Summary
الغشاء المشيمي (CAM) لجنين الطيور هو أداة مفيدة للغاية وقابلة للتطبيق لمختلف مجالات البحث. نموذج خاص من البيضاوي السابق من السمان الياباني CAM مناسب للتحقيق في العلاج الضوئي الديناميكي.
Abstract
الغشاء المشيمي (CAM) لجنين الطيور هو غشاء رقيق خارج الجنين يعمل كعضو تنفسي أساسي. خصائصه تجعله نموذجا تجريبيا ممتازا في الجسم الحي لدراسة تكوين الأوعية الدموية ، ونمو الورم ، وأنظمة توصيل الأدوية ، أو التشخيص الضوئي الديناميكي (PDD) والعلاج الضوئي الديناميكي (PDT). وفي الوقت نفسه، يتناول هذا النموذج شرط استبدال التجارب ببديل مناسب. يسمح الجنين المزروع ب Ex ovo بسهولة تطبيق المادة والوصول إليها ومراقبتها وتوثيقها. الأكثر استخداما هو CAM الفرخ. ومع ذلك ، تصف هذه المقالة مزايا CAM السمان الياباني كنموذج منخفض التكلفة وعالي الإنتاجية. ميزة أخرى هي التطور الجنيني الأقصر ، والذي يسمح بدوران تجريبي أعلى. يتم استكشاف مدى ملاءمة CAM السمان ل PDD و PDT للسرطان والالتهابات الميكروبية هنا. على سبيل المثال ، يتم وصف استخدام المحسس الضوئي hypericin مع البروتينات الدهنية أو الجسيمات النانوية كنظام توصيل. تم تحديد درجة الضرر من الصور في الضوء الأبيض والتغيرات في شدة التألق لأنسجة CAM تحت الضوء البنفسجي (405 نانومتر) ، جنبا إلى جنب مع تحليل المقاطع النسيجية. أظهر CAM السمان بوضوح تأثير PDT على الأوعية الدموية والأنسجة. علاوة على ذلك ، يمكن ملاحظة تغييرات مثل النزيف الشعري ، والجلطة ، وتحلل الأوعية الصغيرة ، ونزيف الأوعية الكبيرة. يعد CAM للسمان الياباني نموذجا واعدا في الجسم الحي للتشخيص الضوئي الديناميكي وأبحاث العلاج ، مع تطبيقات في دراسات تكوين الأوعية الدموية للورم ، وكذلك العلاج المضاد للأوعية الدموية ومضادات الميكروبات.
Introduction
نموذج غشاء الدجاج chorioallantoic (CAM) معروف جيدا ويستخدم على نطاق واسع في مختلف مجالات البحث. وهو عضو خارج الجنين غني بالأوعية الدموية يوفر تبادل الغازات ونقل المعادن1. نظرا لشفافية هذا الغشاء وإمكانية الوصول إليه ، يمكن ملاحظة الأوعية الدموية الفردية وتغييراتها الهيكلية في الوقت الفعلي2. على الرغم من المزايا ، فإن CAM الفرخ لديه أيضا بعض القيود (على سبيل المثال ، مرافق تربية أكبر ، وإنتاج البيض ، واستهلاك الأعلاف) التي يمكن تجنبها باستخدام أنواع الطيور الأخرى. في هذا البروتوكول ، يتم وصف نموذج CAM بديل ل ex ovo باستخدام جنين السمان الياباني (Coturnix japonica). نظرا لصغر حجمه ، فإنه يسمح باستخدام عدد أكبر بكثير من الأفراد التجريبيين من CAM الدجاج. علاوة على ذلك ، فإن التطور الجنيني الأقصر لمدة 16 يوما لأجنة السمان هو ميزة أخرى. تظهر أول أوعية أكبر على CAM السمان في اليوم الجنيني (ED) 7. يمكن مقارنة ذلك مباشرة مع تطور جنين الفرخ (المراحل 4-35) ؛ ومع ذلك ، فإن المراحل المتأخرة من التطور لم تعد قابلة للمقارنة وتتطلب وقتا أقل لجنين السمان3. من المثير للاهتمام هو الحدوث المنتظم للتفرع الوعائي الدقيق على غرار الدجاج CAMs 4,5,6. النضج الجنسي السريع ، وارتفاع إنتاج البيض ، والتربية منخفضة التكلفة هي أمثلة أخرى تفضل استخدام هذا النموذج التجريبي7.
غالبا ما يستخدم نموذج CAM للطيور في دراسات العلاج الضوئي الديناميكي (PDT)8. يستخدم PDT لعلاج عدة أشكال من السرطان (الأورام الموضعية الصغيرة) وغيرها من الأمراض غير الورمية. مبدأها هو في توصيل دواء الفلورسنت ، وهو محسس للضوء (PS) ، إلى الأنسجة التالفة وتنشيطه بضوء الطول الموجي المناسب. أحد PS المحتملين المستخدمين في الأبحاث هو hypericin ، المعزول أصلا من نبتة سانت جون الطبية (Hypericum perforatum)9. تعتمد تأثيرات الحساسية الضوئية القوية لهذا المركب على خصائصه الكيميائية الضوئية والفيزيائية الضوئية. تتميز هذه بقمم إثارة التألق المتعددة في نطاق 400-600 نانومتر ، مما يحفز انبعاث التألق عند حوالي 600 نانومتر. الحد الأقصى لامتصاص hypericin داخل النطاق الطيفي هو في نطاق 540-590 نانومتر ، والحد الأقصى للتألق في نطاق 590-640 نانومتر9. لتحقيق هذه التأثيرات الحساسة للضوء ، يتم إثارة hypericin بواسطة ضوء الليزر بطول موجي يبلغ 405 نانومتر بعد الإدارة المحلية10. في وجود الضوء ، يمكن أن يظهر hypericin تأثيرات مبيد للفيروسات ومضاد للتكاثر وسام للخلايا11 ، في حين لا توجد سمية جهازية ، ويتم إطلاقه بسرعة من الكائن الحي. Hypericin هي مادة محبة للدهون تشكل مجاميع غير قابلة للذوبان في الماء وغير فلورية ، وهذا هو السبب في أن عدة أنواع من الناقلات النانوية ، مثل الجسيمات النانوية البوليمرية12,13 أو البروتينات الدهنية عالية ومنخفضة الكثافة (HDL ، LDL) 14,15 ، تستخدم للمساعدة في توصيلها واختراقها في الخلايا. نظرا لأن CAM هو نظام يعاني من نقص المناعة بشكل طبيعي ، يمكن زرع الخلايا السرطانية مباشرة على سطح الغشاء. كما أن النموذج مناسب تماما لتسجيل مدى تلف الأوعية الدموية الناجم عن PDT وفقا لدرجة محددة16,17. يمكن استخدام ضوء أقل كثافة مقارنة ب PDT للتشخيص الضوئي الديناميكي (PDD). تؤدي مراقبة الأنسجة تحت ضوء LED البنفسجي المثير أيضا إلى التنشيط الضوئي للمحسسات الضوئية18،19،20 التي تؤدي إلى انبعاث ضوء الفلورسنت ، ومع ذلك فهي لا توفر طاقة كافية لبدء تفاعل PDT وإتلاف الخلايا. إنه يجعلها أداة جيدة لتصور الورم وتشخيصه أو مراقبة الحرائك الدوائية ل PSs14,15 المستخدمة.
توضح هذه المقالة إعداد فحص CAM للسمان ex ovo مع معدلات البقاء على قيد الحياة أكثر من 80٪. تم تطبيق هذه الثقافة السابقة بنجاح في عدد كبير من التجارب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجري البحث وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. يجب تعقيم جميع المعدات والكواشف أو تعقيمها بنسبة 70٪ من الإيثانول أو الأشعة فوق البنفسجية.
1. حضانة البيض
- تخزين بيض السمان المخصب في 10-15 درجة مئوية لمدة أقصاها 4-5 أيام قبل البدء في الحضانة. استخدم فقط البيض النظيف وغير التالف.
- احتضان البيض في حاضنة السحب القسري لمدة ~ 53-54 ساعة. ضع البيض أفقيا مع إيقاف دوران البيض ، عند رطوبة 50٪ -60٪ ودرجة حرارة حضانة 37.5 درجة مئوية.
2. إعداد ثقافة البيضة السابقة
ملاحظة: بعد الحضانة الأولية ، يكون البيض مناسبا لبدء زراعة البيضة السابقة.
- تطهير سطح البيضة مع 70 ٪ من الإيثانول ، دون تدوير البيضة.
- في خزانة التدفق الرقائقي المعقمة ، افتح قشر البيض باستخدام مقص جراحي صغير معقم وانقل محتوياته إلى صفيحة استزراع من 6 آبار. إذا تم القيام به بشكل صحيح ، فسوف يستلقي الجنين فوق صفار البيض غير التالف. بعد كل بيضة ، قم بتطهير المقص بنسبة 70٪ من الإيثانول.
- أضف ما يقرب من 5 مل من الماء المعقم إلى الفجوات الموجودة في الصفيحة المكونة من 6 آبار ، حيث أن الرطوبة ضرورية لمنع CAM من الجفاف.
- ضع الأجنة في حاضنة حتى إجراء المزيد من التجارب ، مع الحفاظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية ورطوبة 80٪ -90٪.
- عندما يتم تطوير CAM بالكامل (من ED7) ، ضع حلقة سيليكون معقمة (قطرها 6 مم وسمكها حوالي 1.5 مم) على سطح CAM ، على طول الشعيرات الدموية الصغيرة. تجنب الأوعية الدموية الرئيسية عند وضع الحلقة.
ملاحظة: تحدد الحلقة مساحة العمل، وتساعد في تحديد مكان تطبيق المادة، وتمنع محتويات السائل من التسرب. - إنهاء زراعة الأجنة وفقا لتشريعات البلاد.
- الأهم من ذلك ، ارتداء القفازات أو الحفاظ على تطهير اليدين بنسبة 70 ٪ من الإيثانول أثناء العمل. شفط الأجنة التي تميل بشكل غير صحيح أو البيض غير المخصب باستخدام شفاط فراغ.
الشكل 1: إعداد ثقافة البيضة السابقة . (أ) بيض السمان الياباني أثناء تخزينه واحتضانه. (ب) تطهير سطح البيض بالإيثانول. (ج) يتم قطع قشر البيض بالمقص. (د) يتم إفراغ محتوى البويضة في البئر. (ه) إعداد الجنين بشكل صحيح 3 أيام ، مع تطوير الأوعية الدموية CAM. (و) لوحات الاستزراع المخزنة في حاضنة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: لوحة زراعة 6 آبار مع الأجنة وحلقات السيليكون الموضوعة في الأعلى.
3. تلقيح الخلايا السرطانية
ملاحظة: تتطلب جميع الإجراءات استخدام خزانة تدفق صفحية معقمة.
- استزراع أنواعا مختلفة من الخلايا الملتصقة في قوارير وفقا لبروتوكولات الثقافة المعنية.
- قم بإزالة الوسط القديم من القوارير وشطف طبقة الخلية بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة آثار الوسط.
- بعد التربسين ، قم بتثبيط التربسين عن طريق إضافة وسط الثقافة وحصاد الخلايا في أنابيب أجهزة الطرد المركزي. الطرد المركزي للخلايا وإعادة تعليق بيليه الخلية في وسط ثقافة جديدة. عد الخلايا وأعد تعليقها في وسط زراعة الخلايا بالتركيز المطلوب.
ملاحظة: من الممكن أيضا إنتاج مزارع خلايا 3D ، أي كرويات باستخدام ، على سبيل المثال ، طريقة السقوط المعلقة21.
- زرع 1 × 105-1 × 106 خلايا سرطانية أو 5-15 كروية (لكل CAM) في 30 ميكرولتر من محلول وسط الخلية في حلقة السيليكون أعلى CAM.
ملاحظة: يعتمد الحجم على حجم حلقة السيليكون المستخدمة. إذا تم استخدام حلقة سيليكون ذات قطر أكبر ، فهناك حاجة إلى حجم أكبر لتغطية المنطقة بأكملها. اعتمادا على نوع الخلية ، أو لأنواع مختلفة من التجارب ، يمكن استخدام تركيزات الخلايا المختلفة. في بعض الأحيان ، يتم استخدام الكشط الدقيق ل CAM لتحسين التصاق الخلايا المدمجة. - أعد CAMs مع الخلايا الملقحة إلى الحاضنة (37 درجة مئوية ورطوبة 80٪ -90٪).
الشكل 3: تلقيح الطب التكميلي والبديل بالأورام . (أ) شفط الكرويات باستخدام ماصة، و (ب) الزرع على سطح الطب التكميلي والبديل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. تطبيق محسس للضوء
- تطبيق هايبريسين
- تحت الإضاءة الخافتة ، قم بإعداد محلول مخزون 2 mM من hypericin عن طريق إذابته في 100٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). قم بإعداد محلول عمل 79 ميكرومتر من hypericin قبل وقت قصير من التجربة باستخدام PBS المعقم أو محلول ملحي. تأكد من أن التركيز النهائي ل DMSO في جميع المحاليل يكون دائما أقل من 0.2٪ ، مما لا يؤثر على تطور الجنين.
- في ظل ظروف معقمة ، ضع حجما مناسبا من محلول hypericin على حلقة السيليكون. حجم 30 ميكرولتر يكفي لملء حلقة يبلغ قطرها 6 مم.
- احتفظ بالأجنة في حاضنة عند 37 درجة مئوية ورطوبة 80٪ -90٪. Hypericin في محلول مائي نشط ضوئيا بعد مونوميرات في الأنسجة ، حوالي 3 ساعات بعد تطبيقه على CAM.
- تطبيق hypericin مع LDL أو HDL أو الجسيمات النانوية كأنظمة نقل
ملاحظة: تستخدم أنظمة النقل هذه لتحسين تغلغل hypericin في الخلايا وهياكل الخلايا.- بسبب الحساسية للضوء ، قم بتنفيذ جميع الخطوات ، بما في ذلك إعداد الحلول ، تحت الإضاءة الخافتة وتخزين الحلول في الظلام.
- تحضير تركيبات hypericin-LDL و hypericin-HDL عن طريق خلط كميات مناسبة من البروتينات الدهنية وحلول مخزون hypericin في PBS وفقا للمرجع15. تركيز LDL أو HDL إلى hypericin هو 20: 115.
- توليف الجسيمات النانوية البوليمر عن طريق البلمرة الحية لفتح الحلقة الكاتيونية وفقا للمراجع12,13. اضبط تركيز hypericin في جسيمات البوليمر النانوية مع PBS إلى 10 ميكرومتر12,13.
5. PDD و PDT
- إجراء PDD
- في ظل ظروف معقمة ، ضع المحسس الضوئي (hypericin ، الجسيمات النانوية البوليمرية المحملة ب hypericin ، أو hypericin مع حامل البروتين الدهني) على سطح CAM ، مع أو بدون خلايا الورم (ED 7-9).
- قم بإضاءة CAM باستخدام ضوء الإثارة البنفسجي (ضوء LED دائري مخصص بطول موجي 405 نانومتر) وسجل تألق hypericin في أنسجة CAM والخلايا السرطانية باستخدام كاميرا رقمية على فترات زمنية من 0 و 1 و 3 و 5 و 24 و 48 ساعة بعد إعطاء hypericin.
- إذا كان البحث يتطلب صورة لل CAM في الضوء الأبيض ، فقم بتسجيل CAM قبل إعطاء hypericin وفي نهاية التجربة ، قبل وقت قصير من تثبيت الأنسجة ، حيث يؤثر الضوء على التنشيط الضوئي ل hypericin.
- تقييم شدة التألق باستخدام برنامج معالجة الصور وتحليلها (على سبيل المثال، ImageJ22).
- قسم قنوات صور RGB إلى صور منفصلة باللون الأحمر والأخضر والأزرق. تحليل صورة الكثافة الحمراء في شكل 8 بت. تقييم الكثافة الحمراء من المنطقة داخل الحلقة وتقريبها على أنها تألق hypericin. احصل على مخططات ملف تعريف الصورة بالكامل (باستخدام المكون الإضافي ImageJ's Profile Plot) على فترات زمنية مختلفة بعد إدارة hypericin (أي من 0 ساعة ، مباشرة بعد الإدارة ، حتى 48 ساعة).
- إجراء PDT
- قم بإجراء PDT لمدة 3 ساعات على الأقل بعد تطبيق hypericin.
- ضع الألياف البصرية فوق سطح CAM لأشعة الليزر لتغطية المنطقة بأكملها داخل حلقة السيليكون.
- أداء التشعيع في الجسم الحي (1-2 دقيقة) مع ضوء ليزر 405 نانومتر بمعدل طلاقة 285 mW / cm2.
- سجل CAM باستخدام الضوء الأبيض وضوء الفلورسنت 405 نانومتر قبل وبعد المعالجة الضوئية الديناميكية (24 ساعة و 48 ساعة).
- اكتشف التلف الضوئي 24 ساعة و 48 ساعة بعد PDT من الصور التي تم التقاطها في الضوء الأبيض. تقييم تلف الأوعية الدموية بدرجة شبه كمية16: 1 - لا تدمير ؛ 2 - الإغلاق الجزئي للشعيرات الدموية (قطرها ≤10 ميكرومتر) دون تدمير الأوعية المتوسطة أو الكبيرة (قطرها ≥50 ميكرومتر) والأوعية الأصغر (قطرها 10-50 ميكرومتر) ؛ 3 - الإغلاق الجزئي للأوعية الصغيرة مع اختفاء الشعيرات الدموية ؛ 4 - الإغلاق الجزئي للأوعية الكبيرة مع اختفاء الأوعية الصغيرة والشعيرات الدموية ؛ و 5 - تجلط الصورة الكلي مع اختفاء معظم الأوعية.
الشكل 4: علاج الطب التكميلي والبديل بضوء الليزر. تم التقاط هذه الصورة لأغراض توضيحية. بالنسبة ل PDD أو PDT ، يجب أن تكون الغرفة مظلمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
6. إعداد الطب التكميلي والبديل لمزيد من التقييم
- تضمين البارافين
- إصلاح الأنسجة CAM في لوحة زراعة مع 4٪ paraformaldehyde (PFA) في PBS لمدة لا تقل عن 2 ساعة وبحد أقصى بين عشية وضحاها.
- قم بإزالة PFA وقطع بعناية من CAM جزءا من الأنسجة داخل حلقة السيليكون.
- جفف أنسجة CAM على الفور في سلسلة الكحول الصاعدة على النحو التالي. ضع نسيج CAM في 70٪ من الإيثانول لمدة 3 دقائق ، ومحلول الإيوسين لمدة دقيقتين (لتسهيل تحديد موقع الأنسجة في كتلة البارافين) ، و 96٪ من الإيثانول لمدة 3 × 5 دقائق (دائما في طبق بتري جديد) ، و 100٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق والزيلين لمدة 2 × 10 دقائق.
- باستخدام ملعقة أو فرشاة رقيقة ، انقل العينات في أسرع وقت ممكن إلى البارافين المذاب في أطباق بتري (59 درجة مئوية). بعد 24 ساعة ، ضع الأنسجة في قالب نسيجي ، واملأها بوسط تضمين البارافين ، واتركها تتصلب في الثلاجة. اقطع CAM المتصلب من وسط التضمين ، وقلبه في الدرج بمقدار 90 درجة ، واملأه مرة أخرى بوسط التضمين ، واتركه يتصلب.
- قم بإعداد أقسام 5-10 ميكرومتر على ميكروتوم للتحليل النسيجي المرضي لتحديد الضرر الناجم عن PDT.
- إعداد أقسام الطب التكميلي والبديل المجمدة لعلم الأنسجة
ملاحظة: بالنسبة لبعض المنهجيات بما في ذلك علم الأنسجة ، فإن الأقسام المجمدة المعدة على microtome cryostat هي أكثر ملاءمة. اتبع الخطوات التالية لإعداد أقسام CAM المجمدة.- قم بتركيب CAM الأصلي أو 4٪ الثابت بارافورمالدهيد بعناية على الشريحة الزجاجية.
- املأ قالب التضمين إلى النصف بمركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) وقم بتجميده في النيتروجين السائل أو خليط من الثلج الجاف والإيثانول.
- بعد التجميد ، قم بإمالة CAM بعناية وتحريكها من الشريحة الزجاجية إلى الجزء العلوي من وسط OCT المجمد. ضعه مرة أخرى في القالب ، وقم بتغطيته بوسط OCT ، وقم بتجميده كما في الخطوة 6.2.2.
- التحليل الكسري للسمان CAM
ملاحظة: يمكن تقييم التغيرات الوعائية الناجمة عن PDT عن طريق حساب معامل البعد الكسري19.- في خزانة التدفق الرقائقي ، تفيض CAM في صفيحة زراعة بمحلول تثبيت تم تسخينه مسبقا (37 درجة مئوية) بنسبة 4٪ paraformaldehyde و 2٪ glutaraldehyde في PBS.
- قم بإزالة محلول التثبيت بعد 48 ساعة. افصل CAM بعناية عن الجنين باستخدام مقص دقيق وفرشاة دقيقة واغسله في PBS.
- قم بتركيب CAM المغسول على شريحة زجاجية واتركه يجف ببطء.
- صور الشريحة باستخدام كاميرا رقمية وجهاز إضاءة كمصدر للضوء الأبيض المتجانس.
- معالجة الصور الرقمية باستخدام برنامج ImageJ22. للتحليل، حدد منطقة مربعة (512 × 512 بكسل) من المنطقة ذات الفروع الشريانية البعيدة. قم بربط الصور وهيكلها العظمي وحساب معامل البعد الكسري (Df) باتباع الإجراءات الموضحة في المرجع31.
- التحليل الجزيئي لأنسجة الطب التكميلي والبديل
- للتحليل الجزيئي ، افصل CAM الأصلي بعناية ، وقم بتجميده في النيتروجين السائل ، وخزنه عند -80 درجة مئوية.
- تحديد التعبير الجيني وفقا للبروتوكولات القياسية لعزل الحمض النووي الريبي23 ، والنسخ العكسي إلى cDNA ، و PCRالكمي 24.
الشكل 5: أنسجة الطب التكميلي والبديل لتحليل الكسور. بعد PDT ، يتم إصلاح CAM وتثبيته على شريحة وتجفيفه لتحليل الفركتل. تم التقاط الصورة في ضوء أبيض باستخدام جهاز إضاءة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توطين الورم على سطح CAM صعب في الضوء الأبيض. من المتوقع أن يتم تناول المحسس الضوئي (هنا ، hypericin) المستخدم في PDD بشكل انتقائي من قبل الورم ويساعد على تصور الورم. أظهرت إضافة hypericin واستخدام ضوء الفلورسنت (على سبيل المثال ، 405 نانومتر) موضع الورم (سرطان الخلايا الحرشفية TE1) بشكل جيد للغاية (الشكل 6A). أظهر التحليل النسيجي أن الخلايا السرطانية الحيوية تغزو الأنسجة السليمة. كانت الهياكل متحدة المركز للخلايا الحرشفية غير الطبيعية، والتي غالبا ما توصف في أنسجة سرطان الخلايا الحرشفية (لؤلؤ الكيراتين)، مرئية (الشكل 6B). كان نمو الورم مصحوبا بوذمة وسماكة الغشاء.
الشكل 6: سرطان الخلايا الحرشفية TE1 الورم ينمو على سطح CAM . (A) تم التقاط الصورة باستخدام الضوء الأبيض (يسار) وضوء LED 405 نانومتر (يمين) مع إضافة hypericin. يتم تصور وتحديد مدى نمو الورم بشكل أفضل. (ب) المقطع العرضي للورم الذي ينمو على سطح الطب التكميلي والبديل، مع وجود نقائل (M، لؤلؤ الكيراتين) في أنسجة الطب التكميلي والبديل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يتم استخدام محسس ضوئي وتعرض أطول للأنسجة مع ضوء مركز عالي الكثافة في PDT. يؤثر هذا العلاج على الأوعية الدموية CAM ، مما يسبب تجلط الدم ، وإغلاق الأوعية الكبيرة ، واختفاء الأوعية الصغيرة والشعيرات الدموية (الشكل 7). تأثرت المنطقة التي تم فيها تطبيق العلاج (داخل حلقة السيليكون) ، وكان هناك اختلاف واضح في كثافة الأوعية داخل الحلقة وفي المنطقة المحيطة بها.
الشكل 7: مثال على التغيرات في الأوعية الدموية CAM 24 ساعة بعد PDT. تسبب العلاج بالليزر في اختفاء معظم الشعيرات الدموية ، ومقارنة كثافة الأوعية داخل وخارج منطقة العلاج في حلقة السيليكون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لم يتسبب ضوء الليزر المستخدم في PDT دون وجود محسس ضوئي في أي ضرر (الشكل 8 ، الخط الأوسط ، "التشعيع فقط") ، مقارنة بالتحكم دون أي علاج (الشكل 8 ، السطر العلوي ، "التحكم"). يظهر خلاصة الصور تغيرات في تألق hypericin في الوقت المناسب ، بسبب مونوميرات hypericin10 المجمعة. تم تطبيق PDT بعد 3 ساعات من الحضانة مع hypericin وبعد 2 ساعة كانت هناك تغييرات واضحة بالفعل. تظهر صورة الضوء الأبيض التي التقطت بعد 24 ساعة من العلاج أضرارا جسيمة في الأوعية الدموية.
الشكل 8: التغيرات في شدة التألق وكثافة الأوعية الدموية CAM بعد إعطاء hypericin وتشعيع الليزر (PDT). تم التقاط الصور في 0 و 1 و 3 و 5 و 24 ساعة باستخدام ضوء 405 نانومتر وضوء أبيض. الخط العلوي من الصور يتوافق مع التحكم بدون علاج. الخط الأوسط للصور يتوافق مع تشعيع الليزر فقط (أي بدون hypericin) ؛ تم تطبيق تشعيع الليزر (2 دقيقة ، 405 نانومتر ضوء الليزر ، معدل الطلاقة 285 mW / cm2) بعد 3 ساعات من إعطاء hypericin. خلاصة الصور تتوافق مع العلاج مع هايبريسين وتشعيع الليزر (PDT) ؛ تم تطبيق تشعيع الليزر بعد 3 ساعات من الحضانة مع hypericin. تظهر الصور بوضوح الأضرار التي لحقت الأوعية الدموية CAM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
PDT أثرت سلبا على بنية الأنسجة CAM. وكشف التحليل النسيجي (الشكل 9) أن التحكم غير المعالج في الطب التكميلي والبديل له سمك متساو نسبيا؛ ومع ذلك ، تسبب علاج PDT في أن يصبح CAM أرق وأكثر هشاشة.
الشكل 9: التحليل النسيجي للتحكم وأنسجة الطب التكميلي والبديل المعالجة بتقنية PDT. (أ) المقطع العرضي للتحكم غير المعالج CAM. سمك CAM متساو نسبيا. (ب) المقطع العرضي للتكويد بعد علاج PDT. بالمقارنة مع التحكم ، فإن CAM أرق وأكثر هشاشة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لنجاح زراعة البيضة السابقة ، من المهم اتباع البروتوكول أعلاه. علاوة على ذلك ، إذا لم يتم فتح البيض بعناية كافية أو لم تكن هناك رطوبة كافية أثناء الزراعة ، فإن كيس صفار البيض يلتصق بالقشرة وغالبا ما يتمزق. إن بدء زراعة البيضة السابقة في وقت حوالي 60 ساعة من حضانة البيض يضمن ارتفاع معدل بقاء الأجنة على قيد الحياة ، لأنها بالفعل كبيرة بما يكفي للبقاء على قيد الحياة من المناولة. في مراحل النمو اللاحقة ، يصبح CAM أرق ويلتصق بقشر البيض ، مما يؤدي إلى تمزق الغشاء.
من يوم الحضانة 7 فصاعدا ، تكون الأجنة أقل حساسية للتحريض. تغطي منطقة CAM كامل سطح البئر تقريبا وهي جاهزة لمزيد من التجارب. على الرغم من أن الأجنة الميتة قد تمثل خطر العدوى ، إلا أنه مع طرق العمل الصحيحة في ظروف شبه معقمة على الأقل ، فإنها لا تؤثر على الأجنة الأخرى الحية في الصفيحة المكونة من 6 آبار. كان معدل البقاء على قيد الحياة لجنين السمان خارج الجسم في التجارب الحالية حوالي 80 ٪ ، وهو أفضل نسبيا من تجارب الدجاج خارج الجسم 25،26،27.
في التجارب الحالية ، تم استخدام حلقة سيليكون لتحديد مساحة العمل. حتى الآن ، لا يوجد دليل متاح على أن الحلقات وحدها لها أي تأثير على تطور أو نمو أو تكوين الأوعية الدموية لأنسجة CAM28. اختبر كوهلي وآخرون استخدام المواد الحيوية ذات الهياكل والتراكيب المختلفة في نموذج CAM للدجاج ، ولوحظت الأوعية الدموية في جميع السقالات التي تم اختبارها باستثناء السيليكون ، حيث لم يلاحظ وجود أوعية دموية تتسلل إليها29. فقط التعامل مع الحلقة بلا مبالاة يمكن أن يسبب نزيف الطب التكميلي والبديل ويقلل من بقاء الأجنة.
نظرا لخصائصه ، يمثل نموذج CAM هذا بديلا قابلا للتطبيق ومفيدا اقتصاديا للحيوانات المختبرية ، مثل الفئران أو الجرذان أو الأرانب ، خاصة لمراقبة تغير الأوعية الدموية خلال PDT30. كما أنها مناسبة لمراقبة تغيرات التعبير الجيني وتغيرات الأنسجة على المستوى النسيجي24. يحتوي هذا النموذج الذي يعاني من نقص المناعة بشكل طبيعي على شبكة وعائية غنية ومرئية بسهولة تسمح بتصور في الوقت الفعلي للفحوصات13,31.
من السهل فتح قشر بيض السمان ، وزراعة البيضة السابقة بسيطة وتتطلب مساحة أقل للتخزين30. تطور جنين السمان قصير ويسمح بدوران مرتفع للتجارب. ومع ذلك ، يمكن أن يكون هذا التطور السريع عيبا في التجارب التي تتطلب المزيد من الوقت (على سبيل المثال ، لتطوير الورم ونموه) ، لأن النافذة التجريبية هي بحد أقصى 7 أيام. من بين العيوب الأخرى لاستخدام السمان هو الدستور الأكثر حساسية للجنين وحساسيته للتلوث. الحجم الصغير للسمان CAM يقيد تطبيق العديد من المواد التجريبية10.
يمكن أن تعرض صور الضوء الأبيض أوراما أكبر ومحددة جيدا بشكل جيد ، ولكن التصوير الفلوري هو أداة جذابة للغاية للكشف عن الأمراض ، خاصة بالنسبة للأورام الصغيرة جدا أو مجموعات الخلايا السرطانية32 ، ربما لتصور حواف الآفة. لوحظ تراكم أعلى من المحسسات الضوئية في منطقة الورم ، لذلك فإن التشخيص الضوئي الديناميكي مفيد جدا في التوطين المبكر أو أثناء الإزالة الجراحية. تستخدم المرشحات البصرية أيضا للحصول على الصورة بشكل صحيح32 ؛ غير أنه في هذه الحالة، التقطت الصور بدون مرشحات خاصة. استخدام مثل هذا التصوير (بدون نظام كتلة) هو ، على سبيل المثال ، في التنظير الداخلي و PDD من أورام المثانة البولية والأورام الدبقية ، لذلك لديه تطبيق سريري مناسب.
على الرغم من بعض العيوب ، فإن فحص CAM للسمان الياباني هو أداة رائعة لاختبار الأدوية الجديدة وتطوير تقنيات فوتونية حيوية جديدة ، بالإضافة إلى التشخيص والعلاج الضوئي الديناميكي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم العمل من قبل VEGA 2/0042/21 و APVV 20-0129. مساهمة V. Huntošová هي نتيجة لتنفيذ المشروع: مجتمع علمي مفتوح للبحوث الحديثة متعددة التخصصات في الطب (اختصار: OPENMED) ، ITMS2014 +: 313011V455 بدعم من البرنامج التشغيلي للبنية التحتية المتكاملة ، بتمويل من ERDF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
| CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
| digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
| diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
| eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| incubator Bios Midi | Bios Sedl any, Czech Republic |
Forced draught incubator for initial incubation | |
| incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
| Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
| LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
| macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
| microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
| microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
| scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
| software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
| stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
| stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |
References
- Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
- van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation. Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).
- Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R.
- De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).
- Sandau, K., Kurz, H. Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis. Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).
- Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marmé, D., Christ, B. Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application. Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).
- Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model. Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).
- Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).
- Miškovský, P. Hypericin - a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules. Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).
- Čavarga, I., et al. Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model. Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).
- Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro. Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).
- Datta, S., et al. Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery. Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).
- Huntošová, V., et al. Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin. Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).
- Buríková, M., et al. Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery. General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).
- Lenkavska, L., et al. Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).
- Rück, A., Böhmler, A., Steiner, R. PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).
- Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).
- Buzzá, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).
- Dougherty, T. J., et al.
- Xiang, L., et al. Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J.
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Máčajová, M., Čavarga, I., Sýkorová, M., Valachovič, M., Novotná, V., Bilčík, B. Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model. Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).
- Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials. ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).
- Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).
- Merlos Rodrigo, M. A., et al. Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells. Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).
- Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica). Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).
- Kohli, N., et al. Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications. Biology-Basel. 10 (4), 301 (2021).
- Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).
- Buzzá, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., Gómez-García, P. B., Kurachi, C. Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).
