Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dyrkning og screening af planten parasitisk nematode Ditylenchus dipsaci

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63438
Automatic Translation
1,2,3, 1,3, 1,3,4
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3The Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 4Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto

Summary

Den nuværende protokol beskriver en pålidelig og ligetil metode til dyrkning, indsamling og screening af Ditylenchus dipsaci.

Abstract

Planteparasitære nematoder (PPN'er) ødelægger over 12% af de globale fødevareafgrøder hvert år, hvilket svarer til ca. 157 milliarder dollars (USD) tabt årligt. Med en voksende global befolkning og begrænset agerjord er kontrol med PPN-angreb afgørende for fødevareproduktionen. Udfordringen med at maksimere afgrødeudbyttet forværres af de stigende begrænsninger for effektive pesticider på grund af manglende nematodeseleivitet. Derfor er udvikling af nye og sikre kemiske nematicider afgørende for fødevaresikkerheden. I denne protokol demonstreres kulturen og samlingen af PPN-arten Ditylenchus dipsaci . D. dipsaci er både økonomisk skadelig og relativt modstandsdygtig over for de fleste moderne nematicider. Det nuværende arbejde forklarer også, hvordan man bruger disse nematoder i skærme til nye små molekylenematicider og rapporter om dataindsamlings- og analysemetoder. Den demonstrerede rørledning giver en gennemstrømning på tusindvis af forbindelser om ugen og kan let tilpasses til brug med andre PPN-arter såsom Pratylenchus penetrans. De teknikker, der er beskrevet heri, kan bruges til at opdage nye nematicider, som igen kan videreudvikles til meget selektive kommercielle produkter, der sikkert bekæmper PPN'er for at hjælpe med at fodre en stadig mere sulten verden.

Introduction

Planteparasitære nematoder (PPN'er) anslås at være ansvarlige for tabet af 12,3% af den globale fødevareproduktion og forårsage anslået 157 milliarder dollars i skade årligt 1,2,3. Desværre er evnen til at kontrollere PPN'er aftagende, fordi effektive kemiske nematicider er blevet forbudt eller står over for eskalerende restriktioner på grund af menneskers sikkerhed og miljøhensyn. Dette skyldes primært den dårlige nematodesseleticitet hos tidligere generationer af pesticider4. I løbet af de sidste 25 år er seks nye kemiske nematicider blevet afprøvet eller introduceret på markedet5. En af disse er allerede blevet forbudt i Europa, og en anden er blevet afbrudt, mens den undersøges for dens indvirkning på menneskeligvarmelh 6,7. Der er derfor et presserende behov for nye nematicider, der er meget selektive for PPN'er.

Stamme- og pærenematoden, Ditylenchus dipsaci (D. dipsaci) er en økonomisk virkningsfuld PPN4. D. dipsaci inficerer næsten 500 plantearter på tværs af 30 biologiske racer og er målrettet mod nogle af de mest landbrugsmæssigt vigtige afgrøder som rug, havre, hvidløg, løg og porre 8,9. For eksempel har D. dipsaci for nylig pisket hvidløgsmarker i Ontario og Quebec, hvilket resulterer i tab på op til 90%10,11. Dens geografiske fordeling er næsten allestedsnærværende og omfatter Amerika (herunder Californien og Florida), Europa, meget af Asien (herunder Kina) og Oceanien9. D. dipsaci er en migrerende endoparasit, der kommer ind i stomata på blade eller sår og lenticeller, hvor de frigiver enzymer for at nedbryde cellevæggen12. Ved at forværre virkningen af D. dipsaci på afgrøder gør skaden forårsaget af PPN planten modtagelig for sekundær infektion11. Desværre viser D. dipsaci høje toleranceniveauer over for nuværende nematicider sammenlignet med andre nematodestammer13,14.

Denne protokol beskriver dyrkningen af D. dipsaci og dens anvendelse i store skærme til små molekylekandidatnematicider. Kort fortalt opretholdes og udvides D. dipsaci-populationerne på ærteplanter dyrket i sterile Gamborg B-5 (GA) medier15. Før der dyrkes frøspirer på GA-medium, skal frøene steriliseres gennem en række vaske og belægges på næringsstofagar (NA) for at kontrollere for forurening. Frøsterilisering er afgørende for at detektere bakterielle og svampeforurenende stoffer, der kan være til stede. De ikke-forurenede frø overføres derefter til GA-plader, hvor frøspirer vil vokse som forberedelse til infektion. GA-pladerne, der indeholder frøspirer, inficeres med nematoder fra en tidligere kulturplade ved at overføre et stykke agar indeholdende rodvæv til de friske plader. Efter 6-8 uger ekstraheres nematoderne fra GA-medierne og filtreres gennem en kaffefilterforet tragt til et opsamlingsbægerglas. Nematoderne kan anvendes i forskellige bioassays, når et passende antal er indsamlet. Teknikken beskrevet i denne protokol genererer ca. 15.000 D. dipsaci pr. Kulturplade. Alternative protokoller til dyrkning af D. dipsaci er blevet offentliggjort16,17.

Et in vitro screeningsassay for små molekyler baseret på tidligere arbejde18 er også beskrevet her. Som en proxy for ormens sundhed undersøges mobiliteten af 20 nematoder pr. Brønd efter 5 dages eksponering for små molekyler. For bedre at visualisere ormens mobilitet tilføjes NaOH for at øge bevægelsen af levende orme19,20. Denne protokol tillader screening af medium gennemstrømning og giver værdifulde data til vurdering af små molekylers nematiske potentiale. Hvis der anvendes en anden nematodeopsamlingsteknik16,17, kan den heri beskrevne screeningsmetode for små molekyler ikke desto mindre gennemføres.

Protocol

D. dipsaci-stammen G-137, der blev brugt til det nuværende arbejde, blev indsamlet fra Fish Lake 4 Variety hvidløg i Prince Edward County og blev leveret af Agriculture and Agri-food Canada. Hvis du starter en ny kultur, skal du konsultere Poirier et al. for podningsmetode15.

