Summary
このプロトコルの目的は、緑内障性神経変性の新しいモデルを特徴付けることです 辺縁血管神経叢の360°熱焼灼に基づいて、亜急性高眼圧症を誘発します。
Abstract
緑内障は、世界の失明原因の第2位であり、視神経と網膜神経節細胞(RGC)の変性に構造的損傷があり、眼から脳への視覚情報の伝達が遮断されることにより視覚機能障害を引き起こす不均一な眼疾患群です。眼圧の上昇は最も重要な危険因子です。したがって、高眼圧症のいくつかのモデルは、病気の原因と影響を調査するために、遺伝的または実験的アプローチのいずれかによってげっ歯類で開発されています。それらの中で、外科的侵襲性、不十分な機能評価、広範なトレーニングの必要性、網膜損傷の非常に変動の大きい拡張など、いくつかの制限が報告されています。本研究は、房水ドレナージの主要成分である辺縁血管神経叢の低温全円焼灼に基づく、げっ歯類に高眼圧症を誘発する単純で低コストかつ効率的な方法を特徴付ける。この新しいモデルは、進行性のRGCおよび視神経変性に関連する、技術的に簡単で非侵襲的で再現性のある亜急性高眼圧症と、電気生理学的および行動学的方法の両方による in vivo 機能研究を可能にする独自の術後の臨床回復率を提供します。
Introduction
医学文献では、緑内障は、網膜神経節細胞(RGC)、樹状突起、体細胞、および軸索の進行性変性を特徴とする視神経障害の不均一なグループとして理解されており、その結果、視神経の構造的カッピング(発掘)と視神経の機能低下が起こり、眼から脳への視覚情報の伝達を中断することにより、制御されていない症例で黒内障を引き起こします1.緑内障は現在、世界中で不可逆的な失明の最も一般的な原因であり、2040年には約1億1,180万人に達すると予測されており2、患者の生活の質(QOL)に深く影響し、重大な社会経済的懸念を引き起こしています3。
眼圧の上昇(IOP)は、緑内障の発症と進行にとって最も重要で唯一の修正可能な危険因子の1つです。複数のタイプの緑内障のうち、正常緊張緑内障(NTG)を除くすべての緑内障は、疾患の病歴のある時点でIOPの上昇に関連しています。眼圧を標的とし、疾患の進行を遅らせたり止めたりするための臨床的および外科的進歩にもかかわらず、患者は依然として緑内障のために視力を失います4,5。したがって、この疾患の複雑で多因子的な病態生理学を完全に理解することは、より効果的な治療法の開発、特にRGCに神経保護を提供するために不可欠です。
疾患のメカニズムを理解するためのさまざまな実験的アプローチの中で、高眼圧症(OHT)に基づく動物モデルは、ヒトの緑内障に最もよく似ています。げっ歯類モデルは、低コストで、取り扱いが容易で、遺伝子操作が可能で、寿命が短く、房水の産生や排液など、人間に匹敵する眼の解剖学的および生理学的特徴を示すため、特に有用です6,7,8,9,10,11,12,13 .現在使用されているモデルには、強膜上静脈への高張生理食塩水の注入後の線維柱帯の硬化症14、マイクロビーズ15または粘弾性物質のカメラ内注入16、渦静脈の焼灼17、アルゴンレーザー18、辺縁周囲縫合糸19による線維柱帯網膜の光凝固、および加齢性OHT(DBA/2Jマウス)のトランスジェニックモデルの使用が含まれます8.しかし、侵襲性、角膜の術後混濁、前眼部の破壊、広範な学習曲線、高価な機器、および術後IOPの変動は、現在のモデルに関連する報告された落とし穴のいくつかであり、OHTの代替モデルの開発は、これらの問題を克服するための要求となっています20,21,22。
本プロトコルは、げっ歯類の辺縁神経叢焼灼術(LPC)に基づいて、緑内障の代理としてOHTを誘発する新しい外科的処置を形式化します23。これは、簡単で再現性が高く、アクセスしやすく、非侵襲的なモデルであり、高効率でIOP上昇の変動性が低く、完全に臨床的に回復する割合が他に類を見ないため、各実験で使用される動物の数を減らしてin vivo で機能評価を行うことができます。手術技術は亜急性OHTを誘発し、数日でベースラインレベルに徐々に戻り、急性閉塞隅角緑内障で見られる高血圧発作をモデル化します。さらに、モデルにおける眼圧回復に続いて、緑内障性神経変性が持続し、これは、眼圧の適切な制御にもかかわらず、ヒト緑内障のいくつかの症例で発生するRGCの二次変性の将来の機構研究に有用である。
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Protocol
すべての手順は、Association for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の眼科および視覚研究における動物の使用に関する声明に準拠して実施され、リオデジャネイロ連邦大学健康科学センターの科学実験における動物の使用に関する倫理委員会によって承認されました(プロトコル083/17)。本研究では、生後2〜3ヶ月、体重180〜320gのリスターフード付きラットを用いた。しかし、この手順は、さまざまな年齢層のさまざまなラット株に適応させることができます。
1.高眼圧症の手術と臨床フォローアップ
- 標準的なペレット化されたガンマ線照射食品(Nuvilab® CR-1、Quimtia S / A、ブラジル)と水(トリプルフィルター、無毒の活性炭を含む)を使用して、制御された温度環境で12時間の明暗サイクル(午前6時:ライトオン/午後6時:ライトオフ)で動物を飼育します。
- 10%塩酸ケタミン3部と2%塩酸キシラジン1部からなる麻酔カクテル混合物(希釈液:滅菌水)を調製する。
- 背側皮膚を押さえて動物を静かに拘束し、体重1μL/gの混合物(ケタミン:75mg/kg;キシラジン:5mg/kg)を腹腔内投与して麻酔を誘発する。約5分後、つま先をつまむ反応を行い、適切な麻酔が行われているかどうかを確認します。
- 局所的にproxymetacaineの塩酸塩0.5%の点眼剤を点眼することによって両方の目の表面を麻酔します。.30〜60秒待ち、小さな滅菌綿棒で鼻または外側の球結膜にそっと触れて、地球の前面から残りの溶液を取り除きます。
- 角膜表面が眼圧計の先端に簡単にアクセスできるように、動物をベンチトップの腹側褥瘡位置に置くことにより、実験的および対側対照眼の両方のベースラインIOPを測定します。
- 圧平またはリバウンドハンドヘルド眼圧計のいずれかを使用します(図1A)。眼圧計の先端が角膜中央部に垂直にわずかに接触するように配置します。3〜5個の信頼できる機械生成平均を取得して平均化します。各平均は、6回の個別測定が成功すると、デバイスによって自動的に計算されます。
- リバウンド眼圧計にプローブを装填し、プローブの落下を防ぐために、デバイスの先端を上に置きながら、測定ボタンを1回押して電源を入れます。電源を入れると、ディスプレイに 00が表示され、機器が測定の準備ができていることを示します。
- 角膜から1〜4 mmの距離にプローブの先端を置いてデバイスを配置し、機器を動かさずに測定ボタンをすばやく慎重に押して測定値を取得します。成功した各測定は短いビープ音で識別され、6回後に平均がデバイスの画面に表示されます。
注:圧平眼圧計の長い経験にもかかわらず、手順全体を最適化するために、著者は、信頼性の高い眼圧測定値の取得を容易にするリバウンド眼圧計の使用を推奨しています。
- 実体顕微鏡下で動物をわずかに横方向の褥瘡の位置に置き、40倍の倍率で実験眼を検査して手術を慎重に計画します。カルメロースナトリウムまたはヒアルロン酸ナトリウムを一滴点滴点滴注入することにより、処置中に潤滑された反対側のコントロールアイを維持することを忘れないでください。
- 湾曲した鉗子の助けを借りて、辺縁部13の360°を囲む血管系を露出させるために、実験眼球を静かに前方に押し出します。もう一方の手で、低温の眼科用焼灼(1,300°F;Bovie Medical、米国)(図1B-E)。
注:前述の焼灼には、辺縁血管系に縦方向に接触する丸い先端があります。 - 角膜末梢を焼灼すると、術後に角膜混濁が起こり、網膜機能の in vivo 評価ができなくなる可能性があるため、注意が必要です。
- 強膜辺縁部に焼灼の小さな円形の痕跡が現れ、辺縁血管系が抹消され、手術された眼の瞳孔散大が外科手術の成功の兆候となるのを観察します。
注:ラットとマウスの辺縁血管系は解剖学的に類似しており13,24、使用される焼灼は穏やかな小さな先端を持っているため、このプロトコルはマウスの目にも適応することなく機能します。 - 手術後、ステップ1.5で説明したように、両眼の術後直後の眼圧を確認します。
- 眼科用酢酸プレドニゾロン (1.2 mg/mL) を滴下し、これを実験眼の前面に約 40 秒間接触させてから、抗生物質の眼科軟膏 (塩酸オキシテトラサイクリン 30 mg/g とポリミキシン B 10,000 U/g; またはシプロフロキサシン 3.5 mg/g) と交換します。処置後の痛みを防ぐために、塩酸トラマドールの筋肉内注射(単回投与、2 mg / kg)を実行します。.
- 麻酔からの動物の回復を、温熱パッドなどの暖かい環境や、適切な寝具を備えた飼育ケージ内で優先的に行ってください。呼吸パターンに注意してください。
- 非ステロイド性抗炎症薬(NSAID、例:ケトロラックトロメタモール0.5%点眼薬)と抗生物質軟膏(できれば手術直後に使用したものと同じもの)で構成される局所薬で実験眼の毎日の臨床フォローアップを実施します。
注:ステロイド性抗炎症点眼薬ではなくNSAIDの使用が推奨されます 後者はOHTを誘発する可能性があり、げっ歯類のグルココルチコイド誘発性緑内障モデルに定期的に適用されます。.- わずかな鎮静(ケタミン:18.75 mg / kg、キシラジン:1.25 mg / kg)で、生理学的概日眼圧変動によるバイアスを避けるために、その日の同じ期間に眼圧を優先的に測定します。.
- 眼科検査中に、ブドウ膜脱出に関連する菌膜、角膜線維症、強膜の薄化などのまれな臨床的間発列に注意してください。角膜浮腫、結膜浮腫、結膜充血は一般的ですが、一時的です。
- 術後7日目頃に完全な臨床的回復に注意してください。辺縁血行再建術は通常、手術後の最初の2日間に始まり、予想されるIOPがベースラインに戻ると予想されます。
2.視運動反応(OMR)分析
注:この手順では、特定のシステムを使用しました25。
- 4台のコンピューターモニターを四角形に配置し、中央にプラットフォームがあるアリーナを区切ります。モニターには、垂直方向の正弦波グレーティング(黒と白の交互のストライプ)を備えた仮想シリンダーの画像が表示され、一定の速度(12度/秒)とコントラスト(100%)でプラットフォームの周りを回転します。
- プラットホームの上にビデオカメラを設置し、実験者が動物の動きを観察できるようにします。明所視条件でテストを実行し、ソフトウェアを手動/分離モードに優先的に設定して、各眼を個別に評価します。
- 動物がプラットフォーム上で約2分間慣れるのを待ちます。赤い十字カーソルは、仮想円柱の中心を示すため、自由に動く動物の目の間のビデオフレーム上に保持します(図1G)25。
- 回転する格子によって誘発される動物の頭と首の反射的な追跡で構成されるOMRを観察します。正弦波グレーティングの方向をそれぞれ時計回りと反時計回りに回転させて、左右の視覚経路をテストします。
- 最初は、低い空間周波数(0.042サイクル/度)の刺激を提示します。次に、トラッキングの動きに気付かなくなるまで、周波数を徐々に増やします。明瞭なOMRが誘発される最も高い空間周波数は、評価された眼の閾値空間周波数に対応する。
- 試験中に動物がプラットフォームから落ちた場合は、すぐにプラットフォームに戻し、テストを再開してください。
3.パターン網膜電図(PERG)の記録
注:網膜電図は、信号処理用の特定のシステムと、波形の保存と分析のための関連ソフトウェアを使用して記録されました。
- 塩酸ケタミンと塩酸キシラジンの筋肉内注射により、動物に深く麻酔をかけます(それぞれ75 mg / kgと5 mg / kg)。深い麻酔(手術面)は、検査中の不随意筋の動きや代替の騒音源によるアーチファクトの可能性を減らします。つま先をつまむ反応を実行して、適切な麻酔を確認します。
注:言及された麻酔薬は、応答26の振幅に影響を与えない。角膜に挿入された細い針を活性電極として使用したため、ラットがブースター投与(初期投与量の1/2)を必要とする場合に再注射が容易であり、電極位置を変更する可能性が低く、実験全体を通してより再現性の高い記録につながるため、腹腔内麻酔ではなく筋肉内麻酔が好まれます。 最大60分続く場合があります。 - 局所的にproxymetacaineの塩酸塩0.5%の一滴で角膜を麻酔し、眼科用潤滑剤で湿らせた仲間の目を維持します。.
- 角膜の側頭末梢にアクティブ電極(0.25mm×15mmのステンレス鋼針)を慎重に挿入します。さらに、参照電極と接地電極(0.4mm×37mmのステンレス鋼針)を、それぞれ同側側頭歯の皮下組織と後肢の1つに挿入します(図1I)。
- PERG の場合、刺激を白黒の予約チェッカーボードに設定し、一定の平均輝度 (250 cd/m2) で 15 反転/秒で交互に繰り返します。バンドパスフィルターを1Hz〜100Hzに設定します。
注:急速な反転刺激は、RGC生体電気応答に関連する可能性が最も高い波成分(過渡状態PERGのNII偏向)を集める安定した再現性のある正弦波である定常状態PERGを生成します。 - 刺激スクリーンから20cmの位置に動物を配置します(LCDモニター0.58 m;図1I)、信号ベースラインをモニターし、アクイジションシステムのAnalysisボタンを押してPERGアクイジションを開始します。
- 処置中は、動物を環境光(~140ルクスの白色光)に適応させてください。ここでは、6つの異なる空間周波数(度あたりのサイクル数:0.018、0.037、0.073、0.146、0.292、0.585)がランダムな順序で示されました。
メモ: 信号処理に使用されるソフトウェアは、自動的に平均化を実行します。200〜300個の個々の波の平均は、ノイズから目立ち、波の振幅を分析するのに十分であると考えられました。
4. 網膜神経節細胞体細胞の定量化
注:以下の手順は、脳特異的ホメオボックス/POUドメインタンパク質3A(Brn3a)に対する抗体による網膜フラットマウントの免疫組織化学的染色に基づくRGC体体の定量化です。
- 実験動物を頸椎脱臼安楽死させ、その前に二酸化炭素を吸入して意識を失わせる。
- 安楽死後すぐに、実体顕微鏡で歯付き鉗子と湾曲したハサミを使用して両眼を解剖します。
- 外眼筋の遠位部分と心皮の両方が網膜の地形的方向にとって重要なランドマークであるため、地球に付着したままになるように慎重に解剖します(ステップ4.5で説明)。地球に付着している視神経のストレッチを、将来の分析のためにできるだけ長く保存するようにしてください。
- 摘出後、0.1 Mリン酸緩衝液(PBS)中の4%パラホルムアルデヒド(4%PFA)の1 mL溶液に眼球を入れ、適切な化学的固定のために24時間保持します。
- 網膜を他の眼組織から分離します。
- 解剖顕微鏡下で、1x PBSで覆われたペトリ皿に眼球を入れ、鼻の心細胞、脈絡膜の裂け目、渦静脈からの強膜の痕跡などの重要なランドマークに注意を払い、適切な地形方向付けを行います27。
- 角膜中央部から前房を貫通するには、歯付き鉗子と湾曲したハサミ(ウェストコット)を使用します。眼球の背側象限を区切るために、視神経の強膜孔に向かって、強膜の上(背側)側面に2つの放射状に切り込みを入れます。
- 強膜の辺縁部を縦方向に360°切り込み、角膜を地球の残りの部分から分離します。水晶体と虹彩を取り外し、上記と同じ強膜橈骨境界を使用して網膜背側象限を区切ります(ステップ4.5.2)。
- 脈絡膜と強膜から網膜組織を慎重に剥離し、組織全体のランダムな裂傷と最終的な地形的な方向感覚の喪失の両方を回避します。
- 毛様体体を網膜 大動脈から分離します。湾曲した歯のない鉗子と湾曲したはさみ(硝子体を引っ張り、内部の限界膜の近くで解剖する)と小さなブラシを使用して、網膜カップから残りの硝子体を慎重に取り除きます。
注:硝子体液の除去は、強力でクリーンな免疫組織化学的シグナルを得るための重要なステップです。
- 単離した網膜を、1 mLの1x PBSを含む24ウェル培養プレート(ウェルごとに1つの網膜)に移し、内側の網膜を上に向けています。
- 1x PBS(0.3 mL)で希釈した非イオン性界面活性剤0.5%で3回10分間洗浄し、組織を透過処理します。次に、5%ウシ血清アルブミン(BSA)含有非イオン性界面活性剤2%および1x PBS(ブロッキング溶液;0.25 mL)中で、室温で60分間、組織を静かに振とうします。
- ステップ4.7では、非イオン性界面活性剤0.5%および1x PBSと5%BSAで1:200に希釈してBrn3a一次抗体溶液を調製し、4°Cで保存します。
- 60分間の組織ブロッキング後、網膜を0.2 mLの一次抗体溶液中で4°C、72時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。
- 組織を1x PBSで10分間3回洗浄し、1x PBSと5% BSAで1:750に希釈した0.2 mLの二次抗体溶液中で、室温で2時間インキュベートします。
- さらに、組織を核対比染色液中で10分間インキュベートし、蛍光核染色を行います。1x PBS(0.3 mL)を3回繰り返した最終洗浄ステップで免疫組織化学を終了します。
- 硝子体側を上にしたまま、2つの小さなブラシを使ってガラス顕微鏡スライドに網膜を移します。網膜背側象限を顕微鏡スライド上に配置します(ステップ4.5.3で区切っています)。他の3つの象限(鼻、腹、側頭)を区切るために、視神経頭に向かってさらに2つの放射状の切り込みを入れます。
注:カット寸法は固定されていません。それらは、スライド上の網膜の効率的な平坦化を損なうほど短くはならず、視神経孔に到達し、区切られた網膜象限を残りの組織から完全に分離するように長すぎてはなりません。 - 最後に、0.2 mLの褪色防止剤をガラスカバーガラスに塗布し、これをフラットマウントされた網膜に置き、組織顕微鏡分析を行います。RGCの密度を推定するには、40倍/1.3の対物レンズを使用して共焦点落射蛍光顕微鏡でフラットマウントを調べます。
- 網膜の各象限について、中央網膜から2枚(視神経乳頭から~0.9mm)、網膜中部から3枚(視神経乳頭から~2.0mm)、末梢網膜から3枚(視神経乳頭から~3.7mm)、合計3枚の写真を網膜あたり32枚撮影します。FIJIソフトウェアを使用して、Brn3a陽性細胞をカウントし、平均細胞密度を推定します。
5.視神経の検査
- 安楽死と眼球摘出術(ステップ4.1-4.3)の後、眼内部分の一部を含む視神経の眼窩内部分(1〜2 mm)の近位セグメントを取り除き、すぐにサンプルを0.2〜0.3 mLの低温固定剤(0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)中の2.5%グルタルアルデヒド溶液)を含むバイアル/チューブに2時間入れます。
注:視神経処理の次の手順は、手順5.1と同じバイアル/チューブで実行されます - 冷たい0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で材料を3回5分間洗浄します。0.8%フェロシアン化カリウム中の1.0%四酸化オスミウムと、0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で希釈した5 nM塩化カルシウムの溶液中で、穏やかに振とう下で1時間組織を固定後、4°C(0.1〜0.2 mL)で。
- 視神経断片を冷たい0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で5分間3回洗浄し、続いて冷たい蒸留水で3回1分間洗浄します。4°C(0.1〜0.2 mL)で染色するために、蒸留水に溶かした1.0%酢酸ウラニル溶液中で材料を穏やかに振とうして一晩保管します。断片を冷たい蒸留水で3回洗浄します。
- 段階的なアセトンシリーズ(各0.5 mL)で組織を徐々に脱水し、その後、蒸留水で次の希釈液を置き換えます:15%氷冷アセトン中で2x 7分間のインキュベーション。30%氷冷アセトン中で2x 7分間のインキュベーション。50%氷冷アセトン中で2x 7分間のインキュベーション。70%氷冷アセトン中で2x 7分間インキュベーション。80%氷冷アセトン中で2x 7分間のインキュベーション。90%氷冷アセトン中で2x 7分間インキュベーション。100%アセトン中で室温(RT)で2回15分間インキュベーションします。
- 3つの浸潤/包埋ステップを実行し、その後、次の溶液を交換します:エポキシ樹脂1部:アセトン2部(総容量:0.5 mL)、室温で12時間。エポキシ樹脂1部:アセトン1部(総容量:0.5 mL)、室温で12時間;エポキシ樹脂2部:アセトン1部(総容量:0.5 mL)、室温で12時間。最後に、純粋なエポキシ樹脂に組織を室温で24時間浸潤させます。
- 試料担体からサンプルを取り出し、包埋型に移し、60°Cで48時間重合させます。 視神経片の横方向の半薄切片(300〜400nm)をウルトラミクロトームで切断し、収集して顕微鏡のスライドガラスに転写します。切片をトルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡を使用して100倍の倍率で画像化します。
- 超微細構造解析では、極薄断面(70 nm)を行い、銅グリッド上に収集し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色します。透過型電子顕微鏡で切片を調べます。
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Representative Results
量的変数は、平均±平均の標準誤差(SEM)として表されます。OHT群と対照群の眼圧動態の比較(図1F)を除き、統計解析は二元配置ANOVAとそれに続くSidakの多重比較検定を用いて行った。p値<0.05は統計的に有意であると見なされました。
図1 は、全円輪姦焼灼術(LPC)モデルの外科的手順を示しており、360°の熱による辺縁血管の消失や、手術終了時の手術眼の軽度から中等度の散瞳などの重要なランドマークがあります。
131匹のラットの現在のシリーズでは、全円輪部神経叢焼灼術(LPC)により、手術直後にベースラインで13.0 ± 0.2 mmHgから22.7 ± 0.4 mmHgまでIOP上昇が誘発されました。.術後IOPのピークは手術初日(25.3 ± 0.6 mmHg)に観察され、その後、術後6 日目にベースラインレベルに徐々に戻りました(統計分析:Holm-Sidak法を使用して多重比較を補正した複数のt検定; 図1F)。角膜線維症または浮腫は、正確な眼圧測定を損なう可能性のある臨床的併発でした。.一方、最初のものはまれであり、動物の3.92%が罹患し、術後のフォローアップ中に遅れて気付いたため、最初の5日間の高眼圧症を免れ、亜急性OHTプロファイルが維持されました23。一方、角膜浮腫は、手術後の最初の数日間(1〜3日)に見られるより一般的な合併症でしたが、ほとんどが軽度で一時的なものであったため、IOP23に強く影響しませんでした。
網膜機能は、それぞれ視運動反射とパターンERGを使用して行動学的および電気生理学的に評価されました(図1G-J)。どちらのパラメータも、術後3日目の急性期高眼圧症と術後30日目の二次変性期の2つの障害を示しました(図1H、図J、表1)。 その間に、以前に他の場所で議論したように、機能回復の期間が検出されました23。
対照群と比較して、半薄型の横視神経切片の軸索数は、手術後に漸進的な減少を示した(3日目:68.3%±0.9%、7日目:59.2%±2.6%、14日目:45.4%±2.2%、30日目:28.2%±3.0%、二元配置分散分析:p < 0.0001;図2A)。超微細構造的には、対照眼の視神経は、薄いグリア細胞突起によって分離された高密度の有髄線維と、明らかな軸索微小管およびニューロフィラメントを示しました(図2B)。対照的に、OHTの3日後には、軸索束の焦点破壊、いくつかの変性線維、グリア細胞プロセスにおける細胞質空胞化、およびグリア細胞核におけるクロマチンの凝縮が見られました。OHT誘導の7日後、変性軸索線維、肥大型グリア細胞突起、および個々の軸索線維の腫れと空隙が増加しました。14日目に最も顕著な変化の1つは、軸索間のグリア細胞突起の侵入に関連する視神経線維のより大きな転位であった。フィラメントの束はこれらのプロセスと暗い変性繊維を満たし、ミエリンの分解はより一般的であり、剥離および空胞化したラメラに関連していました(図2B)。
Brn3a+プロファイルの密度は、主に背側および側頭網膜象限において、時間とともに減少し(図2C)、30日後にそれぞれ32.4%±9.6%および35.7%±9.1%に低下した(図2D-Gおよび表2)。
図1:辺縁血管神経叢の熱焼灼とin vivoでの網膜機能への影響。 (A)ラットの眼圧を測定する代替方法:リバウンド眼圧測定法(上)、および圧平眼圧測定法(下)。(B-E)手術;矢じり:辺縁血管神経叢;矢印:眼球の前面を露出させ、辺縁血管への外科的評価を最適化するために使用される湾曲した鉗子。ハッシュ:低温眼焼灼の丸い先端。アスタリスク:焼灼マーク。スケールバー:2mm。(D)の挿入図は、焼灼する辺縁血管系を高倍率で示しています。(F)OHT(赤)および対照(黒)眼(n = 131)における眼圧測定の経時変化。縦向きの下向き矢印:LPC手術。* = p < 0.05 (G) 視運動反応解析用のアリーナで、四角形に配置された4台のコンピュータモニターで構成され、中央にプラットフォームがあります。モニターには、黒と白の縦縞が交互に描かれた仮想の円柱が、一定の回転速度と可変の空間周波数で動物の周りを動き回っている様子が映し出されます。赤い十字線は、仮想円柱の中心に対応します。(H)視運動反応。外科的フォローアップでは、OHT期(0〜5日)と二次変性期(6〜30日)の2つの異なる段階が区別されます。= p < 0.0001 です。(I)パターンERG(PERG)取得のための電極と動物の位置決め:角膜の側頭末梢にあるアクティブ電極、および同側側頭歯と後肢の1つの皮下組織への参照電極と接地電極。動物は刺激スクリーンから20cmの位置にあります。(J) 空間周波数の異なる刺激に対するPERG振幅。視運動反応と同様に、PERG評価は、術後3日目の高眼圧症、7日目と14日目の回復、および術後30日目のその後の減少という、手術後の反応の2つの異なる段階も示しています。c/d = サイクル/度。ナイーブグループ:以前の実験操作にさらされたことのない動物の目。(H)および(J)は、SEM±の平均値と(H)の個々の反復数を示しています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:低温眼科焼灼による辺縁血管神経叢焼灼術(LPC)後の網膜と視神経の構造評価。 (A)軸索は、OHT後の異なる時間にカウントされます(n = 3)。= p = 0.0005、**** = p < 0.0001。(B)OHT後の視神経変性の電子顕微鏡写真。左の画像は対照視神経を示し、次の画像はOHTの3、7、および14日後の進行性の変性を示しています。矢じり:正常な有髄線維;細い矢印:変性繊維;アスタリスク:細胞質空胞化;ハッシュ:グリア細胞プロセス;そしてNu:グリア細胞核。(C)Brn3aに対する抗体で標識されたRGCの代表的な計数野の顕微鏡写真(赤)およびTO-PRO3標識核(青)。スケールバー:50μm。 (D-G)手術の3〜30日後の網膜の4象限における平均Brn3a +細胞密度の分布。グラフは、処置後の1時間あたり3〜11匹の動物のRGC密度の個々の平均を示しています。* = p < 0.05;** = p < 0.01;= p < 0.001;= p < 0.0001 です。定量的データはSEM±平均値です。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
表1:PERGデータの統計分析。 二元配置分散分析とそれに続く Sidak の多重比較検定。0.05未満の p値は統計的に有意であると見なされました。c/d = サイクル/度。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:LPC後のRGCの局所的な損失。 SEM:平均の標準誤差。コントロール:仲間の目。0.05未満の p値は統計的に有意であると見なされました(*)。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
辺縁神経叢焼灼術(LPC)は、結膜やほぞの解剖を必要としない、簡単にアクセスできる血管構造を標的にするという利点を備えた新しい海綿後モデルです17,28。脈絡膜静脈ドレナージの外科的障害に基づく有名なOHTモデルである渦静脈焼灼モデルとは異なり、静脈うっ血はLPCモデルでは、静脈静脈が房水流出の上流に位置するため、IOPの上昇に影響を与えると予想されます。また、技術的に習得が容易で低コストであるため、主に低温の熱焼灼が必要です。さらに、OHT誘導と完全な臨床的回復率(以前に報告されたように>90%)23と関連しており、実験に必要な動物の数を減らし、電気生理学的および行動学的分析の両方を可能にします。最後に、緑内障性変性は、手術後の比較的短い時間枠でRGC層と視神経の両方に存在し、短期または中期の実験計画を可能にします23。個々の網膜層に対する全円輪状血管系焼灼の影響をさらに解明するには、今後の研究が必要です。
外科的プロトコルの重要なステップは次のとおりです:(1)焼灼の先端は、血管軸に平行な強膜辺縁部に穏やかに触れる必要があります。(2)角膜組織は、焼灼中だけでなく、動物操作中も温存する必要があります。定期的に点眼薬を点眼し、綿棒で目の表面から余分な溶液を除去します(角膜上皮の擦過傷や最終的な手術後の合併症につながるため、液体を除去しながら角膜表面の綿棒をこすらないように注意してください)。(3)連続した焼灼マークの全円を視覚化する必要があります。(4)少なくとも手術後5日目までは 、非ステロイド性抗炎症薬と抗生物質軟膏による術後の臨床フォローアップを怠らないでください。
記載されたモデルで見られる亜急性眼圧の上昇は、開放隅角緑内障の圧力動態とは異なるが、急性閉塞隅角緑内障、血管新生緑内障、または強膜上静脈圧の上昇を伴う複数のタイプの線維柱柱後緑内障に類似している29。開放隅角緑内障は、慢性OHTとゆっくりと進行するRGC変性を特徴とする疾患の最も一般的な表現型であるため、これはこの方法の大きな制限です。それにもかかわらず、眼圧の漸進的正常化と継続的なRGC変性との関連は、同じ動物モデルで、高眼圧症と緑内障の発症および進行を結びつける生物学的メカニズムと、主に開放隅角緑内障の症例で観察される二次変性プロセスの両方を研究するユニークな機会を表しています 目標は、臨床的または外科的成功にもかかわらず緑内障が進行します 目標眼圧30.したがって、このモデルは、短期または中期の実験計画を通じてこの現象をよりよく解明し、最終的には圧力に依存しない神経保護療法を開発する機会を表しています 最良のIOP制御治療にもかかわらず、まだ視力を失っている患者に利益をもたらします。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
私たちは、検査技師のホセを認めます。ニルソン・ドス・サントス、ダイアン・マンダリーノ・トーレス、ホセ・フランシスコ・ティブルシオ、ジルド・ブリト・デ・ソウザ、ルチアーノ・カヴァルカンテ・フェレイラ。この研究は、FAPERJ、CNPq、およびCAPESから資金提供を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Isofar | 201 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Active electrode for electroretinography | Hansol Medical Co | - | Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm |
| Anestalcon | Novartis Biociências S/A | MS-1.0068.1087 | Proxymetacaine hydrochloride 0.5% |
| Calcium chloride | Vetec | 560 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx | Bovie Medical Corporation | AA00 | Low-temperature ophthalmic cautery |
| Cetamin | Syntec do Brasil Ltda | 000200-3-000003 | Ketamine hydrochloride 10% |
| DAKO | Dako North America | S3023 | Antifade mounting medium |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 28718-90-3 | diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm |
| Ecofilm | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0487 | Carmellose sodium 0.5% |
| EPON Resin | Polysciences, Inc. | - | Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553) |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16110 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Hyabak | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-8042140002 | Sodium hyaluronate 0.15% |
| Icare Tonolab | Icare Finland Oy | TV02 (model number) | Rebound handheld tonometer |
| IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Secondary antibody solution |
| LCD monitor 23 inches | Samsung Electronics Co. Ltd. | S23B550 | Model LS23B550, for electroretinogram recording |
| LSM 510 Meta | Carl Zeiss | - | Confocal epifluorescence microscope |
| Maxiflox | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0489 | Ciprofloxacin 3.5 mg/g |
| MEB-9400K | Nihon Kohden Corporation | - | System for electroretinogram recording |
| monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a | MilliporeSigma | MAB-1585 | Brn3a primary antibody solution |
| Neuropack Manager v08.33 | Nihon Kohden Corporation | - | Software for electroretinogram signal processing |
| Optomotry | CerebralMechanics | - | System for optomotor response analysis |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Potassium ferrocyanide | Electron Microscopy Sciences | 20150 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Reference and ground electrodes for electroretinography | Chalgren Enterprises | 110-63 | Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm |
| Sodium cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Ster MD | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-1.0497.1287 | Prednisolone acetate 0.12% |
| Terolac | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0497.1286 | Ketorolac trometamol 0.5% |
| Terramicina | Laboratórios Pfizer Ltda | MS-1.0216.0024 | Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g |
| Tono-Pen XL | Reichert Technologies | 230635 | Digital applanation handheld tonometer |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher Scientific | T3605 | Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Non-ionic surfactant |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Xilazin | Syntec do Brasil Ltda | 7899 | Xylazine hydrochloride 2% |
| Carl Zeiss | - | Stereo microscope for surgery and retinal dissection |
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