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Biology

Culturing और स्क्रीनिंग संयंत्र परजीवी सूत्रकृमि Ditylenchus dipsaci

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63438
Automatic Translation
1,2,3, 1,3, 1,3,4
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3The Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 4Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल culturing, संग्रह, और Ditylenchus dipsaci स्क्रीनिंग के लिए एक विश्वसनीय और सरल विधि का वर्णन करता है।

Abstract

प्लांट-परजीवी नेमाटोड (पीपीएन) हर साल वैश्विक खाद्य फसलों के 12% से अधिक को नष्ट कर देते हैं, जो सालाना लगभग 157 बिलियन डॉलर (USD) के बराबर है। बढ़ती वैश्विक आबादी और सीमित कृषि योग्य भूमि के साथ, पीपीएन संक्रमण को नियंत्रित करना खाद्य उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है। फसल की पैदावार को अधिकतम करने की चुनौती को जटिल करना नेमाटोड चयनात्मकता की कमी के कारण प्रभावी कीटनाशकों पर बढ़ते प्रतिबंध हैं। इसलिए, खाद्य सुरक्षा के लिए नए और सुरक्षित रासायनिक नेमेटिकाइड्स विकसित करना महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में, पीपीएन प्रजातियों की संस्कृति और संग्रह Ditylenchus dipsaci का प्रदर्शन किया जाता है। D. dipsaci दोनों आर्थिक रूप से हानिकारक है और अधिकांश आधुनिक nematicides के लिए अपेक्षाकृत प्रतिरोधी है। वर्तमान काम यह भी बताता है कि उपन्यास छोटे अणु नेमेटिकाइड्स के लिए स्क्रीन में इन नेमाटोड का उपयोग कैसे किया जाए और डेटा संग्रह और विश्लेषण के तरीकों पर रिपोर्ट की जाए। प्रदर्शित पाइपलाइन प्रति सप्ताह हजारों यौगिकों का थ्रूपुट प्रदान करती है और इसे अन्य पीपीएन प्रजातियों जैसे कि प्रैटिलेंकस पेनेट्रांस के साथ उपयोग के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। यहां वर्णित तकनीकों का उपयोग नए नेमेटिकाइड्स की खोज के लिए किया जा सकता है, जो बदले में, अत्यधिक चयनात्मक वाणिज्यिक उत्पादों में विकसित हो सकते हैं जो तेजी से भूखी दुनिया को खिलाने में मदद करने के लिए पीपीएन का सुरक्षित रूप से मुकाबला करते हैं।

Introduction

संयंत्र-परजीवी नेमाटोड (पीपीएन) वैश्विक खाद्य उत्पादन के 12.3% के नुकसान के लिए जिम्मेदार होने का अनुमान है और सालाना 1,2,3 को अनुमानित157 बिलियन डॉलर की क्षति का कारण बनता है। दुर्भाग्य से, पीपीएन को नियंत्रित करने की क्षमता कम हो रही है क्योंकि प्रभावी रासायनिक नेमेटिकाइड्स पर प्रतिबंध लगा दिया गया है या मानव सुरक्षा और पर्यावरणीय चिंताओं के कारण बढ़ते प्रतिबंधों का सामना करना पड़ रहा है। यह मुख्य रूप से कीटनाशकों की पिछली पीढ़ियों की खराब सूत्रकृमि चयनात्मकता के कारणहै। पिछले 25 वर्षों में, छह नए रासायनिक नेमेटिकाइड्स को पायलट किया गया है या बाजार में पेश किया गयाहै। इनमें से एक को पहले ही यूरोप में प्रतिबंधित कर दिया गया है, और दूसरे को बंद कर दिया गया है, जबकि मानव हीटल 6,7 पर इसके प्रभाव के लिए जांच की जा रही है। इसलिए, नए नेमैटिकाइड्स की आवश्यकता है जो पीपीएन के लिए अत्यधिक चयनात्मक हैं।

स्टेम और बल्ब नेमाटोड, डिटिलेंकस डिप्सासी (डी. डिप्सासी) एक आर्थिक रूप से प्रभावशाली PPN4 है। D. dipsaci 30 जैविक दौड़ में लगभग 500 पौधों की प्रजातियों को संक्रमित करता है और राई, जई, लहसुन, प्याज और लीक 8,9 जैसी कुछ सबसे कृषि रूप से महत्वपूर्ण फसलों को लक्षित करता है। उदाहरण के लिए, डी डिप्सासी ने हाल ही में ओंटारियो और क्यूबेक में लहसुन के खेतों को बंद कर दिया है, जिसके परिणामस्वरूप 90% 10,11 तक का नुकसान हुआ है। इसका भौगोलिक वितरण लगभग सर्वव्यापी है और इसमें अमेरिका (कैलिफोर्निया और फ्लोरिडा सहित), यूरोप, एशिया का अधिकांश हिस्सा (चीन सहित) और ओशिनिया9 शामिल हैं। डिप्सासी एक प्रवासी एंडोपैरासाइट है जो पत्तियों या घावों और लैंटिसल्स पर स्टोमेटा में प्रवेश करता है जहां वे सेल की दीवार को तोड़ने के लिए एंजाइम जारी करते हैं। फसलों पर डी डिप्सासी के प्रभाव को जोड़ते हुए, पीपीएन के कारण होने वाली क्षति पौधे को द्वितीयक संक्रमणके लिए अतिसंवेदनशील बनाती है। दुर्भाग्य से, डी डिप्सासी अन्य नेमाटोड उपभेदों13,14 की तुलना में वर्तमान नेमेटिकाइड्स के लिए उच्च सहिष्णुता के स्तर को दिखाता है।

यह प्रोटोकॉल D. dipsaci की खेती का वर्णन करता है, और छोटे अणु उम्मीदवार nematicides के लिए बड़े पैमाने पर स्क्रीन में इसके उपयोग का वर्णन करता है। संक्षेप में, डी डिप्सासी आबादी को बनाए रखा जाता है और बाँझ गैम्बोर्ग बी -5 (जीए) मीडिया15 में सुसंस्कृत मटर के पौधों पर विस्तारित किया जाता है। जीए माध्यम पर बीज स्प्राउट्स उगाने से पहले, बीजों को धोने की एक श्रृंखला के माध्यम से निष्फल किया जाना चाहिए और संदूषण की जांच करने के लिए पोषक तत्व आगर (एनए) पर मढ़वाया जाना चाहिए। बीज नसबंदी बैक्टीरिया और कवक संदूषकों का पता लगाने के लिए आवश्यक है जो मौजूद हो सकते हैं। गैर-दूषित बीजों को तब जीए प्लेटों में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जहां बीज स्प्राउट्स संक्रमण की तैयारी में बढ़ेंगे। बीज स्प्राउट्स युक्त जीए प्लेटों को ताजा प्लेटों में जड़ ऊतक वाले आगर के एक टुकड़े को स्थानांतरित करके पिछली संस्कृति प्लेट से नेमाटोड से संक्रमित किया जाता है। 6-8 सप्ताह के बाद, नेमाटोड को जीए मीडिया से निकाला जाता है और एक कॉफी फिल्टर-पंक्तिबद्ध फ़नल के माध्यम से संग्रह बीकर में फ़िल्टर किया जाता है। एक बार एक उपयुक्त संख्या एकत्र किए जाने के बाद नेमाटोड का उपयोग विभिन्न बायोएसेस में किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीक प्रति संस्कृति प्लेट लगभग 15,000 डी डिप्सासी उत्पन्न करती है। D. dipsaci की खेती करने के लिए वैकल्पिक प्रोटोकॉल16,17 प्रकाशित किए गए हैं।

पिछले काम18 के आधार पर एक इन विट्रो छोटे अणु स्क्रीनिंग परख में भी यहाँ वर्णित है. कृमि स्वास्थ्य के एक प्रॉक्सी के रूप में, प्रति अच्छी तरह से 20 नेमाटोड की गतिशीलता की जांच छोटे अणु जोखिम के 5 दिनों के बाद की जाती है। बेहतर कीड़ा गतिशीलता की कल्पना करने के लिए, NaOH को जीवित कीड़े19,20 के आंदोलन को बढ़ाने के लिए जोड़ा जाता है। यह प्रोटोकॉल मध्यम-थ्रूपुट स्क्रीनिंग की अनुमति देता है और छोटे अणुओं की नेमैटिकाइडल क्षमता का आकलन करने के लिए मूल्यवान डेटा प्रदान करता है। यदि एक अलग सूत्रकृमि संग्रह तकनीक का उपयोग16,17 किया जाता है, तो यहां वर्णित छोटे अणु स्क्रीनिंग पद्धति को फिर भी लागू किया जा सकता है।

Protocol

वर्तमान काम के लिए उपयोग किए जाने वाले डी डिप्सासी स्ट्रेन जी -137 को प्रिंस एडवर्ड काउंटी में फिश लेक 4 वैराइटी लहसुन से एकत्र किया गया था और कृषि और कृषि-खाद्य कनाडा द्वारा प्रदान किया गया था। यदि एक नई संस्कृति शुरू कर रहे हैं, तो टीकाकरण पद्धति15 के लिए पोयरियर एट अल से परामर्श करें।

1. डी dipsaci की culturing

  1. पहले रिपोर्ट किए गए काम15 के बाद मीडिया और प्लेटों को तैयार करें।
    1. 23 ग्राम / एल एनए ( सामग्री की तालिका देखें) और अल्ट्राप्योर पानी के साथ पोषक तत्व आगर (एनए) मीडिया के 500 मिलीलीटर तैयार करें। बाँझ तकनीक का उपयोग करते हुए, 20 डिस्पोजेबल पेट्री व्यंजनों (100 मिमी व्यास x 15 मिमी गहरी) में ऑटोक्लेव्ड एनए मीडिया के 25 मिलीलीटर डालें। आगर को कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर ढक्कन के साथ ~ 2 ज के लिए ठोस करने की अनुमति दें और बाद में उपयोग के लिए अलग सेट करें।
    2. गैम्बोर्ग बी -5 (जीए) मीडिया के 500 एमएल तैयार करें जिसमें न्यूनतम ऑर्गेनिक्स के साथ जीए बेसल माध्यम के 3.2 ग्राम / एल, सुक्रोज के 20 ग्राम / एल, आगर के 15 ग्राम / एल, और आसुत पानी ( सामग्री की तालिका देखें)। बाँझ तकनीक का उपयोग करते हुए, 10 डिस्पोजेबल पेट्री डिश (100 मिमी व्यास x 25 मिमी गहरी) में ऑटोक्लेव्ड जीए मीडिया के 50 मिलीलीटर डालें। आगर को कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर ढक्कन के साथ ~ 5 ज के लिए ठोस करने की अनुमति दें और अंकुरित हस्तांतरण तक एक बाँझ बैग में कमरे के तापमान पर सीधा स्टोर करें।
      नोट:: अतिरिक्त मीडिया प्लेटें संदूषण होने की स्थिति में किए जाते हैं।
  2. पिछले काम15 से संशोधित एक विधि के बाद बीज नसबंदी प्रदर्शन करें।
    1. आटोक्लेव एक हलचल बार, 2 संदंश, एक ग्लास पेट्री डिश, और आसुत पानी के 1 एल के साथ एक 2 एल बीकर। 95% EtOH समाधान के 200 mL और एक 15% वाणिज्यिक ब्लीच समाधान के 200 mL तैयार करें।
    2. मटर के बीज का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एक बाँझ 2 एल बीकर में एक प्रयोगशाला बेंच पर एक Bunsen बर्नर लौ के पास एक हलचल बार के साथ 150 बीज डालो.
    3. बीकर के भीतर बीजों में 95% EtOH के 200 मिलीलीटर जोड़ें, 5 मिनट के लिए हलचल प्लेट पर जोर से हलचल करें, और फिर एक अपशिष्ट कंटेनर में ईटीओएच डालें।
    4. बीज को पूरी तरह से विसर्जित करने के लिए बीकर में ब्लीच समाधान डालें। 20 मिनट के लिए एक हलचल प्लेट पर जोर से हिलाएं और फिर एक अपशिष्ट कंटेनर में ब्लीच डालें।
    5. बीज को विसर्जित करने के लिए बीकर में आसुत पानी डालें और 20 मिनट के लिए एक हलचल प्लेट पर जोर से हिलाएं। दोहराएँ पानी तीन बार धोता है, प्रत्येक धोने के बाद आसुत पानी को बंद डालना। अंतिम पानी धोने के बाद, कांच पेट्री डिश में निष्फल बीज डालें।
    6. संदूषण की जांच करने के लिए, प्रत्येक 10 सेमी एनए प्लेट (चरण 1.1.1 में तैयार) में 6 बीजों को स्थानांतरित करें ( चरण 1.1.1 में तैयार) स्टरलाइज़्ड संदंश का उपयोग करके लैमिनर बाढ़ हुड में। प्लेट की परिधि के चारों ओर बीजों को व्यवस्थित करें (प्लंपर बीज सबसे अच्छा काम करते हैं)। प्लेटों को प्रयोगशाला रैपिंग फिल्म में व्यक्तिगत रूप से लपेटें और 26 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
      नोट: आवश्यकता से अधिक बीज चढ़ाना गैर-दूषित बीजों के चयनात्मक उपयोग के लिए अनुमति देगा।
  3. नीचे दिए गए चरण के बाद स्प्राउट स्थानांतरण करें।
    1. एक लैमिनर प्रवाह हुड में, प्रत्येक जीए प्लेट पर 2 गैर-दूषित बीजों को प्लेट करने के लिए निष्फल संदंश का उपयोग करें (चरण 1.1.2 में तैयार)। प्रयोगशाला रैपिंग फिल्म में प्लेटों को व्यक्तिगत रूप से लपेटें और बीज को अंकुरित करने की अनुमति देने के लिए 7-10 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  4. पिछले कार्य15 से संशोधित विधि के बाद इन विट्रो पालन करें।
    1. 20 ग्राम / एल सुक्रोज समाधान के 50 मिलीलीटर तैयार करें। फ़िल्टर निष्फल सुक्रोज समाधान और एक तरफ सेट.
    2. एक लैमिनर प्रवाह हुड में, एक मौजूदा संस्कृति प्लेट से जड़ ऊतक (~ 2 सेमी3) युक्त आगर का एक टुकड़ा काटें। मटर के अंकुर के साथ नए जीए प्लेट पर सुक्रोज समाधान के पिपेट 500 μL और सुक्रोज के शीर्ष पर अगर घन जगह। प्रयोगशाला रैपिंग फिल्म में प्लेटों को व्यक्तिगत रूप से लपेटें और कमरे के तापमान (~ 22 डिग्री सेल्सियस) पर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ पंक्तिबद्ध एक बॉक्स में संस्कृति को बनाए रखें।
    3. संस्कृति को बनाए रखने के लिए हर 8-9 सप्ताह में ताजा जीए प्लेटों पर उपसंस्कृति नेमाटोड। नेमाटोड ~ 8 सप्ताह के बाद निकाले जाने के लिए तैयार हैं।

2. निष्कर्षण और डी dipsaci के संग्रह

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए D. dipsaci का निष्कर्षण निष्पादित करें।
    1. आटोक्लेव एक 50 एमएल बीकर, एक 80 मिमी कीप, 150 एमएल आसुत पानी, और कॉफी फिल्टर। बीकर में कीप जगह और बाँझ कॉफी फिल्टर के साथ कीप लाइन.
    2. एक लैमिनर प्रवाह हुड में, एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके आगर और जड़ ऊतक को 1 सेमी3 में काट लें। कॉफी फिल्टर-पंक्तिबद्ध फ़नल में आगर क्यूब्स को स्थानांतरित करें और धीरे-धीरे कॉफी फिल्टर को नम करने के लिए आगर पर आसुत पानी डालें।
    3. बीकर से कॉफी फिल्टर-पंक्तिबद्ध फ़नल को हटा दें और बीकर को आसुत पानी से भरें जब तक कि पानी का स्तर फ़िल्टर के नीचे को छू न जाए एक बार कॉफी फ़िल्टर-पंक्तिबद्ध फ़नल को बदल दिया जाए।
    4. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कॉफी फिल्टर-पंक्तिबद्ध फ़नल और बीकर को कवर करें। कीड़े को संग्रह बीकर में कॉफी फिल्टर के माध्यम से स्थानांतरित करने की अनुमति देने के लिए बेंचटॉप पर रात भर (16 ज) छोड़ दें।
      नोट: एक सूत्रकृमि-संस्कृति प्लेट निष्कर्षण के लिए तैयार है जब कीड़े एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के साथ जांच करते समय आगर में क्रॉल हो जाते हैं। आमतौर पर, एक प्लेट अपने प्रारंभिक टीकाकरण के 6-8 सप्ताह बाद निष्कर्षण के लिए तैयार होती है।
  2. D. dipsaci का संग्रह निष्पादित करें।
    नोट: अगले दिन, डी डिप्सासी कीड़े बीकर के नीचे बस गए होंगे।
    1. कॉफी फिल्टर-पंक्तिबद्ध फ़नल निकालें और संग्रह बीकर से शीर्ष 40 मिलीलीटर पानी को एस्पिरेट करें; बसे हुए कीड़े को बाधित नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें। एक 10 मिलीलीटर प्लास्टिक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, शेष तरल को 15 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें।
      नोट: इस संग्रह assays में सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है. 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें यदि उनका उपयोग 24 घंटे के भीतर नहीं किया जाएगा। कीड़े को गतिशीलता पर कोई दृश्य प्रभाव नहीं होने के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए छोड़ा जा सकता है। फ़नल को हटाने से संग्रह बीकर में कीड़े परेशान हो सकते हैं। उन्हें इकट्ठा करने से पहले नीचे तक बसने दें।

3. इन विट्रो छोटे अणु स्क्रीन में

  1. नीचे दिए गए चरणों के बाद परख प्लेटों को तैयार करें।
    1. एक बाँझ गर्त में autoclaved आसुत पानी डालो और, एक multichannel पिपेट का उपयोग कर, एक फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में गर्त से आसुत पानी के 40 μL वितरित।
  2. पिनिंग उपकरण तैयार करें और रसायनों को जोड़ें
    1. एक प्रयोगशाला बेंच पर एक Bunsen बर्नर लौ के पास पिनर ट्रे ( सामग्री की तालिका देखें) सेट करें। निम्नलिखित को क्रमिक पिनर ट्रे में जोड़ें: पिन सफाई समाधान के 25 मिलीलीटर, 50% डीएमएसओ (पानी में) के 35 मिलीलीटर, आसुत पानी के 45 एमएल, 70% ईटीओएच के 55 एमएल, और 95% ईटीओएच के 65 एमएल। प्रत्येक ट्रे के सामने ब्लोटिंग पेपर का एक टुकड़ा रखें
    2. सफाई समाधान में पिन emersing और समाधान में तीन बार (3x) पिन ऊपर और नीचे ले जाने के द्वारा पिनिंग उपकरण को साफ करें। इस प्रोटोकॉल में, '3x' और '10x' को क्रमशः तीन या दस बार एक समाधान में पिनर को ऊपर और नीचे ले जाने के रूप में परिभाषित किया गया है। ब्लॉटिंग पेपर पर पिन को ब्लॉट करें। इस प्रक्रिया को एक बार फिर दोहराएं।
      1. इसके बाद, आसुत पानी में पिन 3x कुल्ला, पिन blotting द्वारा पीछा किया. प्रक्रिया को एक बार फिर से दोहराएं।
      2. अंत में, 95% EtOH में पिन 3x कुल्ला, पिन blotting द्वारा पीछा किया. एक बार फिर से दोहराएं। पिनर को लौ और इथेनॉल को वाष्पित करने की अनुमति दें।
    3. रासायनिक प्लेट में 3x पिन करके परख प्लेटों के लिए 96-अच्छी तरह से रासायनिक स्टॉक प्लेटों से रसायनों को जोड़ें, फिर परख प्लेट में पिन 10X स्थानांतरित करें। सफाई समाधान के सामने कागज पर धब्बा।
    4. निम्नलिखित क्रम में धोकर प्लेटों के बीच साफ पिनिंग उपकरण, ब्लोटिंग पेपर पर बीच में ब्लोटिंग: 50% डीएमएसओ (एक बार) में 3x, आसुत पानी में 3x (एक बार), 75% EtOH (एक बार) में 3x, 95% EtOH (दो बार) में 3x। पिनर को लौ और इथेनॉल को वाष्पित करने की अनुमति दें।
    5. सभी पिनिंग पूर्ण होने पर चरण 3.2.2 दोहराएँ।
      नोट: स्क्रीनिंग 60 μM की अंतिम एकाग्रता पर किया गया था।
  3. कीड़े के अलावा
    1. पहले resuspending द्वारा संग्रह से सूत्रकृमि की संख्या की गणना करें और फिर अवलोकन के लिए एक स्लाइड पर कम प्रतिधारण युक्तियों का उपयोग करके 5 μL pipetting. विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 5 μL में नेमाटोड की संख्या की गणना करें।
      1. बाँझ आसुत पानी का उपयोग करके 2 कीड़े / μL के लिए एकाग्रता को समायोजित करें। एक multichannel पिपेट और एक गर्त का उपयोग करते हुए, 96-अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक कुएं में 10 μL (~ 20 कीड़े) जोड़ें।
        नोट: लगभग 15,000 डी डिप्सासी नेमाटोड को वर्णित संस्कृति और संग्रह विधि का उपयोग करके प्रति संस्कृति प्लेट एकत्र किया जाएगा। बीस कीड़े प्रति अच्छी तरह से उपयोग किए जाते हैं क्योंकि छोटी संख्या मोबाइल और अचल लोगों के स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन और लेखांकन की सुविधा प्रदान करती है।
    2. प्रयोगशाला रैपिंग फिल्म में प्लेटों को सील करें और एक नम कागज तौलिया के साथ लपेटें। बॉक्स में रखें और 20 °C में एक चिपचिपा पैड पर चिपकाएं, 200 आरपीएम पर इनक्यूबेटर सेट मिलाते हुए। सुनिश्चित करें कि प्लेटों को प्लेटों के न्यूनतम आंदोलन को सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त नम पेपर तौलिया जोड़कर बॉक्स में स्थिर किया जाता है।

4. डेटा संग्रह और विश्लेषण

  1. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत दिन 5 पर प्लेटों का निरीक्षण करें। मोबाइल की संख्या और डीएमएसओ विलायक नियंत्रण और दवा-उपचारित कुओं में डी डिप्सासी की कुल संख्या की गणना करें।
    1. यदि कीड़े अपेक्षाकृत स्थिर हैं, तो आंदोलन19,20 को उत्तेजित करने के लिए अच्छी तरह से 40 mM की अंतिम एकाग्रता में 1 M NaOH के 2 μL जोड़ें।
      नोट: NaOH जोड़ने के बाद, कीड़े तुरन्त स्थानांतरित हो जाएगा और 5 मिनट के भीतर देखा जा करने की आवश्यकता है। मोबाइल कीड़े की संख्या और कीड़े की कुल संख्या का उपयोग मोबाइल कीड़े के अनुपात की गणना करने के लिए किया जाएगा। परख की लंबाई स्क्रीन के उद्देश्य के आधार पर बदल सकता है.
  2. मोबाइल कीड़े के अनुपात की गणना कीजिये। डी डिप्सासी स्क्रीन में, कुओं कि reproducibly उपज 0% मोबाइल कीड़े मजबूत हिट के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं.
    नोट: विच्छेदन माइक्रोस्कोप के चरण पर प्लेटों के लंबे समय तक जोखिम से बचा जाता है क्योंकि प्रकाश स्रोत प्लेटों को गर्म कर सकता है और बायोएसे पर चर प्रभाव ों को प्रेरित कर सकता है।

Representative Results

स्वतंत्र प्रतिकृति प्रतिलिपि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हिट प्रकट
प्रतिकृति स्क्रीन के बीच अपेक्षित भिन्नता को स्पष्ट करने के लिए, नमूना गतिशीलता में साधन और भिन्नता हाल ही में स्क्रीन (चित्रा 1) से तीन प्रतिनिधि प्लेटों से प्लॉट किए गए हैं। स्क्रीन के तीन प्रतिकृतियों को तीन अलग-अलग दिनों में किया गया था। सभी तीन प्लेटों में नकारात्मक (विलायक-केवल) नियंत्रण (गहरे रंग की सलाखों) होते हैं, और सेट के भीतर नमूनों में स्थापित नेमेटिकाइड्स होते हैं। शेष यौगिक एक कस्टम लाइब्रेरी से हैं जो वर्तमान में रॉय लैब में विशेषता है। एक ही अणुओं (एससी, जेके, पीजेआर, अप्रकाशित परिणाम) के साथ सी एलिगन्स के साथ किए गए समान स्क्रीन की तुलना में, डी डिप्सासी के साथ हिट दर काफी कम है, और कई दवा प्लेटें कोई गतिविधि प्रदर्शित नहीं करती हैं (चित्रा 1 ए)। कुछ प्लेटों में पूरी तरह से पुन: प्रस्तुत करने योग्य हिट होते हैं (चित्रा 1 बी, सी), जबकि अन्य गतिविधि में भिन्न होते हैं (चित्रा 1 सी)। अन्य प्रजातियों की जांच के सापेक्ष (नहीं दिखाया गया है), डी डिप्सासी यौगिकों के लिए अपनी प्रतिक्रिया में कम परिवर्तनशीलता दिखाता है। भले ही, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हिट की पहचान में प्रतिकृतियों को आवश्यक माना जाता है।

नेमेटिकाइड्स डिटिलेंकस डिप्सासी को स्थिर करने की उनकी क्षमता में भिन्न होते हैं
डी dipsaci के खिलाफ परीक्षण सात विशेषता nematicides में से, केवल Fluopyram परख यहाँ वर्णित में मजबूत गतिविधि प्रदर्शित करता है (चित्रा 1C). यह पिछले काम के अनुरूप है जो दिखाता है कि डी डिप्सासी नेमेटिकाइड्स13,14 के प्रति सहिष्णु है। Fluopyram एक सूत्रकृमि-चयनात्मक तरीके से इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के जटिल द्वितीय को रोकता है और एक वाणिज्यिक नेमेटिकाइड है जिसका उपयोग विभिन्न प्रकार के पीपीएन को नियंत्रित करने के लिए किया जाता है, जिसमें रोटिलेंचुलुस रेनिफोर्मिस और मेलोइडोजिन इनकॉग्निटा 4,21,22 शामिल हैं। Fluopyram और nematicides में से एक है कि एकाग्रता परीक्षण (Oxamyl) 23 में गतिविधि की कमी D. dipsaci के साथ एक खुराक प्रतिक्रिया विश्लेषण के माध्यम से अधिक विस्तार से जांच की गई थी. Fluopyram 9.3 μM के EC50 के साथ D. dipsaci गतिशीलता पर एक स्पष्ट खुराक-निर्भर प्रभाव को प्रेरित करता है (8.2 से 10.5 μM के बीच 95% आत्मविश्वास अंतराल के साथ) (चित्रा 2A, B)। यह परिणाम स्टोरली एट अल. 202013 से इन विट्रो परिणामों में प्रकाशित के आधार पर अपेक्षित है। Oxamyl 120 μM (p = 0.3632, unpaired t-test) (चित्रा 2C, D) की एकाग्रता तक गतिशीलता पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ता है।

सोडियम हाइड्रॉक्साइड परख संवेदनशीलता में सुधार
तरल संस्कृति18 में C. elegans की निकट-निरंतर तैराकी गतिविधि के विपरीत, D. dipsaci जानवर नाटकीय रूप से कम मोबाइल हैं। यह संस्कृति16 में परजीवी नेमाटोड के बीच असामान्य नहीं है। बीमार कीड़े से 'आराम' कीड़े को अलग करने में मदद करने के लिए, NaOH के 40 mM परख समापन बिंदु पर उन व्यक्तियों में आंदोलन को प्रोत्साहित करने के लिए उपयोग किया जाता है जो सक्षम हैं (चित्रा 3) 19,20। यह तकनीक छोटे अणुओं की स्पष्ट पहचान के लिए अनुमति देती है जो कीड़े को स्थिर करते हैं, यह देखते हुए कि नकारात्मक नियंत्रण कुओं में सभी कीड़े चलते हैं और स्क्रीन में झूठी सकारात्मकता की असाधारण रूप से कम पृष्ठभूमि उत्पन्न करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: स्क्रीन आउटपुट के उदाहरण। D. dipsaci के साथ तीन जैविक प्रतिकृतियों (खुले हलकों) को दिखाए गए तीन प्लेटों में से प्रत्येक में छोटे अणुओं (60 μM) के खिलाफ किया गया था। सभी तीन प्लेटों में डीएमएसओ विलायक-केवल नियंत्रण (गहरे रंग की सलाखों) का 0.6% है। सिवाय इसके कि जहां अन्यथा विलायक नियंत्रण या ज्ञात नेमेटिकाइड्स के साथ नोट किया गया है, तीन प्लेटों के कुओं में विक्रेताओं से खरीदे गए अपेक्षाकृत अस्वाभाविक दवा जैसे यौगिक होते हैं (बर्न्स एट अल। (ए) छोटे अणु पुस्तकालय से एक 96 अच्छी तरह से प्लेट डी डिप्सासी के खिलाफ अवलोकन योग्य बायोएक्टिविटी के साथ किसी भी अणु की कमी है। (बी) छोटे अणु पुस्तकालय से एक 96 अच्छी तरह से प्लेट में एक एकल अणु होता है जो डी डिप्सासी गतिशीलता को बाधित करता है। (सी) एक 96 अच्छी तरह से दवा प्लेट विशेषता nematicides fluopyram (fluo), iprodione (ipro), abamectin (abam), fluensulfone (फ्लू), tioxazafen (tiox), oxamyl (oxam), और wact-11 युक्त। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: गतिशीलता परख का उपयोग करके सकारात्मक और नकारात्मक परिणामों का उदाहरण। (ए) NaOH के अतिरिक्त से पहले 5 दिनों के बाद फ्लुओपिराम की सांद्रता बढ़ाने के लिए डी. डिप्सासी के जोखिम के बाद टर्मिनल फेनोटाइप के उदाहरण। (बी) फ्लुओपाइरम की इंगित सांद्रता के संपर्क में आने के 5 दिनों के बाद डी डिप्सासी के आंदोलन का एक खुराक-प्रतिक्रिया विश्लेषण। (C,D) ए, बी के समान, ऑक्सामिल को छोड़कर। प्रत्येक ग्राफ प्रत्येक दिन तीन प्रतिकृतियों के साथ दो अलग-अलग दिनों में किए गए परीक्षणों को दिखाता है। प्रत्येक ग्राफ का y-अक्ष प्रत्येक अच्छी तरह से गणना में कीड़े के अंश मोबाइल को इंगित करता है क्योंकि कुएं में जानवरों की कुल संख्या के सापेक्ष चलने वाले जानवरों की संख्या के रूप में। दोनों रेखांकनों पर त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: NaOH के 40 mM जोड़ने के बाद D. dipsaci की गतिशीलता। विलायक-केवल नियंत्रण (ए), tioxazafen (बी), या fluopyram (सी) की उपस्थिति में D. dipsaci नमूनों के लिए NaOH के अलावा का प्रभाव सह-इनक्यूबेशन के 5 दिनों के बाद। स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

महत्वपूर्ण कदम
प्रोटोकॉल की सादगी के बावजूद, प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हैं जो सफलता की संभावना को अधिकतम करने के लिए अतिरिक्त ध्यान देने योग्य हैं। सबसे पहले, बीजों को ओवरब्लीचिंग उनके विकास को बाधित कर सकता है। इसलिए, ब्लीचिंग समाधान में बीज के समय को 20 मिनट या उससे कम तक सीमित करना आवश्यक है। दूसरा, जैसा कि पहले स्टोरली एट अल द्वारा उल्लेख किया गया था, नेमाटोड का स्पष्ट स्वास्थ्य 4 डिग्री सेल्सियस16 पर संग्रहीत होने पर समय के साथ कम हो जाता है। उनके संग्रह के तुरंत बाद नेमाटोड का उपयोग करने से अतिरिक्त आत्मविश्वास मिलता है कि इष्टतम स्क्रीनिंग की स्थिति प्राप्त की जा सकती है। क्या दीर्घकालिक भंडारण आवश्यक होना चाहिए, सुनिश्चित करें कि ट्यूब का ढक्कन ऑक्सीजन एक्सचेंज की अनुमति देने के लिए तंग नहीं है। तीसरा, यह सुनिश्चित करना कि मटर सुझाए गए समय के लिए एनए प्लेटों पर बढ़ता है, प्रयोगकर्ता को यह तय करने में सक्षम बनाता है कि कौन से बीज दूषित हैं। चौथा, नेमाटोड जोड़ने से पहले जीए प्लेटों पर मटर को ओवरग्रो करने से संक्रमण कमजोर हो जाएगा और नेमाटोड की उपज कम हो जाएगी। अंत में, कई कारक जिन्हें नियंत्रित करना मुश्किल है, वे स्क्रीनिंग परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, परिणामों की पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न दिनों में और आदर्श रूप से विभिन्न संस्कृति प्लेटों से एकत्र किए गए पीपीएन के साथ कई स्वतंत्र प्रतिकृति स्क्रीन करना आवश्यक है।

विधि की सीमाएँ
प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि यह एकत्र किए गए कीड़े के विकास के चरण को सिंक्रनाइज़ करने में विफल रहता है, जो किशोरों से लेकर वयस्कों तक होता है। इसलिए, किसी भी स्क्रीन द्वारा प्रकट किए गए मजबूत हिट कई चरणों में प्रभावी होने की संभावना है। हालांकि, प्रोटोकॉल प्रभावी चरण-विशिष्ट हिट को अनदेखा करने के जोखिम को बढ़ाता है। एक दूसरा विचार यह है कि इन विट्रो स्क्रीनिंग को नेमाटाइसाइड-डिस्कवरी पाइपलाइन में पहला कदम माना जाना चाहिए; मिट्टी आधारित assays हिट की translatability का परीक्षण करने के लिए एक पाइपलाइन के लिए एक उत्कृष्ट इसके अलावा कर रहे हैं.

प्रोटोकॉल का महत्व और अनुप्रयोग
यहां वर्णित प्रोटोकॉल सरल और आसानी से दोहराए जाते हैं। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को प्रयोगशाला में अन्य पीपीएन पर सफलतापूर्वक लागू किया गया है, जिसमें केवल मामूली संशोधन करके प्रैटिलेंकस पेनेट्रांस भी शामिल हैं। वैश्विक खाद्य सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए नए और सुरक्षित पीपीएन नियंत्रण उपायों का विकास करना आवश्यक है। यह विशेष रूप से डी डिप्सासी जैसी प्रजातियों के लिए सच है जो आमतौर पर वर्तमान में स्वीकार्य रासायनिक नेमेटिकाइड्स13,14 की एक विस्तृत विविधता के प्रति सहिष्णु होते हैं। इसलिए, यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल में वैश्विक स्तर पर मानव स्वास्थ्य में एक महत्वपूर्ण योगदान देने की क्षमता है।

Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखक डॉ किंग यू (कृषि और कृषि-खाद्य कनाडा) को Ditylenchus dipsaci संस्कृति प्रदान करने और संस्कृति विधियों पर सलाह के लिए स्वीकार करते हैं; डॉ बेंजामिन Mimee (कृषि और कृषि खाद्य कनाडा) और Nathalie Dauphinais (कृषि और कृषि खाद्य कनाडा) संयंत्र परजीवी नेमाटोड के इन विट्रो संस्कृति पर सलाह के लिए; परियोजना और पांडुलिपि पर उपयोगी सुझावों के लिए डॉ एंड्रयू बर्न्स और शॉन हैरिंगटन। JK एक NSERC अलेक्जेंडर ग्राहम बेल कनाडा ग्रेजुएट स्कॉलर है। PJR एक CIHR परियोजना अनुदान (313296) द्वारा समर्थित है। PJR रासायनिक आनुवंशिकी में एक कनाडा अनुसंधान कुर्सी (टियर 1) है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL tube Sarstedt 62.554.205
2 forceps Almedic 7747-A10-108
2L beaker Pyrex CLS10002L
50mL beaker Pyrex CLS100050
96 well plate Sarstedt 83.3924
aluminium foil Alcan Plus
bacteriological agar BioShop AGR001.5
coffee filter No name brand 716
commercial bleach 6% Lavo Pro 6 DIN102358107
disposable petri dishes (10cm x 1.5cm) Fisherbrand FB0875712
disposable petri dishes (10cm x 2.5cm) Sigma-Aldrich Z358762
dissecting scope Leica Leica MZ75
DMSO Sigma-Aldrich 472301-500ML
Funnel VWR 414004-270
Gamborg B5 Sigma-Aldrich G5893-10L
glass petri dish VWR 75845-546
glass slide MAGNA 60-1200
Lint-Free Blotting Paper V&P Scientific VP 522-100
Low retention pipette tips (200uL) LABFORCE 1159M44
mutlichannel pipette Eppendorf research plus 3125000036
NaOH Sigma-Aldrich S8045-500G
nutrient agar Sigma-Aldrich 70148-100G
parafilm Bemis PM-996
pea seeds Ontario Seed Company D-1995-250G
pin cleaning solutions V&P Scientific VP110A
pinner V&P Scientific VP381N
pinner rinse trays V&P Scientific VP 421
reagent reservoir with lid for multichannel pipettes Sigma-Aldrich BR703459
shaking incubator New Brunswick Scientific I26
sterile surgical blade MAGNA sb21-100-a
stir bar Fisherbrand 2109 - 1451359
sucrose BioShop SUC507.1

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References

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जीव विज्ञान अंक 179
Culturing और स्क्रीनिंग संयंत्र परजीवी सूत्रकृमि <em>Ditylenchus dipsaci</em>
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Cammalleri, S. R., Knox, J., Roy, P. … More

Cammalleri, S. R., Knox, J., Roy, P. J. Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci. J. Vis. Exp. (179), e63438, doi:10.3791/63438 (2022).

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