1. Dyrkning af D. dipsaci

  1. Forbered medierne og pladerne efter tidligere rapporteret arbejde15.
    1. Forbered 500 ml næringsstof agar (NA) medier med 23 g / l NA (se tabel over materialer) og ultrarent vand. Brug steril teknik til at hælde 25 ml autoklaveret NA-medier i 20 engangs petriskåle (100 mm diameter x 15 mm dyb). Lad agar størkne ved stuetemperatur (22 °C) med låget tændt i ~2 timer og sæt det til side til senere brug.
    2. 500 ml Gamborg B-5 (GA) medier indeholdende 3,2 g/l GA-basalmedium med minimale organiske stoffer, 20 g/l saccharose, 15 g/l agar og destilleret vand (se materialetabel). Brug steril teknik til at hælde 50 ml autoklaveret GA-medier i 10 engangs petriskåle (100 mm diameter x 25 mm dyb). Lad agar størkne ved stuetemperatur (22 °C) med låget tændt i ~5 timer, og opbevar det oprejst ved stuetemperatur i en steril pose, indtil spiren overføres.
      BEMÆRK: Overskydende medieplader fremstilles, hvis der opstår forurening.
  2. Udfør frøsterilisering efter en metode, der er modificeret fra et tidligere arbejde15.
    1. Autoklave et 2 L bægerglas med omrøringsstang, 2 tang, en glaspetriskål og 1 liter destilleret vand. Forbered 200 ml 95% EtOH-opløsning og 200 ml af en 15% kommerciel blegemiddelopløsning.
    2. Brug ærtefrø (se Materialetabel). Hæld 150 frø i et sterilt 2 L bægerglas med en rørestang nær en Bunsen brænderflamme på en laboratoriebænk.
    3. Tilsæt 200 ml 95% EtOH til frøene i bægerglasset, rør kraftigt på omrøringspladen i 5 minutter, og hæld derefter EtOH af i en affaldsbeholder.
    4. Hæld blegemiddelopløsning i bægerglasset for at nedsænke frøene helt. Rør kraftigt på en røreplade i 20 minutter, og hæld derefter blegemiddel i en affaldsbeholder.
    5. Hæld destilleret vand i bægerglasset for at nedsænke frøene og rør kraftigt på en omrøringsplade i 20 minutter. Gentag vandvask tre gange, hæld destilleret vand af efter hver vask. Efter den endelige vandvask hældes steriliserede frø i glasset petriskålen.
    6. For at kontrollere for forurening overføres 6 frø til hver 10 cm NA-plade (fremstillet i trin 1.1.1) i den laminære oversvømmelseshætte ved hjælp af steriliserede tang. Arranger frøene omkring pladens omkreds (plumper frø fungerer bedst). Pak pladerne individuelt ind i laboratorieindpakningsfilm og inkuber i mørke i 3 dage ved 26 °C.
      BEMÆRK: Plettering af flere frø end nødvendigt giver mulighed for selektiv anvendelse af ikke-forurenede frø.
  3. Udfør spireoverførsel ved at følge nedenstående trin.
    1. I en laminær strømningshætte skal du bruge steriliserede tang til at plade 2 ikke-forurenede frø på hver GA-plade (fremstillet i trin 1.1.2). Pak pladerne individuelt i laboratorieindpakningsfilm og inkuber ved stuetemperatur i 7-10 dage for at lade frøene spire.
  4. Udføre in vitro-opdræt efter en metode, der er modificeret fra et tidligere arbejde15.
    1. Der fremstilles 50 ml 20 g/l saccharoseopløsning. Filtrer steriliser saccharoseopløsning og sæt til side.
    2. I en laminær strømningshætte skæres et stykke agar indeholdende rodvæv (~ 2 cm3) fra en eksisterende kulturplade. Pipette 500 μL saccharoseopløsning på ny GA-plade med ærteplanter og læg agarterning oven på saccharose. Pak pladerne individuelt ind i laboratorieindpakningsfilm og hold kulturen i en kasse foret med aluminiumsfolie ved stuetemperatur (~ 22 ° C).
    3. Subkultur nematoder på friske GA-plader hver 8-9 uger for at opretholde kulturen. Nematoder er klar til at blive ekstraheret efter ~ 8 uger.

2. Ekstraktion og indsamling af D. dipsaci

  1. Udfør ekstraktionen af D. dipsaci ved at følge nedenstående trin.
    1. Autoklave et 50 ml bægerglas, en 80 mm tragt, 150 ml destilleret vand og kaffefiltre. Anbring tragten i bægerglasset, og bekæd tragten med sterilt kaffefilter.
    2. I en laminær strømningshætte skæres agaren og rodvævet i 1 cm3 ved hjælp af en steril skalpel. Overfør agarterningerne i den kaffefilterforede tragt og hæld langsomt destilleret vand på agaren for at fugte kaffefilteret.
    3. Fjern den kaffefilterforede tragt fra bægerglasset, og fyld bægerglasset med destilleret vand, indtil vandstanden kun rører bunden af filteret, når den kaffefilterforede tragt er udskiftet.
    4. Dæk den kaffefilterforede tragt og bægerglas med aluminiumsfolie. Lad natten over (16 timer) ligge på bordpladen, så ormene kan bevæge sig gennem kaffefilteret og ind i opsamlingsbægerglasset.
      BEMÆRK: En nematode-kulturplade er klar til ekstraktion, når orme er kravlet ind i agaren, når de undersøges med et dissektionsmikroskop. Typisk er en plade klar til ekstraktion 6-8 uger efter den første podning.
  2. Udfør samlingen af D. dipsaci.
    BEMÆRK: Den næste dag vil D. dipsaci ormene have lagt sig til bunden af bægerglasset.
    1. Fjern den kaffefilterforede tragt, og aspirer de øverste 40 ml vand fra opsamlingsbægerglasset; Sørg for ikke at forstyrre de bosatte orme. Ved hjælp af en 10 ml plastserologisk pipette opsamles den resterende væske i et 15 ml konisk centrifugerør.
      BEMÆRK: Denne samling kan bruges direkte i assays. Anbring ved 4 °C, hvis de ikke vil blive brugt inden for 24 timer. Ormene kan efterlades i 3 dage ved 4 °C uden synlig indvirkning på mobiliteten. Fjernelse af tragten kan forstyrre ormene i opsamlingsbægerglasset. Lad dem slå sig ned til bunden, før de samles.

3. In vitro lille molekyle skærm

  1. Forbered analysepladerne ved at følge nedenstående trin.
    1. Hæld autoklaveret destilleret vand i et sterilt trug, og dispenser ved hjælp af en flerkanalspipette 40 μL destilleret vand fra truget i hver brønd i en fladbundet plade med 96 brønde.
  2. Forbered fastgørelsesværktøj og tilsæt kemikalierne
    1. Sæt pinnerbakker op (se Table of Materials) i nærheden af en Bunsen-brænderflamme på en laboratoriebænk. Tilsæt følgende til successive pinnerbakker: 25 ml pin-rengøringsopløsning, 35 ml 50% DMSO (i vand), 45 ml destilleret vand, 55 ml 70% EtOH og 65 ml 95% EtOH. Placer et stykke blottingpapir foran hver bakke
    2. Rengør fastgørelsesværktøjet ved at emere stifterne i rengøringsopløsningen og flytte stifterne op og ned tre gange (3x) i opløsningen. I denne protokol defineres »3x« og »10x« som at flytte pinneren op og ned i en opløsning henholdsvis tre eller ti gange. Blot stifterne på blottingpapiret. Gentag denne procedure igen.
      1. Skyl derefter stifterne 3x i destilleret vand efterfulgt af blotting af stifterne. Gentag proceduren igen.
      2. Til sidst skylles stifterne 3x i 95% EtOH, efterfulgt af blotting af stifterne. Gentag igen. Flamme pinneren og lade ethanolen fordampe.
    3. Tilsæt kemikalier fra de 96-brønds kemiske stamplader til analyseplader ved at fastgøre 3x i den kemiske plade og derefter overføre stifterne 10X til analysepladen. Blot på papir foran rengøringsopløsningen.
    4. Rengør fastgørelsesværktøjet mellem pladerne ved at vaske i følgende rækkefølge, blotting imellem på blottingpapir: 3x i 50% DMSO (en gang), 3x i destilleret vand (en gang), 3x i 75% EtOH (en gang), 3x i 95% EtOH (to gange). Flamme stifteren og lade ethanol fordampe.
    5. Gentag trin 3.2.2, når al fastgørelse er afsluttet.
      BEMÆRK: Screeningen blev udført i en endelig koncentration på 60 μM.
  3. Tilsætning af orme
    1. Tæl antallet af nematoder fra samlingen ved først at genbruge og derefter pipettere 5 μL ved hjælp af spidser med lav tilbageholdelse på et dias til observation. Tæl antallet af nematoder i 5 μL ved hjælp af et dissektionsmikroskop.
      1. Juster koncentrationen til 2 orme/μL ved hjælp af sterilt destilleret vand. Brug en flerkanalspipette og et trug til at tilføje 10 μL (~ 20 orme) til hver brønd af pladerne med 96 brønde.
        BEMÆRK: Ca. 15.000 D. dipsaci nematoder vil blive indsamlet pr. kulturplade ved hjælp af den beskrevne kultur- og indsamlingsmetode. Tyve orme bruges pr. Brønd, fordi det lille antal letter den klare visualisering og regnskab for mobile og immobile.
    2. Forsegl pladerne i laboratorieindpakningsfilm og pakk med et fugtigt papirhåndklæde. Anbring i æske og anbring på en klæbrig pude i 20 ° C rystende inkubator indstillet til 200 o / min. Sørg for, at pladerne er stabiliseret i kassen ved at tilføje et ekstra fugtigt papirhåndklæde for at sikre minimal bevægelse af plader.

4. Dataindsamling og -analyse

  1. Overhold plader på dag 5 under et dissekeringsmikroskop. Tæl antallet af mobile og samlede antal D. dipsaci i DMSO-opløsningsmiddelkontroller og lægemiddelbehandlede brønde.
    1. Hvis ormene er relativt ubevægelige, tilsættes 2 μL 1 M NaOH til en endelig koncentration på 40 mM til brønden for at stimulere bevægelsen19,20.
      BEMÆRK: Efter tilsætning af NaOH vil orme bevæge sig øjeblikkeligt og skal ses inden for 5 minutter. Antallet af mobile orme og det samlede antal orme vil blive brugt til at beregne andelen af mobile orme. Assayets længde kan ændre sig afhængigt af skærmens formål.
  2. Beregn andelen af mobile orme. I D. dipsaci-skærmene kategoriseres brønde, der reproducerbart gav 0% mobile orme, som stærke hits.
    BEMÆRK: Langvarig eksponering af plader på dissektionsmikroskoper undgås, fordi lyskilden kan opvarme pladerne og fremkalde variable virkninger på bioassayet.

Representative Results

Uafhængige replikater afslører reproducerbare hits
For at illustrere den forventede variation mellem replikatskærmene afbildes midlerne og variationen i prøvemobiliteten ud fra tre repræsentative plader fra en nylig skærm (figur 1). Tre replikater af skærmen blev udført på tre forskellige dage. Alle tre plader har negative (kun opløsningsmiddel) kontroller (mørkere stænger), og prøver i sættet indeholdt etablerede nematicider. De resterende forbindelser er fra et brugerdefineret bibliotek, der i øjeblikket karakteriseres i Roy-laboratoriet. Sammenlignet med lignende skærme udført med C. elegans med de samme molekyler (SC, JK, PJR, upublicerede resultater) er hitraten med D. dipsaci signifikant lavere, og mange lægemiddelplader udviser ingen aktivitet (figur 1A). Nogle plader har fuldt reproducerbare hits (figur 1B,C), mens andre varierer i aktivitet (figur 1C). I forhold til andre arter, der screenes (ikke vist), viser D. dipsaci mindre variabilitet i sin reaktion på forbindelser. Uanset hvad anses replikater for nødvendige ved identifikationen af reproducerbare hits.

Nematicider varierer i deres evne til at immobilisere Ditylenchus dipsaci
Af de syv karakteriserede nematicider, der er testet mod D. dipsaci, udviser kun Fluopyram robust aktivitet i det assay, der er beskrevet heri (figur 1C). Dette er i overensstemmelse med tidligere arbejde, der viser, at D. dipsaci er tolerant over for nematicider13,14. Fluopyram hæmmer kompleks II af elektrontransportkæden på en nematode-selektiv måde og er et kommercielt nematicid, der anvendes til at kontrollere en række PPN'er, herunder Rotylenchulus reniformis og Meloidogyne incognita 4,21,22. Fluopyram og et af de nematicider, der manglede aktivitet ved den testede koncentration (Oxamyl)23, blev undersøgt mere detaljeret gennem en dosis-respons-analyse med D. dipsaci. Fluopyram inducerer en tilsyneladende dosisafhængig virkning på D. dipsaci-mobilitet med en EC50 på 9,3 μM (med et 95 % konfidensinterval mellem 8,2 og 10,5 μM) (figur 2A,B). Dette resultat forventes baseret på offentliggjorte in vitro-resultater fra Storelli et al., 202013. Oxamyl har ingen signifikant effekt på mobiliteten op til en koncentration på 120 μM (p = 0,3632, uparret t-test) (figur 2C,D).

Natriumhydroxid forbedrer assayfølsomheden
I modsætning til den næsten kontinuerlige svømmeaktivitet af C. elegans i flydende kultur18 er D. dipsaci dyr dramatisk mindre mobile. Dette er ikke ualmindeligt blandt parasitære nematoder i kultur16. For at hjælpe med at skelne 'hvilende' orme fra syge orme anvendes 40 mM NaOH ved assay-endepunktet for at stimulere bevægelsen hos de personer, der er i stand til (figur 3) 19,20. Denne teknik giver mulighed for klar identifikation af små molekyler, der immobiliserer orme, da alle orme i negative kontrolbrønde bevæger sig og giver en usædvanlig lav baggrund for falske positiver på skærmen.

Figure 1
Figur 1: Eksempler på skærmoutput. Tre biologiske replikater (åbne cirkler) med D. dipsaci blev udført mod de små molekyler (60 μM) i hver af de tre viste plader. Alle tre plader har 0,6% dmSO-opløsningsmiddelkontroller (mørkere stænger). Medmindre andet er angivet med opløsningsmiddelkontrol eller kendte nematicider, indeholder brøndene på de tre plader relativt ukarakteriserede lægemiddellignende forbindelser købt hos leverandører (se Burns et al., 2015)18. (A) En 96 brøndplade fra det lille molekylebibliotek mangler ethvert molekyle med observerbar bioaktivitet mod D. dipsaci. (B) En 96 brøndplade fra det lille molekylebibliotek har et enkelt molekyle, der reproducerbart forstyrrer D. dipsaci mobilitet. (C) En 96 brønd lægemiddelplade indeholdende de karakteriserede nematicider fluopyram (fluo), iprodion (ipro), abamectin (abam), fluensulfon (røggas), tioxazafen (tiox), oxamyl (oxam) og wact-11. Fejllinjerne repræsenterer standardfejlen i middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Eksempel på positive og negative resultater ved hjælp af mobilitetsassay. (A) Eksempler på de terminale fænotyper efter eksponering af D. dipsaci for stigende koncentrationer af fluopyram efter 5 dage før tilsætning af NaOH. B) En dosis-respons-analyse af bevægelsen af D. dipsaci efter 5 dages eksponering for de angivne koncentrationer af fluopyram. (C,D) Det samme som A,B, bortset fra oxamyl. Hver graf viser forsøg udført på to separate dage med tre replikater hver dag. Y-aksen for hver graf angiver brøkdelen mobil af ormene i hver brønd beregnet som antallet af dyr, der bevæger sig i forhold til det samlede antal dyr i brønden. Fejllinjerne på begge grafer repræsenterer standardfejlen i middelværdien. Skalabjælken repræsenterer 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Mobilitet af D. dipsaci efter tilsætning af 40 mM NaOH. Virkningen af NaOH-tilsætning til D. dipsaci-prøver i nærvær af opløsningsmiddel-only control (A), tioxazafen (B) eller fluopyram (C) efter 5 dages co-inkubation. Skalabjælken repræsenterer 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Kritiske skridt
På trods af protokollens enkelhed er der kritiske trin i protokollen, der fortjener yderligere opmærksomhed for at maksimere sandsynligheden for succes. For det første kan overblening af frøene forstyrre deres vækst. Derfor er det vigtigt at begrænse frøenes tid i blegeopløsningen til 20 minutter eller mindre. For det andet, som tidligere bemærket af Storelli et al., falder nematodernes tilsyneladende sundhed over tid, når de opbevares ved 4 ° C16. Brug af nematoderne kort efter deres indsamling giver yderligere tillid til, at optimale screeningsbetingelser kan opnås. Hvis længerevarende opbevaring er nødvendig, skal du sørge for, at rørets låg ikke er stramt for at tillade iltudveksling. For det tredje kan forsøgspersonen ved at sikre, at ærterne vokser på NA-pladerne i den foreslåede tid, bedømme, hvilke frø der er forurenet. For det fjerde vil overgroning af ærterne på GA-pladerne, før nematoderne tilsættes, svække infektionen og reducere nematodeudbyttet. Endelig kan mange faktorer, der er vanskelige at kontrollere, påvirke screeningsresultaterne. Derfor er det vigtigt at udføre flere uafhængige replikatskærme på forskellige dage og ideelt set med PPN'er indsamlet fra forskellige kulturplader for at sikre reproducerbarheden af resultaterne.

Begrænsninger af metode
En begrænsning af protokollen er, at den ikke synkroniserer udviklingsstadiet for de indsamlede orme, der spænder fra unge til voksne. Derfor er stærke hits, der afsløres af enhver skærm, sandsynligvis effektive i flere faser. Protokollen øger dog risikoen for at overse effektive scenespecifikke hits. En anden overvejelse er, at in vitro-screening bør betragtes som det første skridt i en nematicid-opdagelsespipeline; jordbaserede assays er en glimrende tilføjelse til en pipeline for at teste oversættelsen af hits.

Protokollens betydning og anvendelse
De protokoller, der er beskrevet heri, er enkle og nemme at replikere. Desuden er denne protokol blevet anvendt med succes på andre PPN'er i laboratoriet, herunder Pratylenchus penetrans, ved kun at foretage små ændringer. Udvikling af nye og sikre PPN-kontrolforanstaltninger er afgørende for at sikre den globale fødevaresikkerhed. Dette gælder især for arter som D. dipsaci, der generelt er tolerante over for en lang række aktuelt acceptable kemiske nematicider13,14. De protokoller, der er skitseret her, har derfor potentiale til at yde et vigtigt bidrag til menneskers sundhed på globalt plan.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender Dr. Qing Yu (Landbrug og Agri-Food Canada) for at levere Ditylenchus dipsaci-kulturen og for rådgivning om kulturmetoder; Dr. Benjamin Mimee (Landbrug og Agri-Food Canada) og Nathalie Dauphinais (Landbrug og Agri-Food Canada) for rådgivning om in vitro-kultur af planteparasitære nematoder; Dr. Andrew Burns og Sean Harrington for nyttige forslag til projektet og manuskriptet. JK er en NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholar. PJR er støttet af et CIHR-projekttilskud (313296). PJR er en Canada Research Chair (Tier 1) i kemisk genetik.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL tube Sarstedt 62.554.205
2 forceps Almedic 7747-A10-108
2L beaker Pyrex CLS10002L
50mL beaker Pyrex CLS100050
96 well plate Sarstedt 83.3924
aluminium foil Alcan Plus
bacteriological agar BioShop AGR001.5
coffee filter No name brand 716
commercial bleach 6% Lavo Pro 6 DIN102358107
disposable petri dishes (10cm x 1.5cm) Fisherbrand FB0875712
disposable petri dishes (10cm x 2.5cm) Sigma-Aldrich Z358762
dissecting scope Leica Leica MZ75
DMSO Sigma-Aldrich 472301-500ML
Funnel VWR 414004-270
Gamborg B5 Sigma-Aldrich G5893-10L
glass petri dish VWR 75845-546
glass slide MAGNA 60-1200
Lint-Free Blotting Paper V&P Scientific VP 522-100
Low retention pipette tips (200uL) LABFORCE 1159M44
mutlichannel pipette Eppendorf research plus 3125000036
NaOH Sigma-Aldrich S8045-500G
nutrient agar Sigma-Aldrich 70148-100G
parafilm Bemis PM-996
pea seeds Ontario Seed Company D-1995-250G
pin cleaning solutions V&P Scientific VP110A
pinner V&P Scientific VP381N
pinner rinse trays V&P Scientific VP 421
reagent reservoir with lid for multichannel pipettes Sigma-Aldrich BR703459
shaking incubator New Brunswick Scientific I26
sterile surgical blade MAGNA sb21-100-a
stir bar Fisherbrand 2109 - 1451359
sucrose BioShop SUC507.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sasser, J. N., Freckman, D. W. A. world perspective on nematology: the role of the society. Vistas on nematology. , Hyattsville: Society of Nematologists Inc. 7-14 (1987).
  2. Abad, P., et al. Genome sequence of the metazoan plant parasitic nematode Meloidogyne incognita. Nature Biotechnology. 26 (8), 909-915 (2008).
  3. Auwal, M., Hassan, T. H. P., Hongli, S., Jingwu, Z. Nematodes threats to global food security. Acta Agriculturae Scandinavica, Section B - Soil & Plant Science. 63 (5), 420-425 (2013).
  4. Chen, Z. X., Chen, S. Y., Dickson, D. W. Nematicides: Past and present uses. Nematology Vol 2, Nematode Management and Utilization. , CABI Publishing. 1179-1200 (2004).
  5. Desaeger, J., Wram, C., Zasada, I. New reduced-risk agricultural nematicides - and review. Journal of nematology. 52, (2020).
  6. Donely, N. The USA lags behind other agricultural nations in banning harmful pesticides. Environmental Health. 18 (1), 44 (2019).
  7. Polansek, T. Monsanto halts launch of chemical after users complain of rashes. Reuters. , (2017).
  8. Sturhan, D., Brzeski, M. W. Stem and bulb nematodes, Ditylenchus spp. Manual of agricultural nematology. , 423-464 (1991).
  9. The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). Data Sheets on Quarantine Pests; Ditylenchus dipsaci. Prepared by CABI and EPPO for the EU under Contract 90/399003. The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). , (2021).
  10. Quebec (Canada), Agriculture, Pêcherie et Alimentation Quebec. Réseau d'avertissements phytosanitaires (RAP). Avertissement Carotte, Céleri, Laitue, Oignon, Poireau [Warning carrot celery, lettuce, onion, leek]. Quebec (Canada), Agriculture, Pêcherie et Alimentation Quebec. , (2011).
  11. Abawi, G. S., Moktan, K. Bloat nematode problem on garlic: symptoms, distribution, and management guidelines. Department of Plant Pathology and Plant-microbe Biology, Geneva. , Cornell University. (2010).
  12. Taylor, R. Chapter 7. Nematodes and other worms. , Academic Press. 143-234 (2019).
  13. Storelli, A., Keiser, A., Eder, R., Jenni, S., Kiewnick, S. Evaluation of fluopyram for the control of Ditylenchus dipsaci in sugar beet. Journal of nematology. 52, 1-10 (2020).
  14. Oka, Y. Nematicidal activity of fluensulfone against some migratory nematodes under laboratory conditions. Pest Management Science. 70, 1850 (2014).
  15. Poirier, S., Dauphinais, N., Van Der Heyden, H., Véronneau, P. Y., Bélair, G., Gravel, V., Mimee, B. Host Range and Genetic Characterization of Ditylenchus dipsaci Populations from Eastern Canada. Plant disease. 103, 456-460 (2019).
  16. Storelli, A., Kiewnick, S., Daub, M., et al. Virulence and pathogenicity of four Ditylenchus dipsaci populations on sugar beet. Eur J Plant Pathol. 161, 63-71 (2021).
  17. Kühnhold, V., Kiewnick, S., Sikora, R. A. Development of an in vivo bioassay to identify sugar beet resistance to the stem nematode Ditylenchus dipsaci. Nematology. 8 (5), 641-645 (2006).
  18. Burns, A., Luciani, G., Musso, G. Caenorhabditis elegans is a useful model for anthelmintic discovery. Nat Communications. 6, (2015).
  19. Chen, S. Y., Dickson, D. W. A Technique for Determining Live Second-stage Juveniles of Heterodera glycines. Journal of nematology. 32, 117-121 (2000).
  20. Xiang, N., Lawrence, K. S. Optimization of In Vitro Techniques for Distinguishing between Live and Dead Second Stage Juveniles of Heterodera glycinesand Meloidogyne incognita. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
  21. US EPA. Fluopyram. US EPA. , OFFICE OF CHEMICAL SAFETY AND POLLUTION PREVENTION (2016).
  22. US EPA. Fluopyram. US EPA. , OFFICE OF CHEMICAL SAFETY AND POLLUTION PREVENTION (2020).
  23. US EPA. Oxamyl Facts. Prevention, Pesticides and Toxic Substances. US EPA. , (2000).

Tags

Biologi udgave 179
Dyrkning og screening af planten parasitisk nematode <em>Ditylenchus dipsaci</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cammalleri, S. R., Knox, J., Roy, P. … More

Cammalleri, S. R., Knox, J., Roy, P. J. Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci. J. Vis. Exp. (179), e63438, doi:10.3791/63438 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter