Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Culturing og screening planten parasittisk Nematode Ditylenchus dipsaci

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63438
Automatic Translation
1,2,3, 1,3, 1,3,4
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3The Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 4Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto

Summary

Den nåværende protokollen beskriver en pålitelig og grei metode for dyrking, innsamling og screening av Ditylenchus dipsaci.

Abstract

Planteparasittiske nematoder (PPNer) ødelegger over 12% av globale matavlinger hvert år, noe som tilsvarer omtrent 157 milliarder dollar (USD) tapt årlig. Med en voksende global befolkning og begrenset dyrkbar jord er kontroll av PPN-angrep avgjørende for matproduksjonen. Sammensetning av utfordringen med å maksimere avlingsutbyttet er de økende restriksjonene på effektive plantevernmidler på grunn av mangel på nematode-selektivitet. Derfor er utvikling av nye og sikre kjemiske nematicider avgjørende for matsikkerheten. I denne protokollen demonstreres kulturen og samlingen av PPN-arten Ditylenchus dipsaci . D. dipsaci er både økonomisk skadelig og relativt motstandsdyktig mot de fleste moderne nematicider. Det nåværende arbeidet forklarer også hvordan du bruker disse nematodene i skjermer for nye små molekylmaomacider og rapporter om datainnsamlings- og analysemetoder. Den demonstrerte rørledningen gir en gjennomstrømning av tusenvis av forbindelser per uke og kan enkelt tilpasses for bruk med andre PPN-arter som Pratylenchus penetrans. Teknikkene som er beskrevet her, kan brukes til å oppdage nye nematicider, som igjen kan videreutvikles til svært selektive kommersielle produkter som trygt bekjemper PPNer for å bidra til å mate en stadig mer sulten verden.

Introduction

Planteparasittiske nematoder (PPNer) anslås å være ansvarlige for tapet av 12,3% av den globale matproduksjonen og forårsake anslagsvis 157 milliarder dollar i skade årlig 1,2,3. Dessverre er evnen til å kontrollere PPNer avtagende fordi effektive kjemiske nematicider har blitt forbudt eller står overfor eskalerende restriksjoner på grunn av menneskelige sikkerhets- og miljøhensyn. Dette skyldes hovedsakelig den dårlige nematode selectivity av tidligere generasjoner av plantevernmidler4. I løpet av de siste 25 årene har seks nye kjemiske nematicider blitt pilotert eller introdusert i markedet5. En av disse har allerede blitt forbudt i Europa, og en annen har blitt avviklet mens den undersøkes for sin innvirkning på menneskelig varmelh 6,7. Derfor er det et presserende behov for nye nematicider som er svært selektive for PPNer.

Stammen og pære nematoden, Ditylenchus dipsaci (D. dipsaci) er en økonomisk virkningsfull PPN4. D. dipsaci infiserer nesten 500 plantearter over 30 biologiske raser og retter seg mot noen av de mest landbruksviktige avlingene som rug, havre, hvitløk, løk og purre 8,9. For eksempel har D. dipsaci nylig plaget hvitløksfelt i Ontario og Quebec, noe som resulterer i tap på opptil 90% 10,11. Den geografiske distribusjonen er nesten allestedsnærværende og inkluderer Amerika (inkludert California og Florida), Europa, mye av Asia (inkludert Kina) og Oseania9. D. dipsaci er en trekkende endoparasitt som kommer inn i stomata på blader eller sår og lentikler der de frigjør enzymer for å bryte ned celleveggen12. Ved å forsterke virkningen av D. dipsaci på avlinger, gjør skaden forårsaket av PPN planten utsatt for sekundær infeksjon11. Dessverre viser D. dipsaci høye toleransenivåer for nåværende nematicider sammenlignet med andre nematodestammer13,14.

Denne protokollen beskriver kultivering av D. dipsaci, og dens bruk i store skjermer for små molekylkandidat nematicider. Kort sagt, D. dipsaci populasjoner opprettholdes og utvides på ertplanter dyrket i sterile Gamborg B-5 (GA) media15. Før du vokser frøspirer på GA-medium, må frøene steriliseres gjennom en rekke vasker og belagt på næringsagar (NA) for å se etter forurensning. Frøsterilisering er viktig for å oppdage bakterielle og soppgifter som kan være til stede. De ikke-forurensede frøene overføres deretter til GA-plater, hvor frøspirer vil vokse som forberedelse til infeksjon. GA-platene som inneholder frøspirer er smittet med nematoder fra en tidligere kulturplate ved å overføre et stykke agar som inneholder rotvev til de friske platene. Etter 6-8 uker ekstraheres nematodene fra GA-mediet og filtreres gjennom en kaffefilterforet trakt i et oppsamlingsbeger. Nematodene kan brukes i ulike bioassays når et passende antall er samlet inn. Teknikken beskrevet i denne protokollen genererer ca 15,000 D. dipsaci per kulturplate. Alternative protokoller for å dyrke D. dipsaci har blitt publisert16,17.

En in vitro liten molekylscreeningsanalyse basert på tidligere arbeid18 er også beskrevet her. Som proxy for ormhelse undersøkes mobiliteten til 20 nematoder per brønn etter 5 dager med liten molekyleksponering. For bedre å visualisere ormmobilitet, legges NaOH til for å øke bevegelsen av levende ormer19,20. Denne protokollen tillater middels gjennomstrømningsscreening og gir verdifulle data for å vurdere det nematiske potensialet til små molekyler. Hvis en annen nematodesamlingsteknikk brukes 16,17, kan den lille molekylscreeningsmetoden beskrevet heri likevel implementeres.

Protocol

D. dipsaci-stammen G-137 som ble brukt til det nåværende arbeidet ble samlet inn fra Fish Lake 4 Variety hvitløk i Prince Edward County og ble levert av Landbruk og Agri-mat Canada. Hvis du starter en ny kultur, kontakt Poirier et al. for inokulasjonsmetodikk15.

1. Dyrking av D. dipsaci

  1. Forbered media og plater etter tidligere rapportert arbeid15.
    1. Forbered 500 ml næringsagar (NA) medier med 23 g/l NA (se materialfortegnelse) og ultrarent vann. Bruk steril teknikk og hell 25 ml autoklavert NA-medium i 20 Petri-retter til engangsbruk (100 mm diameter x 15 mm dyp). La agar størkne ved romtemperatur (22 °C) med lokket på i ca. 2 timer og sett til side for senere bruk.
    2. Forbered 500 ml Gamborg B-5 (GA)-medier som inneholder 3,2 g/l GA basalmedium med minimale organiske stoffer, 20 g/l sukrose, 15 g/l agar og destillert vann (se Materialfortegnelse). Bruk steril teknikk og hell 50 ml autoklavert GA-medier i 10 Petri-retter til engangsbruk (100 mm diameter x 25 mm dyp). La agaren størkne ved romtemperatur (22 °C) med lokket på i ca. 5 timer og oppbevar den oppreist ved romtemperatur i en steril pose til spireoverføringen.
      MERK: Overflødige medieplater er laget i tilfelle forurensning oppstår.
  2. Utfør frøsterilisering etter en metode modifisert fra et tidligere arbeid15.
    1. Autoklav en 2 L beger med en rørestang, 2 tang, en glass petriskål og 1 L destillert vann. Forbered 200 ml 95% EtOH-løsning og 200 ml av en 15% kommersiell blekemiddelløsning.
    2. Bruk ertefrø (se Materialtabell). Hell 150 frø i et sterilt 2 L beger med en rørestang i nærheten av en Bunsen brennerflamme på en labbenk.
    3. Tilsett 200 ml 95% EtOH til frøene i begeret, rør kraftig på røreplaten i 5 min, og hell deretter av EtOH i en avfallsbeholder.
    4. Hell blekemiddeloppløsningen i begeret for å fullstendig nedsenke frøene. Rør kraftig på en røreplate i 20 minutter og hell deretter blekemiddel i en avfallsbeholder.
    5. Hell destillert vann i begeret for å nedsenke frø og rør kraftig på en røreplate i 20 min. Gjenta vannvask tre ganger, hell av destillert vann etter hver vask. Etter den endelige vannvasken, hell steriliserte frø i glass petriskålen.
    6. For å kontrollere forurensning, overfør 6 frø til hver 10 cm NA-plate (fremstilt i trinn 1.1.1) i laminær flomhette ved hjelp av steriliserte tang. Ordne frøene rundt platens omkrets (plumperfrø fungerer best). Pakk platene individuelt inn i laboratoriets innpakningsfilm og inkuber i mørket i 3 dager ved 26 °C.
      MERK: Plating flere frø enn nødvendig vil tillate selektiv bruk av ikke-forurensede frø.
  3. Utfør spireoverføring ved å følge trinnet nedenfor.
    1. I en laminær strømningshette, bruk steriliserte tang til å plate 2 ikke-forurensede frø på hver GA-plate (fremstilt i trinn 1.1.2). Pakk platene individuelt i laboratorieinnpakningsfilm og inkuber ved romtemperatur i 7-10 dager for å tillate frø å spire.
  4. Utfør in vitro oppdrett etter en metode modifisert fra et tidligere arbeid15.
    1. Forbered 50 ml 20 g/l sukroseoppløsning. Filtrer steriliser sukroseoppløsningen og sett til side.
    2. I en laminær strømningshette, kutt et stykke agar som inneholder rotvev (~ 2 cm3) fra en eksisterende kulturplate. Pipette 500 μL sukroseoppløsning på ny GA-plate med erteplanter og legg agarkube på toppen av sukrose. Pakk platene individuelt inn i laboratoriets innpakningsfilm og vedlikehold kulturen i en boks foret med aluminiumsfolie ved romtemperatur (~ 22 °C).
    3. Subkultur nematoder på friske GA-plater hver 8-9 uker for å opprettholde kulturen. Nematoder er klare til å bli ekstrahert etter ~ 8 uker.

2. Ekstraksjon og innsamling av D. dipsaci

  1. Utfør utvinning av D. dipsaci ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Autoklaver et 50 ml beger, en 80 mm trakt, 150 ml destillert vann og kaffefiltre. Plasser trakten i begeret og line trakten med sterilt kaffefilter.
    2. I en laminær strømningshette, kutt agaren og rotvevet i 1 cm3 ved hjelp av en steril skalpell. Overfør agarbitene inn i den kaffefilterforede trakten og hell sakte destillert vann på agaren for å fukte kaffefilteret.
    3. Fjern den kaffefilterforede trakten fra begeret og fyll begeret med destillert vann til vannstanden bare berører bunnen av filteret når den kaffefilterforede trakten er byttet ut.
    4. Dekk til den kaffefilterforede trakten og begeret med aluminiumsfolie. La over natten (16 h) stå på benken slik at ormer kan bevege seg gjennom kaffefilteret inn i oppsamlingsbegeret.
      MERK: En nematodekulturplate er klar til ekstraksjon når ormer har krypet inn i agaren når de undersøkes med et disseksjonsmikroskop. Vanligvis er en tallerken klar for utvinning 6-8 uker etter den første inokulasjonen.
  2. Utfør samlingen av D. dipsaci.
    MERK: Neste dag vil D. dipsaci-ormene ha lagt seg til bunnen av begeret.
    1. Fjern den kaffefilterforede trakten og aspirer de øverste 40 ml vann fra oppsamlingsbegeret; sørg for ikke å forstyrre de avgjorte ormene. Bruk en 10 ml serologisk pipette i plast, samle den gjenværende væsken i et konisk sentrifugerør på 15 ml.
      MERK: Denne samlingen kan brukes direkte i analyser. Plasser ved 4 °C hvis de ikke skal brukes innen 24 timer. Ormene kan stå i 3 dager ved 4 °C uten synlig innvirkning på mobiliteten. Fjerning av trakten kan forstyrre ormene i oppsamlingsbegeret. La dem slå seg ned til bunnen før de samler.

3. In vitro liten molekylskjerm

  1. Forbered analyseplatene ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Hell autoklaved destillert vann i et sterilt trough, og bruk en flerkanals pipette, dispenser 40 μL destillert vann fra troughen i hver brønn på en flatbunnet 96-brønnsplate.
  2. Forbered festeverktøy og legg til kjemikaliene
    1. Sett opp festebrett (se Materialbord) i nærheten av en Bunsen-brennerflamme på en labbenk. Legg til følgende i etterfølgende festebrett: 25 ml pinnerengjøringsløsning, 35 ml 50 % DMSO (i vann), 45 ml destillert vann, 55 ml 70 % EtOH og 65 ml 95 % EtOH. Plasser ett stykke blottingspapir foran hver skuff
    2. Rengjør festeverktøyet ved å vie pinnene i rengjøringsløsningen og flytte pinnene opp og ned tre ganger (3x) i oppløsningen. I denne protokollen er '3x' og '10x' definert som å flytte pinneren opp og ned i en løsning tre eller ti ganger, henholdsvis. Flekk pinnene på blottingspapiret. Gjenta denne prosedyren en gang til.
      1. Skyll deretter pinnene 3x i destillert vann, etterfulgt av oppblåsthet av pinnene. Gjenta prosedyren en gang til.
      2. Skyll til slutt pinnene 3x i 95% EtOH, etterfulgt av oppblåsthet pinnene. Gjenta en gang til. Flamme pinneren og la etanol fordampe.
    3. Tilsett kjemikalier fra de 96-brønns kjemiske lagerplatene til analyseplater ved å feste 3x i kjemikalieplaten, og overfør deretter pinnene 10X inn i analyseplaten. Flekk på papir foran rengjøringsløsningen.
    4. Rengjør festeverktøyet mellom platene ved å vaske i følgende rekkefølge, blotting mellom på blotting papir: 3x i 50% DMSO (en gang), 3x i destillert vann (en gang), 3x i 75% EtOH (en gang), 3x i 95% EtOH (to ganger). Flamme pinneren og la etanol fordampe.
    5. Gjenta trinn 3.2.2 når all festing er fullført.
      MERK: Screeningen ble utført med en endelig konsentrasjon på 60 μM.
  3. Tillegg av ormer
    1. Tell antall nematoder fra samlingen ved først å bruke resuspending og deretter pipettering 5 μL ved hjelp av lave oppbevaringstips på et lysbilde for observasjon. Tell antall nematoder i 5 μL ved hjelp av et disseksjonsmikroskop.
      1. Juster konsentrasjonen til 2 ormer/μL ved hjelp av sterilt destillert vann. Bruk en flerkanals pipette og et trough, tilsett 10 μL (~ 20 ormer) til hver brønn av 96-brønnsplatene.
        MERK: Omtrent 15.000 D. dipsaci nematoder vil bli samlet per kulturplate ved hjelp av den beskrevne kultur- og innsamlingsmetoden. Tjue ormer brukes per brønn fordi det lille tallet letter klar visualisering og regnskapsføring av mobile og immobile.
    2. Forsegle platene i laboratoriets innpakningsfilm og pakk dem inn med et fuktig papirhåndkle. Plasser i esken og fest på en klebrig pute i 20 °C risting inkubator satt til 200 rpm. Sørg for at platene stabiliseres i esken ved å legge til et ekstra fuktig papirhåndkle for å sikre minimal bevegelse av plater.

4. Datainnsamling og analyse

  1. Vær oppmerksom på plater på dag 5 under et dissekerende mikroskop. Tell antall mobile og totale D . dipsaci i DMSO-løsningsmiddelkontroller og narkotikabehandlede brønner.
    1. Hvis ormene er relativt immobile, tilsett 2 μL 1 M NaOH til en endelig konsentrasjon på 40 mM til brønnen for å stimulere bevegelsen19,20.
      MERK: Etter å ha lagt til NaOH, vil ormer bevege seg umiddelbart og må ses innen 5 minutter. Antall mobile ormer og totalt antall ormer vil bli brukt til å beregne andelen mobile ormer. Lengden på analysen kan endres avhengig av målet på skjermen.
  2. Beregn andelen mobile ormer. I D. dipsaci-skjermene er brønner som reproduserer 0% mobile ormer kategorisert som sterke treff.
    MERK: Langvarig eksponering av plater på disseksjonsmikroskopet unngås fordi lyskilden kan varme opp platene og indusere variable effekter på bioassay.

Representative Results

Uavhengige replikeringer avslører reproduserbare treff
For å illustrere den forventede variasjonen mellom replikeringsskjermene, plottes midlene og variasjonen i prøvemobilitet fra tre representative plater fra en nylig skjerm (figur 1). Tre replikeringer av skjermen ble utført på tre forskjellige dager. Alle tre platene har negative (løsemiddelkontroller) (mørkere stenger), og prøver i settet inneholdt etablerte nematiske midler. De resterende forbindelsene er fra et tilpasset bibliotek som for tiden blir karakterisert i Roy-laboratoriet. Sammenlignet med lignende skjermer gjort med C. elegans med de samme molekylene (SC, JK, PJR, upubliserte resultater), er trefffrekvensen med D. dipsaci betydelig lavere, og mange legemiddelplater viser ingen aktivitet (figur 1A). Noen plater har fullt reproduserbare treff (figur 1B,C), mens andre varierer i aktivitet (figur 1C). I forhold til andre arter som er screenet (ikke vist), viser D. dipsaci mindre variasjon i sitt svar på forbindelser. Uansett anses repliker som nødvendig i identifisering av reproduserbare treff.

Nematicides varierer i deres evne til å immobilisere Ditylenchus dipsaci
Av de syv karakteriserte nematicidene som er testet mot D. dipsaci, er det bare Fluopyram som viser robust aktivitet i analysen som er beskrevet her (figur 1C). Dette er i samsvar med tidligere arbeid som viser at D. dipsaci er tolerant overfor nematicider13,14. Fluopyram hemmer kompleks II av elektrontransportkjeden på en nematode-selektiv måte og er et kommersielt nematicid som brukes til å kontrollere en rekke PPNer, inkludert Rotylenchulus reniformis og Meloidogyne incognita 4,21,22. Fluopyram og et av nematicidene som manglet aktivitet ved konsentrasjonstestet (Oxamyl)23 ble undersøkt nærmere gjennom en doseresponsanalyse med D. dipsaci. Fluopyram induserer en tilsynelatende doseavhengig effekt på D. dipsaci-mobilitet med en EC50 på 9,3 μM (med et konfidensintervall på 95 % mellom 8,2 og 10,5 μM) (figur 2A, B). Dette resultatet forventes basert på publiserte in vitro-resultater fra Storelli et al., 202013. Oxamyl har ingen signifikant effekt på mobilitet opp til en konsentrasjon på 120 μM (p = 0,3632, uparret t-test) (figur 2C,D).

Natriumhydroksid forbedrer analysefølsomheten
I motsetning til den nesten kontinuerlige svømmeaktiviteten til C. elegans i flytende kultur18, er D. dipsaci dyr dramatisk mindre mobile. Dette er ikke uvanlig blant parasittiske nematoder i kultur16. For å bidra til å skille "hvilende" ormer fra syke ormer, brukes 40 mM NaOH ved analyseendepunktet for å stimulere bevegelse hos de individer som er i stand (figur 3)19,20. Denne teknikken gjør det mulig å identifisere små molekyler som immobiliserer ormer, gitt at alle ormer i negative kontrollbrønner beveger seg og gir en usedvanlig lav bakgrunn av falske positiver på skjermen.

Figure 1
Figur 1: Eksempler på skjermutgang. Tre biologiske replikeringer (åpne sirkler) med D. dipsaci ble utført mot de små molekylene (60 μM) i hver av de tre platene som vises. Alle tre platene har 0,6% av DMSO løsemiddelkontroller (mørkere stenger). Bortsett fra der annet er notert med løsningsmiddelkontroller eller kjente nematicider, inneholder brønnene på de tre platene relativt ukarakteriserte narkotikalignende forbindelser kjøpt fra leverandører (se Burns et al., 2015)18. (A) En 96 brønnplate fra det lille molekylbiblioteket mangler noe molekyl med observerbar bioaktivitet mot D. dipsaci. (B) En 96 brønnplate fra det lille molekylbiblioteket har et enkelt molekyl som reproduserer D. dipsaci mobilitet. (C) En 96 brønns legemiddelplate som inneholder de karakteriserte nematicidene fluopyram (fluo), iprodione (ipro), abamectin (abam), fluensulfon (røyk), tioksazafen (tiox), oksamyl (oksam) og wact-11. Feilfeltene representerer standardfeilen for gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Eksempel på positive og negative resultater ved bruk av mobilitetsanalyse. (A) Eksempler på terminalfenotyper etter eksponering av D. dipsaci til økende konsentrasjoner av fluopyram etter 5 dager før tilsetning av NaOH. (B) En doseresponsanalyse av bevegelsen av D. dipsaci etter 5 dagers eksponering for de angitte konsentrasjonene av fluopyram. (C,D) Det samme som A,B, bortsett fra oksamyl. Hver graf viser prøveversjoner gjort på to separate dager med tre replikeringer hver dag. Y-aksen til hver graf indikerer fraksjonsmobilen til ormene i hver godt beregnet som antall dyr som beveger seg i forhold til det totale antall dyr i brønnen. Feilfeltene i begge grafene representerer standardfeilen for gjennomsnittet. Skalalinjen representerer 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Mobilitet av D. dipsaci etter å ha tilsagt 40 mM NaOH. Effekten av NaOH-tillegg til D. dipsaci-prøver i nærvær av kun løsningsmiddelkontroll (A), tioxazafen (B) eller fluopyram (C) etter 5 dager med samtidig inkubasjon. Skalalinjen representerer 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Kritiske trinn
Til tross for protokollens enkelhet er det kritiske trinn i protokollen som fortjener ekstra oppmerksomhet for å maksimere sannsynligheten for suksess. For det første kan overbleaching frøene forstyrre veksten. Derfor er det viktig å begrense frøenes tid i blekeløsningen til 20 minutter eller mindre. For det andre, som tidligere nevnt av Storelli et al., reduseres den tilsynelatende helsen til nematodene over tid når de lagres ved 4 °C16. Bruk av nematodene kort tid etter samlingen gir ekstra tillit til at optimale screeningforhold kan oppnås. Hvis det er nødvendig med langvarig lagring, må du sørge for at rørets lokk ikke er stramt for å tillate oksygenutveksling. For det tredje, å sikre at ertene vokser på NA-platene for den foreslåtte tiden, gjør det mulig for eksperimenteren å bedømme hvilke frø som er forurenset. For det fjerde vil overgrowing erter på GA-platene før du legger til nematodene svekke infeksjonen og redusere nematodeutbyttet. Til slutt kan mange faktorer som er vanskelige å kontrollere påvirke screeningresultatene. Derfor er det viktig å utføre flere uavhengige replikeringsskjermer på forskjellige dager og ideelt sett med PPNer samlet fra forskjellige kulturplater for å sikre reproduserbarhet av resultater.

Begrensninger ved metode
En begrensning i protokollen er at den ikke klarer å synkronisere utviklingsstadiet av de innsamlede ormene, som spenner fra ungdommer til voksne. Derfor er sterke treff avslørt av hvilken som helst skjerm sannsynligvis effektive på flere stadier. Protokollen øker imidlertid risikoen for å overse effektive scenespesifikke treff. Et annet hensyn er at in vitro screening bør betraktes som det første trinnet i en nematicide-discovery rørledning; jordbaserte analyser er et utmerket tillegg til en rørledning for å teste overførbarheten av treffene.

Betydning og anvendelse av protokollen
Protokollene som er beskrevet her, er enkle og enkle replikert. Videre har denne protokollen blitt brukt på andre PPNer i laboratoriet, inkludert Pratylenchus penetrans, ved å gjøre bare små modifikasjoner. Utvikling av nye og sikre PPN-kontrolltiltak er avgjørende for å sikre global matsikkerhet. Dette gjelder spesielt for arter som D. dipsaci som generelt er tolerante overfor et bredt utvalg av for tiden akseptable kjemiske nematicider13,14. Derfor har protokollene som er skissert her potensial til å gi et viktig bidrag til menneskers helse i global skala.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner Dr. Qing Yu (Landbruk og Agri-Food Canada) for å gi Ditylenchus dipsaci-kulturen og for råd om kulturmetoder; Dr. Benjamin Mimee (Landbruk og Agri-Food Canada) og Nathalie Dauphinais (Landbruk og Agri-Food Canada) for råd om in vitro kultur av plante-parasittiske nematoder; Dr. Andrew Burns og Sean Harrington for nyttige forslag til prosjektet og manuskriptet. JK er en NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholar. PJR støttes av et CIHR-prosjektstipend (313296). PJR er en canada forskningsleder (Tier 1) i kjemisk genetikk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL tube Sarstedt 62.554.205
2 forceps Almedic 7747-A10-108
2L beaker Pyrex CLS10002L
50mL beaker Pyrex CLS100050
96 well plate Sarstedt 83.3924
aluminium foil Alcan Plus
bacteriological agar BioShop AGR001.5
coffee filter No name brand 716
commercial bleach 6% Lavo Pro 6 DIN102358107
disposable petri dishes (10cm x 1.5cm) Fisherbrand FB0875712
disposable petri dishes (10cm x 2.5cm) Sigma-Aldrich Z358762
dissecting scope Leica Leica MZ75
DMSO Sigma-Aldrich 472301-500ML
Funnel VWR 414004-270
Gamborg B5 Sigma-Aldrich G5893-10L
glass petri dish VWR 75845-546
glass slide MAGNA 60-1200
Lint-Free Blotting Paper V&P Scientific VP 522-100
Low retention pipette tips (200uL) LABFORCE 1159M44
mutlichannel pipette Eppendorf research plus 3125000036
NaOH Sigma-Aldrich S8045-500G
nutrient agar Sigma-Aldrich 70148-100G
parafilm Bemis PM-996
pea seeds Ontario Seed Company D-1995-250G
pin cleaning solutions V&P Scientific VP110A
pinner V&P Scientific VP381N
pinner rinse trays V&P Scientific VP 421
reagent reservoir with lid for multichannel pipettes Sigma-Aldrich BR703459
shaking incubator New Brunswick Scientific I26
sterile surgical blade MAGNA sb21-100-a
stir bar Fisherbrand 2109 - 1451359
sucrose BioShop SUC507.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sasser, J. N., Freckman, D. W. A. world perspective on nematology: the role of the society. Vistas on nematology. , Hyattsville: Society of Nematologists Inc. 7-14 (1987).
  2. Abad, P., et al. Genome sequence of the metazoan plant parasitic nematode Meloidogyne incognita. Nature Biotechnology. 26 (8), 909-915 (2008).
  3. Auwal, M., Hassan, T. H. P., Hongli, S., Jingwu, Z. Nematodes threats to global food security. Acta Agriculturae Scandinavica, Section B - Soil & Plant Science. 63 (5), 420-425 (2013).
  4. Chen, Z. X., Chen, S. Y., Dickson, D. W. Nematicides: Past and present uses. Nematology Vol 2, Nematode Management and Utilization. , CABI Publishing. 1179-1200 (2004).
  5. Desaeger, J., Wram, C., Zasada, I. New reduced-risk agricultural nematicides - and review. Journal of nematology. 52, (2020).
  6. Donely, N. The USA lags behind other agricultural nations in banning harmful pesticides. Environmental Health. 18 (1), 44 (2019).
  7. Polansek, T. Monsanto halts launch of chemical after users complain of rashes. Reuters. , (2017).
  8. Sturhan, D., Brzeski, M. W. Stem and bulb nematodes, Ditylenchus spp. Manual of agricultural nematology. , 423-464 (1991).
  9. The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). Data Sheets on Quarantine Pests; Ditylenchus dipsaci. Prepared by CABI and EPPO for the EU under Contract 90/399003. The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). , (2021).
  10. Quebec (Canada), Agriculture, Pêcherie et Alimentation Quebec. Réseau d'avertissements phytosanitaires (RAP). Avertissement Carotte, Céleri, Laitue, Oignon, Poireau [Warning carrot celery, lettuce, onion, leek]. Quebec (Canada), Agriculture, Pêcherie et Alimentation Quebec. , (2011).
  11. Abawi, G. S., Moktan, K. Bloat nematode problem on garlic: symptoms, distribution, and management guidelines. Department of Plant Pathology and Plant-microbe Biology, Geneva. , Cornell University. (2010).
  12. Taylor, R. Chapter 7. Nematodes and other worms. , Academic Press. 143-234 (2019).
  13. Storelli, A., Keiser, A., Eder, R., Jenni, S., Kiewnick, S. Evaluation of fluopyram for the control of Ditylenchus dipsaci in sugar beet. Journal of nematology. 52, 1-10 (2020).
  14. Oka, Y. Nematicidal activity of fluensulfone against some migratory nematodes under laboratory conditions. Pest Management Science. 70, 1850 (2014).
  15. Poirier, S., Dauphinais, N., Van Der Heyden, H., Véronneau, P. Y., Bélair, G., Gravel, V., Mimee, B. Host Range and Genetic Characterization of Ditylenchus dipsaci Populations from Eastern Canada. Plant disease. 103, 456-460 (2019).
  16. Storelli, A., Kiewnick, S., Daub, M., et al. Virulence and pathogenicity of four Ditylenchus dipsaci populations on sugar beet. Eur J Plant Pathol. 161, 63-71 (2021).
  17. Kühnhold, V., Kiewnick, S., Sikora, R. A. Development of an in vivo bioassay to identify sugar beet resistance to the stem nematode Ditylenchus dipsaci. Nematology. 8 (5), 641-645 (2006).
  18. Burns, A., Luciani, G., Musso, G. Caenorhabditis elegans is a useful model for anthelmintic discovery. Nat Communications. 6, (2015).
  19. Chen, S. Y., Dickson, D. W. A Technique for Determining Live Second-stage Juveniles of Heterodera glycines. Journal of nematology. 32, 117-121 (2000).
  20. Xiang, N., Lawrence, K. S. Optimization of In Vitro Techniques for Distinguishing between Live and Dead Second Stage Juveniles of Heterodera glycinesand Meloidogyne incognita. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
  21. US EPA. Fluopyram. US EPA. , OFFICE OF CHEMICAL SAFETY AND POLLUTION PREVENTION (2016).
  22. US EPA. Fluopyram. US EPA. , OFFICE OF CHEMICAL SAFETY AND POLLUTION PREVENTION (2020).
  23. US EPA. Oxamyl Facts. Prevention, Pesticides and Toxic Substances. US EPA. , (2000).

Tags

Biologi utgave 179
Culturing og screening planten parasittisk Nematode <em>Ditylenchus dipsaci</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cammalleri, S. R., Knox, J., Roy, P. … More

Cammalleri, S. R., Knox, J., Roy, P. J. Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci. J. Vis. Exp. (179), e63438, doi:10.3791/63438 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter