Summary
Den chorioallantoiske membran (CAM) i fugleembryoet er et meget nyttigt og anvendeligt værktøj til forskellige forskningsområder. En særlig ex ovo-model af japansk vagtel CAM er velegnet til fotodynamisk behandlingsundersøgelse.
Abstract
Den chorioallantoiske membran (CAM) i et fugleembryo er en tynd, ekstraembryonal membran, der fungerer som et primært åndedrætsorgan. Dens egenskaber gør det til en fremragende in vivo eksperimentel model til at studere angiogenese, tumorvækst, lægemiddelleveringssystemer eller fotodynamisk diagnose (PDD) og fotodynamisk terapi (PDT). Samtidig imødekommer denne model kravet om udskiftning af forsøgsdyr med et passende alternativ. Ex ovo dyrket embryo giver nem stofpåføring, adgang, overvågning og dokumentation. Den mest anvendte er chick CAM; Denne artikel beskriver dog fordelene ved den japanske vagtel CAM som en billig og høj gennemstrømningsmodel. En anden fordel er den kortere embryonale udvikling, hvilket muliggør højere eksperimentel omsætning. Egnetheden af vagtel CAM til PDD og PDT af kræft og mikrobielle infektioner undersøges her. Som et eksempel beskrives brugen af fotosensibilisatoren hypericin i kombination med lipoproteiner eller nanopartikler som et leveringssystem. Skadesscoren fra billeder i hvidt lys og ændringer i fluorescensintensiteten af CAM-vævet under violet lys (405 nm) blev bestemt sammen med analyse af histologiske sektioner. Vagtel CAM viste tydeligt effekten af PDT på vaskulaturen og vævet. Desuden kunne ændringer som kapillærblødning, trombose, lysis af små kar og blødning af større kar observeres. Japansk vagtel CAM er en lovende in vivo-model til fotodynamisk diagnose og terapiforskning med anvendelser i undersøgelser af tumorangiogenese samt antivaskulær og antimikrobiel terapi.
Introduction
Kylling chorioallantoic membran (CAM) modellen er velkendt og udbredt inden for forskellige forskningsområder. Det er et rigt vaskulariseret ekstraembryonalt organ, der giver gasudveksling og mineraltransport1. På grund af gennemsigtigheden og tilgængeligheden af denne membran kan individuelle blodkar og deres strukturelle ændringer observeres i realtid2. På trods af fordelene har kyllinge-CAM også nogle begrænsninger (f.eks. Større avlsfaciliteter, ægproduktion og foderforbrug), der kunne undgås ved at bruge andre fuglearter. I denne protokol beskrives en alternativ ex ovo CAM-model med japansk vagtel (Coturnix japonica) embryo. På grund af sin lille størrelse tillader det brugen af et meget større antal eksperimentelle individer end kylling CAM. Desuden er den kortere 16-dages embryonale udvikling af vagtelembryoner en anden fordel. De første større fartøjer på vagtel CAM vises på embryonal dag (ED) 7. Dette kan sammenlignes direkte med chick embryo udvikling (trin 4-35); De senere udviklingsstadier er imidlertid ikke længere sammenlignelige og kræver mindre tid til vagtelembryoet3. Af interesse er den regelmæssige forekomst af mikrovaskulær forgrening svarende til kylling CAMs 4,5,6. Hurtig seksuel modning, høj ægproduktion og billig avl er andre eksempler, der favoriserer brugen af denne eksperimentelle model7.
En CAM-model anvendes ofte i fotodynamiske terapiundersøgelser (PDT)8. PDT bruges til behandling af flere former for kræft (små lokaliserede tumorer) og andre ikke-onkologiske sygdomme. Dets princip er i levering af et fluorescerende lægemiddel, en fotosensibilisator (PS), til det beskadigede væv og dets aktivering med lys med den passende bølgelængde. En potentiel PS, der anvendes i forskning, er hypericin, oprindeligt isoleret fra lægeplanten St. John's wort (Hypericum perforatum)9. De stærke fotosensibiliserende virkninger af denne forbindelse er baseret på dets fotokemiske og fotofysiske egenskaber. Disse er kendetegnet ved flere fluorescens excitation toppe i området 400-600 nm, hvilket inducerer emission af fluorescens ved ca. 600 nm. Absorptionsmaksima for hypericin inden for spektralbåndet ligger i området 540-590 nm, og fluorescensmaksima ligger i området 590-640 nm9. For at opnå disse fotosensibiliserende effekter ophidses hypericin af laserlys ved en bølgelængde på 405 nm efter lokal administration10. I nærvær af lys kan hypericin udvise virucide, antiproliferative og cytotoksiske virkninger11, mens der ikke er nogen systemisk toksicitet, og det frigives hurtigt fra organismen. Hypericin er et lipofilt stof, der danner vanduopløselige, ikke-fluorescerende aggregater, hvorfor flere typer nanocarriers, såsom polymere nanopartikler 12,13 eller lipoproteiner med høj og lav densitet (HDL, LDL)14,15, bruges til at hjælpe dets levering og indtrængning i cellerne. Da CAM er et naturligt immundefekt system, kan tumorceller implanteres direkte på membranoverfladen. Modellen er også velegnet til registrering af omfanget af PDT-induceret vaskulær skade i henhold til en defineret score16,17. Lys med lavere intensitet sammenlignet med PDT kan bruges til fotodynamisk diagnose (PDD). Overvågning af vævet under violet excitation LED-lys fører også til fotoaktivering af fotosensibilisatorer18,19,20, der resulterer i en emission af fluorescerende lys, men det giver ikke nok energi til at starte en PDT-reaktion og beskadige cellerne. Det gør det til et godt værktøj til tumorvisualisering og diagnose eller overvågning af farmakokinetikken af brugte PSs14,15.
Denne artikel beskriver forberedelsen af vagtler ex ovo CAM-assay med overlevelsesrater over 80%. Denne ex ovo-kultur blev anvendt med succes i et stort antal eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer. Alt udstyr og reagenser skal autoklaveres eller steriliseres med 70% ethanol eller UV-lys.
1. Inkubation af æg
- Opbefrugtede vagtelæg opbevares ved 10-15 °C i højst 4-5 dage, før inkubationen påbegyndes. Brug kun rene og ubeskadigede æg.
- Inkuber æggene i en tvungen trækkuvøse i ~ 53-54 timer. Læg æggene vandret med ægrotationen slukket, ved 50% -60% fugtighed og 37,5 ° C inkubationstemperatur.
2. Tilberedning af ex ovo-dyrkning
BEMÆRK: Efter den første inkubation er æggene egnede til at starte ex ovo-dyrkningen .
- Desinficer ægoverfladen med 70% ethanol uden at rotere ægget.
- I et sterilt laminar-flow skab skal du åbne æggeskallen ved hjælp af en lille steril kirurgisk saks og overføre indholdet til en 6-brønds kulturplade. Hvis det gøres korrekt, vil embryoet ligge oven på en ubeskadiget æggeblomme. Efter hvert æg desinficeres saksen med 70% ethanol.
- Tilsæt ca. 5 ml sterilt vand til hullerne i 6-brøndspladen, da fugtighed er afgørende for at forhindre CAM i at tørre ud.
- Embryonerne anbringes i en inkubator indtil yderligere forsøg, samtidig med at der opretholdes en temperatur på 37 °C og en luftfugtighed på 80-90 %.
- Når CAM er fuldt udviklet (fra ED7), skal du placere en steriliseret silikonering (6 mm i diameter og ca. 1,5 mm i tykkelse) på CAM-overfladen langs de små kapillærer. Undgå større blodkar, når du placerer ringen.
BEMÆRK: Ringen definerer arbejdsområdet, hjælper med at markere stedet for stofapplikationen og forhindrer væskeindholdet i at lække ud. - Afslut dyrkningen af embryonerne i henhold til landets lovgivning.
- Det er vigtigt, at du bærer handsker eller holder hænderne desinficeret med 70% ethanol under arbejdet. Aspirer forkert tippede embryoner eller ubefrugtede æg med en vakuumaspirator.
Figur 1: Ex ovo-kulturpræparat . A) japanske vagtelæg, efterhånden som de opbevares og udruges. (B) Desinfektion af ægoverfladen med ethanol. (C) Æggeskallet skæres med en saks. (D) Æggets indhold tømmes i brønden. (E) Korrekt forberedt 3 dage gammelt embryo med udvikling af CAM-vaskulatur. (F) Kulturplader opbevaret i en inkubator. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: 6-brønds kulturplade med embryoner og silikone ringe placeret ovenpå. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Podning af tumorceller
BEMÆRK: Alle procedurer kræver brug af et sterilt laminært flowskab.
- Kultur forskellige typer klæbende celler i kolber i henhold til respektive kulturprotokoller.
- Fjern det gamle medium fra kolberne, og skyl cellelaget med sterilt fosfatbufferet saltvand (PBS) for at fjerne spor af mediet.
- Efter trypsinisering hæmmes trypsinen ved at tilsætte kulturmediet og høste cellerne i centrifugerør. Centrifuger cellerne, og resuspenderer cellepelleten i et frisk dyrkningsmedium. Tæl cellerne og suspender dem i et cellekulturmedium i den ønskede koncentration.
BEMÆRK: Det er også muligt at producere 3D-cellekulturer, dvs. sfæroider ved hjælp af for eksempel hængende dråbemetode21.
- Implanter 1 x 10 5-1 x 106 tumorceller eller5-15 sfæroider (pr. CAM) i 30 μL cellemediumopløsning i silikoneringen oven på CAM.
BEMÆRK: Lydstyrken afhænger af størrelsen på den anvendte silikonering. Hvis der anvendes en silikonering med større diameter, er der brug for et større volumen for at dække hele området. Afhængigt af celletypen eller til forskellige typer eksperimenter kan forskellige cellekoncentrationer anvendes. Nogle gange bruges finskrabning af CAM til at forbedre vedhæftningen af de indlejrede celler. - Returner CAM'erne med podede celler til inkubatoren (37 ° C og 80% -90% fugtighed).
Figur 3: Podning af CAM med tumorer . (A) Aspiration af sfæroider med en pipette og (B) implantation på CAM-overfladen. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Anvendelse af fotosensibilisator
- Anvendelse af hypericin
- Under svag belysning fremstilles en 2 mM stamopløsning af hypericin ved at opløse den i 100% dimethylsulfoxid (DMSO). Der fremstilles en 79 μM arbejdsopløsning af hypericin kort før forsøget med steril PBS- eller saltopløsning. Sørg for, at den endelige koncentration af DMSO i alle opløsninger altid er under 0,2%, hvilket ikke påvirker embryonets udvikling.
- Under sterile forhold påføres et passende volumen hypericinopløsning på silikoningen. Et volumen på 30 μL er tilstrækkeligt til at fylde en ring med en diameter på 6 mm.
- Embryoner opbevares i en inkubator ved 37 °C og 80%-90% fugtighed. Hypericin i en vandig opløsning er fotoaktiv efter dets monomerisering i vævet, ca. 3 timer efter dets anvendelse på CAM.
- Anvendelse af hypericin med LDL, HDL eller nanopartikler som transportsystemer
BEMÆRK: Disse transportsystemer bruges til at forbedre indtrængen af hypericin i celler og cellestrukturer.- På grund af lysfølsomheden skal du udføre alle trin, herunder forberedelse af opløsninger, under svag belysning og opbevare opløsningerne i mørke.
- Formuleringerne af hypericin-LDL og hypericin-HDL fremstilles ved at blande passende mængder lipoproteiner og hypericinstamopløsninger i PBS i henhold til reference15. Koncentrationen af LDL eller HDL til hypericin er 20:115.
- Syntetisere polymernanopartikler ved levende kationisk ringåbningspolymerisation i henhold til referencer12,13. Koncentrationen af hypericin i polymernanopartikler med PBS justeres til 10 μM12,13.
5. PDD og PDT
- Udfør PDD
- Under sterile forhold påføres fotosensibilisator (hypericin, hypericinbelastede polymere nanopartikler eller hypericin med lipoproteinbærer) på CAM-overfladen, med eller uden tumorceller (ED 7-9).
- Belys CAM ved hjælp af violet excitationslys (specialfremstillet cirkulært LED-lys med 405 nm bølgelængde) og registrer fluorescensen af hypericin i CAM-væv og tumorceller med et digitalt kamera med tidsintervaller på 0, 1, 3, 5, 24 og 48 timer efter hypericinadministration.
- Hvis forskningen kræver et billede af CAM i hvidt lys, skal du registrere CAM før hypericinadministration og ved afslutningen af eksperimentet, kort før vævsfikseringen, da lyset påvirker fotoaktiveringen af hypericin.
- Evaluer fluorescensintensiteten ved hjælp af et billedbehandlings- og analyseprogram (f.eks. ImageJ22).
- Opdel RGB-billedkanaler i separate røde, grønne og blå billeder. Analyser billedet med rød intensitet i 8-bit form. Evaluer den røde intensitet fra området inde i ringen og tilnærme den som hypericinfluorescens. Få hele billedprofilplots (ved hjælp af ImageJ's Profile Plot-plugin) med forskellige tidsintervaller efter hypericinadministration (dvs. fra 0 timer, lige efter administration, op til 48 timer).
- Adfærd PDT
- Udfør PDT mindst 3 timer efter hypericin-applikation.
- Placer den optiske fiber over CAM'ens overflade, så laserstrålen dækker hele området i silikoneringen.
- Udfør in vivo-bestråling (1-2 min) med et 405 nm laserlys ved en fluenshastighed på 285 mW/cm2.
- Record CAM ved hjælp af hvidt lys og 405 nm fluorescerende lys før og efter fotodynamisk behandling (24 timer og 48 timer).
- Registrer fotoskader 24 timer og 48 timer efter PDT fra billederne taget i hvidt lys. Evaluer vaskulær skade med en semikvantitativ score16: 1 - ingen ødelæggelse; 2 - delvis lukning af kapillærer (diameter ≤10 μm) uden ødelæggelse af mellemstore eller større (diameter ≥50 μm) og mindre kar (diameter 10-50 μm); 3 - delvis lukning af mindre fartøjer med kapillærer, der forsvinder 4 - delvis lukning af større fartøjer med mindre fartøjer og kapillærer, der forsvinder; og 5 - total fototrombose, hvor de fleste af skibene forsvinder.
Figur 4: Behandling af CAM med laserlys. Dette billede blev taget til illustrative formål. For PDD eller PDT skal rummet være mørkt. Klik her for at se en større version af denne figur.
6. Forberedelse af CAM til yderligere evaluering
- Paraffin indlejring
- Fastgør CAM-vævet i en dyrkningsplade med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS i mindst 2 timer og højst natten over.
- Fjern PFA'en og skær forsigtigt en del af vævet i silikoneringen ud af CAM'en.
- Dehydrer straks CAM-vævet i stigende alkoholserier som følger. Anbring CAM-vævet i 70% ethanol i 3 min, eosinopløsning i 2 min (for lettere placering af vævet i paraffinblokken), 96% ethanol i 3 x 5 min (altid i en ny petriskål) og 100% ethanol i 5 min og xylen i 2 x 10 min.
- Ved hjælp af en spatel eller tynd børste overføres prøverne så hurtigt som muligt til den opløste paraffin i petriskåle (59 °C). Efter 24 timer skal du placere vævet i histologisk skimmel, fylde det med paraffinindlejringsmedium og lade det størkne i køleskabet. Skær den størknede CAM fra indlejringsmediet, vend den i bakken med 90°, fyld den igen med indlejringsmediet, og lad den størkne.
- Forbered 5-10 μm sektioner på et mikrotom til histopatologisk analyse for at bestemme PDT-induceret skade.
- Forberedelse af frosne CAM-sektioner til histologi
BEMÆRK: For nogle metoder, herunder histologi, er frosne sektioner fremstillet på kryostatmikrotom mere egnede. Følg nedenstående trin for at forberede de frosne CAM-sektioner.- Monter forsigtigt native eller 4% paraformaldehyd-fastgjort CAM på glasdiaset.
- Fyld indlejringsform til halvdelen med optimal skæretemperaturforbindelse (OCT) og frys i flydende nitrogen eller en blanding af tøris og ethanol.
- Efter frysning vippes og skubbes forsigtigt CAM fra glasrutsjebanen ned på toppen af det frosne OCT-medium. Anbring igen i formen, dæk med OCT-medium, og frys som i trin 6.2.2.
- Fraktal analyse af vagtler CAM
BEMÆRK: Vaskulaturændringer forårsaget af PDT kan vurderes ved at beregne fraktaldimensionskoefficienten19.- I det laminære flowskab overløb CAM i en dyrkningsplade med en forvarmet (37 °C) fikseringsopløsning af 4% paraformaldehyd og 2% glutaraldehyd i PBS.
- Fjern fikseringsopløsningen efter 48 timer. Adskil forsigtigt CAM fra embryoet med mikrosaks og en fin børste og vask det i PBS.
- Monter den vaskede CAM på et glasglas, og lad det langsomt tørre.
- Fotografer diaset ved hjælp af et digitalkamera og en transilluminator som en kilde til homogent hvidt lys.
- Behandl digitale billeder ved hjælp af ImageJ-software22. Til analysen skal du vælge et kvadratisk område (512 × 512 pixels) fra området med distale arterielle grene. Binarisere og skeletisere billederne og beregne fraktal dimensionskoefficienten (Df) efter de procedurer, der er beskrevet i reference31.
- Molekylær analyse af CAM-væv
- Til molekylær analyse adskilles omhyggeligt native CAM, fryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C.
- Bestem genekspression i henhold til standardprotokoller for RNA-isolering23, omvendt transkription i cDNA og kvantitativ PCR24.
Figur 5: CAM-væv til fraktal analyse. Efter PDT fastgøres CAM, monteres på et dias og tørres til fraktal analyse. Billedet blev taget i hvidt lys ved hjælp af en transilluminator. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lokaliseringen af tumoren på CAM-overfladen er vanskelig i hvidt lys. Fotosensibilisator (her hypericin), der anvendes i PDD, forventes at blive optaget selektivt af tumoren og hjælper med at visualisere tumoren. Tilsætningen af hypericin og brugen af fluorescerende lys (f.eks. 405 nm) viste tumorpositionen (pladecellecarcinom TE1) meget godt (figur 6A). Histologisk analyse viste vitale tumorceller, der invaderede sunde væv. Koncentriske strukturer af unormale pladeceller, ofte beskrevet i pladecellecarcinomvæv (keratinperler), var synlige (figur 6B). Væksten af tumoren blev ledsaget af ødem og membranfortykkelse.
Figur 6: Pladecellecarcinom TE1-tumor, der vokser på CAM-overfladen . (A) Billedet blev taget ved hjælp af hvidt lys (venstre) og 405 nm LED-lys (højre) med tilsætning af hypericin. Omfanget af tumorvækst er bedre visualiseret og defineret. (B) Tværsnit af tumoren, der vokser på CAM-overfladen, med metastaser (M, keratinperler) i CAM-vævet. Klik her for at se en større version af denne figur.
En fotosensibilisator og længere eksponering af vævet med fokuseret lys med høj intensitet anvendes i PDT. En sådan behandling påvirker CAM-vaskulaturen, forårsager trombose, lukning af større kar og forsvinden af mindre kar og kapillærer (figur 7). Det område, hvor behandlingen blev anvendt (inde i silikoneringen), blev påvirket, og der var en klar forskel i beholdertætheden inde i ringen og i det omkringliggende område.
Figur 7: Eksempel på ændringer i CAM-vaskulatur 24 timer efter PDT. Behandling med laser forårsagede forsvinden af de fleste kapillærer og sammenlignede kartætheden inden for og uden for behandlingsområdet i silikoneringen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Laserlyset, der blev brugt i PDT uden tilstedeværelse af fotosensibilisator, forårsagede ingen skade (figur 8, midterlinje, "kun bestråling"), der kan sammenlignes med kontrollen uden nogen behandling (figur 8, øverste linje, "kontrol"). Den nederste linje af billederne viser ændringer i hypericin fluorescens i tide, forårsaget af monomerisering af aggregeret hypericin10. PDT blev anvendt efter 3 timers inkubation med hypericin og 2 timer senere var der allerede synlige ændringer. Det hvide lysbillede taget 24 timer efter behandlingen viser omfattende skader på vaskulaturen.
Figur 8: Ændringer i fluorescensintensitet og CAM-vaskulaturtæthed efter hypericinadministration og laserbestråling (PDT). Billeder blev taget ved 0, 1, 3, 5 og 24 timer ved hjælp af 405 nm lys og hvidt lys. Den øverste linje af billeder svarer til kontrol uden behandling. Den midterste linje af billeder svarer kun til laserbestråling (dvs. uden hypericin); laserbestråling (2 min, 405 nm laserlys, fluenshastighed 285 mW/cm2) blev påført 3 timer efter administration af hypericin. Den nederste linje af billeder svarer til behandling med hypericin og laserbestråling (PDT); laserbestråling blev påført efter 3 timers inkubation med hypericin. Billederne viser tydeligt skader på CAM-vaskulaturen. Klik her for at se en større version af denne figur.
PDT påvirkede CAM-vævsstrukturen negativt. Histologisk analyse (figur 9) afslørede, at ubehandlet kontrol-CAM havde relativt jævn tykkelse; PDT-behandling fik imidlertid CAM til at blive tyndere og mere skrøbelig.
Figur 9: Histologisk analyse af kontrol- og PDT-behandlet CAM-væv . (A) Tværsnit af ubehandlet kontrol CAM. Tykkelsen af CAM er relativt jævn. (B) Tværsnit af CAM efter PDT-behandling. Sammenlignet med kontrollen er CAM tyndere og mere skrøbelig. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For en vellykket ex ovo-dyrkning er det vigtigt at følge protokollen ovenfor. Desuden, hvis æggene ikke åbnes omhyggeligt nok, eller der ikke er tilstrækkelig fugtighed under dyrkningen, klæber æggeblommesækken til skallen og brister ofte. Påbegyndelsen af en ex ovo-dyrkning på tidspunktet for ca. 60 timers æginkubation sikrer embryonernes høje overlevelsesrate, da de allerede er store nok til at overleve håndteringen. På de senere udviklingsstadier bliver CAM tyndere og klæber til æggeskallen, hvilket fører til membranbrud.
Fra inkubationsdag 7 og fremefter er embryonerne mindre følsomme over for agitation; CAM-zonen dækker næsten hele brøndens overflade og er klar til yderligere eksperimenter. Selvom de døde embryoner kan udgøre en risiko for infektion, med de rigtige arbejdsmetoder under mindst halvsterile forhold, påvirker de ikke de andre embryoner i live i 6-brøndspladen. Overlevelsesraten for vagtel ex ovo-embryoet i de nuværende forsøg var ca. 80%, hvilket er forholdsvis bedre end i kylling ex ovo-forsøg 25,26,27.
I de nuværende eksperimenter blev en silikonering brugt til at afgrænse arbejdsområdet. Indtil nu er der ingen beviser for, at ringene alene har nogen effekt på CAM-vævets udvikling, vækst eller angiogenese28. Kohli et al. testede brugen af biomaterialer af forskellige strukturer og sammensætninger i en kylling CAM-model , og blodkar blev observeret i alle de testede stilladser undtagen silikone, hvor der ikke blev observeret blodkar for at infiltrere det29. Kun skødesløs håndtering af ringen kan forårsage blødning af CAM og sænke embryonernes overlevelse.
På grund af dets egenskaber repræsenterer denne CAM-model et levedygtigt, økonomisk fordelagtigt alternativ til forsøgsdyr, såsom mus, rotter eller kaniner, især til observation af vaskulaturændring under PDT30. Det er også velegnet til overvågning af genekspressionsændringer og vævsændringer på det histologiske niveau24. Denne naturligt immundefekte model har et rigt og let synligt vaskulært netværk, der muliggør visualisering i realtid af assays13,31.
Vagtel æggeskal er let at åbne, og ex ovo dyrkning er enkel og kræver mindre plads til opbevaring30. Udviklingen af et vagtelembryo er kort og tillader en høj omsætning af eksperimenter. Denne hurtige udvikling kan dog være en ulempe i forsøg, der kræver mere tid (f.eks. til tumorudvikling og vækst), da forsøgsvinduet maksimalt er 7 dage. Blandt andre ulemper ved at bruge vagtler er embryonets mere delikate forfatning og dets følsomhed over for forurening. Den lille størrelse af vagtel CAM begrænser anvendelsen af flere forsøgsstoffer10.
Billeder i hvidt lys kan vise større og veldefinerede tumorer ganske godt, men fluorescensbilleddannelse er et meget attraktivt værktøj til sygdomsdetektion, især for meget små tumorer eller tumorcelleklynger32, muligvis for at visualisere læsionens kanter. En højere ophobning af fotosensibilisatorer observeres i tumorområdet, så fotodynamisk diagnostik er meget nyttig i tidlig lokalisering eller under kirurgisk fjernelse. Optiske filtre bruges også til at få billedet korrekt32; I den foreliggende sag er billederne imidlertid taget uden særlige filtre. Anvendelsen af sådan billeddannelse (uden bloksystem) er for eksempel i endoskopi og PDD af urinblæretumorer og gliomer, så det har en passende klinisk anvendelse.
På trods af nogle ulemper er det japanske vagtel CAM-assay et godt værktøj til ny lægemiddelprøvning og udvikling af nye biofotoniske teknikker samt fotodynamisk diagnose og terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af VEGA 2/0042/21 og APVV 20-0129. V. Huntošovás bidrag er resultatet af projektgennemførelsen: Åbent videnskabeligt fællesskab for moderne tværfaglig forskning inden for medicin (akronym: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 støttet af det operationelle programs integrerede infrastruktur, finansieret af EFRU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
| CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
| digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
| diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
| eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| incubator Bios Midi | Bios Sedl any, Czech Republic |
Forced draught incubator for initial incubation | |
| incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
| Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
| LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
| macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
| microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
| microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
| scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
| software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
| stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
| stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |
References
- Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
- van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation. Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).
- Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R.
- De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).
- Sandau, K., Kurz, H. Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis. Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).
- Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marmé, D., Christ, B. Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application. Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).
- Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model. Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).
- Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).
- Miškovský, P. Hypericin - a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules. Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).
- Čavarga, I., et al. Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model. Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).
- Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro. Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).
- Datta, S., et al. Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery. Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).
- Huntošová, V., et al. Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin. Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).
- Buríková, M., et al. Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery. General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).
- Lenkavska, L., et al. Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).
- Rück, A., Böhmler, A., Steiner, R. PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).
- Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).
- Buzzá, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).
- Dougherty, T. J., et al.
- Xiang, L., et al. Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J.
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Máčajová, M., Čavarga, I., Sýkorová, M., Valachovič, M., Novotná, V., Bilčík, B. Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model. Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).
- Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials. ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).
- Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).
- Merlos Rodrigo, M. A., et al. Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells. Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).
- Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica). Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).
- Kohli, N., et al. Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications. Biology-Basel. 10 (4), 301 (2021).
- Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).
- Buzzá, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., Gómez-García, P. B., Kurachi, C. Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).
