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Cancer Research

बटेर कोरियोलैंटोइक झिल्ली - फोटोडायनामिक निदान और चिकित्सा के लिए एक उपकरण

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63422
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1Centre of Biosciences SAS, IABG, Bratislava, Slovakia, 2Center for Interdisciplinary Biosciences, University of Pavol Jozef Šafárik, Košice, Slovakia

Summary

एवियन भ्रूण का कोरियोलैंटोइक झिल्ली (सीएएम) अनुसंधान के विभिन्न क्षेत्रों के लिए एक बहुत ही उपयोगी और लागू उपकरण है। जापानी बटेर सीएएम का एक विशेष एक्स ओवो मॉडल फोटोडायनामिक उपचार जांच के लिए उपयुक्त है।

Abstract

एक एवियन भ्रूण का कोरियोलैंटोइक झिल्ली (सीएएम) एक पतली, एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक झिल्ली है जो प्राथमिक श्वसन अंग के रूप में कार्य करती है। इसके गुण एंजियोजेनेसिस, ट्यूमर विकास, दवा वितरण प्रणाली, या फोटोडायनामिक निदान (पीडीडी) और फोटोडायनामिक थेरेपी (पीडीटी) का अध्ययन करने के लिए विवो प्रयोगात्मक मॉडल में एक उत्कृष्ट बनाते हैं। इसी समय, यह मॉडल एक उपयुक्त विकल्प के साथ प्रयोगात्मक जानवरों के प्रतिस्थापन की आवश्यकता को संबोधित करता है। एक्स ओवो खेती भ्रूण आसान पदार्थ अनुप्रयोग, पहुंच, निगरानी और प्रलेखन की अनुमति देता है। सबसे अधिक बार इस्तेमाल किया जाता है चिक सीएएम; हालाँकि, यह लेख जापानी बटेर सीएएम के फायदों को कम लागत और उच्च-थ्रूपुट मॉडल के रूप में वर्णित करता है। एक और लाभ छोटा भ्रूण विकास है, जो उच्च प्रयोगात्मक कारोबार की अनुमति देता है। कैंसर और माइक्रोबियल संक्रमण के पीडीडी और पीडीटी के लिए बटेर सीएएम की उपयुक्तता का पता यहां लगाया गया है। एक उदाहरण के रूप में, वितरण प्रणाली के रूप में लिपोप्रोटीन या नैनोकणों के साथ संयोजन में फोटोसेंसिटाइज़र हाइपरिसिन का उपयोग वर्णित है। सफेद प्रकाश में छवियों से क्षति स्कोर और बैंगनी प्रकाश (405 एनएम) के तहत सीएएम ऊतक की प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन हिस्टोलॉजिकल वर्गों के विश्लेषण के साथ निर्धारित किया गया था। बटेर सीएएम ने स्पष्ट रूप से वाहिका और ऊतक पर पीडीटी के प्रभाव को दिखाया। इसके अलावा, केशिका रक्तस्राव, घनास्त्रता, छोटी वाहिकाओं का लाइसिस और बड़ी वाहिकाओं के रक्तस्राव जैसे परिवर्तन देखे जा सकते हैं। जापानी बटेर सीएएम फोटोडायनामिक निदान और चिकित्सा अनुसंधान के लिए विवो मॉडल में एक आशाजनक है, जिसमें ट्यूमर एंजियोजेनेसिस के अध्ययन के साथ-साथ एंटीवास्कुलर और रोगाणुरोधी चिकित्सा के अनुप्रयोग हैं।

Introduction

चिकन कोरिओलैंटोइक झिल्ली (सीएएम) मॉडल अच्छी तरह से जाना जाता है और अनुसंधान के विभिन्न क्षेत्रों में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। यह एक समृद्ध संवहनी एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक अंग है जो गैस विनिमय और खनिज परिवहन प्रदान करता है। इस झिल्ली की पारदर्शिता और पहुंच के कारण, व्यक्तिगत रक्त वाहिकाओं और उनके संरचनात्मक परिवर्तनों को वास्तविक समय में देखा जा सकताहै। फायदों के बावजूद, चिक सीएएम की कुछ सीमाएं भी हैं (जैसे, बड़ी प्रजनन सुविधाएं, अंडे का उत्पादन, और फ़ीड की खपत) जिन्हें अन्य एवियन प्रजातियों का उपयोग करके टाला जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, जापानी बटेर (कोटरनिक्स जैपोनिका) भ्रूण का उपयोग करके एक वैकल्पिक एक्स ओवो सीएएम मॉडल का वर्णन किया गया है। अपने छोटे आकार के कारण, यह चिकन सीएएम की तुलना में प्रयोगात्मक व्यक्तियों की बहुत बड़ी संख्या के उपयोग की अनुमति देता है। इसके अलावा, बटेर भ्रूण का छोटा 16-दिवसीय भ्रूण विकास एक और लाभ है। बटेर सीएएम पर पहले बड़े जहाज भ्रूण दिवस (ईडी) 7 पर दिखाई देते हैं। इसकी तुलना सीधे चूजे के भ्रूण के विकास (चरण 4-35) के साथ की जा सकती है; हालांकि, विकास के बाद के चरण अब तुलनीय नहीं हैं और बटेर भ्रूण 3 के लिए कम समय की आवश्यकता होतीहै। दिलचस्पी चिकन सीएएम 4,5,6 के समान माइक्रोवैस्कुलर शाखाओं की नियमित घटना है। तेजी से यौन परिपक्वता, उच्च अंडा उत्पादन, और कम लागत वाले प्रजनन अन्य उदाहरण हैं जो इस प्रयोगात्मक मॉडल7 के उपयोग का पक्ष लेते हैं।

एक एवियन सीएएम मॉडल का उपयोग अक्सर फोटोडायनामिक थेरेपी (पीडीटी) अध्ययनमें किया जाता है। पीडीटी का उपयोग कैंसर के कई रूपों (छोटे स्थानीय ट्यूमर) और अन्य गैर-ऑन्कोलॉजिकल रोगों के इलाज के लिए किया जाता है। इसका सिद्धांत एक फ्लोरोसेंट दवा, एक फोटोसेंसिटाइज़र (पीएस) के वितरण में है, क्षतिग्रस्त ऊतक को और उचित तरंग दैर्ध्य के प्रकाश के साथ इसकी सक्रियता। अनुसंधान में उपयोग किया जाने वाला एक संभावित पीएस हाइपरिसिन है, जो मूल रूप से औषधीय पौधे सेंट जॉन पौधा (हाइपरिकम परफोराटम) 9 से अलग है। इस यौगिक के मजबूत फोटोसेंसिटाइजिंग प्रभाव इसके फोटोकैमिकल और फोटोफिजिकल गुणों पर आधारित हैं। इन्हें 400-600 एनएम रेंज में कई फ्लोरेसेंस उत्तेजना चोटियों की विशेषता है, जो लगभग 600 एनएम पर प्रतिदीप्ति के उत्सर्जन को प्रेरित करते हैं। वर्णक्रमीय बैंड के भीतर हाइपरिसिन का अवशोषण मैक्सिमा 540-590 एनएम रेंज में है, और फ्लोरेसेंस मैक्सिमा 590-640 एनएम रेंज9 में है। इन फोटोसेंसिटाइजिंग प्रभावों को प्राप्त करने के लिए, हाइपरिसिन स्थानीय प्रशासन10 के बाद 405 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर लेजर प्रकाश द्वारा उत्तेजित होता है। प्रकाश की उपस्थिति में, हाइपरिसिन विरुसाइडल, एंटीप्रोलिफेरेटिव और साइटोटॉक्सिक प्रभाव11 प्रदर्शित कर सकता है, जबकि कोई प्रणालीगत विषाक्तता नहीं है, और यह जीव से तेजी से जारी होता है। हाइपरिसिन एक लिपोफिलिक पदार्थ है जो पानी-अघुलनशील, गैर-फ्लोरोसेंट समुच्चय बनाता है, यही कारण है कि कई प्रकार के नैनोकैरियर, जैसे बहुलक नैनोकणों 12,13 या उच्च और निम्न घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एचडीएल, एलडीएल) 14,15, का उपयोग कोशिकाओं में इसके वितरण और प्रवेश में मदद करने के लिए किया जाता है। चूंकि सीएएम एक स्वाभाविक रूप से इम्यूनोडेफिशिएंट सिस्टम है, ट्यूमर कोशिकाओं को सीधे झिल्ली की सतह पर प्रत्यारोपित किया जा सकता है। मॉडल एक परिभाषित स्कोर16,17 के अनुसार पीडीटी-प्रेरित संवहनी क्षति की सीमा को रिकॉर्ड करने के लिए भी उपयुक्त है। पीडीटी की तुलना में कम तीव्रता के प्रकाश का उपयोग फोटोडायनामिक निदान (पीडीडी) के लिए किया जा सकता है। बैंगनी उत्तेजना एलईडी प्रकाश के तहत ऊतक की निगरानी से फोटोसेंसिटाइज़र18,19,20 का फोटोएक्टिवेशन भी होता है जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट प्रकाश का उत्सर्जन होता है, फिर भी यह पीडीटी प्रतिक्रिया शुरू करने और कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने के लिए पर्याप्त ऊर्जा प्रदान नहीं करता है। यह ट्यूमर विज़ुअलाइज़ेशन और निदान या प्रयुक्त पीएसएस14,15 के फार्माकोकाइनेटिक्स की निगरानी के लिए एक अच्छा उपकरण बनाता है।

यह लेख 80% से अधिक जीवित रहने की दर के साथ बटेर एक्स ओवो सीएएम परख की तैयारी का वर्णन करता है। इस एक्स ओवो संस्कृति को बड़ी संख्या में प्रयोगों में सफलतापूर्वक लागू किया गया था।

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Protocol

अनुसंधान संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में किया गया था। सभी उपकरणों और अभिकर्मकों को 70% इथेनॉल या यूवी प्रकाश के साथ आटोक्लेव या निष्फल किया जाना चाहिए।

1. अंडे की इनक्यूबेशन

  1. इनक्यूबेशन शुरू करने से पहले अधिकतम 4-5 दिनों के लिए 10-15 डिग्री सेल्सियस पर निषेचित बटेर अंडे स्टोर करें। केवल साफ और बिना क्षतिग्रस्त अंडे का उपयोग करें।
  2. अंडे को एक मजबूर ड्राफ्ट इनक्यूबेटर में ~ 53-54 घंटे के लिए सेनें। अंडे को क्षैतिज रूप से 50% -60% आर्द्रता और 37.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेशन तापमान पर बंद करके रखें।

2. पूर्व ओवो संस्कृति तैयारी

नोट: प्रारंभिक इनक्यूबेशन के बाद, अंडे एक्स ओवो खेती शुरू करने के लिए उपयुक्त हैं।

  1. अंडे को घुमाए बिना, 70% इथेनॉल के साथ अंडे की सतह को कीटाणुरहित करें।
  2. एक बाँझ लैमिनार-प्रवाह कैबिनेट में, छोटे बाँझ सर्जिकल कैंची का उपयोग करके अंडे के छिलके को खोलें और सामग्री को 6-वेल कल्चर प्लेट में स्थानांतरित करें। यदि ठीक से किया जाता है, तो भ्रूण एक क्षतिग्रस्त जर्दी के ऊपर होगा। प्रत्येक अंडे के बाद, कैंची को 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित करें।
  3. 6-वेल प्लेट में अंतराल में लगभग 5 एमएल बाँझ पानी जोड़ें, क्योंकि सीएएम को सूखने से रोकने के लिए आर्द्रता आवश्यक है।
  4. भ्रूण को आगे के प्रयोगों तक एक इनक्यूबेटर में रखें, जबकि 37 डिग्री सेल्सियस और 80% -90% आर्द्रता का तापमान बनाए रखें।
  5. जब सीएएम पूरी तरह से विकसित हो जाता है (ईडी 7 से), तो छोटी केशिकाओं के साथ सीएएम सतह पर एक निष्फल सिलिकॉन रिंग (व्यास में 6 मिमी और मोटाई में लगभग 1.5 मिमी) रखें। अंगूठी रखते समय प्रमुख रक्त वाहिकाओं से बचें।
    नोट: अंगूठी कार्यस्थान को परिभाषित करती है, पदार्थ अनुप्रयोग के स्थान को चिह्नित करने में मदद करती है, और तरल सामग्री को लीक होने से रोकती है।
  6. देश के कानून के अनुसार भ्रूण की खेती को समाप्त करें।
  7. महत्वपूर्ण रूप से, दस्ताने पहनें या काम के दौरान 70% इथेनॉल के साथ हाथों को कीटाणुरहित रखें। एस्पिरेटेड ने वैक्यूम एस्पाइरेटर के साथ अनुचित रूप से भ्रूण या अनफर्टिलाइज्ड अंडे को डुबोया।

Figure 1
चित्र 1: पूर्व ओवो संस्कृति तैयारी। (ए) जापानी बटेर अंडे क्योंकि उन्हें संग्रहीत और सेने के लिए कहा जाता है। (बी) इथेनॉल के साथ अंडे की सतह कीटाणुशोधन। (सी) अंडे के छिलके को कैंची से काटा जाता है। (डी) अंडे की सामग्री कुएं में खाली हो जाती है। (ई) सीएएम वास्कुलचर के विकास के साथ ठीक से तैयार 3 दिन पुराना भ्रूण। (एफ) कल्चर प्लेटों को इनक्यूबेटर में संग्रहीत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: शीर्ष पर रखे गए भ्रूण और सिलिकॉन छल्ले के साथ 6-वेल कल्चर प्लेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. ट्यूमर कोशिकाओं का टीकाकरण

नोट: सभी प्रक्रियाओं को बाँझ लामिनार प्रवाह कैबिनेट के उपयोग की आवश्यकता होती है।

  1. संबंधित संस्कृति प्रोटोकॉल के अनुसार फ्लास्क में विभिन्न प्रकार के अनुयायी कोशिकाओं को कल्चर करें।
    1. फ्लास्क से पुराने माध्यम को हटा दें और माध्यम के निशान को हटाने के लिए बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ सेल परत को कुल्ला करें।
    2. ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद, कल्चर माध्यम को जोड़कर ट्रिप्सिन को रोकें और कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में काट लें। कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और सेल पेलेट को एक ताजा संस्कृति माध्यम में पुन: निलंबित करें। कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें वांछित एकाग्रता पर सेल कल्चर माध्यम में पुन: निलंबित करें।
      नोट: 3 डी सेल संस्कृतियों का उत्पादन करना भी संभव है, यानी, स्फेरॉइड का उपयोग करके, उदाहरण के लिए, हैंगिंग ड्रॉप विधि21।
  2. सीएएम के शीर्ष पर सिलिकॉन रिंग में सेल माध्यम समाधान के 30 μL में 1 x 10 5-1 x 106 ट्यूमर कोशिकाओं या 5-15 स्फेरॉइड (प्रति सीएएम) प्रत्यारोपित करें।
    नोट: मात्रा उपयोग की गई सिलिकॉन रिंग के आकार पर निर्भर करती है। यदि एक बड़े व्यास के साथ एक सिलिकॉन रिंग का उपयोग किया जाता है, तो पूरे क्षेत्र को कवर करने के लिए एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है। सेल प्रकार के आधार पर, या विभिन्न प्रकार के प्रयोगों के लिए, विभिन्न सेल सांद्रता का उपयोग किया जा सकता है। कभी-कभी, एम्बेडेड कोशिकाओं के आसंजन में सुधार के लिए सीएएम के ठीक स्क्रैपिंग का उपयोग किया जाता है।
  3. इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 80% -90% आर्द्रता) को टीका कोशिकाओं के साथ सीएएम वापस करें।

Figure 3
चित्र 3: ट्यूमर के साथ सीएएम का टीकाकरण। (ए) पिपेट के साथ स्फेरॉइड की आकांक्षा, और (बी) सीएएम सतह पर आरोपण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. फोटोसेंसिटाइज़र का अनुप्रयोग

  1. हाइपरिसिन का अनुप्रयोग
    1. मंद प्रकाश व्यवस्था के तहत, हाइपरिसिन का 2 एमएम स्टॉक समाधान तैयार करें, इसे 100% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में भंग करके। बाँझ पीबीएस या खारा समाधान के साथ प्रयोग से कुछ समय पहले हाइपरिसिन का 79 μM कार्यशील समाधान तैयार करें। सुनिश्चित करें कि सभी समाधानों में डीएमएसओ की अंतिम एकाग्रता हमेशा 0.2% से कम है, जो भ्रूण के विकास को प्रभावित नहीं करती है।
    2. बाँझ स्थितियों के तहत, सिलिकॉन रिंग में हाइपरिसिन समाधान की उचित मात्रा लागू करें। 6 मिमी के व्यास वाली अंगूठी को भरने के लिए 30 μL की मात्रा पर्याप्त है।
    3. भ्रूण को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 80% -90% आर्द्रता पर रखें। एक जलीय घोल में हाइपरिसिन ऊतक में इसके मोनोमराइजेशन के बाद फोटोएक्टिव होता है, सीएएम पर इसके आवेदन के लगभग 3 घंटे बाद।
  2. परिवहन प्रणालियों के रूप में एलडीएल, एचडीएल, या नैनोकणों के साथ हाइपरिसिन का अनुप्रयोग
    नोट: इन परिवहन प्रणालियों का उपयोग कोशिकाओं और सेल संरचनाओं में हाइपरिसिन के प्रवेश में सुधार करने के लिए किया जाता है।
    1. फोटोसेंसिटिविटी के कारण, मंद प्रकाश व्यवस्था के तहत समाधान तैयार करने सहित सभी चरणों का प्रदर्शन करें और समाधानों को अंधेरे में स्टोर करें।
    2. संदर्भ15 के अनुसार पीबीएस में लिपोप्रोटीन और हाइपरिसिन स्टॉक समाधानों की उचित मात्रा को मिलाकर हाइपरिसिन-एलडीएल और हाइपरिसिन-एचडीएल फॉर्मूलेशन तैयार करें। हाइपरिसिन के लिए एलडीएल या एचडीएल की एकाग्रता 20: 115 है।
    3. संदर्भ12,13 के अनुसार जीवित धनिक रिंग-ओपनिंग पोलीमराइजेशन द्वारा बहुलक नैनोकणों को संश्लेषित करें। पीबीएस के साथ बहुलक नैनोकणों में हाइपरिसिन की एकाग्रता को 10 μM12,13 तक समायोजित करें।

5. पीडीडी और पीडीटी

  1. पीडीडी का संचालन करें
    1. बाँझ परिस्थितियों में, ट्यूमर कोशिकाओं के साथ या बिना सीएएम सतह पर फोटोसेंसिटाइज़र (हाइपरिसिन, हाइपरिसिन-लोडेड पॉलिमरिक नैनोकणों, या लिपोप्रोटीन वाहक के साथ हाइपरिसिन) लागू करें (ईडी 7-9)।
    2. वायलेट उत्तेजना प्रकाश (405 एनएम तरंगदैर्ध्य के कस्टम-निर्मित परिपत्र एलईडी प्रकाश) का उपयोग करके सीएएम को रोशन करें और हाइपरिसिन प्रशासन के बाद 0, 1, 3, 5, 24 और 48 घंटे के समय अंतराल पर डिजिटल कैमरे के साथ सीएएम ऊतक और ट्यूमर कोशिकाओं में हाइपरिसिन की प्रतिदीप्ति रिकॉर्ड करें।
    3. यदि शोध के लिए सफेद प्रकाश में सीएएम की छवि की आवश्यकता होती है, तो हाइपरिसिन प्रशासन से पहले और प्रयोग के अंत में, ऊतक निर्धारण से कुछ समय पहले सीएएम रिकॉर्ड करें, क्योंकि प्रकाश हाइपरिसिन के फोटोएक्टिवेशन को प्रभावित करता है।
    4. एक छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण कार्यक्रम (जैसे, इमेजजे22) का उपयोग करके प्रतिदीप्ति तीव्रता का मूल्यांकन करें।
      1. आरजीबी छवि चैनलों को अलग-अलग लाल, हरे और नीले चित्रों में विभाजित करें। 8-बिट रूप में लाल तीव्रता छवि का विश्लेषण करें। रिंग के अंदर के क्षेत्र से लाल तीव्रता का मूल्यांकन करें और इसे हाइपरिसिन फ्लोरेसेंस के रूप में अनुमानित करें। हाइपरिसिन प्रशासन के बाद अलग-अलग समय अंतराल पर पूरे छवि प्रोफ़ाइल प्लॉट (इमेजजे के प्रोफाइल प्लॉट प्लगइन का उपयोग करके) प्राप्त करें (यानी, 0 घंटे से, प्रशासन के ठीक बाद, 48 घंटे तक)।
  2. पीडीटी का संचालन करें
    1. हाइपरिसिन आवेदन के कम से कम 3 घंटे बाद पीडीटी करें।
    2. सिलिकॉन रिंग के भीतर पूरे क्षेत्र को कवर करने के लिए लेजर किरण के लिए सीएएम की सतह के ऊपर ऑप्टिकल फाइबर रखें।
    3. 285 mW / cm2 की समृद्धि दर पर 405 nm लेजर प्रकाश के साथ विवो विकिरण (1-2 मिनट) में प्रदर्शन करें।
    4. फोटोडायनामिक उपचार (24 घंटे और 48 घंटे) से पहले और बाद में सफेद प्रकाश और 405 एनएम फ्लोरोसेंट लाइट का उपयोग करके सीएएम रिकॉर्ड करें।
    5. सफेद रोशनी में ली गई छवियों से पीडीटी के 24 घंटे और 48 घंटे बाद फोटोडैमेज का पता लगाएं। एक अर्धमात्रात्मक स्कोर16: 1 द्वारा संवहनी क्षति का मूल्यांकन करें - कोई विनाश नहीं; 2 - केशिकाओं का आंशिक बंद होना (व्यास ≤10 μm) जिसमें मध्यम या बड़े (व्यास ≥50 μm) और छोटे जहाजों (व्यास 10-50 μm) का कोई विनाश नहीं होता है; 3 - केशिकाओं के गायब होने के साथ छोटे जहाजों का आंशिक रूप से बंद होना; 4 - छोटे जहाजों और केशिकाओं के गायब होने वाले बड़े जहाजों का आंशिक रूप से बंद होना; और 5 - अधिकांश वाहिकाओं के गायब होने के साथ कुल फोटो थ्रोम्बोसिस।

Figure 4
चित्रा 4: लेजर प्रकाश के साथ सीएएम का उपचार। यह तस्वीर उदाहरण के उद्देश्यों के लिए ली गई थी। पीडीडी या पीडीटी के लिए, कमरे में अंधेरा होना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

6. आगे के मूल्यांकन के लिए सीएएम तैयार करना

  1. पैराफिन एम्बेडिंग
    1. पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ एक खेती प्लेट में सीएएम ऊतक को कम से कम 2 घंटे और अधिकतम रात भर के लिए ठीक करें।
    2. पीएफए को हटा दें और सावधानीपूर्वक सीएएम से सिलिकॉन रिंग के भीतर ऊतक का एक हिस्सा काट लें।
    3. आरोही अल्कोहल श्रृंखला में सीएएम ऊतक को तुरंत निर्जलित करें। सीएएम ऊतक को 3 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में रखें, 2 मिनट के लिए ईओसिन समाधान (पैराफिन ब्लॉक में ऊतक के आसान स्थान के लिए), 3 x 5 मिनट के लिए 96% इथेनॉल (हमेशा एक नई पेट्री डिश में), और 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल और 2 x 10 मिनट के लिए जाइलीन।
    4. स्पैटुला या पतले ब्रश का उपयोग करके, नमूनों को पेट्री व्यंजन (59 डिग्री सेल्सियस) में घुलित पैराफिन में जितनी जल्दी हो सके स्थानांतरित करें। 24 घंटे के बाद, ऊतक को हिस्टोलॉजिकल मोल्ड में रखें, इसे पैराफिन एम्बेडिंग माध्यम से भरें, और इसे रेफ्रिजरेटर में जमने दें। एम्बेडिंग माध्यम से ठोस सीएएम को काटें, इसे ट्रे में 90 ° तक घुमाएं, इसे एम्बेडिंग माध्यम के साथ फिर से भरें, और इसे जमने दें।
    5. पीडीटी-प्रेरित क्षति का निर्धारण करने के लिए हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण के लिए एक माइक्रोटोम पर 5-10 μm अनुभाग तैयार करें।
  2. हिस्टोलॉजी के लिए जमे हुए सीएएम अनुभागों की तैयारी
    नोट: हिस्टोलॉजी सहित कुछ पद्धतियों के लिए, क्रायोस्टैट माइक्रोटोम पर तैयार जमे हुए खंड अधिक उपयुक्त हैं। जमे हुए सीएएम अनुभागों को तैयार करने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. ग्लास स्लाइड पर देशी या 4% पैराफॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड सीएएम को सावधानीपूर्वक माउंट करें।
    2. इष्टतम काटने के तापमान यौगिक (ओसीटी) के साथ आधे से एम्बेडिंग मोल्ड भरें और तरल नाइट्रोजन या सूखी बर्फ और इथेनॉल के मिश्रण में फ्रीज करें।
    3. ठंड के बाद, ग्लास स्लाइड से सीएएम को सावधानीपूर्वक झुकाएं और जमे हुए ओसीटी माध्यम के शीर्ष पर स्लाइड करें। मोल्ड में फिर से रखें, ओसीटी माध्यम के साथ कवर करें, और चरण 6.2.2 के अनुसार फ्रीज करें।
  3. बटेर सीएएम का फ्रैक्टल विश्लेषण
    नोट: पीडीटी के कारण वाहिका परिवर्तन का मूल्यांकन फ्रैक्टल आयाम गुणांक19 की गणना करके किया जा सकता है।
    1. लैमिनार फ्लो कैबिनेट में, पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड और 2% ग्लूटारल्डिहाइड के पूर्व-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) निर्धारण समाधान के साथ एक खेती प्लेट में अतिप्रवाह सीएएम।
    2. 48 घंटे के बाद निर्धारण समाधान को हटा दें। सावधानीपूर्वक सीएएम को माइक्रो-कैंची और एक महीन ब्रश के साथ भ्रूण से अलग करें और इसे पीबीएस में धोएं।
    3. एक ग्लास स्लाइड पर धोए गए सीएएम को माउंट करें और इसे धीरे-धीरे सूखने दें।
    4. समरूप सफेद प्रकाश के स्रोत के रूप में एक डिजिटल कैमरा और एक ट्रांसिलुमिनेटर का उपयोग करके स्लाइड की तस्वीर लें।
    5. ImageJ सॉफ्टवेयर 22 का उपयोग कर डिजिटल छवियों कोसंसाधित करें। विश्लेषण के लिए, डिस्टल धमनी शाखाओं वाले क्षेत्र से एक वर्ग क्षेत्र (512 × 512 पिक्सेल) का चयन करें। छवियों को बिनाराइज और स्केलेटनाइज़ करें और संदर्भ31 में वर्णित प्रक्रियाओं का पालन करते हुए फ्रैक्टल आयाम गुणांक (डीएफ) की गणना करें।
  4. सीएएम ऊतक का आणविक विश्लेषण
    1. आणविक विश्लेषण के लिए, सावधानीपूर्वक देशी सीएएम को अलग करें, तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. आरएनए अलगाव23, सीडीएनए में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और मात्रात्मक पीसीआर24 के लिए मानक प्रोटोकॉल के अनुसार जीन अभिव्यक्ति निर्धारित करें।

Figure 5
चित्रा 5: फ्रैक्टल विश्लेषण के लिए सीएएम ऊतक। पीडीटी के बाद, सीएएम को तय किया जाता है, एक स्लाइड पर रखा जाता है, और फ्रैक्टल विश्लेषण के लिए सुखाया जाता है। तस्वीर को ट्रांसिल्युमिनेटर का उपयोग करके सफेद रोशनी में लिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

सीएएम सतह पर ट्यूमर का स्थानीयकरण सफेद प्रकाश में मुश्किल है। पीडीडी में उपयोग किए जाने वाले फोटोसेंसिटाइज़र (यहां, हाइपरिसिन) को ट्यूमर द्वारा चुनिंदा रूप से लेने की उम्मीद है और ट्यूमर की कल्पना करने में मदद करता है। हाइपरिसिन के अलावा और फ्लोरोसेंट लाइट (जैसे, 405 एनएम) के उपयोग ने ट्यूमर (स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा टीई 1) की स्थिति को बहुत अच्छी तरह से दिखाया (चित्रा 6 ए)। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण ने स्वस्थ ऊतकों पर आक्रमण करने वाले महत्वपूर्ण ट्यूमर कोशिकाओं को दिखाया। असामान्य स्क्वैमस कोशिकाओं की संकेंद्रित संरचनाएं, जिन्हें अक्सर स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा ऊतक (केराटिन मोती) में वर्णित किया जाता है, दिखाई दे रहे थे (चित्रा 6 बी)। ट्यूमर का विकास एडिमा और झिल्ली मोटा होने के साथ हुआ था।

Figure 6
चित्र 6: स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा टीई 1 ट्यूमर सीएएम सतह पर बढ़ रहा है। (ए) छवि को हाइपरिसिन के अलावा सफेद प्रकाश (बाएं) और 405 एनएम एलईडी प्रकाश (दाएं) का उपयोग करके लिया गया था। ट्यूमर के विकास की सीमा बेहतर कल्पना और परिभाषित है। (बी) सीएएम ऊतक में मेटास्टेस (एम, केराटिन मोती) के साथ सीएएम सतह पर बढ़ने वाले ट्यूमर का क्रॉस-सेक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पीडीटी में उच्च तीव्रता के केंद्रित प्रकाश के साथ ऊतक के एक फोटोसेंसिटाइज़र और लंबे समय तक संपर्क का उपयोग किया जाता है। इस तरह के उपचार सीएएम वाहिका को प्रभावित करते हैं, जिससे घनास्त्रता, बड़ी वाहिकाओं का बंद होना और छोटे वाहिकाओं और केशिकाओं का गायब होना पड़ता है (चित्रा 7)। वह क्षेत्र जहां उपचार लागू किया गया था (सिलिकॉन रिंग के अंदर) प्रभावित हुआ था, और अंगूठी के अंदर और आसपास के क्षेत्र में पोत घनत्व में स्पष्ट अंतर था।

Figure 7
चित्रा 7: पीडीटी के 24 घंटे बाद सीएएम वास्कुलचर में परिवर्तन का उदाहरण। लेजर के साथ उपचार ने अधिकांश केशिकाओं के गायब होने का कारण बना, सिलिकॉन रिंग में उपचार क्षेत्र के अंदर और बाहर पोत घनत्व की तुलना की। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फोटोसेंसिटाइज़र की उपस्थिति के बिना पीडीटी में उपयोग किए जाने वाले लेजर प्रकाश ने कोई नुकसान नहीं पहुंचाया (चित्रा 8, मध्य रेखा, "विकिरण केवल"), बिना किसी उपचार के नियंत्रण के बराबर (चित्रा 8, शीर्ष रेखा, "नियंत्रण")। छवियों की निचली पंक्ति समय में हाइपरिसिन फ्लोरेसेंस में परिवर्तन दिखाती है, जो एकत्रित हाइपरिसिन10 के मोनोमराइजेशन के कारण होती है। पीडीटी को हाइपरिसिन के साथ इनक्यूबेशन के 3 घंटे बाद लागू किया गया था और 2 घंटे बाद पहले से ही दिखाई देने वाले परिवर्तन थे। उपचार के 24 घंटे बाद ली गई सफेद प्रकाश छवि वाहिका को व्यापक नुकसान दिखाती है।

Figure 8
चित्रा 8: हाइपरिसिन प्रशासन और लेजर विकिरण (पीडीटी) के बाद प्रतिदीप्ति तीव्रता और सीएएम वाहिका घनत्व में परिवर्तन। छवियों को 405 एनएम प्रकाश और सफेद प्रकाश का उपयोग करके 0, 1, 3, 5 और 24 घंटे पर लिया गया था। छवियों की शीर्ष पंक्ति बिना किसी उपचार के नियंत्रण से मेल खाती है। छवियों की मध्य रेखा केवल लेजर विकिरण से मेल खाती है (यानी, हाइपरिसिन के बिना); हाइपरिसिन प्रशासन के 3 घंटे बाद लेजर विकिरण (2 मिनट, 405 एनएम लेजर प्रकाश, फ्लुएंस दर285 एमडब्ल्यू / सेमी 2) लागू किया गया था। छवियों की निचली रेखा हाइपरिसिन और लेजर विकिरण (पीडीटी) के साथ उपचार से मेल खाती है; हाइपरिसिन के साथ इनक्यूबेशन के 3 घंटे के बाद लेजर विकिरण लागू किया गया था। छवियां स्पष्ट रूप से सीएएम वाहिका को नुकसान दिखाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पीडीटी ने सीएएम ऊतक संरचना को नकारात्मक रूप से प्रभावित किया। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण (चित्रा 9) से पता चला है कि अनुपचारित नियंत्रण सीएएम में अपेक्षाकृत समान मोटाई थी; हालांकि, पीडीटी उपचार के कारण सीएएम पतला और अधिक नाजुक हो गया।

Figure 9
चित्रा 9: नियंत्रण और पीडीटी-उपचारित सीएएम ऊतकों का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण। सीएएम की मोटाई अपेक्षाकृत समान है। (बी) पीडीटी उपचार के बाद सीएएम का क्रॉस-सेक्शन। नियंत्रण की तुलना में, सीएएम पतला और अधिक नाजुक है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सफल एक्स ओवो खेती के लिए, ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल का पालन करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यदि अंडे को पर्याप्त सावधानी से नहीं खोला जाता है या खेती के दौरान अपर्याप्त आर्द्रता होती है, तो जर्दी की बोरी खोल से चिपक जाती है और अक्सर फट जाती है। लगभग 60 घंटे के अंडे की इनक्यूबेशन के समय एक एक्स ओवो खेती की शुरुआत भ्रूण की उच्च जीवित रहने की दर सुनिश्चित करती है, क्योंकि वे हैंडलिंग से बचने के लिए पहले से ही काफी बड़े हैं। बाद के विकास चरणों में, सीएएम पतला हो जाता है और अंडे के छिलके का पालन करता है, जिससे झिल्ली टूट जाती है।

इनक्यूबेशन दिन 7 से, भ्रूण आंदोलन के प्रति कम संवेदनशील होते हैं; सीएएम क्षेत्र कुएं की लगभग पूरी सतह को कवर करता है और आगे के प्रयोगों के लिए तैयार है। यद्यपि मृत भ्रूण संक्रमण के जोखिम का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, कम से कम अर्ध-बाँझ स्थितियों में सही कार्य विधियों के साथ, वे 6-वेल प्लेट में जीवित अन्य भ्रूणों को प्रभावित नहीं करते हैं। वर्तमान प्रयोगों में बटेर एक्स ओवो भ्रूण की जीवित रहने की दर लगभग 80% थी, जो चिकन एक्स ओवो प्रयोगों 25,26,27 की तुलना में तुलनात्मक रूप से बेहतर है।

वर्तमान प्रयोगों में, कार्यस्थान को सीमांकित करने के लिए एक सिलिकॉन रिंग का उपयोग किया गया था। अब तक, कोई सबूत उपलब्ध नहीं है कि अकेले छल्ले सीएएम ऊतक28 के विकास, विकास या एंजियोजेनेसिस पर कोई प्रभाव डालते हैं। कोहली एट अल ने चिकन सीएएम मॉडल में विभिन्न संरचनाओं और रचनाओं के बायोमैटेरियल्स के उपयोग का परीक्षण किया , और सिलिकॉन को छोड़कर सभी परीक्षण किए गए मचानों में रक्त वाहिकाओं को देखा गया,जहां इसमें घुसपैठ करने के लिए कोई रक्त वाहिकाएं नहीं देखी गईं। केवल अंगूठी की लापरवाह हैंडलिंग सीएएम के रक्तस्राव का कारण बन सकती है और भ्रूण के अस्तित्व को कम कर सकती है।

इसके गुणों के कारण, यह सीएएम मॉडल प्रयोगशाला जानवरों, जैसे चूहों, चूहों या खरगोशों के लिए एक व्यवहार्य, आर्थिक रूप से लाभप्रद विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है, विशेष रूप से पीडीटी30 के दौरान वाहिका परिवर्तन को देखने के लिए। यह हिस्टोलॉजिकल स्तर24 पर जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन और ऊतक परिवर्तन की निगरानी के लिए भी उपयुक्त है। इस स्वाभाविक रूप से इम्यूनोडेफिशिएंट मॉडल में एक समृद्ध और आसानी से दिखाई देने वाला संवहनी नेटवर्क है जोपरख 13,31 के वास्तविक समय के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है।

बटेर अंडे के छिलके को खोलना आसान है, और एक्स ओवो खेती सरल है और भंडारण के लिए कम जगह की आवश्यकता होतीहै। बटेर भ्रूण का विकास छोटा है और प्रयोगों के उच्च कारोबार की अनुमति देता है। यह तेजी से विकास, हालांकि, अधिक समय की आवश्यकता वाले प्रयोगों में एक नुकसान हो सकता है (उदाहरण के लिए, ट्यूमर के विकास और विकास के लिए), क्योंकि प्रयोगात्मक खिड़की अधिकतम 7 दिन है। बटेर का उपयोग करने के अन्य नुकसानों में भ्रूण का अधिक नाजुक गठन और संदूषण के प्रति इसकी संवेदनशीलता है। बटेर सीएएम का छोटा आकार कई प्रयोगात्मक पदार्थों के आवेदन को प्रतिबंधित करताहै।

सफेद-प्रकाश छवियां बड़े और अच्छी तरह से परिभाषित ट्यूमर को काफी अच्छी तरह से प्रदर्शित कर सकती हैं, लेकिन फ्लोरेसेंस इमेजिंग रोग का पता लगाने के लिए एक बहुत ही आकर्षक उपकरण है, विशेष रूप से बहुत छोटे ट्यूमर या ट्यूमर सेल क्लस्टर32 के लिए, संभवतः घाव के किनारों की कल्पना करने के लिए। ट्यूमर क्षेत्र में फोटोसेंसिटाइज़र का एक उच्च संचय देखा जाता है, इसलिए फोटोडायनामिक डायग्नोस्टिक्स प्रारंभिक स्थानीयकरण में या सर्जिकल हटाने के दौरान बहुत उपयोगी है। छवि को सही ढंग से प्राप्त करने के लिए ऑप्टिकल फिल्टर का भी उपयोग किया जाताहै; वर्तमान मामले में, हालांकि, तस्वीरें विशेष फिल्टर के बिना ली गई थीं। इस तरह की इमेजिंग (ब्लॉक सिस्टम के बिना) का उपयोग, उदाहरण के लिए, मूत्राशय के ट्यूमर और ग्लियोमास के एंडोस्कोपी और पीडीडी में है, इसलिए इसका एक उपयुक्त नैदानिक अनुप्रयोग है।

कुछ नुकसान के बावजूद, जापानी बटेर सीएएम परख नई दवा परीक्षण और नई बायोफोटोनिक तकनीकों के विकास के साथ-साथ फोटोडायनामिक निदान और चिकित्सा के लिए एक महान उपकरण है।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

काम वीईजीए 2/0042/21 और एपीवीवी 20-0129 द्वारा समर्थित था। हंटोसोवा का योगदान परियोजना कार्यान्वयन का परिणाम है: चिकित्सा में आधुनिक अंतःविषय अनुसंधान के लिए खुला वैज्ञानिक समुदाय (संक्षिप्त नाम: ओपनमेड), आईटीएमएस 2014 +: 313011वी 455 परिचालन कार्यक्रम एकीकृत बुनियादी ढांचे द्वारा समर्थित, ईआरडीएफ द्वारा वित्त पोषित।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-Well Cell Culture Plate Sarstedt 83.392 Transparent polystyrene, sterile
CO2 Incubator ESCO CCL-0508 ESCO, Singapore CCL-050B-8 CO2 cell culture incubator
cryocut Leica CM 1800 Reichert-Jung, USA
digital camera Canon EOS 6D II Canon, Japan
diode laser 405 nm Ocean Optics, USA
DMSO Sigma-Aldrich 67-68-5 dimethyl sulfoxid
eosin Sigma-Aldrich 15086-94-9
ethanol Sigma-Aldrich 64-17-5
fine brush size 2 Faber-Castell 281802 brush for CAM separation and manipulation
glutaraldehyde Sigma-Aldrich 111-30-8
hematoxylin Sigma-Aldrich 517-28-2
hypericin Sigma-Aldrich 84082-80-4
incubator Bios Midi Bios SedlEquation 1any, Czech Republic Forced draught incubator for initial incubation
incubator Memmert IF160 Memmert, Germany Forced air circulation incubator for CAM incubation
Kaiser slimlite plano, LED light box Kaiser, Germany 2453 Transilluminator
LED light 405 nm custom made circular LED light
macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 Canon, Japan
microscope Kapa 2000 Kvant, Slovakia optical microscope
microtome Auxilab 508 Auxilab, Spain manual rotary microtome
paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4
Paraplast Plus Sigma-Aldrich P3683 parafin medium for tissue embedding
PBS Sigma-Aldrich P4417 Phosphate saline buffer
scissors Castroviejo Orimed  OR66-108 micro scissors for CAM separation
software ImageJ 1.53 public domain image processing and analysis program
stock solution HDL Sigma-Aldrich 437641-10MG high density lipoproteins
stock solution LDL Sigma-Aldrich 437644-10MG low density lipoproteins
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583 Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 182
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Máčajová, M., Huntošová, V., Meta, M., Kundeková, B., Čavarga, I., Bilčík, B. Quail Chorioallantoic Membrane - A Tool for Photodynamic Diagnosis and Therapy. J. Vis. Exp. (182), e63422, doi:10.3791/63422 (2022).

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