Summary
El objetivo de este protocolo es caracterizar un nuevo modelo de neurodegeneración glaucomatosa basado en la cauterización térmica de 360° del plexo vascular limbal, induciendo hipertensión ocular subaguda.
Abstract
El glaucoma, la segunda causa de ceguera en todo el mundo, es un grupo heterogéneo de trastornos oculares caracterizados por daño estructural en el nervio óptico y la degeneración de las células ganglionares de la retina (RGC), lo que resulta en una disfunción visual al interrumpir la transmisión de información visual del ojo al cerebro. La presión intraocular elevada es el factor de riesgo más importante; Por lo tanto, se han desarrollado varios modelos de hipertensión ocular en roedores mediante enfoques genéticos o experimentales para investigar las causas y los efectos de la enfermedad. Entre ellas, se han descrito algunas limitaciones, como la invasividad quirúrgica, la evaluación funcional inadecuada, la necesidad de un entrenamiento extenso y la extensión muy variable del daño retiniano. El presente trabajo caracteriza un método simple, de bajo costo y eficiente para inducir hipertensión ocular en roedores, basado en la cauterización a baja temperatura y de círculo completo del plexo vascular limbal, un componente importante del drenaje acuoso del humor. El nuevo modelo proporciona una hipertensión ocular subaguda técnicamente fácil, no invasiva y reproducible, asociada a RGC progresiva y degeneración del nervio óptico, y una tasa de recuperación clínica postoperatoria única que permite estudios funcionales in vivo por métodos electrofisiológicos y conductuales.
Introduction
La literatura médica entiende el glaucoma como un grupo heterogéneo de neuropatías ópticas caracterizadas por la degeneración progresiva de las células ganglionares de la retina (CGR), dendritas, soma y axones, lo que resulta en ahuecamiento estructural (excavación) del disco óptico y deterioro funcional del nervio óptico, lo que conduce a amaurosis en casos no controlados al interrumpir la transmisión de información visual desde el ojo al cerebro1. El glaucoma es actualmente la causa más común de ceguera irreversible en todo el mundo, y se prevé que llegue a aproximadamente 111,8 millones de personas en 20402, lo que afectará profundamente la calidad de vida (CV) de los pacientes y generará importantes problemas socioeconómicos3.
La presión intraocular (PIO) elevada es uno de los factores de riesgo más importantes y el único modificable para el desarrollo y progresión del glaucoma. Entre los múltiples tipos de glaucoma, todos, excepto el glaucoma de tensión normal (NTG), se asocian con una PIO elevada en algún momento de la historia clínica de la enfermedad. A pesar de los notables avances clínicos y quirúrgicos para atacar la PIO y ralentizar o detener la progresión de la enfermedad, los pacientes siguen perdiendo la visión debido al glaucoma 4,5. Por lo tanto, un conocimiento profundo de la fisiopatología compleja y multifactorial de esta enfermedad es imperativo para el desarrollo de tratamientos más efectivos, especialmente para proporcionar neuroprotección a los CGR.
Entre una variedad de enfoques experimentales para la comprensión de los mecanismos de la enfermedad, los modelos animales basados en la hipertensión ocular (OHT) se parecen más al glaucoma humano. Los modelos de roedores son particularmente útiles ya que son de bajo costo, son fáciles de manejar, pueden ser manipulados genéticamente, tienen una vida útil corta y presentan características anatómicas y fisiológicas oculares comparables a las humanas, como la producción de humor acuoso y el drenaje 6,7,8,9,10,11,12,13 . Los modelos utilizados actualmente incluyen la esclerosis de la malla trabecular después de la inyección de solución salina hipertónica en las venas epiesclerales 14, la inyección intracameral de microperlas 15 o sustancias viscoelásticas 16, la cauterización de las venas del vórtice 17, la fotocoagulación de la malla trabecular con láser de argón 18, la sutura circumlimbal 19 y el uso de un modelo transgénico de OHT relacionado con la edad (ratones DBA/2J)8. Sin embargo, la invasividad, la opacificación postoperatoria de la córnea, la disrupción del segmento anterior, las extensas curvas de aprendizaje, el costoso equipamiento y las PIO postoperatorias altamente variables, son algunos de los escollos reportados asociados a los modelos actuales, lo que hace que el desarrollo de un modelo alternativo de THO sea una demanda para superar estos problemas20,21,22.
El presente protocolo formaliza un novedoso procedimiento quirúrgico para inducir THO como proxy del glaucoma, basado en la cauterización del plexo limbal (LPC) en roedores23. Se trata de un modelo fácil, reproducible, accesible y no invasivo que proporciona una alta eficiencia y una baja variabilidad de la elevación de la PIO, asociada a una tasa excepcionalmente alta de recuperación clínica completa, por lo que proporciona una evaluación funcional in vivo en un número reducido de animales utilizados en cada experimento. La técnica quirúrgica induce la OHT subaguda con un retorno gradual a los niveles basales en pocos días, lo que modela el ataque hipertensivo observado en el glaucoma agudo de ángulo cerrado. Además, la recuperación de la PIO en el modelo va seguida de una neurodegeneración glaucomatosa continua, lo que es útil para futuros estudios mecanicistas de la degeneración secundaria de las CGR, que se produce en varios casos de glaucoma humano a pesar de un control adecuado de la PIO.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo con la Declaración para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y Visual de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) y aprobados por el Comité de Ética en el Uso de Animales en la Experimentación Científica del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Federal de Río de Janeiro (protocolo 083/17). En el presente trabajo se utilizaron ratas Lister Hooded de ambos sexos, de 2-3 meses de edad y con un peso de 180-320 g. Sin embargo, el procedimiento se puede adaptar en diferentes cepas de ratas de varios rangos de edad.
1. Cirugía de hipertensión ocular y seguimiento clínico
- Alojar a los animales en un ambiente de temperatura controlada y ciclo de luz/oscuridad de 12 h (6 am: luz encendida / 6 pm: luz apagada) con alimento estándar peletizado irradiado con rayos gamma (Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, Brasil) y agua (triple filtro, con carbón activado no tóxico) disponible ad libitum.
- Prepare una mezcla de cóctel anestésico de caldo compuesta por tres partes de clorhidrato de ketamina al 10% y una parte de clorhidrato de xilacina al 2% (diluyente: agua estéril).
- Sujetar suavemente al animal sujetando la piel dorsal e inducir la anestesia mediante la administración intraperitoneal de 1 μL/g de peso corporal de la mezcla (ketamina: 75 mg/kg; xilacina: 5 mg/kg). Verifique que la anestesia sea adecuada después de aproximadamente 5 minutos realizando una respuesta de pellizco con los dedos de los pies.
- Anestesiar tópicamente ambas superficies oculares mediante la instilación de gotas oftálmicas de clorhidrato de proxymetacaína al 0,5%. Espere 30-60 s y retire la solución restante de la cara anterior del globo, tocando suavemente la conjuntiva bular nasal o lateral con un pequeño hisopo de algodón estéril.
- Mida la PIO basal de los ojos de control experimentales y contralaterales colocando al animal en una posición de decúbito ventral en la mesa de trabajo, de modo que la superficie de la córnea sea fácilmente accesible hasta la punta del tonómetro.
- Utilice un tonómetro de mano de aplanación o de rebote (Figura 1A). Coloque la punta del tonómetro de manera que toque ligeramente la zona corneal central perpendicularmente. Adquiera y promedie de 3 a 5 promedios confiables generados por máquinas. Cada media es calculada automáticamente por el dispositivo después de seis mediciones individuales exitosas.
- Cargue el tonómetro de rebote con una sonda y presione el botón de medición una vez para encenderlo, mientras coloca la punta del dispositivo hacia arriba, para evitar que la sonda se caiga. Después de encenderse, la pantalla mostrará 00 indicando que el equipo está listo para medir.
- Coloque el dispositivo con la punta de la sonda a una distancia de 1-4 mm de la córnea y adquiera las medidas presionando rápida y cuidadosamente el botón de medición, sin mover el equipo. Cada medida exitosa se identifica con un pitido corto y, después de seis veces, la media se muestra en la pantalla del dispositivo.
NOTA: A pesar de una larga experiencia con el tonómetro de aplanación, para optimizar todo el procedimiento, los autores recomiendan el uso de un tonómetro de rebote, que proporciona una adquisición más fácil de una medición confiable de la PIO.
- Coloque al animal en una ligera posición de decúbito lateral bajo un microscopio estereoscópico y planifique cuidadosamente la cirugía inspeccionando el ojo experimental con un aumento de 40x. No olvide mantener lubricado el ojo de control contralateral durante el procedimiento instilando una gota de carmelosa sódica o hialuronato de sodio.
- Con la ayuda de pinzas curvas, empuje suavemente hacia adelante el globo ocular experimental para exponer la vasculatura que rodea 360° del limbo13. Con la otra mano, cauterice suavemente los vasos alrededor de la córnea con una cauterización oftálmica a baja temperatura (1,300 °F; Bovie Medical, EE.UU.) (Figura 1B-E).
NOTA: El mencionado cauterio tiene una punta redonda que debe tocar la vasculatura limbal longitudinalmente. - Tenga cuidado de no cauterizar la periferia corneal, ya que esto puede resultar en una opacificación corneal postoperatoria, lo que impide la evaluación in vivo de la función retiniana.
- Observe la aparición de pequeñas marcas circulares de cauterización en el limbo escleral, la obliteración de la vasculatura limbal y la dilatación de la pupila en el ojo operado, que son signos de un procedimiento quirúrgico exitoso.
NOTA: Como la vasculatura limbal de ratas y ratones es anatómicamente similar13,24 y la cauterización utilizada tiene una punta pequeña y suave, este protocolo también puede funcionar para el ojo del ratón sin ninguna adaptación. - Después de la cirugía, compruebe la PIO postoperatoria inmediata en ambos ojos, tal y como se describe en el paso 1.5.
- Aplicar una gota de acetato de prednisolona oftálmica (1,2 mg/ml) y mantenerla en contacto con la superficie anterior del ojo experimental durante unos 40 s, sustituirla por una pomada oftálmica de antibióticos (clorhidrato de oxitetraciclina 30 mg/g más polimixina B 10.000 U/g; o ciprofloxacina 3,5 mg/g). Realizar una inyección intramuscular de clorhidrato de tramadol (dosis única; 2 mg/kg) para prevenir el dolor después del procedimiento.
- Siga de cerca la recuperación del animal de la anestesia, preferiblemente en un ambiente cálido como una almohadilla térmica o dentro de su jaula de alojamiento con ropa de cama adecuada. Presta atención al patrón respiratorio.
- Realizar un seguimiento clínico diario del ojo experimental con medicamentos tópicos compuestos por un antiinflamatorio no esteroideo (AINE, p. ej., ketorolaco trometamol colirio al 0,5%) y pomada antibiótica (preferiblemente la misma que se utiliza inmediatamente después de la cirugía).
NOTA: Se recomienda el uso de AINE en lugar de colirios antiinflamatorios esteroideos porque este último puede inducir OHT y se aplica regularmente para modelos de glaucoma inducido por glucocorticoides en roedores.- Bajo una ligera sedación (ketamina: 18,75 mg/kg; xilacina: 1,25 mg/kg), medir la PIO preferentemente en el mismo período del día, para evitar sesgos debidos a la fluctuación fisiológica circadiana de la PIO.
- Durante el examen ocular, observe intercurrencias clínicas raras, como hifema, fibrosis corneal o adelgazamiento escleral asociado con prolapso uveal. El edema corneal, la quimosis y la hiperemia conjuntival son frecuentes pero temporales.
- Observe la recuperación clínica completa alrededor del día 7 del postoperatorio. La revascularización limbal suele comenzar en los dos primeros días después de la cirugía, de acuerdo con el retorno gradual esperado de la PIO al valor basal.
2. Análisis de la respuesta optomotora (RMO)
NOTA: Para este procedimiento se utilizó un sistema específico25.
- Coloque cuatro monitores de computadora en un cuadrilátero, que delimitan una arena con una plataforma en el medio. En los monitores, se muestra la imagen de un cilindro virtual con rejillas de onda sinusoidal orientadas verticalmente (franjas alternas en blanco y negro), que giran alrededor de la plataforma a una velocidad fija (12 grados/s) y contraste (100%).
- Coloque una cámara de video sobre la plataforma, lo que permitirá al experimentador observar los movimientos del animal. Realice la prueba en condiciones fotópicas y configure el software preferentemente en modo manual/separado para evaluar cada ojo por separado.
- Permita que los animales se habitúen durante aproximadamente 2 minutos en la plataforma. Mantenga el cursor rojo en forma de cruz en el fotograma de vídeo entre los ojos del animal que se mueve libremente, ya que indica el centro del cilindro virtual (Figura 1G)25.
- Observe el OMR, que consiste en un seguimiento reflejo de la cabeza y el cuello del animal provocado por las rejillas giratorias. Pruebe las vías visuales izquierda y derecha girando las direcciones de las rejillas de onda sinusoidal en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj, respectivamente.
- Inicialmente presentan un estímulo con baja frecuencia espacial (0,042 ciclos/grado). Luego, incremente la frecuencia progresivamente hasta que ya no se note el movimiento de seguimiento. La frecuencia espacial más alta en la que se obtiene un OMR claro corresponde a la frecuencia espacial umbral del ojo evaluado.
- Si el animal finalmente se cae de la plataforma durante el examen, devuélvalo inmediatamente a la plataforma y reanude la prueba.
3. Registro de patrón-electrorretinograma (PERG)
NOTA: El electrorretinograma se registró utilizando un sistema específico para el procesamiento de señales y un software relacionado para el almacenamiento y análisis de las formas de onda.
- Anestesiar profundamente a los animales mediante inyección intramuscular de clorhidrato de ketamina y clorhidrato de xilacina (75 mg/kg y 5 mg/kg, respectivamente). La anestesia profunda (plano quirúrgico) disminuye las posibilidades de artefactos por movimientos musculares involuntarios o fuentes alternativas de ruido durante el examen. Verifique que la anestesia sea adecuada realizando una respuesta de pellizco con los dedos de los pies.
NOTA: Los agentes anestésicos mencionados no afectan la amplitud de la respuesta26. Como se utilizó una pequeña aguja insertada en la córnea como electrodo activo, se prefiere la anestesia intramuscular en lugar de la intraperitoneal, ya que es más fácil de reinyectar en caso de que la rata necesite una dosis de refuerzo (1/2 de la dosis inicial), con menos posibilidades de modificar la posición del electrodo y, por lo tanto, dando lugar a registros más reproducibles durante todo el experimento. que puede durar hasta 60 min. - Anestesiar tópicamente la córnea con una gota de clorhidrato de proximetacaína al 0,5% y mantener el ojo humedecido con lubricantes oftálmicos.
- Inserte con cuidado el electrodo activo (aguja de acero inoxidable de 0,25 mm × 15 mm) en la periferia temporal de la córnea. Además, inserte los electrodos de referencia y de tierra (aguja de acero inoxidable 0,4 mm × 37 mm) en el tejido subcutáneo del canto temporal ipsilateral y en una de las extremidades posteriores, respectivamente (Figura 1I).
- Para PERG, ajuste el estímulo a un tablero de ajedrez de reserva en blanco y negro, alternando a 15 inversiones/s con luminancia media constante (250 cd/m2). Ajuste el filtro de paso de banda a 1 Hz-100 Hz.
NOTA: El estímulo de inversión rápida genera el ERG en estado estacionario, una sinusoide estable y reproducible que reúne el componente de onda más probablemente asociado con la respuesta bioeléctrica de RGC: la desviación NII del ERGG en estado transitorio. - Coloque al animal a 20 cm de la pantalla de estímulo (monitor LCD de 0,58 m; Figura 1I), monitoree la línea de base de la señal e inicie la adquisición de PERG presionando el botón Análisis en el sistema de adquisición.
- Durante el procedimiento, mantenga a los animales adaptados a la luz ambiental (luz blanca de ~140 lux). Aquí, se presentaron seis frecuencias espaciales distintas (en ciclos por grado: 0.018, 0.037, 0.073, 0.146, 0.292, 0.585) en secuencia aleatoria.
NOTA: El software utilizado para el procesamiento de señales realiza automáticamente el promedio. El promedio de 200-300 ondas individuales se consideró adecuado para destacar entre el ruido y analizar la amplitud de las ondas.
4. Cuantificación de somas de células ganglionares de la retina
NOTA: El siguiente procedimiento es para la cuantificación de somas RGC, basado en la tinción inmunohistoquímica de los montajes planos de la retina con un anticuerpo contra la proteína 3A (Brn3a) específica del dominio homeobox/POU específica del cerebro.
- Someter a los animales de experimentación a la eutanasia por dislocación cervical, precedida de inhalación de dióxido de carbono para inducir la inconsciencia.
- Inmediatamente después de la eutanasia, diseccionar ambos ojos bajo un microscopio estereoscópico, usando pinzas dentadas y tijeras curvas.
- Realice una disección cuidadosa de modo que tanto la porción distal de los músculos extraoculares como la carúncula permanezcan unidas al globo, ya que son puntos de referencia importantes para la orientación topográfica de la retina (descrita en el paso 4.5). Trate de guardar un tramo del nervio óptico unido al globo terráqueo el mayor tiempo posible para futuros análisis.
- Después de la enucleación, colocar los ojos en una solución de 1 ml de paraformaldehído al 4% (PFA al 4%) en tampón fosfato (PBS) 0,1 M y mantenerla durante 24 h para una correcta fijación química.
- Separar la retina del resto de los tejidos oculares.
- Bajo un microscopio de disección, coloque el globo ocular en una placa de Petri cubierta con 1x PBS, y preste atención a los puntos de referencia importantes como la carúncula nasal, las fisuras coroideas y las huellas esclerales de las venas del vórtice para una orientación topográfica adecuada27.
- Penetrar la cámara anterior desde la córnea central mediante el uso de pinzas dentadas y tijeras curvas (westcott). Hacer dos cortes radiales en la cara superior (dorsal) de la esclerótica, hacia el agujero escleral del nervio óptico, para delimitar el cuadrante dorsal del globo ocular.
- Separe la córnea del resto del globo a través de un corte longitudinal de 360° en el limbo escleral. Retire el cristalino y el iris y delimite el cuadrante dorsal de la retina utilizando las mismas demarcaciones radiales esclerales descritas anteriormente (paso 4.5.2).
- Separe cuidadosamente el tejido de la retina de la coroides y la esclerótica, evitando laceraciones aleatorias en todo el tejido y una eventual pérdida topográfica de orientación.
- Separar el cuerpo ciliar de la retina o serrata. Retire con cuidado el cuerpo vítreo restante de la copa de la retina utilizando tanto pinzas curvas no dentadas como unas tijeras curvas (tire del vítreo y diseccione cerca de la membrana limitante interna) y un cepillo pequeño.
NOTA: La eliminación del humor vítreo es un paso importante para obtener una señal inmunohistoquímica fuerte y limpia.
- Transfiera las retinas aisladas a una placa de cultivo de 24 pocillos (una retina por pocillo) que contenga 1 ml de 1x PBS y mantenga la retina interna hacia arriba.
- Permeabilizar el tejido lavando 3 veces durante 10 min con un tensioactivo no iónico al 0,5% diluido en 1x PBS (0,3 mL). A continuación, mantener el tejido agitando suavemente en albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en tensioactivo no iónico al 2% y 1x PBS (solución bloqueante; 0,25 ml) durante 60 min a temperatura ambiente.
- Durante el paso 4.7, prepare la solución de anticuerpos primarios Brn3a diluyendo 1:200 en tensioactivo no iónico al 0,5 % y 1 PBS más 5 % de BSA, y guárdela a 4 °C.
- Después de 60 min de bloqueo tisular, incubar las retinas en 0,2 mL de solución primaria de anticuerpos a 4 °C durante 72 h con una suave agitación.
- Lavar el tejido 3 veces durante 10 min con 1x PBS, luego incubar el tejido durante 2 h a temperatura ambiente en 0,2 mL de la solución de anticuerpos secundarios diluida 1:750 en 1x PBS más 5% BSA.
- Además, incubar el tejido durante 10 minutos en una solución de contratinción nuclear para la tinción de núcleos fluorescentes. Concluya la inmunohistoquímica con un paso de lavado final con 1x PBS (0,3 mL) repetido 3x.
- Transfiera las retinas con la ayuda de dos pequeños cepillos a portaobjetos de microscopio de vidrio, manteniendo el lado vítreo hacia arriba. Coloque el cuadrante dorsal de la retina hacia arriba en los portaobjetos del microscopio (previamente delimitados en el paso 4.5.3). Realiza dos cortes radiales más hacia la cabeza del nervio óptico para delimitar los otros 3 cuadrantes (nasal, ventral y temporal).
NOTA: Las dimensiones de corte no son fijas. No deben ser demasiado cortas que perjudiquen un aplanamiento eficiente de la retina en el portaobjetos y no deben ser demasiado largas para que llegue al agujero del nervio óptico y separe completamente el cuadrante retiniano delimitado del resto del tejido. - Por último, aplique 0,2 ml de medio de montaje antidecoloración en un cubreobjetos de vidrio y colóquelo en la retina de montaje plano para su análisis microscópico de tejidos. Para estimar la densidad de las CGR, examine las monturas planas bajo un microscopio de epifluorescencia confocal utilizando un objetivo de 40x/1,3.
- Para cada cuadrante de la retina, tome ocho fotos: dos de la retina central (~0,9 mm del disco óptico), tres de la retina media (~2,0 mm del disco óptico) y tres de la retina periférica (~3,7 mm del disco óptico), lo que hace un total de 32 fotos por retina. Utilice el software FIJI para contar las células positivas para Brn3a y estimar la densidad media de células.
5. Examen del nervio óptico
- Después de la eutanasia y la enucleación del globo ocular (pasos 4.1-4.3), extraer el segmento proximal de la porción intraorbitaria del nervio óptico (1-2 mm), incluyendo parte de la porción intraocular, y colocar inmediatamente las muestras en viales/tubos que contengan 0,2-0,3 mL de fijador frío (solución de glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,4)) durante 2 h.
NOTA: Los siguientes pasos para el procesamiento del nervio óptico se realizan en los mismos viales/tubos del paso 5.1 - Lave el material 3 veces durante 5 minutos con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M frío. Tejido post-fijación durante 1 h bajo agitación suave en una solución de tetróxido de osmio al 1,0% en ferrocianuro potásico al 0,8% y cloruro cálcico 5 nM diluido en tampón cacodilato de sodio 0,1 M a 4 °C (0,1-0,2 mL).
- Lavar los fragmentos del nervio óptico 3 veces durante 5 min con tampón de cacodilato de sodio frío 0,1 M y posteriormente con agua destilada fría, 3 veces durante 1 min. Mantener el material durante la noche bajo agitación suave en una solución de acetato de uranilo al 1,0% en agua destilada para teñir a 4 °C (0,1-0,2 ml). Lave los fragmentos 3 veces con agua destilada fría.
- Deshidratar progresivamente el tejido con una serie de acetonas graduadas (0,5 ml cada una), con sustituciones posteriores de las siguientes diluciones en agua destilada: 2 incubaciones de 7 min en acetona helada al 15%; 2 incubaciones de 7 min en acetona helada al 30%; 2 incubaciones de 7 minutos en acetona helada al 50%; 2 incubaciones de 7 min en acetona helada al 70%; 2 incubaciones de 7 min en acetona helada al 80%; 2 incubaciones de 7 minutos en acetona helada al 90%; 2 incubaciones de 15 min en acetona al 100% a temperatura ambiente (RT).
- Realizar 3 pasos de infiltración/incrustación, con posterior sustitución de las siguientes soluciones: 1 parte de resina epoxi: 2 partes de acetona (volumen total: 0,5 mL), a RT durante 12 h; 1 parte de resina epoxi: 1 parte de acetona (volumen total: 0,5 mL), a RT durante 12 h; 2 partes de resina epoxi: 1 parte de acetona (volumen total: 0,5 mL), a RT durante 12 h. Finalmente, infiltrar el tejido en resina epoxi pura a RT durante 24 h.
- Retire las muestras del portamuestras, transfiéralas a moldes de inclusión y déjelas polimerizar durante 48 h a 60 °C. Corte secciones transversales semifinas (300-400 nm) de los fragmentos del nervio óptico con un ultramicrótomo, recójalos y transfiéralos a un portaobjetos de vidrio de microscopio. Tiñe las secciones con azul de toluidina y toma imágenes de ellas con un microscopio óptico con un aumento de 100x.
- Para el análisis ultraestructural, realice secciones transversales ultrafinas (70 nm), recolóquelas en rejillas de cobre y tíñalas con acetato de uranilo y citrato de plomo. Examine las secciones en un microscopio electrónico de transmisión.
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Representative Results
Las variables cuantitativas se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). A excepción de la comparación de la dinámica de la PIO entre los grupos OHT y control (Figura 1F), el análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
La Figura 1 ilustra los pasos quirúrgicos del modelo de cauterización del plexo limbal (LPC) de círculo completo, con hitos importantes como la desaparición de los vasos limbales inducida térmicamente en 360°, así como la midriasis leve a moderada en el ojo operado al final del procedimiento.
En la presente serie de 131 ratas, la cauterización del plexo limbal (LPC) de círculo completo indujo una elevación de la PIO inmediatamente después de la cirugía de 13,0 ± 0,2 mmHg al inicio del estudio a 22,7 ± 0,4 mmHg. El pico de PIO postoperatoria se observó el primer día después de la cirugía (25,3 ± 0,6 mmHg), seguido de un retorno gradual a los niveles basales al6º día postoperatorio (análisis estadístico: prueba t múltiple corregida para comparaciones múltiples mediante el método de Holm-Sidak; Figura 1F). La fibrosis corneal o el edema eran intercurrencias clínicas que podían comprometer la medición precisa de la PIO. La primera, por un lado, fue rara, afectando al 3,92% de los animales y detectada tardíamente durante el seguimiento postoperatorio, evitando así los primeros 5 días de hipertensión ocular y conservando el perfil de HTO subagudo descrito23. El edema corneal, por otro lado, fue una complicación más común observada durante los primeros días después de la cirugía (1-3 días), pero en su mayoría leve y temporal, por lo que no afectó de manera robusta a la PIO23.
La función retiniana se evaluó tanto conductual como electrofisiológicamente mediante el reflejo optomotor y el patrón-ERG, respectivamente (Figura 1G-J). Ambos parámetros mostraron dos fases de deterioro: una fase aguda de hipertensión ocular al3º día postoperatorio y una fase de degeneración secundaria a los 30 días postoperatorios (Figura 1H, Figura J y Tabla 1). En el medio, se detectó un período de recuperación funcional, como se discutió anteriormente en otro lugar23.
En comparación con los nervios ópticos control, los recuentos axonales en cortes transversales semifinos del nervio óptico mostraron una disminución progresiva después de la cirugía (3º día: 68,3% ± 0,9%; 7º día: 59,2% ± 2,6%; 14º día: 45,4% ± 2,2%; 30º día: 28,2 % ± 3,0%; ANOVA de dos vías: p < 0,0001; Figura 2A). Ultraestructuralmente, los nervios ópticos de los ojos de control presentaban fibras mielinizadas densamente empaquetadas, separadas por procesos de células gliales delgadas, y microtúbulos axonales y neurofilamentos evidentes (Figura 2B). Por el contrario, a los 3 días después de la OHT, encontramos disrupción focal de los haces de axones, algunas fibras degeneradas, vacuolización citoplasmática en los procesos de las células gliales y cromatina condensada en los núcleos de las células gliales. Después de 7 días de inducción de OHT, hubo un aumento en las fibras axonales degeneradas, procesos celulares gliales hipertróficos e hinchazón y vacíos en fibras axonales individuales. A los 14 días, uno de los cambios más destacados fue un mayor desarreglo de las fibras del nervio óptico, asociado a la invasión de los procesos celulares gliales entre los axones. Los haces de filamentos llenaron estos procesos y las fibras oscuras degeneradas, y la descomposición de la mielina fue más común, asociada con laminillas desprendidas y vacuolizadas (Figura 2B).
La densidad de perfiles de Brn3a+ disminuyó a lo largo del tiempo (Figura 2C), principalmente en los cuadrantes retiniano dorsal y temporal, hasta el 32,4% ± 9,6% y el 35,7% ± 9,1% a los 30 días, respectivamente (Figuras 2D-G y Tabla 2).
Figura 1: Cauterización térmica del plexo vascular limbal y consecuencias para la función retiniana in vivo. (A) Métodos alternativos para medir la PIO en ratas: tonometría de rebote (superior) y tonometría de aplanamiento (inferior). (B-E) Procedimiento quirúrgico; punta de flecha: plexo vascular limbal; flecha: pinzas curvas utilizadas para exponer la superficie anterior del globo ocular y optimizar la evaluación quirúrgica de los vasos limbales; hachís: la punta redonda de la cauterización oftálmica a baja temperatura; Asterisco: Marca de cauterización. Barra de escala: 2 mm. El recuadro en (D) muestra con mayor aumento la vasculatura limbal que se va a cauterizar. (F) Evolución temporal de las mediciones de PIO en ojos OHT (rojo) y control (negro) (n = 131). Flecha vertical hacia abajo: cirugía LPC. * = p < 0,05 (G) Arena para el análisis de la respuesta optomotora, compuesta por cuatro monitores de computadora dispuestos en un cuadrilátero, con una plataforma en el centro. Los monitores muestran la imagen de un cilindro virtual compuesto por franjas verticales alternas blancas y negras que se mueven alrededor del animal con una velocidad de rotación constante y frecuencias espaciales variables. El punto de mira rojo corresponde al centro del cilindro virtual. (H) Respuestas optomotoras. En el seguimiento quirúrgico se distinguen dos fases distintas: la fase OHT (0-5 días) y la fase de degeneración secundaria (6-30 días). = p < 0,0001. (I) Electrodos y posicionamiento de los animales para la adquisición de patrón-ERG (PERG): el electrodo activo en la periferia temporal de la córnea, y los electrodos de referencia y tierra en el tejido subcutáneo del canto temporal ipsilateral y una de las extremidades posteriores, respectivamente. El animal se coloca a 20 cm de la pantalla de estímulo. (J) Amplitud PERG sobre estímulos con diferentes frecuencias espaciales. Al igual que la respuesta optomotora, la evaluación PERG también muestra dos fases distintas de respuestas después de la cirugía: hipertensión ocular a los 3 días después de la cirugía, seguida de recuperación a los 7 y 14 días, aunque todavía estadísticamente más baja que las respuestas ingenuas, y una disminución posterior al día 30 después de la cirugía. C/D = ciclos por grado. Grupo ingenuo: ojos de animales no expuestos a ninguna manipulación experimental previa. (H) y (J) muestran la media ± SEM, más réplicas individuales en (H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación estructural de la retina y el nervio óptico después de la cauterización del plexo vascular limbal (LPC) con cauterización oftálmica a baja temperatura. (A) Recuentos de axones en distintos momentos después de la OHT (n = 3). = p = 0,0005, **** = p < 0,0001. (B) Micrografías electrónicas de la degeneración del nervio óptico después de la OHT. La imagen de la izquierda muestra el nervio óptico de control, y las siguientes imágenes ilustran la degeneración progresiva después de 3, 7 y 14 días de OHT. Punta de flecha: fibras mielinizadas normales; flechas finas: fibras degeneradas; asterisco: vacuolización citoplasmática; hashes: proceso de las células gliales; y Nu: núcleo de la célula glial. (C) Fotomicrografías de campos de recuento representativos de RGC marcados con un anticuerpo contra Brn3a (rojo) y núcleos marcados con TO-PRO3 (azul); barra de escala: 50μm. (D-G) Distribución de la densidad media de células Brn3a+ en los cuatro cuadrantes de la retina después de 3-30 días de cirugía. Los gráficos muestran promedios individuales de densidades de RGC para 3-11 animales por tiempo después del procedimiento. * = p < 0,05; ** = p < 0,01; = p < 0,001; = p < 0,0001. Los datos cuantitativos son medios ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Análisis estadístico de los datos de PERG. ANOVA de dos factores seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. El valor de p menor de 0,05 se consideró estadísticamente significativo. C/D = ciclos por grado. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Pérdida regional de RGC después de LPC. SEM: error estándar de la media. Control: ojo compañero. Los valores de p menores de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos (*). Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
La cauterización del plexo limbal (LPC) es un nuevo modelo posttrabecular con la ventaja de que se dirige a estructuras vasculares de fácil acceso que no requieren disección conjuntival o de tenas17,28. A diferencia del modelo de cauterización de las venas de vórtice, un modelo de OHT de renombre basado en el deterioro quirúrgico del drenaje venoso coroideo, no se espera que la congestión venosa influya en el aumento de la PIO en el modelo LPC, ya que las venas limbales están situadas aguas arriba en la salida de humor acuoso. Además, es técnicamente fácil de aprender y de bajo costo, ya que requiere principalmente una cauterización térmica a baja temperatura. Además, se asocia con una tasa única de inducción de OHT y recuperación clínica completa (> 90%, como se informó anteriormente)23, lo que reduce el número de animales necesarios para los experimentos y permite el análisis electrofisiológico y conductual. Finalmente, la degeneración glaucomatosa está presente tanto en la capa RGC como en el nervio óptico en un período de tiempo relativamente corto después de la cirugía, lo que permite diseños experimentales a corto o mediano plazo23. Se necesitan estudios futuros para dilucidar aún más el impacto de la cauterización de la vasculatura limbal de círculo completo en las capas individuales de la retina.
Los pasos críticos en el protocolo quirúrgico son: (1) la punta de cauterización debe tocar suavemente el limbo escleral paralelo al eje del vaso; (2) El tejido corneal debe preservarse, no sólo durante la cauterización, sino también durante la manipulación animal. Realice regularmente la instilación de gotas para los ojos y la eliminación del exceso de solución de la superficie del ojo con un hisopo de algodón (tenga cuidado de no frotar el hisopo de algodón en la superficie de la córnea mientras elimina cualquier líquido, ya que conduce a la abrasión del epitelio corneal y eventuales complicaciones postoperatorias); (3) se debe visualizar un círculo completo de marcas de cauterización contiguas; (4) No descuidar el seguimiento clínico postoperatorio con un antiinflamatorio no esteroideo y una pomada antibiótica, al menos hasta el5º día después de la cirugía.
La elevación subaguda de la PIO observada en el modelo descrito difiere de la dinámica de presión del glaucoma de ángulo abierto, pero es similar al glaucoma agudo de ángulo cerrado, al glaucoma neovascular o a múltiples tipos de glaucoma posttrabecular con presión venosa epiescleral elevada29. Esta es una limitación importante de este método, ya que el glaucoma de ángulo abierto es el fenotipo más prevalente de la enfermedad, caracterizado por OHT crónica y degeneración de RGC lentamente progresiva. Sin embargo, la asociación de la normalización progresiva de la PIO con la degeneración continua de la CGR representa una oportunidad única para estudiar, en un mismo modelo animal, tanto los mecanismos biológicos que relacionan la hipertensión ocular con el desarrollo y la progresión del glaucoma, como el proceso degenerativo secundario que se observa mayoritariamente en los casos de glaucoma de ángulo abierto, en el que los pacientes presentan una evolución del glaucoma a pesar del éxito clínico o quirúrgico en la consecución del objetivo de PIO30. Por lo tanto, este modelo representa una oportunidad para dilucidar mejor este fenómeno a través de diseños experimentales a corto o mediano plazo, y eventualmente desarrollar terapias neuroprotectoras independientes de la presión para beneficiar a los pacientes que aún pierden la visión a pesar del mejor tratamiento de control de la PIO.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a nuestros técnicos de laboratorio José; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza y Luciano Cavalcante Ferreira. Esta investigación fue financiada por la FAPERJ, el CNPq y la CAPES.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Isofar | 201 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Active electrode for electroretinography | Hansol Medical Co | - | Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm |
| Anestalcon | Novartis Biociências S/A | MS-1.0068.1087 | Proxymetacaine hydrochloride 0.5% |
| Calcium chloride | Vetec | 560 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx | Bovie Medical Corporation | AA00 | Low-temperature ophthalmic cautery |
| Cetamin | Syntec do Brasil Ltda | 000200-3-000003 | Ketamine hydrochloride 10% |
| DAKO | Dako North America | S3023 | Antifade mounting medium |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 28718-90-3 | diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm |
| Ecofilm | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0487 | Carmellose sodium 0.5% |
| EPON Resin | Polysciences, Inc. | - | Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553) |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16110 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Hyabak | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-8042140002 | Sodium hyaluronate 0.15% |
| Icare Tonolab | Icare Finland Oy | TV02 (model number) | Rebound handheld tonometer |
| IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Secondary antibody solution |
| LCD monitor 23 inches | Samsung Electronics Co. Ltd. | S23B550 | Model LS23B550, for electroretinogram recording |
| LSM 510 Meta | Carl Zeiss | - | Confocal epifluorescence microscope |
| Maxiflox | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0489 | Ciprofloxacin 3.5 mg/g |
| MEB-9400K | Nihon Kohden Corporation | - | System for electroretinogram recording |
| monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a | MilliporeSigma | MAB-1585 | Brn3a primary antibody solution |
| Neuropack Manager v08.33 | Nihon Kohden Corporation | - | Software for electroretinogram signal processing |
| Optomotry | CerebralMechanics | - | System for optomotor response analysis |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Potassium ferrocyanide | Electron Microscopy Sciences | 20150 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Reference and ground electrodes for electroretinography | Chalgren Enterprises | 110-63 | Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm |
| Sodium cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Ster MD | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-1.0497.1287 | Prednisolone acetate 0.12% |
| Terolac | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0497.1286 | Ketorolac trometamol 0.5% |
| Terramicina | Laboratórios Pfizer Ltda | MS-1.0216.0024 | Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g |
| Tono-Pen XL | Reichert Technologies | 230635 | Digital applanation handheld tonometer |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher Scientific | T3605 | Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Non-ionic surfactant |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Xilazin | Syntec do Brasil Ltda | 7899 | Xylazine hydrochloride 2% |
| Carl Zeiss | - | Stereo microscope for surgery and retinal dissection |
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