Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה אמינה ופשוטה לגידול, איסוף וסינון של Ditylenchus dipsaci.
Abstract
נמטודות טפיליות של צמחים (PPNs) הורסות יותר מ-12% מגידולי המזון העולמיים מדי שנה, מה שמשתווה לכ-157 מיליארד דולר (דולר ארה"ב) שאבדו מדי שנה. עם אוכלוסייה גלובלית הולכת וגדלה וקרקע חקלאית מוגבלת, שליטה בהתפשטות PPN היא קריטית לייצור מזון. לאתגר של מקסום תפוקת היבולים מתווסף ההגבלות הגוברות על חומרי הדברה יעילים בגלל היעדר סלקטיביות של נמטודות. לפיכך, פיתוח נמטידים כימיים חדשים ובטוחים הוא חיוני לביטחון התזונתי. בפרוטוקול זה, התרבות והאיסוף של מיני PPN Ditylenchus dipsaci מודגמים. D. dipsaci הוא גם מזיק מבחינה כלכלית וגם עמיד יחסית לרוב הנמטידים המודרניים. העבודה הנוכחית גם מסבירה כיצד להשתמש בנמטודות אלה במסכים עבור נמטידים חדשים של מולקולות קטנות ומדווחת על מתודולוגיות איסוף וניתוח נתונים. הצינור המודגם מעניק תפוקה של אלפי תרכובות בשבוע וניתן להתאים אותו בקלות לשימוש עם מיני PPN אחרים כגון Pratylenchus penetrans. ניתן להשתמש בטכניקות המתוארות כאן כדי לגלות נמטידים חדשים, אשר בתורם עשויים להתפתח עוד יותר למוצרים מסחריים סלקטיביים ביותר הנלחמים בבטחה ב-PPNs כדי לעזור להאכיל עולם רעב יותר ויותר.
Introduction
נמטודות טפיליות-צמחיות (PPNs) מוערכות כאחראיות לאובדן של 12.3% מייצור המזון העולמי וגורמות לנזק מוערך של 157 מיליארד דולר בשנה ב-1,2,3. למרבה הצער, היכולת לשלוט ב-PPNs הולכת ופוחתת מכיוון שנמטידים כימיים יעילים נאסרו או עומדים בפני הגבלות הולכות ומסלימות בגלל בטיחות האדם וחששות סביבתיים. הסיבה העיקרית לכך היא סלקטיביות הנמטודה הלקויה של הדורות הקודמים של חומרי הדברה4. במהלך 25 השנים האחרונות, שישה נמטידים כימיים חדשים נוסו או הוכנסו לשוק5. אחד מהם כבר נאסר לשימוש באירופה, ואחר הופסק תוך כדי חקירה על השפעתו על 6,7 בני אדם. לפיכך, יש צורך דחוף בנמטידים חדשים שהם סלקטיביים מאוד עבור PPNs.
נמטודת הגזע והפקעת, Ditylenchus dipsaci (D. dipsaci) היא נמטודת גזע ופקעת בעלת השפעה כלכלית PPN 4. D. dipsaci מדביק כמעט 500 מיני צמחים על פני 30 גזעים ביולוגיים ומכוון לכמה מהגידולים החשובים ביותר מבחינה חקלאית כגון שיפון, שיבולת שועל, שום, בצל וכרישה 8,9. לדוגמה, D. dipsaci ניתק לאחרונה שדות שום באונטריו ובקוויבק, וכתוצאה מכך הפסדים של עד 90%10,11. תפוצתו הגיאוגרפית נמצאת כמעט בכל מקום וכוללת את יבשת אמריקה (כולל קליפורניה ופלורידה), אירופה, רוב אסיה (כולל סין) ואוקיאניה9. D. dipsaci הוא אנדופראזיט נודד שנכנס לסטומה על עלים או פצעים ולנטיקלים, שם הם משחררים אנזימים כדי לפרק את דופן התא12. בנוסף להשפעה של D. dipsaci על יבולים, הנזק שנגרם על ידי PPN הופך את הצמח לרגיש לזיהום משני11. למרבה הצער, D. dipsaci מראה רמות סבילות גבוהות לנמטידים הנוכחיים בהשוואה לזני נמטודות אחרים13,14.
פרוטוקול זה מתאר את התרבות של D. dipsaci, ואת השימוש בו במסכים בקנה מידה גדול עבור נמטידים מועמדים למולקולות קטנות. בקצרה, אוכלוסיות D. dipsaci נשמרות ומורחבות על צמחי אפונה מתורבתים במדיה סטרילית של גמבורג B-5 (GA)15. לפני גידול נבטי זרעים על מדיום GA, יש לעקר את הזרעים באמצעות סדרה של שטיפות ולצפות אותם על אגר מזין (NA) כדי לבדוק זיהום. עיקור זרעים חיוני לאיתור מזהמים חיידקיים ופטרייתיים שעשויים להיות נוכחים. הזרעים שאינם מזוהמים מועברים לאחר מכן לצלחות GA, שם יגדלו נבטי הזרעים כהכנה לזיהום. לוחות GA המכילים נבטי זרעים נגועים בנמטודות מצלחת תרבית קודמת על ידי העברת חתיכת אגר המכילה רקמת שורש לצלחות הטריות. לאחר 6-8 שבועות, הנמטודות מופקות ממדיית GA ומסוננות דרך משפך מרופד במסנן קפה לכוס איסוף. ניתן להשתמש בנמטודות בבדיקות ביולוגיות שונות לאחר שנאסף מספר מתאים. הטכניקה המתוארת בפרוטוקול זה מייצרת כ-15,000 D. dipsaci לכל צלחת תרבית. פרוטוקולים חלופיים לטיפוח D. dipsaci פורסמו16,17.
כאן מתוארת גם בדיקת סינון מולקולות קטנות במבחנה המבוססת על עבודות קודמות18. כמיופה כוח של בריאות התולעים, הניידות של 20 נמטודות לכל באר נבדקת לאחר 5 ימים של חשיפה למולקולות קטנות. כדי לדמיין טוב יותר את ניידות התולעים, NaOH מתווסף כדי להגביר את התנועה של תולעים חיות19,20. פרוטוקול זה מאפשר סינון בתפוקה בינונית ומספק נתונים חשובים להערכת הפוטנציאל הנמטיסידי של מולקולות קטנות. אם נעשה שימוש בטכניקת איסוף נמטודות אחרת16,17, ניתן בכל זאת ליישם את מתודולוגיית סינון המולקולות הקטנות המתוארת כאן.
Protocol
זן D. dipsaci G-137 המשמש לעבודה הנוכחית נאסף מאגם הדגים 4 מגוון שום במחוז הנסיך אדוארד וסופק על ידי חקלאות ומזון חקלאי קנדה. אם מתחילים תרבות חדשה, התייעצו עם Poirier et al. למתודולוגיית חיסון15.
1. התרבות של ד. דיפסאצ'י
- הכן את המדיה והצלחות בעקבות עבודה שדווחה בעבר15.
- הכינו 500 מ"ל של מדיית אגר מזין (NA) עם 23 גרם לליטר של NA (ראו טבלת חומרים) ומים אולטרה-פוריים. בטכניקה סטרילית, מוזגים 25 מ"ל של מדיית NA אוטוקלבית לתוך 20 כלי פטרי חד פעמיים (קוטר 100 מ"מ x 15 מ"מ עומק). אפשרו לאגר להתמצק בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס) עם המכסה דולק למשך כ-2 שעות והניחו בצד לשימוש מאוחר יותר.
- הכינו 500 מ"ל של מדיה מסוג Gamborg B-5 (GA) המכילה 3.2 גרם/ליטר של מדיום בסיסי GA עם חומרים אורגניים מינימליים, 20 גרם/ל' של סוכרוז, 15 גרם/ל' של אגר ומים מזוקקים (ראו טבלת חומרים). בטכניקה סטרילית, יוצקים 50 מ"ל של מדיית GA אוטוקלבית ב-10 כלי פטרי חד פעמיים (קוטר 100 מ"מ x 25 מ"מ עומק). אפשרו לאגר להתמצק בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס) כשהמכסה דולק למשך כ-5 שעות ומאחסנים זקוף בטמפרטורת החדר בשקית סטרילית עד להעברת הנבטים.
הערה: צלחות מדיה עודפות נעשות במקרה של זיהום מתרחש.
- בצע עיקור זרעים בשיטה ששונתה מעבודה קודמת15.
- אוטוקלאב אחת של 2 ליטר עם מוט ערבוב, 2 מלקחיים, צלחת פטרי מזכוכית ו-1 ליטר מים מזוקקים. הכינו 200 מ"ל של תמיסת EtOH של 95% ו-200 מ"ל של תמיסת אקונומיקה מסחרית של 15%.
- השתמש בזרעי אפונה (ראה טבלת חומרים). יוצקים 150 זרעים לכוס 2 ליטר סטרילית עם מוט ערבוב ליד להבת מבער בונזן על ספסל מעבדה.
- מוסיפים 200 מ"ל של 95% EtOH לזרעים שבתוך הכוס, מערבבים במרץ על צלחת הערבוב למשך 5 דקות, ואז שופכים את EtOH במיכל פסולת.
- יוצקים תמיסת אקונומיקה לתוך הכוס כדי לטבול לחלוטין את הזרעים. מערבבים במרץ על צלחת ערבוב במשך 20 דקות ואז שופכים אקונומיקה במיכל פסולת.
- יוצקים מים מזוקקים לתוך הכוס כדי לטבול זרעים ולערבב במרץ על צלחת ערבוב במשך 20 דקות. יש לחזור על שטיפת המים שלוש פעמים, ולמזוג מים מזוקקים לאחר כל שטיפה. לאחר שטיפת המים הסופית, יוצקים זרעים מעוקרים לתוך צלחת הפטרי הכוס.
- כדי לבדוק זיהום, העבירו 6 זרעים לכל צלחת NA בגודל 10 ס"מ (שהוכנה בשלב 1.1.1) במכסה המנוע הלמינרי באמצעות מלקחיים מעוקרים. סדרו את הזרעים סביב היקף הצלחת (זרעים שמנמנים עובדים הכי טוב). עטפו את הצלחות בנפרד בסרט עטיפה במעבדה ודגרו בחושך במשך 3 ימים בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס.
הערה: ציפוי יותר זרעים מהנדרש יאפשר שימוש סלקטיבי בזרעים שאינם מזוהמים.
- בצע את העברת הנבטים לאחר השלב הבא.
- במכסה זרימה למינרי, השתמש במלקחיים מעוקרים כדי לצלוח 2 זרעים לא מזוהמים על כל צלחת GA (הוכן בשלב 1.1.2). עוטפים את הצלחות בנפרד בסרט עטיפה במעבדה ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 7-10 ימים כדי לאפשר לזרעים לנבוט.
- בצע גידול במבחנה בשיטה ששונתה מעבודה קודמת15.
- הכינו 50 מ"ל של תמיסת סוכרוז 20 גרם/ל'. המסנן מעקר את תמיסת הסוכרוז ומניח בצד.
- במכסה גלימה למינרי, חותכים חתיכת אגר המכילה רקמת שורש (כ-2 ס"מ3) מלוח תרבית קיים. פיפטה 500 μL של תמיסת סוכרוז על צלחת GA חדשה עם שתילי אפונה ומניחים קוביית אגר על גבי סוכרוז. עוטפים את הצלחות בנפרד בסרט עטיפה במעבדה ושומרים על התרבית בקופסה מרופדת בנייר אלומיניום בטמפרטורת החדר (~22 מעלות צלזיוס).
- נמטודות תת-תרבותיות על צלחות GA טריות כל 8-9 שבועות כדי לשמור על התרבות. נמטודות מוכנות לחילוץ לאחר כ-8 שבועות.
2. מיצוי ואיסוף של ד. דיפסאצ'י
- בצע את החילוץ של D. dipsaci לאחר השלבים הבאים.
- Autoclave 50 מל, משפך 80 ממ, 150 מל מים מזוקקים, ומסנני קפה. מכניסים את המשפך לכוס ומרפדים את המשפך במסנן קפה סטרילי.
- במכסה זרימה למינרי, חותכים את האגר ואת רקמת השורש ל-1 ס"מ3 באמצעות אזמל סטרילי. מעבירים את קוביות האגר לתוך המשפך המרופד במסנן הקפה ושופכים באיטיות מים מזוקקים על האגר כדי להרטיב את מסנן הקפה.
- מוציאים את המשפך המרופד במסנן הקפה מהכוס וממלאים את הכוס במים מזוקקים עד שמפלס המים פשוט נוגע בתחתית המסנן ברגע שמחליפים את המשפך המרופד במסנן הקפה.
- מכסים את המשפך והכוס מרופדים במסנן קפה בנייר אלומיניום. השאירו את הלילה (16 שעות) על הספסל כדי לאפשר לתולעים לעבור דרך מסנן הקפה לתוך האיסוף.
הערה: צלחת תרבית נמטודה מוכנה למיצוי כאשר תולעים זחלו לתוך האגר כאשר נבדקו באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה. בדרך כלל, צלחת מוכנה למיצוי 6-8 שבועות לאחר החיסון הראשוני שלה.
- בצע את האוסף של D. dipsaci.
הערה: למחרת, תולעי D. dipsaci ישקעו לתחתית הכוס.- הסר את משפך הקפה המרופד במסנן הקפה ושאף את 40 מ"ל המים העליונים מכוס האיסוף; להבטיח לא לשבש את התולעים המיושבות. באמצעות פיפטה סרולוגית מפלסטיק 10 מ"ל, אספו את הנוזל הנותר לתוך צינור צנטריפוגה חרוטית בגודל 15 מ"ל.
הערה: ניתן להשתמש באוסף זה ישירות במבחנים. יש להניח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס אם לא ייעשה בהם שימוש תוך 24 שעות. ניתן להשאיר את התולעים למשך 3 ימים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ללא השפעה נראית לעין על הניידות. הסרת המשפך עלולה להפריע לתולעים בכוס הקולקציה. תנו להם להתיישב בתחתית לפני האיסוף.
- הסר את משפך הקפה המרופד במסנן הקפה ושאף את 40 מ"ל המים העליונים מכוס האיסוף; להבטיח לא לשבש את התולעים המיושבות. באמצעות פיפטה סרולוגית מפלסטיק 10 מ"ל, אספו את הנוזל הנותר לתוך צינור צנטריפוגה חרוטית בגודל 15 מ"ל.
3. מסך מולקולה קטנה במבחנה
- הכן את לוחות הבדיקה בהתאם לשלבים הבאים.
- יוצקים מים מזוקקים אוטוקלאבים לתוך שוקת סטרילית, ובאמצעות פיפטה רב-ערוצית, מפזרים 40 μL של מים מזוקקים מהשוקת לכל באר של צלחת שטוחה בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות.
- הכינו כלי הצמדה והוסיפו את הכימיקלים
- הציבו מגשי פינר (ראו טבלת חומרים) ליד להבת מבער בונזן על ספסל מעבדה. הוסיפו את הדברים הבאים למגשי הפינרים הבאים: 25 מ"ל של תמיסת ניקוי פינים, 35 מ"ל של 50% DMSO (במים), 45 מ"ל של מים מזוקקים, 55 מ"ל של 70% EtOH ו-65 מ"ל של 95% EtOH. הניחו פיסת נייר מכתימה אחת לפני כל מגש
- נקו את כלי ההצמדה על ידי הוספת הפינים בתמיסת הניקוי והזזת הפינים למעלה ולמטה שלוש פעמים (3x) בתמיסה. בפרוטוקול זה, '3x' ו- '10x' מוגדרים כהזזת הפינר למעלה ולמטה בתמיסה שלוש או עשר פעמים, בהתאמה. כתם את הסיכות על נייר הכתם. חזור על הליך זה פעם נוספת.
- לאחר מכן, יש לשטוף את הפינים פי 3 במים מזוקקים, ולאחר מכן להכתים את הפינים. חזור על ההליך פעם נוספת.
- לבסוף, יש לשטוף את הפינים פי 3 ב-95% EtOH, ולאחר מכן לטשטש את הפינים. חזור על הפעולה פעם נוספת. להצית את הפינר ולאפשר לאתנול להתאדות.
- הוסיפו כימיקלים מלוחות המלאי הכימיים בני 96 הבארות כדי לבדוק לוחות על ידי הצמדת 3x לתוך הלוח הכימי, ולאחר מכן העברת הפינים 10X לתוך לוחית הבדיקה. כתם על נייר מול תמיסת הניקוי.
- נקה את כלי ההצמדה בין הצלחות על ידי שטיפה בסדר הבא, כתם בין לבין על נייר כתם: 3x ב-50% DMSO (פעם אחת), 3x במים מזוקקים (פעם אחת), 3x ב-75% EtOH (פעם אחת), 3x ב-95% EtOH (פעמיים). להצית את הפינר ולאפשר לאתנול להתאדות.
- חזור על שלב 3.2.2 כאשר כל ההצמדה הושלמה.
הערה: ההקרנה בוצעה בריכוז סופי של 60 מיקרומטר.
- תוספת של תולעים
- ספרו את מספר הנמטודות מהאוסף על ידי החייאה תחילה ולאחר מכן טפטוף של 5 μL באמצעות קצוות שמירה נמוכים על שקופית לצורך תצפית. ספרו את מספר הנמטודות ב-5 μL באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה.
- התאימו את הריכוז ל-2 תולעים/μL באמצעות מים מזוקקים סטריליים. באמצעות פיפטה רב-ערוצית ושוקת, הוסיפו 10 μL (כ-20 תולעים) לכל באר של לוחות 96 הבאר.
הערה: כ-15,000 נמטודות D. dipsaci ייאספו לכל צלחת תרבית בשיטת התרבות והאיסוף המתוארת. עשרים תולעים משמשות לכל באר מכיוון שהמספר הקטן מקל על הדמיה ברורה וחשבונאות של ניידים וחסרי תנועה.
- התאימו את הריכוז ל-2 תולעים/μL באמצעות מים מזוקקים סטריליים. באמצעות פיפטה רב-ערוצית ושוקת, הוסיפו 10 μL (כ-20 תולעים) לכל באר של לוחות 96 הבאר.
- אטמו את הצלחות בסרט עטיפה במעבדה ועטפו במגבת נייר לחה. מניחים בקופסה ומדביקים על כרית דביקה באינקובטור רועד ב-20 מעלות צלזיוס שנקבע ב-200 סל"ד. יש לוודא שהצלחות מתייצבות בקופסה על ידי הוספת מגבת נייר לחה במיוחד כדי להבטיח תנועה מינימלית של הצלחות.
- ספרו את מספר הנמטודות מהאוסף על ידי החייאה תחילה ולאחר מכן טפטוף של 5 μL באמצעות קצוות שמירה נמוכים על שקופית לצורך תצפית. ספרו את מספר הנמטודות ב-5 μL באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה.
4. איסוף וניתוח נתונים
- שימו לב ללוחות ביום 5 תחת מיקרוסקופ מנתח. ספרו את מספר המכשירים הניידים ואת המספר הכולל של D. dipsaci בבקרות ממסים של DMSO ובבארות שטופלו בתרופות.
- אם התולעים חסרות תנועה יחסית, הוסיפו 2 μL של 1 M NaOH לריכוז סופי של 40 mM לבאר כדי לעורר תנועה19,20.
הערה: לאחר הוספת NaOH, תולעים יזוזו באופן מיידי ויש לצפות בהן תוך 5 דקות. מספר התולעים הניידות והמספר הכולל של התולעים ישמשו לחישוב שיעור התולעים הניידות. אורך הבדיקה עשוי להשתנות בהתאם למטרת המסך.
- אם התולעים חסרות תנועה יחסית, הוסיפו 2 μL של 1 M NaOH לריכוז סופי של 40 mM לבאר כדי לעורר תנועה19,20.
- חשב את שיעור התולעים הניידות. במסכי D. dipsaci , בארות שהניבו באופן משוחזר 0% תולעים ניידות מסווגות כלהיטים חזקים.
הערה: חשיפה ממושכת של לוחות בשלב של מיקרוסקופי דיסקציה נמנעת מכיוון שמקור האור יכול לחמם את הלוחות ולגרום להשפעות משתנות על הביו-בדיקה.
Representative Results
שכפולים עצמאיים חושפים להיטים הניתנים לשחזור
כדי להמחיש את השונות הצפויה בין המסכים המשוכפלים, האמצעים והשונות בניידות הדגימה משורטטים משלושה לוחות מייצגים ממסך עדכני (איור 1). שלושה העתקים של המסך בוצעו בשלושה ימים שונים. לכל שלושת הלוחות יש בקרות שליליות (ממסים בלבד) (פסים כהים יותר), והדגימות בתוך הקבוצה הכילו נמטידים מבוססים. שאר התרכובות הן מספרייה מותאמת אישית המאופיינת כיום במעבדת רועי. בהשוואה למסכים דומים שנעשו עם C. elegans עם אותן מולקולות (SC, JK, PJR, תוצאות שלא פורסמו), שיעור הפגיעה ב-D. dipsaci נמוך משמעותית, וצלחות תרופות רבות אינן מראות פעילות (איור 1A). לחלק מהלוחות יש פגיעות הניתנות לשחזור מלא (איור 1B,C), בעוד שאחרות משתנות בפעילותן (איור 1C). יחסית למינים אחרים שנבדקו (לא מוצגים), D. dipsaci מראה פחות שונות בתגובתו לתרכובות. ללא קשר, שכפולים נחשבים הכרחיים בזיהוי של להיטים הניתנים לשחזור.
נמטידים שונים ביכולתם לשתק את דיטלנכוס דיפסאצ'י
מבין שבעת הנמטידים המאופיינים שנבדקו מול D. dipsaci, רק פלופירם מפגין פעילות חזקה במבחן המתואר כאן (איור 1C). זה עולה בקנה אחד עם עבודות קודמות שהראו כי D. dipsaci הוא סובלני כלפי נמטידים13,14. פלואופירם מעכב את קומפלקס II של שרשרת הובלת האלקטרונים באופן סלקטיבי של נמטודה והוא נמטיד מסחרי המשמש לשליטה במגוון של PPNs, כולל Rotylenchulus reniformis ו- Meloidogyne incognita 4,21,22. פלואופירם ואחד הנמטידים שחסרה פעילות בריכוז שנבדק (אוקסמיל)23 נחקרו ביתר פירוט באמצעות ניתוח תגובת מינון עם D. dipsaci. Fluopyram גורם להשפעה תלוית מינון לכאורה על ניידות D. dipsaci עם EC50 של 9.3 μM (עם רווח בר-סמך של 95% בין 8.2 ל-10.5 μM) (איור 2A,B). תוצאה זו צפויה על סמך תוצאות שפורסמו במבחנה מ- Storelli et al., 202013. לאוקסמיל אין השפעה משמעותית על הניידות עד לריכוז של 120 מיקרומטר (p = 0.3632, בדיקת t לא מזווגת) (איור 2C,D).
נתרן הידרוקסיד משפר את רגישות הבדיקה
בניגוד לפעילות השחייה הכמעט רציפה של C. elegans בתרבית נוזלית18, בעלי חיים מסוג D. dipsaci הם פחות ניידים באופן דרמטי. זה לא נדיר בקרב נמטודות טפיליות בתרבות16. כדי לעזור להבחין בין תולעים 'נחות' לבין תולעים חולות, 40 mM של NaOH משמשים בנקודת הקצה של הבדיקה כדי לעורר תנועה אצל אותם אנשים שמסוגלים (איור 3)19,20. טכניקה זו מאפשרת זיהוי ברור של מולקולות קטנות שמשתקות תולעים, בהתחשב בכך שכל התולעים בבארות בקרה שליליות נעות ומניבות רקע נמוך במיוחד של תוצאות חיוביות כוזבות במסך.
איור 1: דוגמאות לפלט מסך. שלושה שכפולים ביולוגיים (מעגלים פתוחים) עם D. dipsaci בוצעו כנגד המולקולות הקטנות (60 μM) בכל אחת משלושת הלוחות המוצגים. כל שלוש הצלחות כוללות 0.6% מפקדי ממס DMSO בלבד (פסים כהים יותר). למעט אם צוין אחרת עם בקרות ממסים או נמטידים ידועים, הבארות של שלוש הצלחות מכילות תרכובות דמויות תרופה לא אופייניות יחסית שנרכשו מספקים (ראו Burns et al., 2015)18. (A) צלחת קידוח בת 96 מספריית המולקולות הקטנות חסרה כל מולקולה עם פעילות ביולוגית נצפית כנגד D. dipsaci. (B) לצלחת קידוח בת 96 מספריית המולקולות הקטנות יש מולקולה בודדת המשבשת באופן משתקם את ניידות ה-D. dipsaci . (C) צלחת תרופה בת 96 באר המכילה את הנמטידים האופייניים פלואופירם (פלואו), איפרודיון (איפרו), אבמקטין (אבאם), פלואנסולפון (flue), טיוקסאזאפן (tiox), אוקסמיל (oxam) ו-wact-11. סרגלי השגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: דוגמה לתוצאות חיוביות ושליליות באמצעות בדיקת ניידות. (A) דוגמאות לפנוטיפים הטרמינליים לאחר החשיפה של D. dipsaci לריכוזים הולכים וגדלים של פלואופירם לאחר 5 ימים לפני הוספת NaOH. (B) ניתוח מינון-תגובה של תנועת D. dipsaci לאחר 5 ימים של חשיפה לריכוזים המצוינים של פלואופירם. (ג,ד) זהה ל-A,B, למעט אוקסמיל. כל גרף מציג ניסויים שנעשו בשני ימים נפרדים עם שלושה שכפולים בכל יום. ציר ה-y של כל גרף מציין את השבר הנייד של התולעים בכל באר המחושב כמספר בעלי החיים הנעים ביחס למספר הכולל של בעלי החיים בבאר. פסי השגיאה בשני הגרפים מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע. סרגל קנה המידה מייצג 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ניידות של D. dipsaci לאחר הוספת 40 mM של NaOH. ההשפעה של הוספת NaOH לדגימות D. dipsaci בנוכחות שליטה בממסים בלבד (A), tioxazafen (B), או fluopyram (C) לאחר 5 ימים של דגירה משותפת. סרגל קנה המידה מייצג 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Discussion
שלבים קריטיים
למרות הפשטות של הפרוטוקול, ישנם שלבים קריטיים בפרוטוקול הראויים לתשומת לב נוספת כדי למקסם את סיכויי ההצלחה. ראשית, הלבנת יתר של הזרעים עלולה לשבש את צמיחתם. לכן, הגבלת זמן הזרעים בתמיסת ההלבנה ל-20 דקות או פחות היא חיונית. שנית, כפי שצוין בעבר על ידי Storelli et al., הבריאות לכאורה של הנמטודות פוחתת עם הזמן כאשר מאוחסנים ב 4 ° C16. השימוש בנמטודות זמן קצר לאחר איסוףן מספק ביטחון נוסף שניתן להשיג תנאי סינון אופטימליים. אם יש צורך באחסון לטווח ארוך יותר, ודא שמכסה הצינור אינו הדוק כדי לאפשר חילופי חמצן. שלישית, ההבטחה שהאפונה תגדל על צלחות ה-NA במשך הזמן המומלץ מאפשרת לנסיין לשפוט אילו זרעים מזוהמים. רביעית, גידול יתר של האפונה על לוחות GA לפני הוספת הנמטודות יחליש את הזיהום ויפחית את תפוקת הנמטודות. לבסוף, גורמים רבים שקשה לשלוט בהם יכולים להשפיע על תוצאות הסינון. לכן, חיוני לבצע מספר מסכים משוכפלים עצמאיים בימים שונים ובאופן אידיאלי עם PPNs שנאספו מלוחות תרבות שונים כדי להבטיח את יכולת השחזור של התוצאות.
מגבלות השיטה
מגבלה לפרוטוקול היא שהוא אינו מצליח לסנכרן את השלב ההתפתחותי של התולעים שנאספו, הנעות בין צעירים למבוגרים. לפיכך, להיטים חזקים שנחשפו על ידי כל מסך הם ככל הנראה יעילים במספר שלבים. עם זאת, הפרוטוקול מגביר את הסיכון להתעלמות מלהיטים יעילים ספציפיים לבמה. שיקול שני הוא שיש לראות בסינון חוץ גופי את הצעד הראשון בצנרת גילוי הנמטיד; מבחנים מבוססי קרקע הם תוספת מצוינת לצינור לבדיקת יכולת התרגום של הלהיטים.
משמעותו ויישומו של הפרוטוקול
הפרוטוקולים המתוארים כאן פשוטים ומשוכפלים בקלות. יתר על כן, פרוטוקול זה יושם בהצלחה על PPNs אחרים במעבדה, כולל Pratylenchus penetrans, על ידי ביצוע שינויים קלים בלבד. פיתוח אמצעי בקרת PPN חדשים ובטוחים הוא חיוני כדי להבטיח ביטחון תזונתי גלובלי. זה נכון במיוחד עבור מינים כמו D. dipsaci שהם בדרך כלל סובלניים למגוון רחב של נמטידים כימיים מקובלים כיום13,14. לפיכך, לפרוטוקולים המתוארים כאן יש פוטנציאל לתרום תרומה חשובה לבריאות האדם בקנה מידה עולמי.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.
Acknowledgments
המחברים מודים לד"ר צ'ינג יו (חקלאות וחקלאות-מזון קנדה) על כך שסיפק את תרבות דיטלנכוס דיפסאצ'י ועל ייעוץ על שיטות תרבות; ד"ר בנג'מין מימי (חקלאות ומזון חקלאי קנדה) ונטלי דופינאיס (חקלאות וחקלאות-מזון קנדה) לייעוץ על תרבות חוץ גופית של נמטודות טפיליות-צמחיות; ד"ר אנדרו ברנס ושון הרינגטון להצעות מועילות על הפרויקט ועל כתב היד. JK הוא חוקר בוגר NSERC אלכסנדר גרהם בל קנדה. PJR נתמך על ידי מענק פרויקט CIHR (313296). PJR הוא יו"ר מחקר בקנדה (דרגה 1) בגנטיקה כימית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.205 | |
| 2 forceps | Almedic | 7747-A10-108 | |
| 2L beaker | Pyrex | CLS10002L | |
| 50mL beaker | Pyrex | CLS100050 | |
| 96 well plate | Sarstedt | 83.3924 | |
| aluminium foil | Alcan Plus | ||
| bacteriological agar | BioShop | AGR001.5 | |
| coffee filter | No name brand | 716 | |
| commercial bleach 6% | Lavo Pro 6 | DIN102358107 | |
| disposable petri dishes (10cm x 1.5cm) | Fisherbrand | FB0875712 | |
| disposable petri dishes (10cm x 2.5cm) | Sigma-Aldrich | Z358762 | |
| dissecting scope | Leica | Leica MZ75 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-500ML | |
| Funnel | VWR | 414004-270 | |
| Gamborg B5 | Sigma-Aldrich | G5893-10L | |
| glass petri dish | VWR | 75845-546 | |
| glass slide | MAGNA | 60-1200 | |
| Lint-Free Blotting Paper | V&P Scientific | VP 522-100 | |
| Low retention pipette tips (200uL) | LABFORCE | 1159M44 | |
| mutlichannel pipette | Eppendorf research plus | 3125000036 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| nutrient agar | Sigma-Aldrich | 70148-100G | |
| parafilm | Bemis | PM-996 | |
| pea seeds | Ontario Seed Company | D-1995-250G | |
| pin cleaning solutions | V&P Scientific | VP110A | |
| pinner | V&P Scientific | VP381N | |
| pinner rinse trays | V&P Scientific | VP 421 | |
| reagent reservoir with lid for multichannel pipettes | Sigma-Aldrich | BR703459 | |
| shaking incubator | New Brunswick Scientific | I26 | |
| sterile surgical blade | MAGNA | sb21-100-a | |
| stir bar | Fisherbrand | 2109 - 1451359 | |
| sucrose | BioShop | SUC507.1 |
References
- Sasser, J. N., Freckman, D. W. A. world perspective on nematology: the role of the society. Vistas on nematology. , Hyattsville: Society of Nematologists Inc. 7-14 (1987).
- Abad, P., et al. Genome sequence of the metazoan plant parasitic nematode Meloidogyne incognita. Nature Biotechnology. 26 (8), 909-915 (2008).
- Auwal, M., Hassan, T. H. P., Hongli, S., Jingwu, Z. Nematodes threats to global food security. Acta Agriculturae Scandinavica, Section B - Soil & Plant Science. 63 (5), 420-425 (2013).
- Chen, Z. X., Chen, S. Y., Dickson, D. W. Nematicides: Past and present uses. Nematology Vol 2, Nematode Management and Utilization. , CABI Publishing. 1179-1200 (2004).
- Desaeger, J., Wram, C., Zasada, I. New reduced-risk agricultural nematicides - and review. Journal of nematology. 52, (2020).
- Donely, N. The USA lags behind other agricultural nations in banning harmful pesticides. Environmental Health. 18 (1), 44 (2019).
- Polansek, T. Monsanto halts launch of chemical after users complain of rashes. Reuters. , (2017).
- Sturhan, D., Brzeski, M. W. Stem and bulb nematodes, Ditylenchus spp. Manual of agricultural nematology. , 423-464 (1991).
- The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). Data Sheets on Quarantine Pests; Ditylenchus dipsaci. Prepared by CABI and EPPO for the EU under Contract 90/399003. The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). , (2021).
- Quebec (Canada), Agriculture, Pêcherie et Alimentation Quebec. Réseau d'avertissements phytosanitaires (RAP). Avertissement Carotte, Céleri, Laitue, Oignon, Poireau [Warning carrot celery, lettuce, onion, leek]. Quebec (Canada), Agriculture, Pêcherie et Alimentation Quebec. , (2011).
- Abawi, G. S., Moktan, K. Bloat nematode problem on garlic: symptoms, distribution, and management guidelines. Department of Plant Pathology and Plant-microbe Biology, Geneva. , Cornell University. (2010).
- Taylor, R. Chapter 7. Nematodes and other worms. , Academic Press. 143-234 (2019).
- Storelli, A., Keiser, A., Eder, R., Jenni, S., Kiewnick, S. Evaluation of fluopyram for the control of Ditylenchus dipsaci in sugar beet. Journal of nematology. 52, 1-10 (2020).
- Oka, Y. Nematicidal activity of fluensulfone against some migratory nematodes under laboratory conditions. Pest Management Science. 70, 1850 (2014).
- Poirier, S., Dauphinais, N., Van Der Heyden, H., Véronneau, P. Y., Bélair, G., Gravel, V., Mimee, B. Host Range and Genetic Characterization of Ditylenchus dipsaci Populations from Eastern Canada. Plant disease. 103, 456-460 (2019).
- Storelli, A., Kiewnick, S., Daub, M., et al. Virulence and pathogenicity of four Ditylenchus dipsaci populations on sugar beet. Eur J Plant Pathol. 161, 63-71 (2021).
- Kühnhold, V., Kiewnick, S., Sikora, R. A. Development of an in vivo bioassay to identify sugar beet resistance to the stem nematode Ditylenchus dipsaci. Nematology. 8 (5), 641-645 (2006).
- Burns, A., Luciani, G., Musso, G. Caenorhabditis elegans is a useful model for anthelmintic discovery. Nat Communications. 6, (2015).
- Chen, S. Y., Dickson, D. W. A Technique for Determining Live Second-stage Juveniles of Heterodera glycines. Journal of nematology. 32, 117-121 (2000).
- Xiang, N., Lawrence, K. S. Optimization of In Vitro Techniques for Distinguishing between Live and Dead Second Stage Juveniles of Heterodera glycinesand Meloidogyne incognita. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
- US EPA.
- US EPA.
- US EPA. Oxamyl Facts. Prevention, Pesticides and Toxic Substances. US EPA. , (2000).
