Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Het kweken en screenen van de plant Parasitaire Nematode Ditylenchus dipsaci

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63438
Automatic Translation
1,2,3, 1,3, 1,3,4
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3The Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 4Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto

Summary

Het huidige protocol beschrijft een betrouwbare en eenvoudige methode voor het kweken, verzamelen en screenen van Ditylenchus dipsaci.

Abstract

Plantparasitaire nematoden (PPN's) vernietigen elk jaar meer dan 12% van de wereldwijde voedselgewassen, wat neerkomt op ongeveer 157 miljard dollar (USD) die jaarlijks verloren gaat. Met een groeiende wereldbevolking en beperkt bouwland is het beheersen van PPN-besmetting van cruciaal belang voor de voedselproductie. Wat de uitdaging van het maximaliseren van gewasopbrengsten nog groter maakt, zijn de toenemende beperkingen op effectieve pesticiden vanwege een gebrek aan selectiviteit van nematoden. Daarom is het ontwikkelen van nieuwe en veilige chemische nematiciden van vitaal belang voor de voedselzekerheid. In dit protocol worden de kweek en verzameling van de PPN-soort Ditylenchus dipsaci gedemonstreerd. D. dipsaci is zowel economisch schadelijk als relatief resistent tegen de meeste moderne nematiciden. Het huidige werk legt ook uit hoe deze nematoden kunnen worden gebruikt in schermen voor nieuwe nematiciden met kleine moleculen en rapporteert over gegevensverzameling en analysemethoden. De gedemonstreerde pijpleiding biedt een doorvoer van duizenden verbindingen per week en kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met andere PPN-soorten zoals Pratylenchus penetrans. De hierin beschreven technieken kunnen worden gebruikt om nieuwe nematiciden te ontdekken, die op hun beurt verder kunnen worden ontwikkeld tot zeer selectieve commerciële producten die PPN's veilig bestrijden om een steeds hongeriger wordende wereld te helpen voeden.

Introduction

Plantparasitaire nematoden (PPN's) zijn naar schatting verantwoordelijk voor het verlies van 12,3% van de wereldwijde voedselproductie en veroorzaken naar schatting 157 miljard dollar aan schade per jaar 1,2,3. Helaas neemt het vermogen om PPN's te beheersen af omdat effectieve chemische nematiciden zijn verboden of worden geconfronteerd met escalerende beperkingen vanwege menselijke veiligheid en milieuproblemen. Dit is voornamelijk te wijten aan de slechte selectiviteit van nematoden van eerdere generaties pesticiden4. In de afgelopen 25 jaar zijn zes nieuwe chemische nematiciden getest of op de markt gebracht5. Een van deze is al verboden in Europa, en een andere is stopgezet terwijl wordt onderzocht op de impact ervan op de menselijke hitte 6,7. Daarom is er een dringende behoefte aan nieuwe nematiciden die zeer selectief zijn voor PPN's.

De stengel- en bolnematode, Ditylenchus dipsaci (D. dipsaci) is een economisch impactvolle PPN4. D. dipsaci infecteert bijna 500 plantensoorten in 30 biologische rassen en richt zich op enkele van de meest agrarisch belangrijke gewassen zoals rogge, haver, knoflook, ui en prei 8,9. D. dipsaci heeft bijvoorbeeld onlangs knoflookvelden in Ontario en Quebec gegeseld, wat resulteerde in verliezen tot 90% 10,11. De geografische spreiding is bijna alomtegenwoordig en omvat Amerika (inclusief Californië en Florida), Europa, een groot deel van Azië (inclusief China) en Oceanië9. D. dipsaci is een migrerende endoparasiet die de huidmondjes binnendringt op bladeren of wonden en lenticels waar ze enzymen afgeven om de celwand af te breken12. Door de impact van D. dipsaci op gewassen te vergroten, maakt de schade veroorzaakt door de PPN de plant vatbaar voor secundaire infectie11. Helaas vertoont D. dipsaci hoge tolerantieniveaus voor huidige nematiciden in vergelijking met andere nematodenstammen13,14.

Dit protocol beschrijft de kweek van D. dipsaci en het gebruik ervan in grootschalige schermen voor kandidaat-nematiciden met kleine moleculen. Kortom, D. dipsaci populaties worden onderhouden en uitgebreid op erwtenplanten gekweekt in steriele Gamborg B-5 (GA) media15. Voordat zaadspruiten op GA-medium worden gekweekt, moeten de zaden worden gesteriliseerd door een reeks wasbeurten en op voedingsagar (NA) worden geplateerd om te controleren op verontreiniging. Zaadsterilisatie is essentieel om bacteriële en schimmelverontreinigingen te detecteren die aanwezig kunnen zijn. De niet-besmette zaden worden vervolgens overgebracht naar GA-platen, waar zaadspruiten zullen groeien ter voorbereiding op infectie. De GA-platen met zaadspruiten worden geïnfecteerd met nematoden van een eerdere kweekplaat door een stuk agar met wortelweefsel over te brengen naar de verse platen. Na 6-8 weken worden de nematoden uit de GA-media geëxtraheerd en door een met koffiefilters beklede trechter in een verzamelbeker gefilterd. De aaltjes kunnen in verschillende bioassays worden gebruikt zodra een geschikt aantal is verzameld. De in dit protocol beschreven techniek genereert ongeveer 15.000 D. dipsaci per kweekplaat. Alternatieve protocollen om D. dipsaci te kweken zijn gepubliceerd16,17.

Een in vitro screeningstest met kleine moleculen op basis vaneerder werk 18 wordt hier ook beschreven. Als proxy voor de gezondheid van wormen wordt de mobiliteit van 20 nematoden per put onderzocht na 5 dagen blootstelling aan kleine moleculen. Om de mobiliteit van wormen beter te visualiseren, wordt NaOH toegevoegd om de beweging van levende wormen19,20 te verhogen. Dit protocol maakt screening met gemiddelde doorvoer mogelijk en biedt waardevolle gegevens om het nematicidale potentieel van kleine moleculen te beoordelen. Als een andere nematodenverzamelingstechniek wordt gebruikt 16,17, kan de hierin beschreven screeningsmethode voor kleine moleculen toch worden geïmplementeerd.

Protocol

De D. dipsaci-stam G-137 die voor het huidige werk werd gebruikt, werd verzameld uit Fish Lake 4 Variety knoflook in Prince Edward County en werd geleverd door Agriculture and Agri-food Canada. Als u een nieuwe kweek start, raadpleeg dan Poirier et al. voor inentingsmethodologie15.

1. Kweken van D. dipsaci

  1. Bereid de media en platen voor na eerder gemeld werk15.
    1. Bereid 500 ml voedingsagar (NA) media met 23 g/l NA (zie tabel met materialen) en ultrapuur water. Giet met behulp van steriele techniek 25 ml geautoclaveerde NA-media in 20 wegwerp petrischalen (100 mm diameter x 15 mm diep). Laat agar stollen bij kamertemperatuur (22 °C) met het deksel erop gedurende ~2 uur en zet apart voor later gebruik.
    2. Bereid 500 ml Gamborg B-5 (GA) media met 3,2 g/l GA basaal medium met minimale organische stoffen, 20 g/l sucrose, 15 g/l agar en gedestilleerd water (zie Tabel met materialen). Giet met behulp van steriele techniek 50 ml geautoclaveerde GA-media in 10 wegwerp petrischalen (100 mm diameter x 25 mm diep). Laat agar stollen bij kamertemperatuur (22 °C) met het deksel erop gedurende ~5 uur en bewaar rechtop bij kamertemperatuur in een steriele zak totdat de kiem overgaat.
      OPMERKING: Overtollige mediaplaten worden gemaakt voor het geval er verontreiniging optreedt.
  2. Voer zaadsterilisatie uit volgens een methode die is gewijzigd op basis van eeneerder werk 15.
    1. Autoclaaf een bekerglas van 2 L met een roerstaaf, 2 tangen, een glazen petrischaal en 1 L gedestilleerd water. Bereid 200 ml 95% EtOH-oplossing en 200 ml van een 15% commerciële bleekoplossing.
    2. Gebruik erwtenzaden (zie Tabel met materialen). Giet 150 zaden in een steriel bekerglas van 2 L met een roerstaaf bij een Bunsen-brandervlam op een laboratoriumbank.
    3. Voeg 200 ml 95% EtOH toe aan de zaden in het bekerglas, roer krachtig op de roerplaat gedurende 5 minuten en giet EtOH vervolgens af in een afvalcontainer.
    4. Giet bleekoplossing in het bekerglas om de zaden volledig onder te dompelen. Roer krachtig op een roerplaat gedurende 20 minuten en giet het bleekmiddel af in een afvalcontainer.
    5. Giet gedestilleerd water in het bekerglas om zaden onder te dompelen en roer krachtig op een roerplaat gedurende 20 minuten. Herhaal de waterwassingen drie keer en giet gedestilleerd water na elke wasbeurt af. Giet na de laatste waterwas gesteriliseerde zaden in de glazen petrischaal.
    6. Om te controleren op verontreiniging, brengt u 6 zaden over op elke NA-plaat van 10 cm (bereid in stap 1.1.1) in de laminaire afzuigkap met behulp van een gesteriliseerde tang. Schik de zaden rond de omtrek van de plaat (vollere zaden werken het beste). Wikkel de platen afzonderlijk in laboratoriumfolie en incubeer gedurende 3 dagen in het donker bij 26 °C.
      OPMERKING: Door meer zaden te platen dan nodig is, kunnen niet-verontreinigde zaden selectief worden gebruikt.
  3. Voer kiemoverdracht uit volgens de onderstaande stap.
    1. Gebruik in een laminaire stromingskap gesteriliseerde tang om 2 niet-verontreinigde zaden op elke GA-plaat te plaatsen (bereid in stap 1.1.2). Wikkel de platen afzonderlijk in laboratoriumwikkelfolie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 7-10 dagen om zaden te laten ontkiemen.
  4. Voer in vitro kweek uit volgens een methode die is gewijzigd ten opzichte van een eerder werk15.
    1. Bereid 50 ml sacharoseoplossing van 20 g/l. Filter steriliseer sucrose-oplossing en zet apart.
    2. Snijd in een laminaire stromingskap een stuk agar met wortelweefsel (~2 cm3) uit een bestaande kweekplaat. Pipetteer 500 μL sucrose-oplossing op een nieuwe GA-plaat met erwtenzaailingen en plaats een agarblokje bovenop sucrose. Wikkel de platen afzonderlijk in laboratoriumwikkelfolie en bewaar de cultuur in een doos bekleed met aluminiumfolie bij kamertemperatuur (~ 22 °C).
    3. Subcultuurnematoden op verse GA-platen om de 8-9 weken om de cultuur te behouden. Nematoden zijn na ~8 weken klaar om geëxtraheerd te worden.

2. Extractie en verzameling van D. dipsaci

  1. Voer de extractie van D. dipsaci uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Autoclaaf een bekerglas van 50 ml, een trechter van 80 mm, gedestilleerd water van 150 ml en koffiefilters. Plaats de trechter in het bekerglas en bekleed de trechter met steriel koffiefilter.
    2. Snijd in een laminaire flowkap de agar en het wortelweefsel in 1 cm3 met behulp van een steriel scalpel. Breng de agarblokjes over in de met koffiefilters beklede trechter en giet langzaam gedestilleerd water op de agar om het koffiefilter te bevochtigen.
    3. Verwijder de met koffiefilters beklede trechter uit het bekerglas en vul het bekerglas met gedestilleerd water totdat het waterniveau net de bodem van het filter raakt zodra de met koffiefilter beklede trechter is vervangen.
    4. Bedek de met koffiefilters beklede trechter en bekerglas met aluminiumfolie. Laat een nacht (16 uur) op het tafelblad staan zodat wormen door het koffiefilter in het verzamelbekertje kunnen bewegen.
      OPMERKING: Een nematodencultuurplaat is klaar voor extractie wanneer wormen in de agar zijn gekropen wanneer ze met een dissectiemicroscoop worden onderzocht. Meestal is een plaat 6-8 weken na de eerste inenting klaar voor extractie.
  2. Voer de verzameling van D. dipsaci uit.
    OPMERKING: De volgende dag zullen de D. dipsaci-wormen zich op de bodem van het bekerglas hebben gevestigd.
    1. Verwijder de met koffiefilters beklede trechter en zuig de bovenste 40 ml water uit het verzamelbeker op; zorg ervoor dat de gevestigde wormen niet worden verstoord. Gebruik een plastic serologische pipet van 10 ml en verzamel de resterende vloeistof in een conische centrifugebuis van 15 ml.
      OPMERKING: Deze verzameling kan direct in assays worden gebruikt. Plaats bij 4 °C als ze niet binnen 24 uur worden gebruikt. De wormen kunnen 3 dagen bij 4 °C worden gelaten zonder zichtbare impact op de mobiliteit. Het verwijderen van de trechter kan de wormen in het verzamelbeker verstoren. Laat ze naar de bodem zakken voordat je ze verzamelt.

3. In vitro screen met kleine moleculen

  1. Bereid de testplaten voor volgens de onderstaande stappen.
    1. Giet gedestilleerd water met autoclaven in een steriele trog en doseer met behulp van een meerkanaalspipet 40 μL gedestilleerd water uit de trog in elke put van een vlakke bodemplaat met 96 putten.
  2. Bereid pinnen voor en voeg de chemicaliën toe
    1. Zet pinner trays (zie Tabel met materialen) in de buurt van een Bunsen brander vlam op een lab bank. Voeg het volgende toe aan opeenvolgende pinner trays: 25 ml pinreinigingsoplossing, 35 ml 50% DMSO (in water), 45 ml gedestilleerd water, 55 ml 70% EtOH en 65 ml 95% EtOH. Plaats een stuk vloeipapier voor elke lade
    2. Reinig het pingereedschap door de pinnen in de reinigingsoplossing te emersen en de pinnen drie keer (3x) in de oplossing op en neer te bewegen. In dit protocol worden '3x' en '10x' gedefinieerd als het op en neer bewegen van de pinner in een oplossing, respectievelijk drie of tien keer. Dep de spelden op het vloeipapier. Herhaal deze procedure nogmaals.
      1. Spoel vervolgens de pinnen 3x af in gedestilleerd water, gevolgd door het deppen van de pinnen. Herhaal de procedure nogmaals.
      2. Spoel ten slotte de pinnen 3x in 95% EtOH, gevolgd door het deppen van de pinnen. Herhaal dit nog een keer. Druk de pinner in en laat de ethanol verdampen.
    3. Voeg chemicaliën van de 96-well chemische stamplaten toe aan testplaten door 3x in de chemische plaat te pinnen en vervolgens de pinnen 10X in de testplaat over te brengen. Dep op papier voor de reinigingsoplossing.
    4. Reinig het pingereedschap tussen de platen door het in de volgende volgorde te wassen, tussendoor te deppen op vloeipapier: 3x in 50% DMSO (eenmalig), 3x in gedestilleerd water (eenmaal), 3x in 75% EtOH (eenmaal), 3x in 95% EtOH (tweemaal). Druk de pinner in en laat ethanol verdampen.
    5. Herhaal stap 3.2.2 wanneer alle vastzetten is voltooid.
      OPMERKING: De screening werd uitgevoerd bij een eindconcentratie van 60 μM.
  3. Toevoeging van wormen
    1. Tel het aantal nematoden uit de collectie door eerst 5 μL te resuspenderen en vervolgens met behulp van lage retentietips op een dia te pipetteren voor observatie. Tel het aantal nematoden in 5 μL met behulp van een dissectiemicroscoop.
      1. Stel de concentratie in op 2 wormen/μL met steriel gedestilleerd water. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet en een trog 10 μL (~ 20 wormen) toe aan elke put van de 96-putplaten.
        OPMERKING: Ongeveer 15.000 D. dipsaci-nematoden worden per kweekplaat verzameld met behulp van de beschreven kweek- en verzamelmethode. Twintig wormen worden per put gebruikt omdat het kleine aantal de duidelijke visualisatie en boekhouding van mobiele en immobiele wormen vergemakkelijkt.
    2. Sluit de platen af in laboratoriumwikkelfolie en wikkel ze in met een vochtig keukenpapier. Plaats in de doos en bevestig op een kleverige pad in 20 °C schudincubator ingesteld op 200 rpm. Zorg ervoor dat platen in de doos worden gestabiliseerd door een extra vochtige papieren handdoek toe te voegen om minimale beweging van platen te garanderen.

4. Gegevensverzameling en -analyse

  1. Bekijk platen op dag 5 onder een ontleedmicroscoop. Tel het aantal mobiele en totale D . dipsaci in DMSO-oplosmiddelcontroles en met geneesmiddelen behandelde putjes.
    1. Als de wormen relatief onbeweeglijk zijn, voeg dan 2 μL van 1 M NaOH toe aan een eindconcentratie van 40 mM aan de put om beweging 19,20 te stimuleren.
      OPMERKING: Na het toevoegen van NaOH zullen wormen onmiddellijk bewegen en binnen 5 minuten worden bekeken. Het aantal mobiele wormen en het totale aantal wormen worden gebruikt om het aandeel mobiele wormen te berekenen. De lengte van de test kan veranderen afhankelijk van het doel van het scherm.
  2. Bereken het aandeel mobiele wormen. In de D. dipsaci-schermen worden putten die reproduceerbaar 0% mobiele wormen opleverden, gecategoriseerd als sterke hits.
    OPMERKING: Langdurige blootstelling van platen op het stadium van dissectiemicroscopen wordt vermeden omdat de lichtbron de platen kan verwarmen en variabele effecten op de bioassay kan veroorzaken.

Representative Results

Onafhankelijke replica's onthullen reproduceerbare hits
Om de verwachte variatie tussen de replicaatschermen te illustreren, zijn de middelen en variatie in monstermobiliteit uitgezet uit drie representatieve platen van een recent scherm (figuur 1). Drie replicaties van het scherm werden uitgevoerd op drie verschillende dagen. Alle drie de platen hebben negatieve (solvent-only) controles (donkere balken) en monsters binnen de set bevatten gevestigde nematiciden. De resterende verbindingen komen uit een aangepaste bibliotheek die momenteel wordt gekarakteriseerd in het Roy-lab. Vergeleken met vergelijkbare schermen met C. elegans met dezelfde moleculen (SC, JK, PJR, ongepubliceerde resultaten), is de hit rate met D. dipsaci significant lager en vertonen veel medicijnplaten geen activiteit (figuur 1A). Sommige platen hebben volledig reproduceerbare treffers (figuur 1B,C), terwijl andere variëren in activiteit (figuur 1C). Ten opzichte van andere gescreende soorten (niet getoond), vertoont D. dipsaci minder variabiliteit in zijn reactie op verbindingen. Hoe dan ook, replicaties worden noodzakelijk geacht bij de identificatie van reproduceerbare treffers.

Nematiciden variëren in hun vermogen om Ditylenchus dipsaci te immobiliseren
Van de zeven gekarakteriseerde nematiciden die tegen D. dipsaci zijn getest, vertoont alleen Fluopyram een robuuste activiteit in de hierin beschreven test (figuur 1C). Dit komt overeen met eerder werk waaruit blijkt dat D. dipsaci tolerant is voor nematiciden13,14. Fluopyram remt complex II van de elektronentransportketen op een nematode-selectieve manier en is een commercieel nematicide dat wordt gebruikt om een verscheidenheid aan PPN's te beheersen, waaronder Rotylenchulus reniformis en Meloidogyne incognita 4,21,22. Fluopyram en een van de nematiciden die geen activiteit hadden bij de geteste concentratie (Oxamyl)23 werden in meer detail onderzocht door middel van een dosis-responsanalyse met D. dipsaci. Fluopyram induceert een schijnbaar dosisafhankelijk effect op de mobiliteit van D. dipsaci met een EC50 van 9,3 μM (met een betrouwbaarheidsinterval van 95% tussen 8,2 en 10,5 μM) (figuur 2A,B). Dit resultaat wordt verwacht op basis van gepubliceerde in vitro resultaten van Storelli et al., 202013. Oxamyl heeft geen significant effect op de mobiliteit tot een concentratie van 120 μM (p = 0,3632, ongepaarde t-test) (figuur 2C,D).

Natriumhydroxide verbetert de testgevoeligheid
In tegenstelling tot de bijna continue zwemactiviteit van C. elegans in vloeibare cultuur18, zijn D. dipsaci-dieren dramatisch minder mobiel. Dit is niet ongewoon bij parasitaire nematoden in cultuur16. Om 'rustende' wormen van zieke wormen te onderscheiden, wordt 40 mM NaOH gebruikt op het eindpunt van de test om beweging te stimuleren bij die personen die capabel zijn (figuur 3)19,20. Deze techniek maakt de duidelijke identificatie mogelijk van kleine moleculen die wormen immobiliseren, aangezien alle wormen in negatieve controleputten bewegen en een uitzonderlijk lage achtergrond van valse positieven in het scherm opleveren.

Figure 1
Figuur 1: Voorbeelden van schermuitvoer. Drie biologische replicaties (open cirkels) met D. dipsaci werden uitgevoerd tegen de kleine moleculen (60 μM) in elk van de drie getoonde platen. Alle drie de platen hebben 0,6% DMSO solvent-only controles (donkere balken). Tenzij anders vermeld met oplosmiddelcontroles of bekende nematiciden, bevatten de putten van de drie platen relatief niet-gekarakteriseerde geneesmiddelachtige verbindingen die zijn gekocht van leveranciers (zie Burns et al., 2015)18. (A) Een 96-putplaat uit de bibliotheek met kleine moleculen mist elk molecuul met waarneembare bioactiviteit tegen D. dipsaci. (B) Een 96-putplaat uit de bibliotheek met kleine moleculen heeft een enkel molecuul dat de mobiliteit van D. dipsaci reproduceerbaar verstoort. (C) Een 96 well drug plaat met de gekarakteriseerde nematiciden fluopyram (fluo), iprodion (ipro), abamectine (abam), fluensulfon (flue), tioxazafen (tiox), oxamyl (oxam) en wact-11. De foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Voorbeeld van positieve en negatieve resultaten met behulp van mobiliteitstest. (A) Voorbeelden van de terminale fenotypen na blootstelling van D. dipsaci aan toenemende concentraties fluopyram na 5 dagen vóór toevoeging van NaOH. (B) Een dosis-responsanalyse van de beweging van D. dipsaci na 5 dagen blootstelling aan de aangegeven concentraties fluopyram. (C,D) Hetzelfde als A,B, behalve oxamyl. Elke grafiek toont proeven die op twee afzonderlijke dagen zijn uitgevoerd met drie replicaties per dag. De y-as van elke grafiek geeft de fractie mobiel van de wormen in elke put berekend als het aantal bewegende dieren ten opzichte van het totale aantal dieren in de put. De foutbalken op beide grafieken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. De schaalbalk vertegenwoordigt 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Mobiliteit van D. dipsaci na toevoeging van 40 mM NaOH. Het effect van NaOH-toevoeging aan D. dipsaci-monsters in de aanwezigheid van solvent-only controle (A), tioxazafen (B) of fluopyram (C) na 5 dagen co-incubatie. De schaalbalk vertegenwoordigt 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Kritieke stappen
Ondanks de eenvoud van het protocol zijn er cruciale stappen in het protocol die extra aandacht verdienen om de kans op succes te maximaliseren. Ten eerste kan het overbleken van de zaden hun groei verstoren. Daarom is het essentieel om de tijd van de zaden in de bleekoplossing te beperken tot 20 minuten of minder. Ten tweede, zoals eerder opgemerkt door Storelli et al., neemt de schijnbare gezondheid van de nematoden in de loop van de tijd af wanneer ze worden bewaard bij 4 °C16. Het gebruik van de aaltjes kort na hun verzameling geeft extra vertrouwen dat optimale screeningcondities kunnen worden bereikt. Mocht opslag op langere termijn nodig zijn, zorg er dan voor dat het deksel van de buis niet strak is om zuurstofuitwisseling mogelijk te maken. Ten derde, door ervoor te zorgen dat de erwten gedurende de voorgestelde tijd op de NA-platen groeien, kan de experimentator beoordelen welke zaden besmet zijn. Ten vierde zal het overwoekeren van de erwten op de GA-platen voordat de nematoden worden toegevoegd, de infectie verzwakken en de opbrengst van de nematoden verminderen. Ten slotte kunnen veel factoren die moeilijk te beheersen zijn, van invloed zijn op de screeningsresultaten. Daarom is het essentieel om meerdere onafhankelijke replicatieschermen uit te voeren op verschillende dagen en idealiter met PPN's verzameld van verschillende kweekplaten om de reproduceerbaarheid van de resultaten te garanderen.

Beperkingen van de methode
Een beperking van het protocol is dat het er niet in slaagt om het ontwikkelingsstadium van de verzamelde wormen, die variëren van juvenielen tot volwassenen, te synchroniseren. Vandaar dat sterke hits die door elk scherm worden onthuld, waarschijnlijk in meerdere stadia effectief zijn. Het protocol verhoogt echter het risico op het over het hoofd zien van effectieve podiumspecifieke treffers. Een tweede overweging is dat in vitro screening moet worden beschouwd als de eerste stap in een pijplijn voor nematicide-ontdekking; bodemanalyses zijn een uitstekende aanvulling op een pijpleiding om de vertaalbaarheid van de treffers te testen.

Betekenis en toepassing van het protocol
De hierin beschreven protocollen zijn eenvoudig en gemakkelijk te repliceren. Bovendien is dit protocol met succes toegepast op andere PPN's in het laboratorium, waaronder Pratylenchus penetrans, door slechts kleine wijzigingen aan te brengen. Het ontwikkelen van nieuwe en veilige PPN-beheersmaatregelen is essentieel om de wereldwijde voedselzekerheid te waarborgen. Dit geldt met name voor soorten zoals D. dipsaci die over het algemeen tolerant zijn voor een breed scala aan momenteel aanvaardbare chemische nematiciden13,14. Daarom hebben de hier geschetste protocollen het potentieel om een belangrijke bijdrage te leveren aan de menselijke gezondheid op wereldschaal.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Acknowledgments

De auteurs erkennen Dr. Qing Yu (Agriculture and Agri-Food Canada) voor het verstrekken van de Ditylenchus dipsaci-cultuur en voor advies over cultuurmethoden; Dr. Benjamin Mimee (Agriculture and Agri-Food Canada) en Nathalie Dauphinais (Agriculture and Agri-Food Canada) voor advies over in vitro kweek van plantparasitaire nematoden; Dr. Andrew Burns en Sean Harrington voor nuttige suggesties over het project en het manuscript. JK is een NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholar. PJR wordt ondersteund door een CIHR projectsubsidie (313296). PJR is een Canada Research Chair (Tier 1) in chemische genetica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL tube Sarstedt 62.554.205
2 forceps Almedic 7747-A10-108
2L beaker Pyrex CLS10002L
50mL beaker Pyrex CLS100050
96 well plate Sarstedt 83.3924
aluminium foil Alcan Plus
bacteriological agar BioShop AGR001.5
coffee filter No name brand 716
commercial bleach 6% Lavo Pro 6 DIN102358107
disposable petri dishes (10cm x 1.5cm) Fisherbrand FB0875712
disposable petri dishes (10cm x 2.5cm) Sigma-Aldrich Z358762
dissecting scope Leica Leica MZ75
DMSO Sigma-Aldrich 472301-500ML
Funnel VWR 414004-270
Gamborg B5 Sigma-Aldrich G5893-10L
glass petri dish VWR 75845-546
glass slide MAGNA 60-1200
Lint-Free Blotting Paper V&P Scientific VP 522-100
Low retention pipette tips (200uL) LABFORCE 1159M44
mutlichannel pipette Eppendorf research plus 3125000036
NaOH Sigma-Aldrich S8045-500G
nutrient agar Sigma-Aldrich 70148-100G
parafilm Bemis PM-996
pea seeds Ontario Seed Company D-1995-250G
pin cleaning solutions V&P Scientific VP110A
pinner V&P Scientific VP381N
pinner rinse trays V&P Scientific VP 421
reagent reservoir with lid for multichannel pipettes Sigma-Aldrich BR703459
shaking incubator New Brunswick Scientific I26
sterile surgical blade MAGNA sb21-100-a
stir bar Fisherbrand 2109 - 1451359
sucrose BioShop SUC507.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sasser, J. N., Freckman, D. W. A. world perspective on nematology: the role of the society. Vistas on nematology. , Hyattsville: Society of Nematologists Inc. 7-14 (1987).
  2. Abad, P., et al. Genome sequence of the metazoan plant parasitic nematode Meloidogyne incognita. Nature Biotechnology. 26 (8), 909-915 (2008).
  3. Auwal, M., Hassan, T. H. P., Hongli, S., Jingwu, Z. Nematodes threats to global food security. Acta Agriculturae Scandinavica, Section B - Soil & Plant Science. 63 (5), 420-425 (2013).
  4. Chen, Z. X., Chen, S. Y., Dickson, D. W. Nematicides: Past and present uses. Nematology Vol 2, Nematode Management and Utilization. , CABI Publishing. 1179-1200 (2004).
  5. Desaeger, J., Wram, C., Zasada, I. New reduced-risk agricultural nematicides - and review. Journal of nematology. 52, (2020).
  6. Donely, N. The USA lags behind other agricultural nations in banning harmful pesticides. Environmental Health. 18 (1), 44 (2019).
  7. Polansek, T. Monsanto halts launch of chemical after users complain of rashes. Reuters. , (2017).
  8. Sturhan, D., Brzeski, M. W. Stem and bulb nematodes, Ditylenchus spp. Manual of agricultural nematology. , 423-464 (1991).
  9. The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). Data Sheets on Quarantine Pests; Ditylenchus dipsaci. Prepared by CABI and EPPO for the EU under Contract 90/399003. The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). , (2021).
  10. Quebec (Canada), Agriculture, Pêcherie et Alimentation Quebec. Réseau d'avertissements phytosanitaires (RAP). Avertissement Carotte, Céleri, Laitue, Oignon, Poireau [Warning carrot celery, lettuce, onion, leek]. Quebec (Canada), Agriculture, Pêcherie et Alimentation Quebec. , (2011).
  11. Abawi, G. S., Moktan, K. Bloat nematode problem on garlic: symptoms, distribution, and management guidelines. Department of Plant Pathology and Plant-microbe Biology, Geneva. , Cornell University. (2010).
  12. Taylor, R. Chapter 7. Nematodes and other worms. , Academic Press. 143-234 (2019).
  13. Storelli, A., Keiser, A., Eder, R., Jenni, S., Kiewnick, S. Evaluation of fluopyram for the control of Ditylenchus dipsaci in sugar beet. Journal of nematology. 52, 1-10 (2020).
  14. Oka, Y. Nematicidal activity of fluensulfone against some migratory nematodes under laboratory conditions. Pest Management Science. 70, 1850 (2014).
  15. Poirier, S., Dauphinais, N., Van Der Heyden, H., Véronneau, P. Y., Bélair, G., Gravel, V., Mimee, B. Host Range and Genetic Characterization of Ditylenchus dipsaci Populations from Eastern Canada. Plant disease. 103, 456-460 (2019).
  16. Storelli, A., Kiewnick, S., Daub, M., et al. Virulence and pathogenicity of four Ditylenchus dipsaci populations on sugar beet. Eur J Plant Pathol. 161, 63-71 (2021).
  17. Kühnhold, V., Kiewnick, S., Sikora, R. A. Development of an in vivo bioassay to identify sugar beet resistance to the stem nematode Ditylenchus dipsaci. Nematology. 8 (5), 641-645 (2006).
  18. Burns, A., Luciani, G., Musso, G. Caenorhabditis elegans is a useful model for anthelmintic discovery. Nat Communications. 6, (2015).
  19. Chen, S. Y., Dickson, D. W. A Technique for Determining Live Second-stage Juveniles of Heterodera glycines. Journal of nematology. 32, 117-121 (2000).
  20. Xiang, N., Lawrence, K. S. Optimization of In Vitro Techniques for Distinguishing between Live and Dead Second Stage Juveniles of Heterodera glycinesand Meloidogyne incognita. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
  21. US EPA. Fluopyram. US EPA. , OFFICE OF CHEMICAL SAFETY AND POLLUTION PREVENTION (2016).
  22. US EPA. Fluopyram. US EPA. , OFFICE OF CHEMICAL SAFETY AND POLLUTION PREVENTION (2020).
  23. US EPA. Oxamyl Facts. Prevention, Pesticides and Toxic Substances. US EPA. , (2000).

Tags

Biologie Nummer 179
Het kweken en screenen van de plant <em>Parasitaire Nematode Ditylenchus dipsaci</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cammalleri, S. R., Knox, J., Roy, P. … More

Cammalleri, S. R., Knox, J., Roy, P. J. Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci. J. Vis. Exp. (179), e63438, doi:10.3791/63438 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter