Summary
Die chorioallantoische Membran (CAM) des Vogelembryos ist ein sehr nützliches und anwendbares Werkzeug für verschiedene Forschungsbereiche. Ein spezielles Ex-Ovo-Modell der japanischen Wachtel-CAM eignet sich für die photodynamische Behandlungsuntersuchung.
Abstract
Die chorioallantoische Membran (CAM) eines Vogelembryos ist eine dünne, extraembryonale Membran, die als primäres Atmungsorgan fungiert. Seine Eigenschaften machen es zu einem ausgezeichneten experimentellen In-vivo-Modell zur Untersuchung von Angiogenese, Tumorwachstum, Medikamentenabgabesystemen oder photodynamischer Diagnose (PDD) und photodynamischer Therapie (PDT). Gleichzeitig adressiert dieses Modell die Anforderung, Versuchstiere durch eine geeignete Alternative zu ersetzen. Ex ovo kultivierter Embryo ermöglicht eine einfache Substanzanwendung, den Zugang, die Überwachung und die Dokumentation. Am häufigsten wird chick CAM verwendet; Dieser Artikel beschreibt jedoch die Vorteile der japanischen Wachtel-CAM als kostengünstiges Modell mit hohem Durchsatz. Ein weiterer Vorteil ist die kürzere Embryonalentwicklung, die einen höheren experimentellen Umsatz ermöglicht. Die Eignung von Wachtel-CAM für PDD und PDT von Krebs und mikrobiellen Infektionen wird hier untersucht. Als Beispiel wird die Verwendung des Photosensibilisators Hypericin in Kombination mit Lipoproteinen oder Nanopartikeln als Abgabesystem beschrieben. Der Schadenswert aus Bildern in weißem Licht und Änderungen der Fluoreszenzintensität des CAM-Gewebes unter violettem Licht (405 nm) wurde zusammen mit der Analyse histologischer Schnitte bestimmt. Die Wachtel-CAM zeigte deutlich die Wirkung der PDT auf das Gefäßsystem und das Gewebe. Darüber hinaus konnten Veränderungen wie Kapillarblutungen, Thrombosen, Lyse kleiner Gefäße und Blutungen größerer Gefäße beobachtet werden. Japanische Wachtel-CAM ist ein vielversprechendes In-vivo-Modell für die photodynamische Diagnose und Therapieforschung mit Anwendungen in Studien der Tumorangiogenese sowie der antivaskulären und antimikrobiellen Therapie.
Introduction
Das Modell der Chorioallantoischen Hühnermembran (CAM) ist bekannt und in verschiedenen Forschungsbereichen weit verbreitet. Es ist ein reich vaskularisiertes extraembryonales Organ, das für Gasaustausch und Mineraltransport sorgt1. Durch die Transparenz und Zugänglichkeit dieser Membran können einzelne Blutgefäße und ihre strukturellen Veränderungen in Echtzeit beobachtet werden2. Trotz der Vorteile hat Küken-CAM auch einige Einschränkungen (z. B. größere Zuchtanlagen, Eierproduktion und Futterverbrauch), die durch die Verwendung anderer Vogelarten vermieden werden könnten. In diesem Protokoll wird ein alternatives Ex-Ovo-CAM-Modell mit japanischen Wachtelembryonen (Coturnix japonica) beschrieben. Aufgrund seiner geringen Größe ermöglicht es die Verwendung einer viel größeren Anzahl von experimentellen Individuen als Hühner-CAM. Darüber hinaus ist die kürzere 16-tägige Embryonalentwicklung von Wachtelembryonen ein weiterer Vorteil. Die ersten größeren Gefäße auf Wachtel-CAM erscheinen am Embryonaltag (ED) 7. Dies kann direkt mit der Entwicklung von Hühnerembryonen (Stadien 4-35) verglichen werden; Die späteren Entwicklungsstadien sind jedoch nicht mehr vergleichbar und benötigen weniger Zeit für den Wachtelembryo3. Von Interesse ist das regelmäßige Auftreten von mikrovaskulären Verzweigungen ähnlich denen von Hühner-CAMs 4,5,6. Schnelle sexuelle Reifung, hohe Eierproduktion und kostengünstige Zucht sind weitere Beispiele, die die Verwendung dieses experimentellen Modellsbegünstigen 7.
Ein Vogel-CAM-Modell wird häufig in Studien zur photodynamischen Therapie (PDT) verwendet8. Die PDT wird zur Behandlung verschiedener Krebsformen (kleine lokalisierte Tumore) und anderer nicht-onkologischer Erkrankungen eingesetzt. Sein Prinzip besteht in der Abgabe eines fluoreszierenden Arzneimittels, eines Photosensibilisators (PS), an das geschädigte Gewebe und dessen Aktivierung mit Licht der entsprechenden Wellenlänge. Ein prospektives PS, das in der Forschung verwendet wird, ist Hypericin, das ursprünglich aus der Heilpflanze Johanniskraut (Hypericum perforatum) isoliert wurde9. Die starke photosensibilisierende Wirkung dieser Verbindung beruht auf ihren photochemischen und photophysikalischen Eigenschaften. Diese zeichnen sich durch multiple Fluoreszenzanregungspeaks im Bereich von 400-600 nm aus, die die Emission von Fluoreszenz bei etwa 600 nm induzieren. Die Absorptionsmaxima von Hypericin innerhalb des Spektralbandes liegen im Bereich von 540-590 nm und die Fluoreszenzmaxima im Bereich von 590-640 nm9. Um diese photosensibilisierenden Effekte zu erzielen, wird Hypericin nach lokaler Verabreichung durch Laserlicht bei einer Wellenlänge von 405 nm angeregt10. In Gegenwart von Licht kann Hypericin viruzide, antiproliferative und zytotoxische Wirkungen zeigen11, während keine systemische Toxizität vorliegt, und es wird schnell aus dem Organismus freigesetzt. Hypericin ist eine lipophile Substanz, die wasserunlösliche, nicht fluoreszierende Aggregate bildet, weshalb verschiedene Arten von Nanocarriern, wie polymere Nanopartikel 12,13 oder High- und Low-Density-Lipoproteine (HDL, LDL)14,15, verwendet werden, um seine Abgabe und das Eindringen in die Zellen zu unterstützen. Da CAM ein natürlich immundefizientes System ist, können Tumorzellen direkt auf der Membranoberfläche implantiert werden. Das Modell eignet sich auch gut, um das Ausmaß von PDT-induzierten Gefäßschäden nach einem definierten Score16,17 zu erfassen. Licht mit geringerer Intensität im Vergleich zur PDT kann für die photodynamische Diagnose (PDD) verwendet werden. Die Überwachung des Gewebes unter violetter Anregung LED-Licht führt auch zur Photoaktivierung von Photosensibilisatoren18,19,20, die zu einer Emission von fluoreszierendem Licht führt, aber nicht genug Energie liefert, um eine PDT-Reaktion zu starten und die Zellen zu schädigen. Es macht es zu einem guten Werkzeug für die Tumorvisualisierung und Diagnose oder Überwachung der Pharmakokinetik von verwendeten PSs14,15.
Dieser Artikel beschreibt die Herstellung des Wachtel-Ex-Ovo-CAM-Assays mit Überlebensraten von über 80%. Diese Ex-Ovo-Kultur wurde in einer Vielzahl von Experimenten erfolgreich angewendet.
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Protocol
Die Forschung wurde in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien durchgeführt. Alle Geräte und Reagenzien müssen mit 70% Ethanol oder UV-Licht autoklaviert oder sterilisiert werden.
1. Inkubation der Eier
- Lagern Sie befruchtete Wachteleier bei 10-15 °C für maximal 4-5 Tage, bevor Sie mit der Inkubation beginnen. Verwenden Sie nur saubere und unbeschädigte Eier.
- Inkubieren Sie die Eier in einem Zwangszuginkubator für ~ 53-54 h. Legen Sie die Eier horizontal mit ausgeschalteter Eirotation, bei 50%-60% Luftfeuchtigkeit und 37,5 °C Inkubationstemperatur.
2. Ex ovo Kulturaufbereitung
HINWEIS: Nach der ersten Inkubation sind die Eier geeignet, um mit der Ex-Ovo-Kultivierung zu beginnen.
- Desinfizieren Sie die Eioberfläche mit 70% Ethanol, ohne das Ei zu drehen.
- Öffnen Sie in einem sterilen Laminar-Flow-Schrank die Eierschale mit einer kleinen sterilen chirurgischen Schere und geben Sie den Inhalt in eine 6-Well-Kulturplatte. Wenn es richtig gemacht wird, liegt der Embryo auf einem unbeschädigten Eigelb. Desinfizieren Sie die Schere nach jedem Ei mit 70% Ethanol.
- Fügen Sie ca. 5 ml steriles Wasser in die Lücken in der 6-Well-Platte hinzu, da Feuchtigkeit unerlässlich ist, um das Austrocknen des CAM zu verhindern.
- Legen Sie die Embryonen bis zu weiteren Versuchen in einen Inkubator, wobei eine Temperatur von 37 ° C und 80% -90% Luftfeuchtigkeit beibehalten wird.
- Wenn das CAM vollständig entwickelt ist (ab ED7), legen Sie einen sterilisierten Silikonring (6 mm Durchmesser und ca. 1,5 mm dick) entlang der kleinen Kapillaren auf die CAM-Oberfläche. Vermeiden Sie größere Blutgefäße, wenn Sie den Ring platzieren.
HINWEIS: Der Ring definiert den Arbeitsbereich, markiert den Ort der Stoffanwendung und verhindert, dass der Flüssigkeitsinhalt austritt. - Beenden Sie die Kultivierung der Embryonen gemäß der Gesetzgebung des Landes.
- Wichtig ist, Handschuhe zu tragen oder die Hände während der Arbeit mit 70% Ethanol desinfiziert zu lassen. Saugen Sie falsch gekippte Embryonen oder unbefruchtete Eier mit einem Vakuumsauger ab.
Abbildung 1: Ex-ovo-Kulturvorbereitung . (A) Japanische Wachteleier bei der Lagerung und Bebrütung. (B) Desinfektion der Eioberfläche mit Ethanol. (C) Die Eierschale wird mit einer Schere geschnitten. (D) Der Inhalt des Eies wird in den Brunnen entleert. (E) Richtig vorbereiteter 3 Tage alter Embryo mit sich entwickelndem CAM-Gefäßsystem. (F) In einem Inkubator gelagerte Kulturplatten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: 6-Well-Kulturplatte mit Embryonen und Silikonringen darauf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
3. Impfung von Tumorzellen
HINWEIS: Alle Verfahren erfordern die Verwendung eines sterilen Laminar-Flow-Schranks.
- Kultur verschiedener Arten von adhärenten Zellen in Kolben gemäß den jeweiligen Kulturprotokollen.
- Entfernen Sie das alte Medium aus den Kolben und spülen Sie die Zellschicht mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab, um Spuren des Mediums zu entfernen.
- Nach der Trypsinisierung das Trypsin durch Zugabe des Kulturmediums hemmen und die Zellen in Zentrifugenröhrchen ernten. Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem frischen Kulturmedium. Zählen Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in einem Zellkulturmedium in der gewünschten Konzentration.
HINWEIS: Es ist auch möglich, 3D-Zellkulturen, d.h. Sphäroide, beispielsweise mit der Hanging-Drop-Methode21 herzustellen.
- Implantieren Sie 1 x 10 5-1 x 106 Tumorzellen oder5-15 Sphäroide (pro CAM) in 30 μL Zellmediumlösung in den Silikonring auf der Oberseite des CAM.
HINWEIS: Das Volumen hängt von der Größe des verwendeten Silikonrings ab. Wird ein Silikonring mit größerem Durchmesser verwendet, wird ein größeres Volumen benötigt, um die gesamte Fläche abzudecken. Je nach Zelltyp oder für verschiedene Arten von Experimenten können unterschiedliche Zellkonzentrationen verwendet werden. Manchmal wird feines Scraping von CAM verwendet, um die Haftung der eingebetteten Zellen zu verbessern. - Geben Sie die CAMs mit den beimpften Zellen in den Inkubator zurück (37 °C und 80%-90% Luftfeuchtigkeit).
Abbildung 3: Impfung von CAM mit Tumoren. (A) Aspiration von Sphäroiden mit einer Pipette und (B) Implantation auf der CAM-Oberfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
4. Anwendung von Photosensibilisator
- Anwendung von Hypericin
- Bereiten Sie bei schwachem Licht eine 2 mM Stammlösung von Hypericin vor, indem Sie sie in 100% Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen. Bereiten Sie kurz vor dem Versuch eine 79 μM Arbeitslösung von Hypericin mit steriler PBS- oder Kochsalzlösung vor. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration von DMSO in allen Lösungen immer unter 0,2% liegt, was die Entwicklung des Embryos nicht beeinträchtigt.
- Unter sterilen Bedingungen ein geeignetes Volumen Hypericinlösung auf den Silikonring auftragen. Ein Volumen von 30 μL reicht aus, um einen Ring mit einem Durchmesser von 6 mm zu füllen.
- Bewahren Sie die Embryonen in einem Inkubator bei 37 °C und 80%-90% Luftfeuchtigkeit auf. Hypericin in einer wässrigen Lösung ist nach seiner Monomerisierung im Gewebe photoaktiv, etwa 3 h nach seiner Anwendung auf dem CAM.
- Anwendung von Hypericin mit LDL, HDL oder Nanopartikeln als Transportsysteme
HINWEIS: Diese Transportsysteme werden verwendet, um das Eindringen von Hypericin in Zellen und Zellstrukturen zu verbessern.- Aufgrund der Lichtempfindlichkeit führen Sie alle Schritte, einschließlich der Vorbereitung der Lösungen, bei schwachem Licht durch und lagern Sie die Lösungen im Dunkeln.
- Die Hypericin-LDL- und Hypericin-HDL-Formulierungen werden durch Mischen geeigneter Mengen von Lipoproteinen und Hypericin-Stammlösungen in PBS gemäß Referenz15 hergestellt. Die Konzentration von LDL oder HDL zu Hypericin beträgt 20:115.
- Synthese von Polymernanopartikeln durch lebende kationische Ringöffnungspolymerisation gemäß Referenz12,13. Die Konzentration von Hypericin in Polymernanopartikeln mit PBS wird auf 10 μM12,13 eingestellt.
5. PDD und PDT
- PDD durchführen
- Unter sterilen Bedingungen Photosensibilisator (Hypericin, Hypericin-beladene polymere Nanopartikel oder Hypericin mit Lipoproteinträger) auf die CAM-Oberfläche auftragen, mit oder ohne Tumorzellen (ED 7-9).
- Beleuchten Sie das CAM mit violettem Anregungslicht (maßgeschneidertes kreisförmiges LED-Licht mit 405 nm Wellenlänge) und erfassen Sie die Fluoreszenz von Hypericin in CAM-Gewebe- und Tumorzellen mit einer Digitalkamera in Zeitintervallen von 0, 1, 3, 5, 24 und 48 h nach Hypericin-Verabreichung.
- Wenn die Forschung ein Bild der CAM in weißem Licht erfordert, zeichnen Sie die CAM vor der Hypericin-Verabreichung und am Ende des Experiments, kurz vor der Gewebefixierung, auf, da das Licht die Photoaktivierung von Hypericin beeinflusst.
- Bewerten Sie die Fluoreszenzintensität mit einem Bildverarbeitungs- und Analyseprogramm (z. B. ImageJ22).
- Teilen Sie RGB-Bildkanäle in separate Rot-, Grün- und Blaubilder auf. Analysieren Sie das Bild mit roter Intensität in 8-Bit-Form. Bewerten Sie die Rotintensität aus dem Bereich innerhalb des Rings und nähern Sie sich ihr als Hypericinfluoreszenz an. Erhalten Sie ganze Bildprofildiagramme (mit dem Profilplot-Plugin von ImageJ) in verschiedenen Zeitintervallen nach der Hypericin-Verabreichung (d.h. von 0 h, direkt nach der Verabreichung, bis zu 48 h).
- PDT durchführen
- Führen Sie die PDT mindestens 3 h nach der Hypericin-Anwendung durch.
- Platzieren Sie die optische Faser über der Oberfläche des CAM, damit der Laserstrahl den gesamten Bereich innerhalb des Silikonrings bedeckt.
- Durchführung einer In-vivo-Bestrahlung (1-2 min) mit einem 405 nm Laserlicht bei einer Flukenzrate von 285 mW/cm2.
- Aufzeichnung von CAM mit weißem Licht und 405 nm Fluoreszenzlicht vor und nach der photodynamischen Behandlung (24 h und 48 h).
- Erkennen Sie Lichtschäden 24 h und 48 h nach PDT aus den Bildern, die in weißem Licht aufgenommen wurden. Bewerten Sie Gefäßschäden mit einem semiquantitativen Score16: 1 - keine Zerstörung; 2 - teilweiser Verschluss der Kapillaren (Durchmesser ≤10 μm) ohne Zerstörung von mittleren oder größeren (Durchmesser ≥50 μm) und kleineren Gefäßen (Durchmesser 10-50 μm); 3 - teilweiser Verschluss kleinerer Gefäße mit verschwindenden Kapillaren; 4 - teilweiser Verschluss größerer Gefäße mit kleineren Gefäßen und Kapillaren, die verschwinden; und 5 - totale Photothrombose mit den meisten Gefäßen verschwinden.
Abbildung 4: Behandlung von CAM mit Laserlicht. Dieses Bild wurde zur Veranschaulichung aufgenommen. Für PDD oder PDT muss der Raum dunkel sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
6. CAM für die weitere Evaluierung vorbereiten
- Paraffin-Einbettung
- Fixieren Sie das CAM-Gewebe in einer Kultivierungsplatte mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für mindestens 2 h und maximal über Nacht.
- Entfernen Sie das PFA und schneiden Sie vorsichtig einen Teil des Gewebes im Silikonring aus dem CAM aus.
- Dehydrieren Sie sofort das CAM-Gewebe in aufsteigender Alkoholserie wie folgt. Legen Sie das CAM-Gewebe in 70% Ethanol für 3 min, Eosinlösung für 2 min (zur leichteren Lokalisierung des Gewebes im Paraffinblock), 96% Ethanol für 3 x 5 min (immer in einer neuen Petrischale) und 100% Ethanol für 5 min und Xylol für 2 x 10 min.
- Mit einem Spatel oder einer dünnen Bürste werden die Proben so schnell wie möglich in das gelöste Paraffin in Petrischalen (59 °C) überführt. Nach 24 h legen Sie das Gewebe in eine histologische Form, füllen Sie es mit Paraffin-Einbettungsmedium und lassen Sie es im Kühlschrank erstarren. Schneiden Sie das erstarrte CAM aus dem Einbettmedium, drehen Sie es im Fach um 90°, füllen Sie es erneut mit dem Einbettmedium und lassen Sie es erstarren.
- Bereiten Sie 5-10 μm Schnitte auf einem Mikrotom für die histopathologische Analyse vor, um PDT-induzierte Schäden zu bestimmen.
- Vorbereitung von eingefrorenen CAM-Profilen für die Histologie
HINWEIS: Für einige Methoden, einschließlich Histologie, sind gefrorene Schnitte, die auf Kryostatmikrotom hergestellt wurden, besser geeignet. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um die eingefrorenen CAM-Abschnitte vorzubereiten.- Montieren Sie vorsichtig natives oder 4% paraformaldehyd-fixiertes CAM auf dem Objektträger.
- Füllen Sie die Einbettungsform zur Hälfte mit der optimalen Schnitttemperaturverbindung (OCT) und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff oder einer Mischung aus Trockeneis und Ethanol ein.
- Nach dem Einfrieren das CAM vorsichtig kippen und schieben Sie es vom Glasobjektträger auf die Oberseite des gefrorenen OCT-Mediums. Erneut in die Form geben, mit OCT-Medium abdecken und wie in Schritt 6.2.2 einfrieren.
- Fraktale Analyse von Wachtel-CAM
ANMERKUNG: Durch PDT verursachte Gefäßveränderungen können durch Berechnung des fraktalen Dimensionskoeffizienten19 beurteilt werden.- Im Laminar-Flow-Schrank CAM in einer Kultivierungsplatte mit einer vorgewärmten (37 °C) Fixierungslösung aus 4% Paraformaldehyd und 2% Glutaraldehyd in PBS überlaufen.
- Entfernen Sie die Fixierlösung nach 48 h. Trennen Sie das CAM vorsichtig mit einer Mikroschere und einer feinen Bürste vom Embryo und waschen Sie es in PBS.
- Montieren Sie das gewaschene CAM auf einem Glasobjektträger und lassen Sie es langsam trocknen.
- Fotografieren Sie das Dia mit einer Digitalkamera und einem Transilluminator als Quelle für homogenes weißes Licht.
- Digitale Bilder mit der ImageJ-Software22 verarbeiten. Wählen Sie für die Analyse einen quadratischen Bereich (512 × 512 Pixel) aus dem Bereich mit distalen arteriellen Ästen aus. Binarisieren und skelettieren Sie die Bilder und berechnen Sie den fraktalen Dimensionskoeffizienten (Df) gemäß den in Referenz31 beschriebenen Verfahren.
- Molekulare Analyse von CAM-Gewebe
- Für die molekulare Analyse natives CAM sorgfältig trennen, in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
- Bestimmung der Genexpression gemäß Standardprotokollen für RNA-Isolierung23, reverse Transkription in cDNA und quantitative PCR24.
Abbildung 5: CAM-Gewebe für die fraktale Analyse. Nach der PDT wird CAM fixiert, auf einen Objektträger montiert und für die fraktale Analyse getrocknet. Das Bild wurde in weißem Licht mit einem Transilluminator aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Representative Results
Die Lokalisation des Tumors auf der CAM-Oberfläche ist bei weißem Licht schwierig. Es wird erwartet, dass der bei PDD verwendete Photosensibilisator (hier Hypericin) selektiv vom Tumor aufgenommen wird und hilft, den Tumor sichtbar zu machen. Die Zugabe von Hypericin und die Verwendung von Fluoreszenzlicht (z.B. 405 nm) zeigten die Position des Tumors (Plattenepithelkarzinom TE1) sehr gut (Abbildung 6A). Die histologische Analyse zeigte, dass lebenswichtige Tumorzellen in gesundes Gewebe eindringen. Konzentrische Strukturen abnormaler Plattenepithelzellen, die oft in Plattenepithelkarzinomgewebe (Keratinperlen) beschrieben werden, waren sichtbar (Abbildung 6B). Das Wachstum des Tumors wurde von Ödemen und Membranverdickungen begleitet.
Abbildung 6: Plattenepithelkarzinom TE1-Tumor wächst auf CAM-Oberfläche . (A) Das Bild wurde mit weißem Licht (links) und 405 nm LED-Licht (rechts) unter Zusatz von Hypericin aufgenommen. Das Ausmaß des Tumorwachstums wird besser visualisiert und definiert. (B) Querschnitt des Tumors, der auf der CAM-Oberfläche wächst, mit Metastasen (M, Keratinperlen) im CAM-Gewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ein Photosensibilisator und eine längere Belichtung des Gewebes mit fokussiertem Licht von hoher Intensität werden bei der PDT verwendet. Eine solche Behandlung beeinflusst das CAM-Gefäßsystem und verursacht Thrombose, den Verschluss größerer Gefäße und das Verschwinden kleinerer Gefäße und Kapillaren (Abbildung 7). Der Bereich, in dem die Behandlung angewendet wurde (innerhalb des Silikonrings), war betroffen, und es gab einen deutlichen Unterschied in der Gefäßdichte innerhalb des Rings und in der Umgebung.
Abbildung 7: Beispiel für Veränderungen des CAM-Gefäßsystems 24 h nach PDT. Die Behandlung mit dem Laser verursachte das Verschwinden der meisten Kapillaren, wobei die Gefäßdichte innerhalb und außerhalb des Behandlungsbereichs im Silikonring verglichen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Das Laserlicht, das in der PDT ohne Vorhandensein eines Photosensibilisators verwendet wurde, verursachte keinen Schaden (Abbildung 8, mittlere Linie, "nur Bestrahlung"), vergleichbar mit der Kontrolle ohne jegliche Behandlung (Abbildung 8, obere Zeile, "Kontrolle"). Die untere Zeile der Bilder zeigt Veränderungen der Hypericinfluoreszenz im Laufe der Zeit, verursacht durch Monomerisierung von aggregiertem Hypericin10. Die PDT wurde nach 3 h Inkubation mit Hypericin angewendet und 2 h später gab es bereits sichtbare Veränderungen. Das Weißlichtbild, das 24 h nach der Behandlung aufgenommen wurde, zeigt umfangreiche Schäden am Gefäßsystem.
Abbildung 8: Änderungen der Fluoreszenzintensität und der CAM-Gefäßdichte nach Hypericin-Verabreichung und Laserbestrahlung (PDT). Die Bilder wurden bei 0, 1, 3, 5 und 24 h mit 405 nm Licht und weißem Licht aufgenommen. Die oberste Bildzeile entspricht der Kontrolle ohne Behandlung. Die mittlere Bildlinie entspricht nur der Laserbestrahlung (d.h. ohne Hypericin); Die Laserbestrahlung (2 min, 405 nm Laserlicht, Flukenrate 285 mW/cm2) wurde 3 h nach Hypericin-Verabreichung angewendet. Die untere Bildzeile entspricht der Behandlung mit Hypericin und Laserbestrahlung (PDT); Die Laserbestrahlung wurde nach 3 h Inkubation mit Hypericin angewendet. Die Bilder zeigen deutlich Schäden am CAM-Gefäßsystem. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die PDT wirkte sich negativ auf die CAM-Gewebestruktur aus. Die histologische Analyse (Abbildung 9) ergab, dass unbehandelte Kontroll-CAM eine relativ gleichmäßige Dicke aufwies; Die PDT-Behandlung führte jedoch dazu, dass die CAM dünner und zerbrechlicher wurde.
Abbildung 9: Histologische Analyse von Kontroll- und PDT-behandelten CAM-Geweben . (A) Querschnitt der unbehandelten Kontroll-CAM. Die Dicke von CAM ist relativ gleichmäßig. (B) Querschnitt der CAM nach PDT-Behandlung. Im Vergleich zur Steuerung ist das CAM dünner und zerbrechlicher. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Für einen erfolgreichen Ex-Ovo-Anbau ist es wichtig, das obige Protokoll zu befolgen. Wenn die Eier nicht sorgfältig genug geöffnet werden oder während der Kultivierung nicht genügend Feuchtigkeit vorhanden ist, haftet der Dottersack an der Schale und reißt oft. Der Beginn einer Ex-Ovo-Kultivierung zum Zeitpunkt von ca. 60 h Eiinkubation sichert die hohe Überlebensrate der Embryonen, da sie bereits groß genug sind, um die Handhabung zu überstehen. In den späteren Entwicklungsstadien wird das CAM dünner und haftet an der Eierschale, was zu Membranrissen führt.
Ab dem 7. Inkubationstag sind die Embryonen weniger empfindlich gegenüber Agitation; Die CAM-Zone bedeckt fast die gesamte Oberfläche des Bohrlochs und ist bereit für weitere Experimente. Obwohl die toten Embryonen ein Infektionsrisiko darstellen können, beeinträchtigen sie mit den richtigen Arbeitsmethoden unter zumindest halbsterilen Bedingungen nicht die anderen lebenden Embryonen in der 6-Well-Platte. Die Überlebensrate des Wachtel-Ex-Ovo-Embryos lag in den aktuellen Experimenten bei etwa 80%, was vergleichsweise besser ist als in Hühner-Ex-Ovo-Experimenten 25,26,27.
In den aktuellen Experimenten wurde ein Silikonring verwendet, um den Arbeitsbereich abzugrenzen. Bisher gibt es keine Hinweise darauf, dass die Ringe allein einen Einfluss auf die Entwicklung, das Wachstum oder die Angiogenese des CAM-Gewebes haben28. Kohli et al. testeten die Verwendung von Biomaterialien unterschiedlicher Strukturen und Zusammensetzungen in einem Hühner-CAM-Modell, und Blutgefäße wurden in allen getesteten Gerüsten außer Silikon beobachtet, wo keine Blutgefäße beobachtet wurden, um es zu infiltrieren29. Nur ein unvorsichtiger Umgang mit dem Ring kann zu Blutungen der CAM führen und das Überleben der Embryonen verringern.
Aufgrund seiner Eigenschaften stellt dieses CAM-Modell eine praktikable, wirtschaftlich vorteilhafte Alternative zu Versuchstieren wie Mäusen, Ratten oder Kaninchen dar, insbesondere zur Beobachtung von Gefäßveränderungen während der PDT30. Es eignet sich auch zur Überwachung von Genexpressionsveränderungen und Gewebeveränderungen auf histologischer Ebene24. Dieses natürlich immundefiziente Modell verfügt über ein reichhaltiges und leicht sichtbares vaskuläres Netzwerk, das eine Echtzeitvisualisierung der Assays13,31 ermöglicht.
Wachteleierschale ist leicht zu öffnen, und Ex-Ovo-Anbau ist einfach und erfordert weniger Platz für die Lagerung30. Die Entwicklung eines Wachtelembryos ist kurz und ermöglicht einen hohen Umsatz von Experimenten. Diese schnelle Entwicklung kann jedoch bei Experimenten, die mehr Zeit benötigen (z.B. für Tumorentwicklung und -wachstum), ein Nachteil sein, da das Versuchsfenster maximal 7 Tage beträgt. Zu den anderen Nachteilen der Verwendung von Wachteln gehört die empfindlichere Konstitution des Embryos und seine Empfindlichkeit gegenüber Kontamination. Die geringe Größe der Wachtel-CAM schränkt die Anwendung mehrerer experimenteller Substanzen ein10.
Weißlichtbilder können größere und gut definierte Tumore recht gut darstellen, aber die Fluoreszenzbildgebung ist ein sehr attraktives Werkzeug zur Krankheitserkennung, insbesondere für sehr kleine Tumore oder Tumorzellcluster32, möglicherweise um die Ränder der Läsion sichtbar zu machen. Eine höhere Akkumulation von Photosensibilisatoren wird in der Tumorregion beobachtet, so dass die photodynamische Diagnostik bei der frühen Lokalisation oder während der chirurgischen Entfernung sehr nützlich ist. Optische Filter werden auch verwendet, um das Bild korrekt zu erhalten32; Im vorliegenden Fall wurden die Fotos jedoch ohne spezielle Filter aufgenommen. Der Einsatz einer solchen Bildgebung (ohne Blocksystem) erfolgt beispielsweise in der Endoskopie und PDD von Harnblasentumoren und Gliomen, so dass sie eine geeignete klinische Anwendung hat.
Trotz einiger Nachteile ist der japanische Wachtel-CAM-Assay ein großartiges Werkzeug für neuartige Arzneimitteltests und die Entwicklung neuer biophotonischer Techniken sowie für die photodynamische Diagnose und Therapie.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde von VEGA 2/0042/21 und APVV 20-0129 unterstützt. Der Beitrag von V. Huntošová ist das Ergebnis der Projektdurchführung: Open scientific community for modern interdisciplinary research in medicine (Akronym: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 unterstützt durch das vom EFRE finanzierte Operationelle Programm Integrierte Infrastruktur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
| CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
| digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
| diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
| eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| incubator Bios Midi | Bios Sedl any, Czech Republic |
Forced draught incubator for initial incubation | |
| incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
| Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
| LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
| macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
| microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
| microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
| scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
| software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
| stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
| stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |
References
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