Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kultivierung und Screening des pflanzenparasitären Nematoden Ditylenchus dipsaci

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63438
Automatic Translation
1,2,3, 1,3, 1,3,4
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3The Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 4Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine zuverlässige und unkomplizierte Methode zur Kultivierung, Sammlung und zum Screening von Ditylenchus dipsaci.

Abstract

Pflanzenparasitäre Nematoden (PPNs) zerstören jedes Jahr über 12% der globalen Nahrungspflanzen, was einem jährlichen Verlust von rund 157 Milliarden Dollar (USD) entspricht. Mit einer wachsenden Weltbevölkerung und begrenzten Ackerflächen ist die Kontrolle des PPN-Befalls für die Nahrungsmittelproduktion von entscheidender Bedeutung. Die Herausforderung der Maximierung der Ernteerträge wird durch die zunehmenden Einschränkungen wirksamer Pestizide aufgrund mangelnder Nematodenselektivität noch verstärkt. Daher ist die Entwicklung neuer und sicherer chemischer Nematizide für die Ernährungssicherheit von entscheidender Bedeutung. In diesem Protokoll werden die Kultur und Sammlung der PPN-Arten Ditylenchus dipsaci nachgewiesen. D. dipsaci ist sowohl wirtschaftlich schädlich als auch relativ resistent gegen die meisten modernen Nematizide. Die aktuelle Arbeit erklärt auch, wie diese Nematoden in Bildschirmen für neuartige niedermolekulare Nematizide verwendet werden können, und berichtet über Datenerhebungs- und Analysemethoden. Die demonstrierte Pipeline bietet einen Durchsatz von Tausenden von Verbindungen pro Woche und kann leicht für die Verwendung mit anderen PPN-Spezies wie Pratylenchus penetrans angepasst werden. Die hier beschriebenen Techniken können verwendet werden, um neue Nematizide zu entdecken, die wiederum zu hochselektiven kommerziellen Produkten weiterentwickelt werden können, die PPNs sicher bekämpfen, um eine zunehmend hungrige Welt zu ernähren.

Introduction

Es wird geschätzt, dass pflanzenparasitäre Nematoden (PPNs) für den Verlust von 12,3% der globalen Nahrungsmittelproduktion verantwortlich sind und jährlich einen geschätzten Schaden von 157 Milliarden Dollar verursachen 1,2,3. Leider nimmt die Fähigkeit, PPNs zu kontrollieren, ab, da wirksame chemische Nematizide verboten wurden oder aufgrund von Sicherheits- und Umweltbedenken für den Menschen mit eskalierenden Einschränkungen konfrontiert sind. Dies ist in erster Linie auf die schlechte Nematodenselektivität früherer Generationen von Pestizidenzurückzuführen 4. In den letzten 25 Jahren wurden sechs neue chemische Nematizide pilotiert oder auf den Markt gebracht5. Einer von ihnen wurde in Europa bereits verboten, und ein anderer wurde eingestellt, während er wegen seiner Auswirkungen auf die menschliche Wärmeuntersucht wurde. Daher besteht ein dringender Bedarf an neuen Nematiziden, die für PPNs sehr selektiv sind.

Der Stamm- und Zwiebelnematode, Ditylenchus dipsaci (D. dipsaci), ist ein wirtschaftlich wirksames PPN4. D. dipsaci infiziert fast 500 Pflanzenarten aus 30 biologischen Rassen und zielt auf einige der landwirtschaftlich wichtigsten Kulturen wie Roggen, Hafer, Knoblauch, Zwiebeln und Lauchab 8,9. Zum Beispiel hat D. dipsaci kürzlich Knoblauchfelder in Ontario und Quebec gegeißelt, was zu Verlusten von bis zu 90% führte10,11. Seine geografische Verteilung ist fast allgegenwärtig und umfasst Amerika (einschließlich Kalifornien und Florida), Europa, einen Großteil Asiens (einschließlich China) und Ozeanien9. D. dipsaci ist ein wandernder Endoparasit, der auf Blättern oder Wunden und Lentikeln in die Stomata eindringt, wo sie Enzyme freisetzen, um die Zellwand12 abzubauen. Die durch das PPN verursachten Schäden verstärken die Auswirkungen von D. dipsaci auf die Pflanzen und machen die Pflanze anfällig für Sekundärinfektionen11. Leider zeigt D. dipsaci im Vergleich zu anderen Nematodenstämmen eine hohe Toleranz gegenüber aktuellen Nematiziden13,14.

Dieses Protokoll beschreibt die Kultivierung von D. dipsaci und seine Verwendung in großflächigen Screens für niedermolekulare Kandidatennematizide. Kurz gesagt, D. dipsaci-Populationen werden auf Erbsenpflanzen, die in sterilen Gamborg B-5 (GA) Medien15 kultiviert werden, gepflegt und erweitert. Vor dem Anbau von Samensprossen auf GA-Medium müssen die Samen durch eine Reihe von Waschungen sterilisiert und auf Nährstoffagar (NA) plattiert werden, um auf Kontamination zu prüfen. Die Saatgutsterilisation ist unerlässlich, um bakterielle und pilzliche Verunreinigungen zu erkennen, die möglicherweise vorhanden sind. Die nicht kontaminierten Samen werden dann auf GA-Platten übertragen, wo Samensprossen in Vorbereitung auf eine Infektion wachsen. Die GA-Platten, die Samensprossen enthalten, werden mit Nematoden aus einer früheren Kulturplatte infiziert, indem ein Stück Agar mit Wurzelgewebe auf die frischen Platten übertragen wird. Nach 6-8 Wochen werden die Nematoden aus den GA-Medien extrahiert und durch einen mit Kaffeefiltern ausgekleideten Trichter in ein Sammelbecherglas gefiltert. Die Nematoden können in verschiedenen Bioassays verwendet werden, sobald eine geeignete Anzahl gesammelt wurde. Die in diesem Protokoll beschriebene Technik erzeugt ungefähr 15.000 D. dipsaci pro Kulturplatte. Alternative Protokolle zur Kultivierung von D. dipsaci wurdenveröffentlicht 16,17.

Ein in vitro niedermolekularer Screening-Assay, der auf früheren Arbeiten18 basiert, wird hier ebenfalls beschrieben. Als Stellvertreter für die Gesundheit von Würmern wird die Beweglichkeit von 20 Nematoden pro Well nach 5 Tagen niedermolekularer Exposition untersucht. Um die Mobilität von Würmern besser sichtbar zu machen, wird NaOH hinzugefügt, um die Bewegung von lebenden Würmernzu erhöhen 19,20. Dieses Protokoll ermöglicht ein Screening mit mittlerem Durchsatz und liefert wertvolle Daten zur Beurteilung des nematiziden Potenzials kleiner Moleküle. Wenn eine andere Nematodensammeltechnikverwendet wird 16,17, kann die hierin beschriebene niedermolekulare Screening-Methodik dennoch implementiert werden.

Protocol

Der D. dipsaci-Stamm G-137, der für die vorliegende Arbeit verwendet wurde, wurde aus dem Knoblauch der Sorte Fish Lake 4 in Prince Edward County gesammelt und von Agriculture and Agri-food Canada zur Verfügung gestellt. Wenn Sie eine frische Kultur beginnen, konsultieren Sie Poirier et al. für die Impfmethodik15.

1. Kultivierung von D. dipsaci

  1. Bereiten Sie die Medien und Platten nach den zuvor berichteten Arbeitenvor 15.
    1. Bereiten Sie 500 ml Nähr-Agar (NA)-Medien mit 23 g/L NA (siehe Materialtabelle) und Reinstwasser vor. Gießen Sie in steriler Technik 25 ml autoklavierte NA-Medien in 20 Einweg-Petrischalen (100 mm Durchmesser x 15 mm tief). Agar bei Raumtemperatur (22 °C) bei aufgesetztem Deckel ~2 h erstarren lassen und für den späteren Gebrauch beiseite stellen.
    2. Bereiten Sie 500 ml Gamborg B-5 (GA)-Medien vor, die 3,2 g/L GA-Basalmedium mit minimalen organischen Stoffen, 20 g/L Saccharose, 15 g/L Agar und destilliertes Wasser enthalten (siehe Materialtabelle). Gießen Sie in steriler Technik 50 ml autoklavierte GA-Medien in 10 Einweg-Petrischalen (100 mm Durchmesser x 25 mm tief). Agar bei Raumtemperatur (22 °C) mit aufgesetztem Deckel für ~5 h erstarren lassen und aufrecht bei Raumtemperatur in einem sterilen Beutel bis zum Sprossentransfer lagern.
      HINWEIS: Überschüssige Medienplatten werden für den Fall einer Kontamination hergestellt.
  2. Führen Sie die Saatgutsterilisation nach einer Methode durch, die gegenüber einer früheren Arbeitmodifiziert wurde 15.
    1. Autoklavieren Sie ein 2 L Becherglas mit einer Rührstange, 2 Pinzetten, einer Glaspetrischale und 1 L destilliertem Wasser. Bereiten Sie 200 ml 95%ige EtOH-Lösung und 200 ml einer handelsüblichen 15%igen Bleichlösung vor.
    2. Verwenden Sie Erbsensamen (siehe Materialtabelle). Gießen Sie 150 Samen in ein steriles 2-Liter-Becherglas mit einem Rührstab in der Nähe einer Bunsenbrennerflamme auf einer Laborbank.
    3. Fügen Sie 200 ml 95% EtOH zu den Samen im Becherglas hinzu, rühren Sie 5 Minuten lang kräftig auf der Rührplatte um und gießen Sie dann EtOH in einen Abfallbehälter.
    4. Gießen Sie Bleichlösung in das Becherglas, um die Samen vollständig einzutauchen. 20 min kräftig auf einer Rührplatte umrühren und dann Bleichmittel in einem Abfallbehälter abgießen.
    5. Gießen Sie destilliertes Wasser in das Becherglas, um die Samen einzutauchen und 20 min lang kräftig auf einer Rührplatte zu rühren. Wiederholen Sie das Wasser dreimal und gießen Sie destilliertes Wasser nach jeder Wäsche ab. Nach der letzten Wasserwäsche sterilisierte Samen in die Glas-Petrischale gießen.
    6. Um die Kontamination zu überprüfen, werden 6 Samen mit sterilisierten Pinzetten auf jede 10 cm große NA-Platte (hergestellt in Schritt 1.1.1) in der laminaren Fluthaube überführt. Ordnen Sie die Samen um den Umfang des Tellers an (prallere Samen funktionieren am besten). Wickeln Sie die Platten einzeln in Laborwickelfolie und inkubieren Sie sie im Dunkeln für 3 Tage bei 26 °C.
      HINWEIS: Wenn Sie mehr Samen als benötigt plattieren, können Sie nicht kontaminiertes Saatgut selektiv verwenden.
  3. Führen Sie die Sprossenübertragung gemäß dem folgenden Schritt durch.
    1. Verwenden Sie in einer Laminar-Flow-Haube eine sterilisierte Pinzette, um 2 nicht kontaminierte Samen auf jeder GA-Platte (vorbereitet in Schritt 1.1.2) zu platten. Wickeln Sie die Platten einzeln in Laborwickelfolie und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 7-10 Tage, damit die Samen sprießen können.
  4. Durchführung der In-vitro-Aufzucht nach einer Methode, die gegenüber einer früheren Arbeitmodifiziert wurde 15.
    1. Bereiten Sie 50 ml 20 g/L Saccharoselösung vor. Saccharoselösung sterilisieren und beiseite stellen.
    2. Schneiden Sie in einer Laminar-Flow-Haube ein Stück Agar, das Wurzelgewebe (~ 2 cm3) enthält, aus einer vorhandenen Kulturplatte. Pipette 500 μL Saccharoselösung auf neue GA-Platte mit Erbsensämlingen und Agarwürfel auf Saccharose legen. Wickeln Sie die Platten einzeln in Laborwickelfolie ein und pflegen Sie die Kultur in einer mit Aluminiumfolie ausgelegten Box bei Raumtemperatur (~22 °C).
    3. Subkultur-Nematoden auf frischen GA-Tellern alle 8-9 Wochen, um die Kultur zu erhalten. Nematoden sind bereit, nach ~ 8 Wochen extrahiert zu werden.

2. Extraktion und Sammlung von D. dipsaci

  1. Führen Sie die Extraktion von D. dipsaci gemäß den folgenden Schritten durch.
    1. Autoklavieren Sie ein 50-ml-Becherglas, einen 80-mm-Trichter, 150 mL destilliertes Wasser und Kaffeefilter. Legen Sie den Trichter in das Becherglas und kleiden Sie den Trichter mit sterilem Kaffeefilter aus.
    2. In einer laminaren Flow-Haube den Agar und das Wurzelgewebe mit einem sterilen Skalpell in 1 cm3 schneiden. Geben Sie die Agarwürfel in den mit Kaffeefiltern ausgekleideten Trichter und gießen Sie langsam destilliertes Wasser auf das Agar, um den Kaffeefilter zu befeuchten.
    3. Entfernen Sie den mit Kaffeefiltern ausgekleideten Trichter aus dem Becherglas und füllen Sie das Becherglas mit destilliertem Wasser, bis der Wasserstand gerade den Boden des Filters berührt, sobald der mit Kaffeefiltern ausgekleidete Trichter ersetzt ist.
    4. Decken Sie den mit Kaffeefiltern ausgekleideten Trichter und das Becherglas mit Aluminiumfolie ab. Über Nacht (16 h) auf der Tischplatte lassen, damit sich Würmer durch den Kaffeefilter in das Auffangbecherglas bewegen können.
      HINWEIS: Eine Nematodenkulturplatte ist bereit für die Extraktion, wenn Würmer in den Agar gekrochen sind, wenn sie mit einem Dissektionsmikroskop untersucht wurden. Typischerweise ist eine Platte 6-8 Wochen nach ihrer ersten Impfung bereit für die Extraktion.
  2. Führen Sie die Sammlung von D. dipsaci durch.
    HINWEIS: Am nächsten Tag haben sich die D. dipsaci-Würmer auf dem Boden des Becherglases abgesetzt.
    1. Entfernen Sie den mit Kaffeefiltern ausgekleideten Trichter und saugen Sie die oberen 40 ml Wasser aus dem Auffangbecherglas ab. Stellen Sie sicher, dass Sie die abgesetzten Würmer nicht stören. Sammeln Sie die verbleibende Flüssigkeit mit einer serologischen 10-ml-Kunststoffpipette in einem konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Diese Sammlung kann direkt in Assays verwendet werden. Bei 4 °C platzieren, wenn sie nicht innerhalb von 24 Stunden verwendet werden. Die Würmer können 3 Tage lang bei 4 °C ohne sichtbare Auswirkungen auf die Mobilität belassen werden. Das Entfernen des Trichters kann die Würmer im Auffangbecherglas stören. Lassen Sie sie sich vor dem Sammeln auf dem Boden absetzen.

3. In-vitro-Kleinmolekül-Screening

  1. Bereiten Sie die Assay-Platten gemäß den folgenden Schritten vor.
    1. Gießen Sie autoklaviertes destilliertes Wasser in einen sterilen Trog und dosieren Sie mit einer Mehrkanalpipette 40 μL destilliertes Wasser aus dem Trog in jedes Bohrloch einer flachen 96-Well-Platte.
  2. Bereiten Sie das Pinning Tool vor und fügen Sie die Chemikalien hinzu
    1. Stellen Sie Pinner-Tabletts (siehe Materialtabelle) in der Nähe einer Bunsenbrennerflamme auf einem Labortisch auf. Fügen Sie den aufeinanderfolgenden Pinnerschalen Folgendes hinzu: 25 ml Pin-Reinigungslösung, 35 ml 50% DMSO (in Wasser), 45 mL destilliertes Wasser, 55 mL 70% EtOH und 65 mL 95% EtOH. Legen Sie ein Blatt Löschpapier vor jedes Fach
    2. Reinigen Sie das Stiftwerkzeug, indem Sie die Stifte in der Reinigungslösung einpressen und die Stifte dreimal (3x) in der Lösung auf und ab bewegen. In diesem Protokoll sind "3x" und "10x" definiert als das drei- bzw. zehnfache Bewegen des Pinners in einer Lösung nach oben und unten. Tupfen Sie die Stifte auf dem Löschpapier ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal.
      1. Als nächstes spülen Sie die Pins 3x in destilliertem Wasser ab, gefolgt von einem Abtupfen der Pins. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal.
      2. Zum Schluss spülen Sie die Pins 3x in 95% EtOH, gefolgt von einem Löschen der Pins. Wiederholen Sie den Vorgang. Zünden Sie den Pinner an und lassen Sie das Ethanol verdampfen.
    3. Fügen Sie Chemikalien aus den 96-Well-Chemiematerialplatten zu Assay-Platten hinzu, indem Sie 3X in die Chemikalienplatte einstecken und dann die Pins 10X in die Assay-Platte übertragen. Vor der Reinigungslösung auf Papier tupfen.
    4. Reinigen Sie das Pinning Tool zwischen den Platten, indem Sie es in der folgenden Reihenfolge waschen, dazwischen auf Löschpapier tupfen: 3x in 50% DMSO (einmal), 3x in destilliertem Wasser (einmal), 3x in 75% EtOH (einmal), 3x in 95% EtOH (zweimal). Zünden Sie den Pinner an und lassen Sie Ethanol verdampfen.
    5. Wiederholen Sie Schritt 3.2.2, wenn alle Anheftungen abgeschlossen sind.
      HINWEIS: Das Screening wurde mit einer Endkonzentration von 60 μM durchgeführt.
  3. Hinzufügen von Würmern
    1. Zählen Sie die Anzahl der Nematoden aus der Sammlung, indem Sie zuerst resuspendieren und dann 5 μL mit Spitzen mit geringer Retention zur Beobachtung auf einen Objektträger pipettieren. Zählen Sie die Anzahl der Nematoden in 5 μL mit einem Dissektionsmikroskop.
      1. Stellen Sie die Konzentration mit sterilem destilliertem Wasser auf 2 Würmer/μL ein. Fügen Sie mit einer Mehrkanalpipette und einer Mulde 10 μL (~ 20 Würmer) zu jeder Vertiefung der 96-Well-Platten hinzu.
        HINWEIS: Ungefähr 15.000 D. dipsaci-Nematoden werden pro Kulturplatte mit der beschriebenen Kultur- und Sammlungsmethode gesammelt. Pro Bohrung werden zwanzig Würmer eingesetzt, da die geringe Anzahl die übersichtliche Visualisierung und Abrechnung von mobilen und immobilen Würmern erleichtert.
    2. Verschließen Sie die Platten in Laborwickelfolie und wickeln Sie sie mit einem feuchten Papiertuch ein. In die Box geben und auf einem klebrigen Pad im 20 °C Schüttelinkubator bei 200 U/min befestigen. Stellen Sie sicher, dass die Platten in der Box stabilisiert sind, indem Sie ein zusätzliches feuchtes Papiertuch hinzufügen, um eine minimale Bewegung der Platten zu gewährleisten.

4. Datenerhebung und -analyse

  1. Beobachten Sie die Platten am 5. Tag unter einem Seziermikroskop. Zählen Sie die Anzahl der mobilen und die Gesamtzahl der D. dipsaci in DMSO-Lösungsmittelkontrollen und medikamentenbehandelten Brunnen.
    1. Wenn die Würmer relativ unbeweglich sind, fügen Sie 2 μL 1 M NaOH zu einer Endkonzentration von 40 mM in die Vertiefung hinzu, um die Bewegung 19,20 zu stimulieren.
      HINWEIS: Nach dem Hinzufügen von NaOH bewegen sich Würmer sofort und müssen innerhalb von 5 Minuten angezeigt werden. Die Anzahl der mobilen Würmer und die Gesamtzahl der Würmer werden verwendet, um den Anteil der mobilen Würmer zu berechnen. Die Länge des Assays kann sich je nach Ziel des Bildschirms ändern.
  2. Berechnen Sie den Anteil mobiler Würmer. In den D. dipsaci-Bildschirmen werden Vertiefungen, die reproduzierbar 0% mobile Würmer lieferten, als starke Treffer kategorisiert.
    HINWEIS: Eine längere Exposition von Platten auf der Stufe von Dissektionsmikroskopen wird vermieden, da die Lichtquelle die Platten erwärmen und variable Wirkungen auf den Bioassay induzieren kann.

Representative Results

Unabhängige Replikate zeigen reproduzierbare Treffer
Um die erwartete Variation zwischen den Replikationsbildschirmen zu veranschaulichen, werden die Mittelwerte und die Variation der Probenmobilität aus drei repräsentativen Platten eines neueren Bildschirms dargestellt (Abbildung 1). Drei Nachbildungen des Bildschirms wurden an drei verschiedenen Tagen durchgeführt. Alle drei Platten haben negative (nur Lösungsmittel-) Kontrollen (dunklere Balken), und Proben innerhalb des Sets enthielten etablierte Nematizide. Die verbleibenden Verbindungen stammen aus einer benutzerdefinierten Bibliothek, die derzeit im Roy-Labor charakterisiert wird. Im Vergleich zu ähnlichen Screens mit C. elegans mit den gleichen Molekülen (SC, JK, PJR, unveröffentlichte Ergebnisse) ist die Trefferrate bei D. dipsaci signifikant niedriger, und viele Wirkstoffplatten zeigen keine Aktivität (Abbildung 1A). Einige Platten haben vollständig reproduzierbare Treffer (Abbildung 1B,C), während andere in der Aktivität variieren (Abbildung 1C). Im Vergleich zu anderen untersuchten Arten (nicht gezeigt) zeigt D. dipsaci eine geringere Variabilität in seiner Reaktion auf Verbindungen. Unabhängig davon werden Replikate bei der Identifizierung reproduzierbarer Treffer als notwendig erachtet.

Nematizide variieren in ihrer Fähigkeit, Ditylenchus dipsaci zu immobilisieren
Von den sieben charakterisierten Nematiziden, die gegen D. dipsaci getestet wurden, zeigt nur Fluopyram eine robuste Aktivität in dem hierin beschriebenen Assay (Abbildung 1C). Dies steht im Einklang mit früheren Arbeiten, die zeigen, dass D. dipsaci gegenüber Nematiziden13,14 tolerant ist. Fluopyram hemmt den Komplex II der Elektronentransportkette nematodenselektiv und ist ein kommerzielles Nematizid, das zur Kontrolle einer Vielzahl von PPNs verwendet wird, einschließlich Rotylenchulus reniformis und Meloidogyne incognita 4,21,22. Fluopyram und eines der Nematizide, denen die Aktivität bei der getesteten Konzentration fehlte (Oxamyl)23, wurden durch eine Dosis-Wirkungs-Analyse mit D. dipsaci genauer untersucht. Fluopyram induziert eine scheinbare dosisabhängige Wirkung auf die D. dipsaci-Mobilität mit einem EC50 von 9,3 μM (mit einem 95%-Konfidenzintervall zwischen 8,2 und 10,5 μM) (Abbildung 2A,B). Dieses Ergebnis wird auf der Grundlage veröffentlichter In-vitro-Ergebnisse von Storelli et al., 202013, erwartet. Oxamyl hat bis zu einer Konzentration von 120 μM (p = 0,3632, ungepaarter t-Test) keinen signifikanten Einfluss auf die Mobilität (Abbildung 2C,D).

Natriumhydroxid verbessert die Assay-Empfindlichkeit
Im Gegensatz zur nahezu kontinuierlichen Schwimmaktivität von C. elegans in flüssiger Kultur18 sind D. dipsaci-Tiere dramatisch weniger mobil. Dies ist bei parasitären Nematoden in Kultur16 nicht ungewöhnlich. Um "ruhende" Würmer von kranken Würmern unterscheiden zu können, werden 40 mM NaOH am Assay-Endpunkt verwendet, um die Bewegung bei Personen zu stimulieren, die dazu in der Lage sind (Abbildung 3) 19,20. Diese Technik ermöglicht die eindeutige Identifizierung von kleinen Molekülen, die Würmer immobilisieren, da sich alle Würmer in Negativkontrollbrunnen bewegen und einen außergewöhnlich niedrigen Hintergrund von Fehlalarmen im Bildschirm ergeben.

Figure 1
Abbildung 1: Beispiele für die Bildschirmausgabe Drei biologische Replikate (offene Kreise) mit D. dipsaci wurden gegen die kleinen Moleküle (60 μM) in jeder der drei gezeigten Platten durchgeführt. Alle drei Platten verfügen über 0,6 % der DMSO-Lösemittelkontrollen (dunklere Balken). Sofern nicht anders mit Lösungsmittelkontrollen oder bekannten Nematiziden angegeben, enthalten die Vertiefungen der drei Platten relativ uncharakterisierte arzneimittelähnliche Verbindungen, die von Anbietern gekauft wurden (siehe Burns et al., 2015)18. (A) Einer 96-Well-Platte aus der niedermolekularen Bibliothek fehlt jedes Molekül mit beobachtbarer Bioaktivität gegen D. dipsaci. (B) Eine 96-Well-Platte aus der kleinen Molekülbibliothek hat ein einzelnes Molekül, das die D. dipsaci-Mobilität reproduzierbar stört. (C) Eine 96-Well-Wirkstoffplatte, die die charakterisierten Nematizide Fluopyram (Fluo), Iprodion (ipro), Abamectin (Abam), Fluensulfon (Rauch), Tioxazafen (Tiox), Oxamyl (Oxam) und Wact-11 enthält. Die Fehlerindikatoren stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Beispiel für positive und negative Ergebnisse mittels Mobilitätsassay . (A) Beispiele für die terminalen Phänotypen nach der Exposition von D. dipsaci gegenüber steigenden Konzentrationen von Fluopyram nach 5 Tagen vor der Zugabe von NaOH. (B) Eine Dosis-Wirkungs-Analyse der Bewegung von D. dipsaci nach 5 Tagen Exposition gegenüber den angegebenen Konzentrationen von Fluopyram. (C,D) Das gleiche wie A,B, außer für Oxamyl. Jede Grafik zeigt Versuche, die an zwei verschiedenen Tagen mit drei Wiederholungen pro Tag durchgeführt werden. Die y-Achse jedes Diagramms gibt den beweglichen Anteil der Würmer in jedem Bohrloch an, berechnet als die Anzahl der Tiere, die sich im Verhältnis zur Gesamtzahl der Tiere im Bohrloch bewegen. Die Fehlerbalken in beiden Diagrammen stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. Die Maßstabsleiste entspricht 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Beweglichkeit von D. dipsaci nach Zugabe von 40 mM NaOH. Die Wirkung der NaOH-Zugabe zu D. dipsaci-Proben in Gegenwart von reiner Lösungsmittelkontrolle (A), Tioxazafen (B) oder Fluopyram (C) nach 5 Tagen Co-Inkubation. Die Maßstabsleiste entspricht 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Kritische Schritte
Trotz der Einfachheit des Protokolls gibt es kritische Schritte im Protokoll, die zusätzliche Aufmerksamkeit verdienen, um die Erfolgswahrscheinlichkeit zu maximieren. Erstens kann das Überbleichen der Samen ihr Wachstum stören. Daher ist es wichtig, die Zeit der Samen in der Bleichlösung auf 20 Minuten oder weniger zu begrenzen. Zweitens, wie bereits von Storelli et al. erwähnt, nimmt die scheinbare Gesundheit der Nematoden im Laufe der Zeit ab, wenn sie bei 4 ° C16 gelagert werden. Die Verwendung der Nematoden kurz nach ihrer Sammlung bietet zusätzliches Vertrauen, dass optimale Siebbedingungen erreicht werden können. Sollte eine längerfristige Lagerung erforderlich sein, stellen Sie sicher, dass der Deckel des Röhrchens nicht dicht ist, um den Sauerstoffaustausch zu ermöglichen. Drittens ermöglicht die Sicherstellung, dass die Erbsen für die vorgeschlagene Zeit auf den NA-Platten wachsen, dem Experimentator zu beurteilen, welche Samen kontaminiert sind. Viertens wird das Überwachsen der Erbsen auf den GA-Platten vor dem Hinzufügen der Nematoden die Infektion schwächen und die Nematodenausbeute verringern. Schließlich können viele Faktoren, die schwer zu kontrollieren sind, die Screening-Ergebnisse beeinflussen. Daher ist es wichtig, mehrere unabhängige Replikationsbildschirme an verschiedenen Tagen und idealerweise mit PPNs durchzuführen, die von verschiedenen Kulturplatten gesammelt wurden, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.

Einschränkungen der Methode
Eine Einschränkung des Protokolls besteht darin, dass es das Entwicklungsstadium der gesammelten Würmer, die von Jungtieren bis zu Erwachsenen reichen, nicht synchronisiert. Daher sind starke Treffer, die von jedem Bildschirm angezeigt werden, wahrscheinlich in mehreren Phasen wirksam. Das Protokoll erhöht jedoch das Risiko, effektive stadienspezifische Treffer zu übersehen. Eine zweite Überlegung ist, dass das In-vitro-Screening als erster Schritt in einer Nematizid-Entdeckungspipeline betrachtet werden sollte; Bodenbasierte Assays sind eine hervorragende Ergänzung zu einer Pipeline, um die Übersetzbarkeit der Treffer zu testen.

Bedeutung und Anwendung des Protokolls
Die hierin beschriebenen Protokolle sind einfach und leicht replizierbar. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll erfolgreich auf andere PPNs im Labor, einschließlich Pratylenchus penetrans, angewendet, indem nur geringfügige Änderungen vorgenommen wurden. Die Entwicklung neuer und sicherer PPN-Kontrollmaßnahmen ist für die Gewährleistung der globalen Ernährungssicherheit von entscheidender Bedeutung. Dies gilt insbesondere für Arten wie D. dipsaci, die im Allgemeinen gegenüber einer Vielzahl von derzeit akzeptablen chemischen Nematiziden tolerant sind13,14. Daher haben die hier skizzierten Protokolle das Potenzial, einen wichtigen Beitrag zur menschlichen Gesundheit auf globaler Ebene zu leisten.

Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Qing Yu (Agriculture and Agri-Food Canada) für die Bereitstellung der Ditylenchus-Dipsaci-Kultur und für die Beratung zu Kulturmethoden; Dr. Benjamin Mimee (Agriculture and Agri-Food Canada) und Nathalie Dauphinais (Agriculture and Agri-Food Canada) für die Beratung zur In-vitro-Kultur von pflanzenparasitären Nematoden; Dr. Andrew Burns und Sean Harrington für hilfreiche Vorschläge zum Projekt und zum Manuskript. JK ist ein NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholar. PJR wird durch einen CIHR-Projektzuschuss (313296) unterstützt. PJR ist ein Canada Research Chair (Tier 1) in Chemischer Genetik.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL tube Sarstedt 62.554.205
2 forceps Almedic 7747-A10-108
2L beaker Pyrex CLS10002L
50mL beaker Pyrex CLS100050
96 well plate Sarstedt 83.3924
aluminium foil Alcan Plus
bacteriological agar BioShop AGR001.5
coffee filter No name brand 716
commercial bleach 6% Lavo Pro 6 DIN102358107
disposable petri dishes (10cm x 1.5cm) Fisherbrand FB0875712
disposable petri dishes (10cm x 2.5cm) Sigma-Aldrich Z358762
dissecting scope Leica Leica MZ75
DMSO Sigma-Aldrich 472301-500ML
Funnel VWR 414004-270
Gamborg B5 Sigma-Aldrich G5893-10L
glass petri dish VWR 75845-546
glass slide MAGNA 60-1200
Lint-Free Blotting Paper V&P Scientific VP 522-100
Low retention pipette tips (200uL) LABFORCE 1159M44
mutlichannel pipette Eppendorf research plus 3125000036
NaOH Sigma-Aldrich S8045-500G
nutrient agar Sigma-Aldrich 70148-100G
parafilm Bemis PM-996
pea seeds Ontario Seed Company D-1995-250G
pin cleaning solutions V&P Scientific VP110A
pinner V&P Scientific VP381N
pinner rinse trays V&P Scientific VP 421
reagent reservoir with lid for multichannel pipettes Sigma-Aldrich BR703459
shaking incubator New Brunswick Scientific I26
sterile surgical blade MAGNA sb21-100-a
stir bar Fisherbrand 2109 - 1451359
sucrose BioShop SUC507.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sasser, J. N., Freckman, D. W. A. world perspective on nematology: the role of the society. Vistas on nematology. , Hyattsville: Society of Nematologists Inc. 7-14 (1987).
  2. Abad, P., et al. Genome sequence of the metazoan plant parasitic nematode Meloidogyne incognita. Nature Biotechnology. 26 (8), 909-915 (2008).
  3. Auwal, M., Hassan, T. H. P., Hongli, S., Jingwu, Z. Nematodes threats to global food security. Acta Agriculturae Scandinavica, Section B - Soil & Plant Science. 63 (5), 420-425 (2013).
  4. Chen, Z. X., Chen, S. Y., Dickson, D. W. Nematicides: Past and present uses. Nematology Vol 2, Nematode Management and Utilization. , CABI Publishing. 1179-1200 (2004).
  5. Desaeger, J., Wram, C., Zasada, I. New reduced-risk agricultural nematicides - and review. Journal of nematology. 52, (2020).
  6. Donely, N. The USA lags behind other agricultural nations in banning harmful pesticides. Environmental Health. 18 (1), 44 (2019).
  7. Polansek, T. Monsanto halts launch of chemical after users complain of rashes. Reuters. , (2017).
  8. Sturhan, D., Brzeski, M. W. Stem and bulb nematodes, Ditylenchus spp. Manual of agricultural nematology. , 423-464 (1991).
  9. The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). Data Sheets on Quarantine Pests; Ditylenchus dipsaci. Prepared by CABI and EPPO for the EU under Contract 90/399003. The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). , (2021).
  10. Quebec (Canada), Agriculture, Pêcherie et Alimentation Quebec. Réseau d'avertissements phytosanitaires (RAP). Avertissement Carotte, Céleri, Laitue, Oignon, Poireau [Warning carrot celery, lettuce, onion, leek]. Quebec (Canada), Agriculture, Pêcherie et Alimentation Quebec. , (2011).
  11. Abawi, G. S., Moktan, K. Bloat nematode problem on garlic: symptoms, distribution, and management guidelines. Department of Plant Pathology and Plant-microbe Biology, Geneva. , Cornell University. (2010).
  12. Taylor, R. Chapter 7. Nematodes and other worms. , Academic Press. 143-234 (2019).
  13. Storelli, A., Keiser, A., Eder, R., Jenni, S., Kiewnick, S. Evaluation of fluopyram for the control of Ditylenchus dipsaci in sugar beet. Journal of nematology. 52, 1-10 (2020).
  14. Oka, Y. Nematicidal activity of fluensulfone against some migratory nematodes under laboratory conditions. Pest Management Science. 70, 1850 (2014).
  15. Poirier, S., Dauphinais, N., Van Der Heyden, H., Véronneau, P. Y., Bélair, G., Gravel, V., Mimee, B. Host Range and Genetic Characterization of Ditylenchus dipsaci Populations from Eastern Canada. Plant disease. 103, 456-460 (2019).
  16. Storelli, A., Kiewnick, S., Daub, M., et al. Virulence and pathogenicity of four Ditylenchus dipsaci populations on sugar beet. Eur J Plant Pathol. 161, 63-71 (2021).
  17. Kühnhold, V., Kiewnick, S., Sikora, R. A. Development of an in vivo bioassay to identify sugar beet resistance to the stem nematode Ditylenchus dipsaci. Nematology. 8 (5), 641-645 (2006).
  18. Burns, A., Luciani, G., Musso, G. Caenorhabditis elegans is a useful model for anthelmintic discovery. Nat Communications. 6, (2015).
  19. Chen, S. Y., Dickson, D. W. A Technique for Determining Live Second-stage Juveniles of Heterodera glycines. Journal of nematology. 32, 117-121 (2000).
  20. Xiang, N., Lawrence, K. S. Optimization of In Vitro Techniques for Distinguishing between Live and Dead Second Stage Juveniles of Heterodera glycinesand Meloidogyne incognita. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
  21. US EPA. Fluopyram. US EPA. , OFFICE OF CHEMICAL SAFETY AND POLLUTION PREVENTION (2016).
  22. US EPA. Fluopyram. US EPA. , OFFICE OF CHEMICAL SAFETY AND POLLUTION PREVENTION (2020).
  23. US EPA. Oxamyl Facts. Prevention, Pesticides and Toxic Substances. US EPA. , (2000).

Tags

Biologie Heft 179
Kultivierung und Screening des pflanzenparasitären <em>Nematoden Ditylenchus dipsaci</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cammalleri, S. R., Knox, J., Roy, P. … More

Cammalleri, S. R., Knox, J., Roy, P. J. Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci. J. Vis. Exp. (179), e63438, doi:10.3791/63438 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter