Summary
Het chorioallantoic membrane (CAM) van het aviaire embryo is een zeer nuttig en toepasbaar hulpmiddel voor verschillende onderzoeksgebieden. Een speciaal ex ovo model van Japanse kwartel CAM is geschikt voor fotodynamisch behandelonderzoek.
Abstract
Het chorioallantoïsche membraan (CAM) van een vogelembryo is een dun, extra-embryonaal membraan dat functioneert als een primair ademhalingsorgaan. De eigenschappen maken het een uitstekend in vivo experimenteel model om angiogenese, tumorgroei, medicijnafgiftesystemen of fotodynamische diagnose (PDD) en fotodynamische therapie (PDT) te bestuderen. Tegelijkertijd gaat dit model in op de eis van vervanging van proefdieren door een geschikt alternatief. Ex ovo gekweekt embryo maakt eenvoudige toepassing van stoffen, toegang, monitoring en documentatie mogelijk. De meest gebruikte is chick CAM; dit artikel beschrijft echter de voordelen van de Japanse kwartel CAM als een low-cost en high-throughput model. Een ander voordeel is de kortere embryonale ontwikkeling, die een hogere experimentele omzet mogelijk maakt. De geschiktheid van kwartel CAM voor PDD en PDT van kanker en microbiële infecties wordt hier onderzocht. Als voorbeeld wordt het gebruik van de photosensitizer hypericine in combinatie met lipoproteïnen of nanodeeltjes als toedieningssysteem beschreven. De schadescore van beelden in wit licht en veranderingen in fluorescentie-intensiteit van het CAM-weefsel onder violet licht (405 nm) werd bepaald, samen met analyse van histologische secties. De kwartel CAM toonde duidelijk het effect van PDT op de vasculatuur en het weefsel. Bovendien konden veranderingen zoals capillaire bloeding, trombose, lysis van kleine bloedvaten en bloedingen van grotere bloedvaten worden waargenomen. Japanse kwartel CAM is een veelbelovend in vivo model voor fotodynamische diagnose en therapieonderzoek, met toepassingen in studies van tumorangiogenese, evenals antivasculaire en antimicrobiële therapie.
Introduction
Het kip chorioallantoic membrane (CAM) model is bekend en wordt veel gebruikt in verschillende onderzoeksgebieden. Het is een rijkelijk gevasculariseerd extra-embryonaal orgaan dat zorgt voor gasuitwisseling en mineraaltransport1. Door de transparantie en toegankelijkheid van dit membraan kunnen individuele bloedvaten en hun structurele veranderingen in realtime worden waargenomen2. Ondanks de voordelen heeft kuiken CAM ook enkele beperkingen (bijv. Grotere fokfaciliteiten, eierproductie en voerconsumptie) die kunnen worden vermeden door andere vogelsoorten te gebruiken. In dit protocol wordt een alternatief ex ovo CAM-model beschreven met Japans kwartel (Coturnix japonica) embryo. Vanwege zijn kleine formaat maakt het het gebruik van een veel groter aantal experimentele individuen mogelijk dan kip CAM. Bovendien is de kortere 16-daagse embryonale ontwikkeling van kwartembryo's een ander voordeel. De eerste grotere vaten op kwartel CAM verschijnen op embryonale dag (ED) 7. Dit kan direct worden vergeleken met de ontwikkeling van kuikenembryo's (stadia 4-35); de latere ontwikkelingsstadia zijn echter niet meer vergelijkbaar en vergen minder tijd voor het kwartembryo3. Van belang is het regelmatig voorkomen van microvasculaire vertakkingen vergelijkbaar met die van kip CAMs 4,5,6. Snelle seksuele rijping, hoge eiproductie en goedkope fokkerij zijn andere voorbeelden die het gebruik van dit experimentele model7 bevorderen.
Een aviair CAM-model wordt vaak gebruikt in fotodynamische therapie (PDT) studies8. PDT wordt gebruikt voor de behandeling van verschillende vormen van kanker (kleine gelokaliseerde tumoren) en andere niet-oncologische ziekten. Het principe is in de afgifte van een fluorescerend medicijn, een fotosensitizer (PS), aan het beschadigde weefsel en de activering ervan met licht van de juiste golflengte. Een prospectieve PS die in onderzoek wordt gebruikt, is hypericine, oorspronkelijk geïsoleerd uit de medicinale plant Sint-janskruid (Hypericum perforatum)9. De sterke fotosensibiliserende effecten van deze verbinding zijn gebaseerd op de fotochemische en fotofysische eigenschappen. Deze worden gekenmerkt door meerdere fluorescentie-excitatiepieken in het bereik van 400-600 nm, die de emissie van fluorescentie bij ongeveer 600 nm induceren. De absorptiemaxima van hypericine binnen de spectrale band liggen in het bereik van 540-590 nm en de fluorescentiemaxima liggen in het 590-640 nm-bereik9. Om deze fotosensibiliserende effecten te bereiken, wordt hypericine geëxciteerd door laserlicht op een golflengte van 405 nm na lokale toediening10. In aanwezigheid van licht kan hypericine virucide, antiproliferatieve en cytotoxische effecten vertonen11, terwijl er geen systemische toxiciteit is en het snel uit het organisme wordt vrijgegeven. Hypericine is een lipofiele stof die in water onoplosbare, niet-fluorescerende aggregaten vormt, daarom worden verschillende soorten nanodragers, zoals polymere nanodeeltjes12,13 of lipoproteïnen met hoge en lage dichtheid (HDL, LDL)14,15, gebruikt om de afgifte en penetratie ervan in de cellen te helpen. Omdat CAM van nature een immunodeficiënt systeem is, kunnen tumorcellen direct op het membraanoppervlak worden geïmplanteerd. Het model is ook zeer geschikt voor het registreren van de omvang van PDT-geïnduceerde vasculaire schade volgens een gedefinieerde score16,17. Licht met een lagere intensiteit in vergelijking met PDT kan worden gebruikt voor fotodynamische diagnose (PDD). Het monitoren van het weefsel onder violet excitatie LED-licht leidt ook tot fotoactivering van fotosensitizers 18,19,20 die resulteert in een emissie van fluorescerend licht, maar het levert niet genoeg energie om een PDT-reactie te starten en de cellen te beschadigen. Het maakt het een goed hulpmiddel voor tumorvisualisatie en -diagnose of het monitoren van de farmacokinetiek van gebruikte PS'en14,15.
Dit artikel beschrijft de bereiding van de kwartel ex ovo CAM-test met overlevingspercentages van meer dan 80%. Deze ex ovo-cultuur werd met succes toegepast in een groot aantal experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen. Alle apparatuur en reagentia moeten worden geautoclaveerd of gesteriliseerd met 70% ethanol of UV-licht.
1. Ei-incubatie
- Bewaar bevruchte kwarteleitjes bij 10-15 °C gedurende maximaal 4-5 dagen voordat u met de incubatie begint. Gebruik alleen schone en onbeschadigde eieren.
- Incubeer de eieren in een geforceerde trekincubator gedurende ~ 53-54 uur. Leg de eieren horizontaal met de eirotatie uitgeschakeld, bij 50% -60% vochtigheid en 37,5 ° C incubatietemperatuur.
2. Ex ovo cultuur voorbereiding
OPMERKING: Na de eerste incubatie zijn de eieren geschikt voor het starten van de ex ovo-teelt .
- Desinfecteer het eioppervlak met 70% ethanol, zonder het ei te roteren.
- Open in een steriele laminaire stromingskast de eierschaal met een kleine steriele chirurgische schaar en breng de inhoud over in een 6-well kweekplaat. Als het goed wordt gedaan, ligt het embryo bovenop een onbeschadigde dooier. Desinfecteer na elk ei de schaar met 70% ethanol.
- Voeg ongeveer 5 ml steriel water toe aan de openingen in de 6-wellsplaat, omdat vochtigheid essentieel is om te voorkomen dat de CAM uitdroogt.
- Plaats de embryo's in een couveuse tot verdere experimenten, met behoud van een temperatuur van 37 °C en een luchtvochtigheid van 80%-90%.
- Wanneer de CAM volledig is ontwikkeld (vanaf ED7), plaatst u een gesteriliseerde siliconenring (6 mm in diameter en ongeveer 1,5 mm dik) op het CAM-oppervlak, langs de kleine haarvaten. Vermijd grote bloedvaten bij het plaatsen van de ring.
OPMERKING: De ring definieert de werkruimte, helpt bij het markeren van de plaats van het aanbrengen van de stof en voorkomt dat de vloeibare inhoud eruit lekt. - Beëindig de teelt van de embryo's volgens de wetgeving van het land.
- Belangrijk is dat je handschoenen draagt of de handen gedesinfecteerd houdt met 70% ethanol tijdens het werk. Aspirateer onjuist getipte embryo's of onbevruchte eieren met een vacuümaspirator.
Figuur 1: Ex ovo kweekvoorbereiding. A) Japanse kwarteleitjes zoals deze worden opgeslagen en bebroed. B) Ontsmetting van het eioppervlak met ethanol. (C) Eierschaal wordt met een schaar gesneden. (D) De inhoud van het ei wordt in de put geleegd. (E) Goed voorbereid 3-dagen oud embryo, met ontwikkelende CAM vasculatuur. F) Kweekplaten die in een broedmachine zijn opgeslagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: 6-well kweekplaat met embryo's en siliconenringen bovenop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Inenting van tumorcellen
OPMERKING: Alle procedures vereisen het gebruik van een steriele laminaire flowkast.
- Kweek verschillende soorten aanhankelijke cellen in kolven volgens de respectieve kweekprotocollen.
- Verwijder het oude medium uit de kolven en spoel de cellaag af met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om sporen van het medium te verwijderen.
- Rem na trypsinisatie het trypsine door het kweekmedium toe te voegen en oogst de cellen in centrifugebuizen. Centrifugeer de cellen en resuspeneer de celpellet in een vers kweekmedium. Tel de cellen en resuspenteer ze in een celkweekmedium in de gewenste concentratie.
OPMERKING: Het is ook mogelijk om 3D-celculturen te produceren, d.w.z. sferoïden met behulp van bijvoorbeeld de hanging drop-methode21.
- Implanteer 1 x 105-1 x 106 tumorcellen of 5-15 sferoïden (per CAM) in 30 μL celmediumoplossing in de siliconenring bovenop de CAM.
OPMERKING: Het volume is afhankelijk van de grootte van de gebruikte siliconenring. Als een siliconenring met een grotere diameter wordt gebruikt, is een groter volume nodig om het hele gebied te bedekken. Afhankelijk van het celtype, of voor verschillende soorten experimenten, kunnen verschillende celconcentraties worden gebruikt. Soms wordt fijn schrapen van CAM gebruikt om de hechting van de ingebedde cellen te verbeteren. - Breng de CAMs met geënte cellen terug naar de incubator (37 °C en 80%-90% vochtigheid).
Figuur 3: Inenting van CAM met tumoren. (A) Aspiratie van sferoïden met een pipet en (B) implantatie op het CAM-oppervlak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Toepassing van photosensitizer
- Toepassing van hypericine
- Bereid onder gedimd licht een 2 mM stockoplossing van hypericine door deze op te lossen in 100% dimethylsulfoxide (DMSO). Bereid kort voor het experiment een 79 μM-werkoplossing van hypericine met steriele PBS- of zoutoplossing. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie DMSO in alle oplossingen altijd lager is dan 0,2%, wat de ontwikkeling van het embryo niet beïnvloedt.
- Breng onder steriele omstandigheden een geschikt volume hypericine-oplossing aan op de siliconenring. Een volume van 30 μL is voldoende om een ring met een diameter van 6 mm te vullen.
- Bewaar embryo's in een couveuse bij 37 °C en 80%-90% luchtvochtigheid. Hypericine in een waterige oplossing is fotoactief na monomerisatie in het weefsel, ongeveer 3 uur na het aanbrengen op de CAM.
- Toepassing van hypericine met LDL, HDL of nanodeeltjes als transportsystemen
OPMERKING: Deze transportsystemen worden gebruikt om de penetratie van hypericine in cellen en celstructuren te verbeteren.- Vanwege de lichtgevoeligheid voert u alle stappen uit, inclusief de voorbereiding van oplossingen, onder gedimd licht en slaat u de oplossingen in het donker op.
- Bereid de hypericine-LDL- en hypericine-HDL-formuleringen voor door geschikte volumes lipoproteïnen en hypericine-stockoplossingen in PBS te mengen volgens referentie15. De concentratie van LDL of HDL tot hypericine is 20:115.
- Synthetiseer polymeer nanodeeltjes door levende kationische ring-opening polymerisatie volgens referenties12,13. Pas de concentratie hypericine in polymeer nanodeeltjes met PBS aan op 10 μM12,13.
5. PDD en PDT
- PDD uitvoeren
- Breng onder steriele omstandigheden photosensitizer (hypericine, hypericine-geladen polymere nanodeeltjes of hypericine met lipoproteïnedrager) aan op het CAM-oppervlak, met of zonder tumorcellen (ED 7-9).
- Verlicht de CAM met violet excitatielicht (op maat gemaakt cirkelvormig LED-licht van 405 nm golflengte) en registreer de fluorescentie van hypericine in CAM-weefsel en tumorcellen met een digitale camera met tijdsintervallen van 0, 1, 3, 5, 24 en 48 uur na toediening van hypericine.
- Als het onderzoek een afbeelding van de CAM in wit licht vereist, neem dan de CAM op vóór hypericinetoediening en aan het einde van het experiment, kort voor de weefselfixatie, omdat het licht de fotoactivatie van hypericine beïnvloedt.
- Evalueer de fluorescentie-intensiteit met behulp van een beeldverwerkings- en analyseprogramma (bijv. ImageJ22).
- Splits RGB-afbeeldingskanalen in afzonderlijke rode, groene en blauwe afbeeldingen. Analyseer de afbeelding met rode intensiteit in 8-bits vorm. Evalueer de rode intensiteit van het gebied binnen de ring en benader het als de hypericine fluorescentie. Verkrijg volledige afbeeldingsprofielplots (met behulp van imageJ's Profile Plot-plug-in) op verschillende tijdsintervallen na hypericinetoediening (d.w.z. van 0 uur, direct na toediening, tot 48 uur).
- PDT uitvoeren
- Voer de PDT ten minste 3 uur na hypericinetoepassing uit.
- Plaats de optische vezel boven het oppervlak van de CAM voor de laserstraal om het hele gebied binnen de siliconenring te bedekken.
- Voer in vivo bestraling (1-2 min) uit met een laserlicht van 405 nm met een fluencesnelheid van 285 mW/cm2.
- Neem CAM op met wit licht en 405 nm tl-licht voor en na fotodynamische behandeling (24 uur en 48 uur).
- Detecteer fotoschade 24 uur en 48 uur na PDT van de beelden die in wit licht zijn genomen. Evalueer vasculaire schade door een semikwantitatieve score16: 1 - geen vernietiging; 2 - gedeeltelijke sluiting van haarvaten (diameter ≤10 μm) zonder vernietiging van medium of groter (diameter ≥50 μm) en kleinere vaten (diameter 10-50 μm); 3 - gedeeltelijke sluiting van kleinere vaten met haarvaten die verdwijnen; 4 - gedeeltelijke sluiting van grotere vaten met kleinere vaten en haarvaten die verdwijnen; en 5 - totale fototrombose waarbij de meeste bloedvaten verdwijnen.
Figuur 4: Behandeling van CAM met laserlicht. Deze foto is genomen ter illustratie. Voor PDD of PDT moet de kamer donker zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. CAM voorbereiden voor verdere evaluatie
- Paraffine inbedding
- Bevestig het CAM-weefsel in een kweekplaat met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende minimaal 2 uur en maximaal een nacht.
- Verwijder de PFA en snijd voorzichtig een deel van het weefsel in de siliconenring uit de CAM.
- Droog het CAM-weefsel onmiddellijk uit in oplopende alcoholreeksen als volgt. Plaats het CAM-weefsel in 70% ethanol gedurende 3 minuten, eosine-oplossing gedurende 2 minuten (voor een gemakkelijkere locatie van het weefsel in het paraffineblok), 96% ethanol gedurende 3 x 5 minuten (altijd in een nieuwe petrischaal) en 100% ethanol gedurende 5 minuten en xyleen gedurende 2 x 10 minuten.
- Breng de monsters met een spatel of dunne borstel zo snel mogelijk over op de opgeloste paraffine in petrischalen (59 °C). Plaats na 24 uur het weefsel in histologische mal, vul het met paraffine-insluitmedium en laat het stollen in de koelkast. Knip de gestolde CAM uit het insluitmedium, draai hem 90° in de lade, vul hem opnieuw met het insluitmedium en laat hem stollen.
- Bereid 5-10 μm secties op een microtoom voor histopathologische analyse om PDT-geïnduceerde schade te bepalen.
- Voorbereiding van bevroren CAM-secties voor histologie
OPMERKING: Voor sommige methodologieën, waaronder histologie, zijn bevroren secties bereid op cryostaatmicrotoom meer geschikt. Volg de onderstaande stappen voor het voorbereiden van de bevroren CAM-secties.- Monteer zorgvuldig native of 4% paraformaldehyde-gefixeerde CAM op de glazen schuif.
- Vul de inbeddende schimmel tot de helft met een optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) en vries in vloeibare stikstof of een mengsel van droogijs en ethanol.
- Na het invriezen kunt u de CAM voorzichtig kantelen en van het glas op de bovenkant van het bevroren OCT-medium schuiven. Plaats opnieuw in de mal, dek af met OCT-medium en vries in zoals in stap 6.2.2.
- Fractal analyse van kwartel CAM
OPMERKING: Vasculatuurveranderingen veroorzaakt door PDT kunnen worden beoordeeld door de fractaldimensiecoëfficiënt19 te berekenen.- In de laminaire flowkast, overloop CAM in een teeltplaat met een voorverwarmde (37 °C) fixatieoplossing van 4% paraformaldehyde en 2% glutaaraldehyde in PBS.
- Verwijder de fixatieoplossing na 48 uur. Scheid de CAM zorgvuldig van het embryo met een microschaar en een fijne borstel en was het in PBS.
- Monteer de gewassen CAM op een glazen schuif en laat hem langzaam drogen.
- Fotografeer de dia met een digitale camera en een transilluminator als bron van homogeen wit licht.
- Verwerk digitale beelden met ImageJ-software22. Selecteer voor de analyse een vierkant gebied (512 × 512 pixels) uit het gebied met distale arteriële takken. Binarize en skeletonize de beelden en bereken de fractal dimensiecoëfficiënt (Df) volgens de procedures beschreven in referentie31.
- Moleculaire analyse van CAM-weefsel
- Voor moleculaire analyse, zorgvuldig scheiden inheemse CAM, bevriezen in vloeibare stikstof, en opslaan bij -80 °C.
- Bepaal genexpressie volgens standaardprotocollen voor RNA-isolatie23, reverse transcriptie in cDNA en kwantitatieve PCR24.
Figuur 5: CAM-weefsel voor fractalanalyse. Na PDT wordt CAM bevestigd, op een dia gemonteerd en gedroogd voor fractalanalyse. De foto is genomen in wit licht met behulp van een transilluminator. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De lokalisatie van de tumor op het CAM-oppervlak is moeilijk bij wit licht. Photosensitizer (hier hypericine) die bij PDD wordt gebruikt, wordt naar verwachting selectief door de tumor opgenomen en helpt de tumor te visualiseren. De toevoeging van hypericine en het gebruik van fluorescerend licht (bijv. 405 nm) toonden de positie van de tumor (plaveiselcelcarcinoom TE1) zeer goed aan (figuur 6A). Histologische analyse toonde vitale tumorcellen die gezonde weefsels binnendringen. Concentrische structuren van abnormale plaveiselcellen, vaak beschreven in plaveiselcelcarcinoomweefsel (keratineparels), waren zichtbaar (figuur 6B). De groei van de tumor ging gepaard met oedeem en verdikking van het membraan.
Figuur 6: Plaveiselcelcarcinoom TE1-tumor groeit op CAM-oppervlak. (A) De opname is gemaakt met wit licht (links) en 405 nm LED-licht (rechts) met de toevoeging van hypericine. De mate van tumorgroei wordt beter gevisualiseerd en gedefinieerd. (B) Dwarsdoorsnede van de tumor die groeit op CAM-oppervlak, met metastasen (M, keratineparels) in het CAM-weefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een fotosensitizer en langere belichting van het weefsel met gefocust licht van hoge intensiteit worden gebruikt bij PDT. Een dergelijke behandeling beïnvloedt de CAM-vasculatuur, waardoor trombose, sluiting van grotere bloedvaten en verdwijnen van kleinere bloedvaten en haarvaten ontstaat (figuur 7). Het gebied waar de behandeling werd toegepast (binnenkant van de siliconenring) werd beïnvloed en er was een duidelijk verschil in vaatdichtheid binnen de ring en in de omgeving.
Figuur 7: Voorbeeld van veranderingen in CAM-vasculatuur 24 uur na PDT. Behandeling met laser veroorzaakte het verdwijnen van de meeste haarvaten, waarbij de vaatdichtheid binnen en buiten het behandelingsgebied in de siliconenring werd vergeleken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het laserlicht dat in PDT werd gebruikt zonder de aanwezigheid van fotosensitizer veroorzaakte geen schade (figuur 8, middellijn, "alleen bestraling"), vergelijkbaar met de controle zonder enige behandeling (figuur 8, bovenste regel, "controle"). De bottom line van de beelden toont veranderingen in hypericine fluorescentie in de tijd, veroorzaakt door monomerisatie van geaggregeerd hypericine10. PDT werd toegepast na 3 uur incubatie met hypericine en 2 uur later waren er al zichtbare veranderingen. De foto van wit licht die 24 uur na de behandeling is gemaakt, toont uitgebreide schade aan de vasculatuur.
Figuur 8: Veranderingen in fluorescentie-intensiteit en CAM-vasculatuurdichtheid na hypericinetoediening en laserbestraling (PDT). Foto's werden gemaakt in 0, 1, 3, 5 en 24 uur met 405 nm licht en wit licht. De bovenste regel van beelden komt overeen met controle zonder behandeling. De middelste lijn van afbeeldingen komt alleen overeen met laserbestraling (d.w.z. zonder hypericine); laserbestraling (2 min, 405 nm laserlicht, fluence rate 285 mW/cm2) werd 3 uur na toediening van hypericine toegepast. De bottom line van beelden komt overeen met behandeling met hypericine en laserbestraling (PDT); laserbestraling werd toegepast na 3 uur incubatie met hypericine. De beelden tonen duidelijk schade aan de CAM-vasculatuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
PDT had een negatieve invloed op de CAM-weefselstructuur. Histologische analyse (figuur 9) toonde aan dat onbehandelde controle CAM een relatief gelijkmatige dikte had; PDT-behandeling zorgde er echter voor dat de CAM dunner en kwetsbaarder werd.
Figuur 9: Histologische analyse van controle- en PDT-behandelde CAM-weefsels. (A) Dwarsdoorsnede van onbehandelde controle-CAM. De dikte van CAM is relatief gelijkmatig. (B) Dwarsdoorsnede van CAM na PDT-behandeling. In vergelijking met de besturing is de CAM dunner en kwetsbaarder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor succesvolle ex ovo teelt is het belangrijk om het bovenstaande protocol te volgen. Bovendien, als de eieren niet voorzichtig genoeg worden geopend of als er onvoldoende vochtigheid is tijdens de teelt, kleeft de dooierzak aan de schaal en scheurt vaak. De start van een ex ovo-teelt op het moment van ongeveer 60 uur ei-incubatie zorgt voor de hoge overlevingskans van de embryo's, omdat ze al groot genoeg zijn om de behandeling te overleven. In de latere ontwikkelingsstadia wordt de CAM dunner en hecht zich aan de eierschaal, wat leidt tot membraanrupturen.
Vanaf incubatiedag 7 zijn de embryo's minder gevoelig voor agitatie; de CAM-zone beslaat bijna het hele oppervlak van de put en is klaar voor verdere experimenten. Hoewel de dode embryo's een risico op infectie kunnen vormen, hebben ze met de juiste werkmethoden in ten minste semi-steriele omstandigheden geen invloed op de andere embryo's die in de 6-well-plaat leven. De overlevingskans van het kwartel ex ovo embryo in de huidige experimenten was ongeveer 80%, wat relatief beter is dan in kip ex ovo experimenten 25,26,27.
In de huidige experimenten werd een siliconenring gebruikt om de werkruimte af te bakenen. Tot nu toe is er geen bewijs beschikbaar dat de ringen alleen enig effect hebben op de ontwikkeling, groei of angiogenese van het CAM-weefsel28. Kohli et al. testten het gebruik van biomaterialen van verschillende structuren en samenstellingen in een kip CAM-model, en bloedvaten werden waargenomen in alle geteste scaffolds behalve siliconen, waar geen bloedvaten werden waargenomen om het te infiltreren29. Alleen onzorgvuldig omgaan met de ring kan bloedingen van de CAM veroorzaken en de overleving van de embryo's verlagen.
Vanwege zijn eigenschappen vertegenwoordigt dit CAM-model een levensvatbaar, economisch voordelig alternatief voor proefdieren, zoals muizen, ratten of konijnen, vooral voor het observeren van vasculatuurverandering tijdens PDT30. Het is ook geschikt voor het monitoren van genexpressieveranderingen en weefselveranderingen op histologisch niveau24. Dit van nature immunodeficiënte model heeft een rijk en gemakkelijk zichtbaar vasculair netwerk dat real-time visualisatie van de testenmogelijk maakt 13,31.
Kwarteleischelp is gemakkelijk te openen en ex ovo-teelt is eenvoudig en vereist minder ruimte voor opslag30. De ontwikkeling van een kwartembryo is kort en maakt een hoog verloop van experimenten mogelijk. Deze snelle ontwikkeling kan echter een nadeel zijn in experimenten die meer tijd nodig hebben (bijvoorbeeld voor tumorontwikkeling en groei), omdat het experimentele venster maximaal 7 dagen is. Een van de andere nadelen van het gebruik van kwartels is de meer delicate samenstelling van het embryo en de gevoeligheid voor besmetting. Het kleine formaat van kwartel CAM beperkt de toepassing van verschillende experimentele stoffen10.
Witlichtbeelden kunnen grotere en goed gedefinieerde tumoren vrij goed weergeven, maar fluorescentiebeeldvorming is een zeer aantrekkelijk hulpmiddel voor ziektedetectie, vooral voor zeer kleine tumoren of tumorcelclusters32, mogelijk om de randen van de laesie te visualiseren. Een hogere accumulatie van fotosensitizers wordt waargenomen in het tumorgebied, dus fotodynamische diagnostiek is zeer nuttig bij vroege lokalisatie of tijdens chirurgische verwijdering. Optische filters worden ook gebruikt om het beeld correct te verkrijgen32; in het onderhavige geval zijn de foto's echter zonder speciale filters gemaakt. Het gebruik van dergelijke beeldvorming (zonder bloksysteem) is bijvoorbeeld bij endoscopie en PDD van urineblaastumoren en gliomen, dus het heeft een geschikte klinische toepassing.
Ondanks enkele nadelen is de Japanse kwartel CAM-test een geweldig hulpmiddel voor het testen van nieuwe geneesmiddelen en de ontwikkeling van nieuwe biofotonische technieken, evenals fotodynamische diagnose en therapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund door VEGA 2/0042/21 en APVV 20-0129. De bijdrage van V. Huntošová is het resultaat van de projectimplementatie: Open wetenschappelijke gemeenschap voor modern interdisciplinair onderzoek in de geneeskunde (Acroniem: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 ondersteund door het Operational Program Integrated Infrastructure, gefinancierd door het EFRO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
| CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
| digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
| diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
| eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| incubator Bios Midi | Bios Sedl any, Czech Republic |
Forced draught incubator for initial incubation | |
| incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
| Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
| LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
| macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
| microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
| microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
| scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
| software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
| stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
| stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |
References
- Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
- van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation. Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).
- Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R.
- De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).
- Sandau, K., Kurz, H. Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis. Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).
- Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marmé, D., Christ, B. Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application. Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).
- Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model. Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).
- Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).
- Miškovský, P. Hypericin - a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules. Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).
- Čavarga, I., et al. Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model. Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).
- Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro. Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).
- Datta, S., et al. Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery. Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).
- Huntošová, V., et al. Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin. Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).
- Buríková, M., et al. Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery. General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).
- Lenkavska, L., et al. Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).
- Rück, A., Böhmler, A., Steiner, R. PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).
- Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).
- Buzzá, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).
- Dougherty, T. J., et al.
- Xiang, L., et al. Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J.
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Máčajová, M., Čavarga, I., Sýkorová, M., Valachovič, M., Novotná, V., Bilčík, B. Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model. Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).
- Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials. ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).
- Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).
- Merlos Rodrigo, M. A., et al. Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells. Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).
- Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica). Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).
- Kohli, N., et al. Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications. Biology-Basel. 10 (4), 301 (2021).
- Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).
- Buzzá, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., Gómez-García, P. B., Kurachi, C. Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).
