Summary
Målet med denne protokol er at karakterisere en ny model af glaukomatøs neurodegeneration baseret på 360 ° termisk cauterization af limbal vaskulær plexus, hvilket inducerer subakut okulær hypertension.
Abstract
Glaukom, den næststørste årsag til blindhed på verdensplan, er en heterogen gruppe af okulære lidelser karakteriseret ved strukturel skade på synsnerven og retinal ganglioncelle (RGC) degeneration, hvilket resulterer i visuel dysfunktion ved at afbryde transmissionen af visuel information fra øjet til hjernen. Forhøjet intraokulært tryk er den vigtigste risikofaktor; Således er flere modeller af okulær hypertension blevet udviklet hos gnavere ved enten genetiske eller eksperimentelle tilgange til at undersøge årsagerne og virkningerne af sygdommen. Blandt disse er der rapporteret om nogle begrænsninger, såsom kirurgisk invasivitet, utilstrækkelig funktionel vurdering, krav om omfattende træning og meget variabel forlængelse af nethindeskader. Det nuværende arbejde karakteriserer en enkel, billig og effektiv metode til at inducere okulær hypertension hos gnavere, baseret på lav temperatur, fuldcirkel cauterization af limbal vaskulær plexus, en vigtig bestanddel af vandig humordræning. Den nye model giver en teknisk let, ikke-invasiv og reproducerbar subakut okulær hypertension, forbundet med progressiv RGC og optisk nervedegeneration, og en unik postoperativ klinisk genopretningshastighed, der tillader in vivo funktionelle undersøgelser ved både elektrofysiologiske og adfærdsmæssige metoder.
Introduction
Medicinsk litteratur forstår glaukom som en heterogen gruppe af optiske neuropatier præget af progressiv degeneration af retinale ganglionceller (RGC'er), dendritter, soma og axoner, hvilket resulterer i strukturel cupping (udgravning) af den optiske skive og funktionel forringelse af synsnerven, hvilket fører til amaurose i ukontrollerede tilfælde ved at afbryde transmissionen af visuel information fra øjet til hjernen1. Glaukom er i øjeblikket den mest almindelige årsag til irreversibel blindhed på verdensplan og forventes at nå ca. 111,8 millioner mennesker i 20402, hvilket i høj grad påvirker patienternes livskvalitet (QoL) og fører til betydelige socioøkonomiske bekymringer3.
Forhøjet intraokulært tryk (IOP) er en af de vigtigste og den eneste modificerbare risikofaktor for udvikling og progression af glaukom. Blandt de mange typer glaukom er alle, bortset fra normal spændingsglaukom (NTG), forbundet med forhøjet IOP på et eller andet tidspunkt i sygdommens kliniske historie. På trods af bemærkelsesværdige kliniske og kirurgiske fremskridt med at målrette IOP og bremse eller stoppe sygdomsprogression, mister patienterne stadig synet på grund af glaukom 4,5. Derfor er en grundig forståelse af den komplekse og multifaktorielle patofysiologi af denne sygdom afgørende for udviklingen af mere effektive behandlinger, især for at give neurobeskyttelse til RGC'er.
Blandt en række eksperimentelle tilgange til forståelse af sygdomsmekanismer ligner dyremodeller baseret på okulær hypertension (OHT) mest human glaukom. Gnavermodeller er særligt nyttige, da de er billige, er nemme at håndtere, kan genmanipuleres, har en kort levetid og præsenterer okulære anatomiske og fysiologiske egenskaber, der kan sammenlignes med mennesker, såsom vandig humorproduktion og dræning 6,7,8,9,10,11,12,13 . Aktuelt anvendte modeller omfatter sklerose i det trabekulære maskeværk efter injektion af hypertonisk saltvand i episklerale vener 14, intrakameral injektion af mikroperler 15 eller viskoelastiske stoffer 16, cauterization af hvirvelvener 17, fotokoagulation af trabekulært maskeværk med argonlaser18, circumlimbal sutur 19 og anvendelse af en transgen model af aldersrelateret OHT (DBA / 2J mus)8. Imidlertid er invasivitet, postoperativ opacificering af hornhinden, forstyrrelse af forreste segment, omfattende indlæringskurver, dyrt udstyr og meget variable postoperative IOP'er blandt få af de rapporterede faldgruber forbundet med de nuværende modeller, hvilket gør udviklingen af en alternativ model af OHT til et krav for at overvinde disse problemer20,21,22.
Den nuværende protokol formaliserer en ny kirurgisk procedure for at inducere OHT som en proxy for glaukom, baseret på limbal plexus cauterization (LPC) hos gnavere23. Dette er en nem, reproducerbar, tilgængelig og ikke-invasiv model, der giver høj effektivitet og lav variabilitet af IOP-forhøjelse, forbundet med en unik høj grad af fuld klinisk restitution, hvilket giver in vivo funktionel evaluering i et reduceret antal dyr, der anvendes i hvert forsøg. Operationsteknikken inducerer subakut OHT med en gradvis tilbagevenden til baseline-niveauer på få dage, hvilket modellerer det hypertensive angreb, der ses i akut vinkellukningsglaukom. Desuden efterfølges IOP-genopretningen i modellen af kontinuerlig glaukomatøs neurodegeneration, hvilket er nyttigt for fremtidige mekanistiske undersøgelser af den sekundære degeneration af RGC'er, som forekommer i flere tilfælde af humant glaukom på trods af tilstrækkelig kontrol af IOP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med erklæringen om brug af dyr i oftalmisk og visuel forskning fra Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) og godkendt af den etiske komité for brug af dyr i videnskabelige eksperimenter fra Health Sciences Center, Federal University of Rio de Janeiro (protokol 083/17). I dette arbejde blev Lister Hooded rotter af begge køn brugt, i alderen 2-3 måneder og vejer 180-320 g. Proceduren kan dog tilpasses i forskellige rottestammer i forskellige aldersgrupper.
1. Operation for okulær hypertension og klinisk opfølgning
- Husdyr i et miljø med kontrolleret temperatur og 12 timers lys/mørk cyklus (kl. 6: lys tændt / kl. 18: lys slukket) med standard pelleteret gammabestrålet mad (Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, Brasilien) og vand (tredobbelt filter med ikke-giftigt aktivt kul) tilgængeligt ad libitum.
- Forbered en bedøvelsescocktailblanding bestående af tre dele 10% ketaminhydrochlorid og en del af 2% xylazinhydrochlorid (fortyndingsmiddel: sterilt vand).
- Dyret fastholdes forsigtigt ved at holde på ryghuden og fremkaldes anæstesi ved intraperitoneal administration af 1 μL/g legemsvægt af blandingen (ketamin: 75 mg/kg; xylazin: 5 mg/kg). Kontroller for korrekt bedøvelse efter ca. 5 minutter ved at udføre et tåklemmerespons.
- Topisk bedøvelse begge øjenoverflader ved at indstille proxymetacainhydrochlorid 0,5% øjendråbe. Vent i 30-60 s og fjern den resterende opløsning fra det forreste aspekt af kloden ved forsigtigt at røre næse- eller lateral bulbar conjunctiva med en lille steril vatpind.
- Baseline IOP måles for både eksperimentelle og kontralaterale kontroløjne ved at placere dyret i en ventral decubitusposition på bænken, således at hornhindeoverfladen er let tilgængelig for spidsen af tonometeret.
- Brug enten applanation eller rebound håndholdt tonometer (figur 1A). Tonometerspidsen placeres, så den berører den centrale hornhindezone vinkelret let. Anskaf og gennemsnit 3-5 pålidelige maskingenererede gennemsnit. Hvert gennemsnit beregnes automatisk af enheden efter seks vellykkede individuelle målinger.
- Læg rebound-tonometeret med en sonde, og tryk én gang på måleknappen for at tænde den, mens du placerer spidsen af enheden opad for at undgå, at sonden falder. Når den er tændt, viser displayet 00, hvilket indikerer, at udstyret er klar til måling.
