Summary
Целью данного протокола является характеристика новой модели глаукоматозной нейродегенерации, основанной на термическом прижигании лимбального сосудистого сплетения на 360°, индуцирующем подострую глазную гипертензию.
Abstract
Глаукома, вторая по значимости причина слепоты во всем мире, представляет собой гетерогенную группу глазных заболеваний, характеризующихся структурным повреждением зрительного нерва и дегенерацией ганглиозных клеток сетчатки (RGC), что приводит к зрительной дисфункции из-за прерывания передачи визуальной информации от глаза к мозгу. Повышенное внутриглазное давление является наиболее важным фактором риска; Таким образом, было разработано несколько моделей глазной гипертензии у грызунов с помощью генетических или экспериментальных подходов для изучения причин и последствий заболевания. Среди них были выявлены некоторые ограничения, такие как хирургическая инвазивность, неадекватная функциональная оценка, необходимость интенсивной подготовки и очень вариабельная протяженность повреждения сетчатки. В настоящей работе охарактеризован простой, малозатратный и эффективный метод индуцирования глазной гипертензии у грызунов, основанный на низкотемпературном прижигании по всему кругу лимбального сосудистого сплетения, являющегося основным компонентом дренажа водянистой влаги. Новая модель обеспечивает технически простую, неинвазивную и воспроизводимую подострую глазную гипертензию, связанную с прогрессирующей РГК и дегенерацией зрительного нерва, а также уникальную скорость послеоперационного клинического восстановления, позволяющую проводить функциональные исследования in vivo как электрофизиологическими, так и поведенческими методами.
Introduction
В медицинской литературе глаукома понимается как гетерогенная группа оптических невропатий, характеризующихся прогрессирующей дегенерацией ганглиозных клеток сетчатки (РГК), дендритов, сомы и аксонов, что приводит к структурному купированию (выкапыванию) диска зрительного нерва и функциональному ухудшению зрительного нерва, приводящему в неконтролируемых случаях к амаврозу из-за прерывания передачи зрительной информации от глаза к мозгу1. В настоящее время глаукома является наиболее распространенной причиной необратимой слепоты во всем мире, и, по прогнозам, к 2040 г. она охватит примерно 111,8 миллионачеловек2, что оказывает глубокое влияние на качество жизни пациентов (КЖ) и приводит к серьезным социально-экономическимпроблемам3.
Повышенное внутриглазное давление (ВГД) является одним из наиболее важных и единственно модифицируемых факторов риска развития и прогрессирования глаукомы. Среди множества типов глаукомы все, за исключением глаукомы нормального напряжения (НТГ), связаны с повышенным ВГД в какой-то момент клинической истории заболевания. Несмотря на выдающиеся клинические и хирургические достижения в области воздействия на ВГД и замедления или остановки прогрессирования заболевания, пациенты по-прежнему теряют зрение из-за глаукомы 4,5. Поэтому глубокое понимание сложной и многофакторной патофизиологии этого заболевания является обязательным условием для разработки более эффективных методов лечения, особенно для обеспечения нейропротекции РГК.
Среди многообразия экспериментальных подходов к пониманию механизмов заболевания животные модели, основанные на глазной гипертензии (ОГТ), наиболее близки к глаукоме человека. Модели грызунов особенно полезны, поскольку они недороги, просты в обращении, могут быть генетически модифицированы, имеют короткую продолжительность жизни и обладают анатомическими и физиологическими особенностями глаза, сопоставимыми с человеческими, такими как выработка водянистой влаги и дренаж 6,7,8,9,10,11,12,13 . В настоящее время используются такие модели, как склероз трабекулярной сетки после введения гипертонического физиологического раствора в эписклеральные вены14, внутрикамерная инъекция микрогранул15 или вязкоэластичных веществ 16, прижигание вихревых вен 17, фотокоагуляция трабекулярной сетки аргоновым лазером 18, окололимбальный шов 19 и использование трансгенной модели возрастной ОГТ (мыши DBA/2J)8. Тем не менее, инвазивность, послеоперационное помутнение роговицы, разрушение переднего сегмента, обширные кривые обучения, дорогостоящее оборудование и высокая вариабельность послеоперационного ВГД являются одними из немногих зарегистрированных подводных камней, связанных с существующими моделями, что делает разработку альтернативной модели ГВТ требованием для преодоления этих проблем20,21,22.
Настоящий протокол формализует новую хирургическую процедуру для индуцирования ГТ в качестве прокси глаукомы, основанную на прижигании лимбального сплетения (ЛПК) у грызунов23. Это простая, воспроизводимая, доступная и неинвазивная модель, которая обеспечивает высокую эффективность и низкую вариабельность повышения ВГД, связанную с уникально высокой скоростью полного клинического выздоровления, что обеспечивает функциональную оценку in vivo на меньшем количестве животных, используемых в каждом эксперименте. Хирургический метод индуцирует подострую ГТ с постепенным возвращением к исходному уровню через несколько дней, что моделирует гипертонический приступ, наблюдаемый при острой закрытоугольной глаукоме. Кроме того, восстановление ВГД в модели сопровождается непрерывной глаукоматозной нейродегенерацией, что полезно для будущих механистических исследований вторичной дегенерации РГК, которая происходит в нескольких случаях глаукомы человека, несмотря на адекватный контроль ВГД.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были выполнены в соответствии с Положением об использовании животных в офтальмологических и визуальных исследованиях Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) и одобрены Комитетом по этике по использованию животных в научных экспериментах Центра медицинских наук Федерального университета Рио-де-Жанейро (протокол 083/17). В настоящей работе использовались крысы Lister Hooded обоего пола в возрасте 2-3 месяцев и массой 180-320 г. Тем не менее, процедура может быть адаптирована для разных линий крыс различных возрастных диапазонов.
1. Хирургия глазной гипертензии и клиническое наблюдение
- Содержание животных в среде с контролируемой температурой и 12-часовым циклом света и темноты (6 утра: свет включен / 6 вечера: свет выключен) со стандартным гранулированным гамма-облученным кормом (Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, Бразилия) и водой (тройной фильтр, с нетоксичным активированным углем), доступными вволю.
- Приготовьте смесь для приготовления анестетика, состоящую из трех частей 10% кетамина гидрохлорида и одной части 2% ксилазина гидрохлорида (разбавитель: стерильная вода).
- Осторожно удерживают животное, удерживая спинную кожу, и вызывают анестезию путем внутрибрюшинного введения 1 мкл/г массы тела смеси (кетамин: 75 мг/кг; ксилазин: 5 мг/кг). Проверьте правильность анестезии примерно через 5 минут, выполнив реакцию на щипок пальца ноги.
- Местно обезболивают обе глазные поверхности путем закапывания проксиметакаина гидрохлорида 0,5% глазных капель. Подождите 30-60 с и удалите оставшийся раствор с передней стороны земного шара, осторожно прикоснувшись к носовой или боковой бульбарной конъюнктиве небольшим стерильным ватным тампоном.
- Измерьте исходный уровень ВГД как экспериментальных, так и контралатеральных контрольных глаз, поместив животное в положение вентрального пролежня на столе таким образом, чтобы поверхность роговицы была легко доступна для кончика тонометра.
- Используйте ручной тонометр с аппланацией или отскоком (Рисунок 1A). Расположите наконечник тонометра так, чтобы он слегка касался центральной зоны роговицы перпендикулярно. Получите и усредните 3-5 надежных средних значений, сгенерированных машиной. Каждое среднее значение автоматически вычисляется устройством после шести успешных отдельных измерений.
- Загрузите тонометр отскока зондом и нажмите кнопку измерения один раз, чтобы включить его, расположив наконечник прибора вверх, чтобы зонд не упал. После включения на дисплее отобразится 00, указывающий на то, что оборудование готово к измерению.
- Расположите прибор наконечником зонда на расстоянии 1-4 мм от роговицы и проводите измерения быстрым и осторожным нажатием кнопки измерения, не перемещая оборудование. Каждое успешное измерение обозначается коротким звуковым сигналом, а после шести раз среднее значение отображается на экране устройства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на большой опыт работы с аппланационным тонометром, для оптимизации всей процедуры авторы рекомендуют использовать тонометр с отскоком, который обеспечивает более легкий получение достоверного измерения ВГД.
- Поместите животное в слегка боковое пролежневое положение под стереомикроскопом и тщательно спланируйте операцию, осматривая экспериментальный глаз при 40-кратном увеличении. Не забывайте поддерживать контралатеральный контроль глаза смазанным во время процедуры, закапывая каплю кармеллозы натрия или гиалуроната натрия.
- С помощью изогнутых щипцов осторожно выдвиньте вперед экспериментальное глазное яблоко так, чтобы обнажить сосудистую сеть, которая окружает лимб13 на 360°. Другой рукой осторожно прижгите сосуды вокруг роговицы с помощью низкотемпературного офтальмологического прижигания (1,300 °F; Bovie Medical, США) (рис. 1B-E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Упомянутое прижигание имеет круглый кончик, который должен касаться лимбальной сосудистой сети в продольном направлении. - Будьте осторожны и не прижигайте периферию роговицы, так как это может привести к послеоперационному помутнению роговицы, что исключает оценку функции сетчатки in vivo .
- Наблюдайте появление небольших круглых следов прижигания на лимбе склеры, облитерацию лимбальной сосудистой сети и расширение зрачка в прооперированном глазу, которые являются признаками успешного хирургического вмешательства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку лимбальная сосудистая сеть крыс и мышей анатомически сходна13,24, а используемое прижигание имеет мягкий маленький кончик, этот протокол может работать и для мышиного глаза без какой-либо адаптации. - После операции проверьте послеоперационное ВГД на обоих глазах, как описано в шаге 1.5.
- Нанесите каплю офтальмологического преднизолона ацетата (1,2 мг/мл) и поддерживайте контакт с передней поверхностью экспериментального глаза в течение примерно 40 с, затем замените ее офтальмологической мазью с антибиотиками (окситетрациклина гидрохлорид 30 мг/г плюс полимиксин В 10 000 ЕД/г; или ципрофлоксацин 3,5 мг/г). Выполнить внутримышечную инъекцию трамадола гидрохлорида (разовая доза; 2 мг/кг) для предотвращения болевых ощущений после процедуры.
- Внимательно следите за восстановлением животного после наркоза, предпочтительно в теплой среде, такой как грелка, или в клетке с надлежащей подстилкой. Обратите внимание на рисунок дыхания.
- Проводите ежедневное клиническое наблюдение за экспериментальным глазом с помощью местных препаратов, состоящих из нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП, например, 0,5% глазных капель кеторолака трометамола) и мази с антибиотиком (желательно такой же, которая используется сразу после операции).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать НПВП вместо стероидных противовоспалительных глазных капель, поскольку последние могут индуцировать ОГТ, и регулярно применяются для моделей глюкокортикоид-индуцированной глаукомы у грызунов.- При небольшом седативном эффекте (кетамин: 18,75 мг/кг; ксилазин: 1,25 мг/кг) измеряйте ВГД предпочтительно в тот же период дня, чтобы избежать смещения из-за физиологических циркадных колебаний ВГД.
- Во время офтальмологического обследования обратите внимание на редкие клинические проявления, такие как гифема, фиброз роговицы или истончение склеры, связанные с увеальным пролапсом. Отек роговицы, хемоз и гиперемия конъюнктивы являются распространенными, но временными явлениями.
- Отметьте полное клиническое выздоровление примерно на 7-й день после операции. Лимбальная реваскуляризация обычно начинается в первые два дня после операции, в соответствии с ожидаемым постепенным возвращением ВГД к исходному уровню.
2. Анализ оптомоторного ответа (OMR)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой процедуры была использована специальная система25.
- Расположите четыре компьютерных монитора в четырехугольнике, которые разграничивают арену с площадкой посередине. На мониторах выводится изображение виртуального цилиндра с вертикально ориентированными синусоидальными решетками (чередующиеся черные и белые полосы), вращающегося вокруг платформы с фиксированной скоростью (12 градусов/с) и контрастностью (100%).
- Расположите видеокамеру над платформой, чтобы экспериментатор мог наблюдать за движениями животного. Выполните тест в фотопических условиях и установите программное обеспечение предпочтительно в ручной/раздельный режим, чтобы оценить каждый глаз отдельно.
- Дайте животным привыкнуть примерно на 2 минуты на платформе. Удерживайте красный курсор прицела на видеокадре между глазами свободно движущегося животного, так как он указывает на центр виртуального цилиндра (рис. 1G)25.
- Наблюдайте за OMR, состоящим из рефлекторного слежения за головой и шеей животного, вызванного вращающимися решетками. Проверьте левый и правый зрительные пути, поворачивая направления синусоидальных решеток по часовой стрелке и против часовой стрелки соответственно.
- Первоначально предъявляют стимул с низкой пространственной частотой (0,042 цикла/градус). Затем постепенно увеличивайте частоту до тех пор, пока отслеживание движения не перестанет быть заметным. Наибольшая пространственная частота, при которой вызывается четкий OMR, соответствует пороговой пространственной частоте оцениваемого глаза.
- Если животное все-таки упадет с платформы во время осмотра, немедленно верните его на платформу и возобновите тест.
3. Регистрация паттерн-электроретинограммы (ПЕРГ)
ПРИМЕЧАНИЕ: Электроретинограмма была записана с использованием специальной системы обработки сигналов и соответствующего программного обеспечения для хранения и анализа сигналов.
- Глубоко обезболивают животных путем внутримышечного введения кетамина гидрохлорида и ксилазина гидрохлорида (75 мг/кг и 5 мг/кг соответственно). Глубокая анестезия (хирургическая плоскость) снижает вероятность возникновения артефактов при непроизвольных движениях мышц или альтернативных источниках шума во время обследования. Проверьте правильность анестезии, выполнив реакцию щипки пальца ноги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Упомянутые анестетики не влияют на амплитуду ответа26. Поскольку в качестве активного электрода использовалась маленькая игла, введенная в роговицу, внутримышечная анестезия предпочтительнее внутрибрюшинной, так как ее легче ввести повторно в случае, если крысе потребуется бустерная доза (1/2 начальной дозы), с меньшими шансами изменить положение электрода и, таким образом, привести к более воспроизводимым записям в течение всего эксперимента. который может длиться до 60 минут. - Местно обезболивайте роговицу каплей проксиметакаина гидрохлорида 0,5% и увлажняйте глаз офтальмологическими смазками.
- Осторожно введите активный электрод (иглу из нержавеющей стали 0,25 мм × 15 мм) на височную периферию роговицы. Дополнительно вводят электроды сравнения и заземления (игла из нержавеющей стали 0,4 мм × 37 мм) в подкожную клетчатку ипсилатерального височного кантуса и в одну из задних конечностей соответственно (рис. 1I).
- Для PERG установите стимул на черно-белую резервную шахматную доску, чередующуюся со скоростью 15 разворотов/с с постоянной средней яркостью (250 кд/м2). Установите полосовой фильтр на частоту 1–100 Гц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Быстрый реверсивный стимул генерирует стационарный PERG, стабильную и воспроизводимую синусоиду, которая собирает волновой компонент, который, скорее всего, связан с биоэлектрическим откликом RGC: NII отклонения переходного состояния PERG. - Расположите животное на расстоянии 20 см от экрана стимула (ЖК-монитор 0,58 м; Рисунок 1I), отслеживайте базовую линию сигнала и начните сбор PERG, нажав кнопку Analysis (Анализ) в системе сбора данных.
- Во время процедуры следите за тем, чтобы животные были адаптированы к окружающему свету (белый свет ~140 люкс). Здесь шесть различных пространственных частот (в циклах на градус: 0,018, 0,037, 0,073, 0,146, 0,292, 0,585) были представлены в случайной последовательности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение, используемое для обработки сигналов, автоматически выполняет усреднение. Среднее значение в 200-300 отдельных волн считалось достаточным для того, чтобы выделиться из шума и проанализировать амплитуду волны.
4. Количественная оценка сома ганглиозных клеток сетчатки
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура предназначена для количественной оценки сомов RGC, основанной на иммуногистохимическом окрашивании плоских монтирований сетчатки антителом против специфичного для мозга гомеобокса/POU домена белка 3A (Brn3a).
- Подопытные животные подвергались эвтаназии при вывихе шейки матки, которой предшествовало вдыхание углекислого газа, чтобы вызвать потерю сознания.
- Сразу после эвтаназии препарируйте оба глаза под стереомикроскопом, используя зубчатые щипцы и изогнутые ножницы.
- Выполняйте тщательное рассечение таким образом, чтобы и дистальная часть экстраокулярных мышц, и карункул оставались прикрепленными к глобусу, так как они являются важными ориентирами для топографической ориентации сетчатки (описано в шаге 4.5). Постарайтесь сохранить участок зрительного нерва, прикрепленный к глобусу, как можно дольше для будущего анализа.
- После энуклеации поместите глаза в 1 мл раствора 4% параформальдегида (4% PFA) в 0,1 М фосфатном буфере (PBS) и держите его в течение 24 ч для правильной химической фиксации.
- Отделите сетчатку от остальных тканей глаза.
- Под препарирующим микроскопом поместите глазное яблоко в чашку Петри, покрытую 1x PBS, и обратите внимание на важные ориентиры, такие как носовой карункул, трещины сосудистой оболочки и отпечатки склеры из вихревых вен, для правильной топографической ориентации27.
- Проникают в переднюю камеру из центральной роговицы с помощью зубчатых щипцов и изогнутых ножниц (Уэсткотт). Сделайте два радиальных надреза в верхней (дорсальной) части склеры, по направлению к склеральному отверстию зрительного нерва, чтобы разграничить дорсальный квадрант глазного яблока.
- Отделите роговицу от остального шара через продольный разрез на 360° в области склерального лимба. Удалите хрусталик и радужную оболочку и разграничите дорсальный квадрант сетчатки, используя те же склеральные радиальные разграничения, которые описаны выше (шаг 4.5.2).
- Осторожно отделите ткань сетчатки от сосудистой оболочки и склеры, избегая как случайных разрывов по всей ткани, так и возможной потери топографической ориентации.
- Отделяют цилиарное тело от ретинальной ora serrata. Осторожно извлеките оставшееся стекловидное тело из чашечки сетчатки с помощью изогнутых беззубых щипцов, а также изогнутых ножниц (вытяните стекловидное тело и рассеките его близко к внутренней ограничивающей мембране) и небольшой щетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление стекловидного тела является важным шагом для получения сильного и чистого иммуногистохимического сигнала.
- Перенесите изолированную сетчатку в 24-луночный культуральный планшет (по одной сетчатке на лунку), содержащую 1 мл 1x PBS, и держите внутреннюю сетчатку вверх.
- Пермеабилизируйте ткани, промывая 3 раза в течение 10 минут неионогенным поверхностно-активным веществом 0,5%, разведенным в 1x PBS (0,3 мл). Затем осторожно встряхивайте ткань в 5% бычьем сывороточном альбумине (БСА) в неионогном поверхностно-активном веществе 2% и 1x PBS (блокирующий раствор; 0,25 мл) в течение 60 минут при комнатной температуре.
- На этапе 4.7 приготовьте раствор первичных антител Brn3a, разбавив 1:200 неионогенным поверхностно-активным веществом 0,5% и 1x PBS плюс 5% BSA, и храните его при температуре 4 °C.
- После 60 мин блокады тканей инкубируют сетчатку в 0,2 мл раствора первичных антител при 4 °C в течение 72 ч при легком встряхивании.
- Промойте ткань 3 раза в течение 10 минут с 1 PBS, затем инкубируйте ткань в течение 2 ч при комнатной температуре в 0,2 мл раствора вторичных антител, разведенных 1:750 в 1x PBS плюс 5% BSA.
- Далее инкубируют ткань в течение 10 мин в растворе ядерного контрокрашивания для флуоресцентного окрашивания ядер. Завершите иммуногистохимическое исследование заключительным этапом промывки с повторением 1x PBS (0,3 мл) 3 раза.
- Перенесите сетчатку с помощью двух маленьких кистей на предметные стекла микроскопа, держа стекловидную сторону вверх. Расположите дорсальный квадрант сетчатки вверх на предметных стеклах микроскопа (ранее разграниченные в шаге 4.5.3). Сделайте еще два радиальных надреза по направлению к головке зрительного нерва, чтобы разграничить остальные 3 квадранта (носовой, вентральный и височный).
ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры выреза не фиксированы. Они не должны быть слишком короткими, что ухудшает эффективное уплощение сетчатки на предметном стекле, и не должны быть слишком длинными, чтобы они достигали отверстия зрительного нерва и полностью отделяли разграниченный квадрант сетчатки от остальной ткани. - Наконец, нанесите 0,2 мл антизатухающей монтажной среды на стеклянный покровный лист и поместите его на плоскую сетчатку для микроскопического анализа тканей. Чтобы оценить плотность RGC, исследуйте плоские крепления под конфокальным эпифлуоресцентным микроскопом с использованием объектива 40x/1,3.
- Для каждого квадранта сетчатки сделайте восемь фотографий: две с центральной части сетчатки (~0,9 мм от диска зрительного нерва), три со средней части сетчатки (~2,0 мм с диска зрительного нерва) и три с периферической сетчатки (~3,7 мм с диска зрительного нерва), всего 32 фотографии на сетчатку. Используйте программное обеспечение FIJI для подсчета Brn3a-положительных клеток и оценки средней плотности клеток.
5. Обследование зрительного нерва
- После эвтаназии и энуклеации глазного яблока (этапы 4.1-4.3) удаляют проксимальный сегмент внутриглазничного отдела зрительного нерва (1-2 мм), включая часть внутриглазной части, и немедленно помещают образцы во флаконы/пробирки, содержащие 0,2-0,3 мл фиксатора холода (2,5% раствор глутарового альдегида в 0,1 М буфере какодилата натрия (рН 7,4)) на 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы обработки зрительного нерва выполняются в тех же флаконах/пробирках, что и на этапе 5.1 - Промыть материал 3 раза в течение 5 мин холодным 0,1 М буфером какодилата натрия. После фиксации ткани в течение 1 ч при легком встряхивании в растворе 1,0% тетраоксида осмия в 0,8% ферроцианиде калия и 5 нМ кальция хлорида, разбавленного в 0,1 М буфере какодилата натрия при 4 °С (0,1-0,2 мл).
- Фрагменты зрительного нерва промывают 3 раза в течение 5 мин холодным 0,1 М буфером какодилата натрия, а затем холодной дистиллированной водой 3 раза в течение 1 мин. Материал выдерживают в течение ночи при легком встряхивании в растворе 1,0% уранилацетата в дистиллированной воде для окрашивания при 4 °C (0,1-0,2 мл). Фрагменты промыть 3 раза холодной дистиллированной водой.
- Постепенно обезвоживайте ткань с помощью ступенчатой серии ацетона (0,5 мл каждая) с последующей заменой следующих разведений в дистиллированной воде: 2x 7-минутная инкубация в 15% ледяном ацетоне; 2x 7-минутная инкубация в 30% ледяном ацетоне; 2x 7-минутная инкубация в 50% ледяном ацетоне; 2x 7-минутная инкубация в 70% ледяном ацетоне; 2x 7-минутная инкубация в 80% ледяном ацетоне; 2x 7-минутная инкубация в 90% ледяном ацетоне; 2x 15-минутная инкубация в 100% ацетоне при комнатной температуре (RT).
- Выполнить 3 этапа инфильтрации/заделки, с последующей заменой следующих растворов: 1 часть эпоксидной смолы: 2 части ацетона (общий объем: 0,5 мл), при RT в течение 12 ч; 1 часть эпоксидной смолы: 1 часть ацетона (общий объем: 0,5 мл), при RT в течение 12 ч; 2 части эпоксидной смолы: 1 часть ацетона (общий объем: 0,5 мл), при RT в течение 12 ч. Наконец, инфильтрировать ткань в чистую эпоксидную смолу при RT в течение 24 ч.
- Извлеките образцы из носителя образцов, переложите их в формы для встраивания и дайте полимеризоваться в течение 48 ч при 60 °C. С помощью ультрамикротома вырезать поперечные полутонкие срезы (300-400 нм) фрагментов зрительного нерва, собрать и перенести их на предметное стекло микроскопа. Окрасьте срезы толуидиновым синим и визуализируйте с помощью оптического микроскопа при 100-кратном увеличении.
- Для ультраструктурного анализа выполняют ультратонкие поперечные срезы (70 нм), собирают их на медные сетки и окрашивают уранилацетатом и цитратом свинца. Рассмотрите срезы в просвечивающий электронный микроскоп.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Количественные переменные выражаются в виде среднего значения ± стандартной ошибки среднего значения (SEM). За исключением сравнения динамики ВГД между ГВТ и контрольной группами (рис. 1F), статистический анализ проводили с использованием двуфакторного ANOVA с последующим тестом множественных сравнений Сидака. p-значение < 0,05 считалось статистически значимым.
На рисунке 1 показаны хирургические этапы модели прижигания лимбального сплетения (LPC) по всему кругу с важными вехами, такими как термически индуцированное исчезновение лимбальных сосудов на 360°, а также мидриаз от легкой до умеренной степени в прооперированном глазу в конце процедуры.
В данной серии из 131 крысы прижигание лимбального сплетения по всему кругу (ЛПК) индуцировало повышение ВГД сразу после операции с 13,0 ± 0,2 мм рт.ст. на исходном уровне до 22,7 ± 0,4 мм рт.ст. Пик послеоперационного ВГД наблюдался в первые сутки после операции (25,3 ± 0,6 мм рт.ст.) с последующим постепенным возвращением к исходному уровню на6-е сутки после операции (статистический анализ: множественный t-критерий с поправкой на множественные сравнения по методу Хольма-Сидака; Рисунок 1F). Фиброз или отек роговицы были клиническими нарушениями, которые потенциально могли поставить под угрозу точность измерения ВГД. Первый, с одной стороны, был редким, поражал 3,92% животных и был выявлен на поздних стадиях послеоперационного наблюдения, что позволило избежать глазной гипертензии в первые 5 дней и сохранить подострый профиль ОГТ, описанный23. Отек роговицы, с другой стороны, был более распространенным осложнением, наблюдаемым в течение первых нескольких дней после операции (1-3 дня), но в основном легким и временным, поэтому не сильно влиял на ВГД23.
Функцию сетчатки оценивали как поведенчески, так и электрофизиологически с помощью оптомоторного рефлекса и паттерн-ЭРГ соответственно (рис. 1G-J). Оба показателя показали две фазы нарушения: острая фаза глазной гипертензии на3-е сутки после операции и фаза вторичной дегенерации на 30-е сутки после операции (рис. 1H, рис. J и табл. 1). Между ними был выявлен период функционального восстановления, о чем говорилось ранее в другом месте23.
По сравнению с контрольными собратьями по зрительным нервам, количество аксонов в полутонких поперечных срезах зрительного нерва показало прогрессирующее снижение после операции (3-й день: 68,3% ± 0,9%; 7-й день: 59,2% ± 2,6%; 14-й день: 45,4% ± 2,2%;30-й день: 28,2 % ± 3,0%; двусторонний АНОВА: p < 0,0001; Рисунок 2А). В ультраструктурном отношении зрительные нервы контрольных глаз представляли собой плотно упакованные миелинизированные волокна, разделенные тонкими отростками глиальных клеток, и явные аксональные микротрубочки и нейрофиламенты (рис. 2B). Напротив, через 3 дня после ОГТ мы обнаружили очаговое разрушение пучков аксонов, несколько дегенеративных волокон, цитоплазматическую вакуолизацию в процессах глиальных клеток и конденсированный хроматин в ядрах глиальных клеток. Через 7 дней индукции ОГТ наблюдалось увеличение дегенеративных аксональных волокон, гипертрофированные глиальные клеточные отростки, а также отеки и пустоты в отдельных аксональных волокнах. На 14-й день одним из наиболее заметных изменений была большая дисорганизация волокон зрительного нерва, связанная с инвазией глиальноклеточных отростков между аксонами. Пучки филаментов заполняли эти отростки и темные дегенеративные волокна, и чаще встречался распад миелина, связанный с отслоившимися и вакуолизированными ламелями (рис. 2B).
Плотность профилей Brn3a+ снижалась с течением времени (рис. 2C), в основном в дорсальном и височном квадрантах сетчатки, до 32,4% ± 9,6% и 35,7% ± 9,1% через 30 дней соответственно (рис. 2D-G и табл. 2).
Рисунок 1: Термическое прижигание лимбального сосудистого сплетения и последствия для функции сетчатки in vivo. (A) Альтернативные методы измерения ВГД у крыс: тонометрия рикошета (верхняя) и аппланационная тонометрия (нижняя). (Б-Е) Хирургическое вмешательство; наконечник стрелы: лимбальное сосудистое сплетение; стрелка: изогнутые щипцы, используемые для обнажения передней поверхности глазного яблока и оптимизации хирургического обследования лимбальных сосудов; гашиш: круглый кончик низкотемпературного офтальмологического прижигания; Звездочка: след прижигания. Масштабная линейка: 2 мм. На врезке (D) при увеличении показана лимбальная сосудистая сеть, подлежащая прижиганию. (F) Временной ход измерений ВГД в OHT (красные) и контрольные (черные) глаза (n = 131). Вертикальная стрелка вниз: операция LPC. * = p < 0,05 (G) Арена для анализа оптомоторного ответа, состоящая из четырех компьютерных мониторов, расположенных в четырехугольнике, с платформой посередине. На мониторах отображается изображение виртуального цилиндра, состоящего из вертикальных чередующихся черных и белых полос, движущихся вокруг животного с постоянной скоростью вращения и переменными пространственными частотами. Красное перекрестие соответствует центру виртуального цилиндра. (H) Оптомоторные реакции. При последующем хирургическом наблюдении выделяют две фазы: фаза ОГТ (0-5 дней) и фаза вторичной дегенерации (6-30 дней). = p < 0,0001. (I) Электроды и позиционирование животных для получения образа-ЭРГ (PERG): активный электрод на височной периферии роговицы, а также электроды сравнения и заземления в подкожную клетчатку ипсилатерального височного кантуса и одной из задних конечностей соответственно. Животное располагают на расстоянии 20 см от экрана стимула. (J) амплитуда PERG на стимулы с различными пространственными частотами. Как и в случае с оптомоторным ответом, оценка PERG также показывает две различные фазы реакций после операции: глазная гипертензия через 3 дня после операции, за которой следует восстановление на 7-й и 14-й день, хотя статистически все еще ниже, чем наивные ответы, и последующее снижение на 30-й день после операции. c/d = циклов на градус. Наивная группа: глаза животных, не подвергавшихся каким-либо предыдущим экспериментальным манипуляциям. (H) и (J) показывают среднее значение ± SEM, плюс отдельные репликации в (H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Структурная оценка сетчатки и зрительного нерва после прижигания лимбального сосудистого сплетения (ЛПК) низкотемпературным офтальмологическим прижиганием. (A) Количество аксонов в разное время после OHT (n = 3). = p = 0,0005, **** = p < 0,0001. (Б) Электронные микрофотографии дегенерации зрительного нерва после ОГТ. На левом рисунке показан контрольный зрительный нерв, а на следующих изображениях показана прогрессирующая дегенерация после 3, 7 и 14 дней ОГТ. Наконечник стрелы: нормальные миелинизированные волокна; тонкие стрелки: дегенеративные волокна; звездочка: цитоплазматическая вакуолизация; хеши: процесс глиальных клеток; и Nu: ядро глиальной клетки. (C) Микрофотографии репрезентативных счетных полей RGC, меченных антителами к ядрам Brn3a (красный) и TO-PRO3 (синий); Масштабная линейка: 50 мкм. (D-G) Распределение средней плотности клеток Brn3a+ в четырех квадрантах сетчатки через 3-30 дней после операции. Графики показывают индивидуальные средние значения плотностей RGC для 3-11 животных за время после процедуры. * = p < 0,05; ** = p < 0,01; = p < 0,001; = p < 0,0001. Количественные данные являются средними ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Статистический анализ данных PENG. Двусторонний ANOVA с последующим тестом множественных сравнений Сидака. P-значение менее 0,05 считалось статистически значимым. c/d = циклов на градус. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Региональная потеря РГК после ЛПК. SEM: стандартная ошибка среднего значения. Управление: глазочник. P-значения менее 0,05 считались статистически значимыми (*). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Прижигание лимбального сплетения (ЛПК) является новой посттрабекулярной моделью, преимущество которой заключается в том, что она нацелена на легкодоступные сосудистые структуры, не требующие диссекции конъюнктивы или шипа17,28. В отличие от модели прижигания вихревых вен, известной модели ОГТ, основанной на хирургическом нарушении дренажа хориоидальных вен, венозный застой, как ожидается, не повлияет на повышение ВГД в модели LPC, поскольку лимбальные вены расположены выше по течению в оттоке водянистой влаги. Кроме того, он технически прост в освоении и недорог, требует в основном низкотемпературного термического прижигания. Более того, он связан с уникальной скоростью индукции ОГТ и полного клинического выздоровления (> 90%, как сообщалось ранее)23, что сокращает количество животных, необходимых для экспериментов, и позволяет проводить как электрофизиологический, так и поведенческий анализ. Наконец, глаукоматозная дегенерация присутствует как в слое RGC, так и в зрительном нерве в относительно короткие сроки после операции, что позволяет проводить как краткосрочные, так и среднесрочные экспериментальные проекты23. Необходимы дальнейшие исследования для дальнейшего выяснения влияния прижигания лимбальной сосудистой сети по всему кругу на отдельные слои сетчатки.
Важнейшими этапами хирургического протокола являются: (1) наконечник для прижигания должен осторожно касаться склерального лимба параллельно оси сосуда; (2) Ткань роговицы должна быть сохранена не только во время прижигания, но и во время манипуляций с животными. Регулярно проводите закапывание глазных капель и удаление излишков раствора с поверхности глаза ватным тампоном (будьте осторожны, не трите ватным тампоном поверхность роговицы при удалении жидкости, так как это приводит к стиранию эпителия роговицы и возможным послеоперационным осложнениям); (3) должен быть визуализирован полный круг смежных следов прижигания; (4) Не пренебрегайте послеоперационным клиническим наблюдением с применением нестероидных противовоспалительных препаратов и мази с антибиотиком, по крайней мере, до5-го дня после операции.
Подострое повышение ВГД, наблюдаемое в описанной модели, отличается от динамики давления при открытоугольной глаукоме, но сродни острой закрытоугольной глаукоме, неоваскулярной глаукоме или множественным типам посттрабекулярной глаукомы с повышенным эписклеральным венозным давлением29. Это является основным ограничением данного метода, так как открытоугольная глаукома является наиболее распространенным фенотипом заболевания, характеризующимся хронической АГТ и медленно прогрессирующей дегенерацией РГК. Тем не менее, связь прогрессирующей нормализации ВГД с непрерывной дегенерацией РГК представляет собой уникальную возможность изучить на одной и той же животной модели как биологические механизмы, связывающие глазную гипертензию с развитием и прогрессированием глаукомы, так и вторичный дегенеративный процесс, который в основном наблюдается в случаях открытоугольной глаукомы, после которой у пациентов наблюдается прогрессирование глаукомы, несмотря на клинический или хирургический успех в достижении целевого показателя ВГД30. Таким образом, эта модель представляет собой возможность лучше объяснить этот феномен с помощью краткосрочных или среднесрочных экспериментальных схем и, в конечном итоге, разработать независимые от давления нейропротекторные методы лечения для пациентов, которые по-прежнему теряют зрение, несмотря на лучшее лечение ВГД.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы выражаем признательность нашим лаборантам Хосе; Нильсон душ Сантуш, Дайанн Мандарино Торрес, Хосе Франсиско Тибурсио, Жильдо Бриту де Соуза и Лучано Кавальканте Феррейра. Это исследование финансировалось FAPERJ, CNPq и CAPES.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Isofar | 201 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Active electrode for electroretinography | Hansol Medical Co | - | Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm |
| Anestalcon | Novartis Biociências S/A | MS-1.0068.1087 | Proxymetacaine hydrochloride 0.5% |
| Calcium chloride | Vetec | 560 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx | Bovie Medical Corporation | AA00 | Low-temperature ophthalmic cautery |
| Cetamin | Syntec do Brasil Ltda | 000200-3-000003 | Ketamine hydrochloride 10% |
| DAKO | Dako North America | S3023 | Antifade mounting medium |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 28718-90-3 | diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm |
| Ecofilm | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0487 | Carmellose sodium 0.5% |
| EPON Resin | Polysciences, Inc. | - | Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553) |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16110 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Hyabak | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-8042140002 | Sodium hyaluronate 0.15% |
| Icare Tonolab | Icare Finland Oy | TV02 (model number) | Rebound handheld tonometer |
| IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Secondary antibody solution |
| LCD monitor 23 inches | Samsung Electronics Co. Ltd. | S23B550 | Model LS23B550, for electroretinogram recording |
| LSM 510 Meta | Carl Zeiss | - | Confocal epifluorescence microscope |
| Maxiflox | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0489 | Ciprofloxacin 3.5 mg/g |
| MEB-9400K | Nihon Kohden Corporation | - | System for electroretinogram recording |
| monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a | MilliporeSigma | MAB-1585 | Brn3a primary antibody solution |
| Neuropack Manager v08.33 | Nihon Kohden Corporation | - | Software for electroretinogram signal processing |
| Optomotry | CerebralMechanics | - | System for optomotor response analysis |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Potassium ferrocyanide | Electron Microscopy Sciences | 20150 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Reference and ground electrodes for electroretinography | Chalgren Enterprises | 110-63 | Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm |
| Sodium cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Ster MD | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-1.0497.1287 | Prednisolone acetate 0.12% |
| Terolac | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0497.1286 | Ketorolac trometamol 0.5% |
| Terramicina | Laboratórios Pfizer Ltda | MS-1.0216.0024 | Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g |
| Tono-Pen XL | Reichert Technologies | 230635 | Digital applanation handheld tonometer |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher Scientific | T3605 | Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Non-ionic surfactant |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Xilazin | Syntec do Brasil Ltda | 7899 | Xylazine hydrochloride 2% |
| Carl Zeiss | - | Stereo microscope for surgery and retinal dissection |
References
- Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The Pathophysiology and Treatment of Glaucoma A Review. JAMA. 311 (8), 1901-1911 (2014).
- Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: A systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
- Quaranta, L., et al. Quality of Life in Glaucoma: A Review of the Literature. Advances in Therapy. 33 (6), 959-981 (2016).
- Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Archives of Ophthalmology. 120 (10), Chicago, Ill. 1268-1279 (2002).
- Susanna, R., De Moraes, C. G., Cioffi, G. A., Ritch, R. Why Do People (Still) Go Blind from Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 4 (2), 1 (2015).
- Fujikawa, K., et al. VAV2 and VAV3 as candidate disease genes for spontaneous glaucoma in mice and humans. PLoS One. 5 (2), 9050 (2010).
- Mao, M., Hedberg-Buenz, A., Koehn, D., John, S. W., Anderson, M. G. Anterior segment dysgenesis and early-onset glaucoma in nee mice with mutation of Sh3pxd2b. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2679-2688 (2011).
- John, S. W., et al. Essential iris atrophy, pigment dispersion, and glaucoma in DBA/2J mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (6), 951-962 (1998).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Ocular hypertension in mice with a targeted type I collagen mutation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (4), 1581-1585 (2003).
- Chou, T. H., Tomarev, S., Porciatti, V. Transgenic mice expressing mutated Tyr437His human myocilin develop progressive loss of retinal ganglion cell electrical responsiveness and axonopathy with normal iop. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (9), 5602-5609 (2014).
- vander Zypen, E. Experimental morphological study on structure and function of the filtration angel of the rat eye. Ophthalmologica. 174 (5), 285-298 (1977).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N.
- Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G.
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: A paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
- Zhu, M. D., Cai, F. Y. Development of experimental chronic intraocular hypertension in the rabbit. Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology. 20 (3), 225-234 (1992).
- Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61 (3), 379-382 (1995).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 402-410 (2002).
- Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
- Biswas, S., Wan, K. H. Review of rodent hypertensive glaucoma models. Acta Ophthalmologica. 97 (3), 331-340 (2019).
- Pitha, I., et al. Sustained Dorzolamide Release Prevents Axonal and Retinal Ganglion Cell Loss in a Rat Model of IOP-Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 7 (2), 13 (2018).
- Grozdanic, S. D., et al. Temporary elevation of the intraocular pressure by cauterization of vortex and episcleral veins in rats causes functional deficits in the retina and optic nerve. Experimental Eye Research. 77 (1), 27-33 (2003).
- Lani, R., et al. A subacute model of glaucoma based on limbal plexus cautery in pigmented rats. Scientific Reports. 9 (1), 16286 (2019).
- vander Merwe, E. L., Kidson, S. H. The three-dimensional organisation of the post-trabecular aqueous outflow pathway and limbal vasculature in the mouse. Experimental Eye Research. 125, 226-235 (2014).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
- Sasovetz, D. Ketamine hydrochloride: an effective general anesthetic for use in electroretinography. Annals of Ophthalmology. 10 (11), 1510-1514 (1978).
- Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. The Journal of Comparative Neurology. 526 (11), 1749-1759 (2018).
- Blanco, R., et al. A Chronic Ocular-Hypertensive Rat Model induced by Injection of the Sclerosant Agent Polidocanol in the Aqueous Humor Outflow Pathway. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3209 (2019).
- Paranhos, A., Prata, J. A., de Mello, P. A., da Silva, F. A. Post-Trabecular Glaucomas with Elevated Episcleral Venous Pressure. Mechanisms of the Glaucomas. , Humana Press. 139-157 (2008).
- Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective Vulnerability of Specific Retinal Ganglion Cell Types and Synapses after Transient Ocular Hypertension. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of The Society for Neuroscience. 36 (35), 9240-9252 (2016).
