell, och blodkärl observerades i alla testade byggnadsställningar utom silikon, där inga blodkärl observerades för att infiltrera det29. Endast vårdslös hantering av ringen kan orsaka blödning av CAM och sänka embryonas överlevnad.
På grund av dess egenskaper representerar denna CAM-modell ett livskraftigt, ekonomiskt fördelaktigt alternativ till laboratoriedjur, såsom möss, råttor eller kaniner, särskilt för att observera vaskulaturförändring under PDT30. Det är också lämpligt för övervakning av genuttrycksförändringar och vävnadsförändringar på histologisk nivå24. Denna naturligt immunbristmodell har ett rikt och lätt synligt vaskulärt nätverk som möjliggör visualisering i realtid av analyserna13,31.
Quail äggskal är lätt att öppna, och ex ovo odling är enkel och kräver mindre utrymme för lagring30. Utvecklingen av ett vaktelembryo är kort och möjliggör en hög omsättning av experiment. Denna snabba utveckling kan dock vara en nackdel i experiment som kräver mer tid (t.ex. för tumörutveckling och tillväxt), eftersom experimentfönstret är högst 7 dagar. Bland andra nackdelar med att använda vaktel är den mer känsliga konstitutionen av embryot och dess känslighet för förorening. Den lilla storleken på vaktel CAM begränsar tillämpningen av flera experimentella ämnen10.
Bilder med vitt ljus kan visa större och väldefinierade tumörer ganska bra, men fluorescensavbildning är ett mycket attraktivt verktyg för sjukdomsdetektering, särskilt för mycket små tumörer eller tumörcellkluster32, möjligen för att visualisera kanterna på lesionen. En högre ackumulering av fotosensibiliserare observeras i tumörregionen, så fotodynamisk diagnostik är mycket användbar vid tidig lokalisering eller under kirurgisk borttagning. Optiska filter används också för att få bilden korrekt32; I förevarande fall har bilderna emellertid tagits utan särskilda filter. Användningen av sådan avbildning (utan blocksystem) är till exempel i endoskopi och PDD av urinblåstumörer och gliom, så det har en lämplig klinisk tillämpning.
Trots vissa nackdelar är den japanska vaktel CAM-analysen ett utmärkt verktyg för nya drogtester och utveckling av nya biofotoniska tekniker samt fotodynamisk diagnos och terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Arbetet stöddes av VEGA 2/0042/21 och APVV 20-0129. V. Huntošovás bidrag är resultatet av projektets genomförande: Open scientific community for modern interdisciplinary research in medicine (Akronym: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 som stöds av det operativa programmet Integrated Infrastructure, finansierat av ERUF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
| CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
| digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
| diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
| eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| incubator Bios Midi | Bios Sedl any, Czech Republic |
Forced draught incubator for initial incubation | |
| incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
| Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
| LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
| macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
| microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
| microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
| scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
| software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
| stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
| stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |
References
- Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
- van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation. Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).
- Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R.
- De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).
- Sandau, K., Kurz, H. Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis. Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).
- Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marmé, D., Christ, B. Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application. Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).
- Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model. Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).
- Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).
- Miškovský, P. Hypericin - a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules. Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).
- Čavarga, I., et al. Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model. Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).
- Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro. Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).
- Datta, S., et al. Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery. Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).
- Huntošová, V., et al. Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin. Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).
- Buríková, M., et al. Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery. General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).
- Lenkavska, L., et al. Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).
- Rück, A., Böhmler, A., Steiner, R. PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).
- Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).
- Buzzá, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).
- Dougherty, T. J., et al.
- Xiang, L., et al. Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J.
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Máčajová, M., Čavarga, I., Sýkorová, M., Valachovič, M., Novotná, V., Bilčík, B. Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model. Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).
- Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials. ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).
- Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).
- Merlos Rodrigo, M. A., et al. Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells. Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).
- Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica). Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).
- Kohli, N., et al. Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications. Biology-Basel. 10 (4), 301 (2021).
- Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).
- Buzzá, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., Gómez-García, P. B., Kurachi, C. Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).