- Placer enheden med spidsen af sonden i en afstand af 1-4 mm fra hornhinden, og få målinger ved hurtigt og forsigtigt at trykke på måleknappen uden at flytte udstyret. Hver vellykket foranstaltning identificeres ved et kort bip, og efter seks gange vises middelværdien på enhedens skærm.
BEMÆRK: På trods af en lang erfaring med applanation tonometer, for at optimere hele proceduren, anbefaler forfatterne brugen af et rebound tonometer, hvilket giver lettere erhvervelse af pålidelig IOP-måling.
- Placer dyret på en let lateral decubitus position under et stereomikroskop, og planlæg omhyggeligt operationen ved at inspicere det eksperimentelle øje ved 40x forstørrelse. Glem ikke at opretholde det kontralaterale kontroløje, der smøres under proceduren ved at indstille en dråbe carmellosenatrium eller natriumhyaluronat.
- Ved hjælp af buede tang skubbes forsigtigt det eksperimentelle øjeæble fremad for at afsløre vaskulaturen, der omgiver 360 ° af limbus13. Med den anden hånd cauterize forsigtigt karrene rundt om hornhinden med en lav temperatur oftalmisk cautery (1,300 ° F; Bovie Medical, USA) (figur 1B-E).
BEMÆRK: Det nævnte cautery har en rund spids, der skal røre limbal vaskulatur i længderetningen. - Vær forsigtig med ikke at cauterize hornhindens periferi, da dette kan resultere i postoperativ hornhindeopacificering, hvilket udelukker in vivo vurdering af retinal funktion.
- Overhold fremkomsten af små cirkulære mærker af cauterization på scleral limbus, udslettelsen af limbal vaskulatur og pupiludvidelse i det opererede øje, hvilket er tegn på en vellykket kirurgisk procedure.
BEMÆRK: Da limbalvaskulaturen hos rotter og mus er anatomisk ens13,24, og det anvendte kauteri, har en blid lille spids, kan denne protokol også fungere for museøjet uden nogen tilpasning. - Efter operationen kontrolleres den umiddelbare postoperative IOP i begge øjne som beskrevet i trin 1.5.
- Påfør en dråbe oftalmisk prednisolonacetat (1,2 mg / ml) og hold dette i kontakt med den forreste overflade af det eksperimentelle øje i ca. 40 s, og erstat det derefter med en oftalmisk salve af antibiotika (oxytetracyclinhydrochlorid 30 mg / g plus polymyxin B 10.000 E / g; eller ciprofloxacin 3,5 mg / g). Udfør intramuskulær injektion af tramadolhydrochlorid (enkeltdosis; 2 mg/kg) for at forhindre smerter efter proceduren.
- Følg nøje dyrets genopretning fra anæstesi, fortrinsvis i et varmt miljø som en varmepude eller inde i dets husbur med korrekt strøelse. Vær opmærksom på åndedrætsmønsteret.
- Udfør en daglig klinisk opfølgning af det eksperimentelle øje med topiske lægemidler sammensat af et ikke-steroide antiinflammatorisk lægemiddel (NSAID, fx ketorolac trometamol 0,5% øjendråbe) og antibiotikasalve (helst den samme, der anvendes umiddelbart efter operationen).
BEMÆRK: Brug af NSAID snarere end steroide antiinflammatoriske øjendråber anbefales, fordi sidstnævnte kan inducere OHT og anvendes regelmæssigt til glukokortikoidinducerede glaukommodeller hos gnavere.- Under let sedation (ketamin: 18,75 mg/kg; xylazin: 1,25 mg/kg) måles IOP fortrinsvis på samme tidspunkt af dagen for at undgå bias på grund af fysiologiske cirkadiske IOP-udsving.
- Under den okulære undersøgelse skal du bemærke sjældne kliniske intercurrencer, såsom hyphema, hornhindefibrose eller scleral udtynding forbundet med uveal prolaps. Hornhindeødem, kemose og konjunktival hyperæmi er almindelige, men midlertidige.
- Bemærk fuld klinisk bedring omkring postoperativ dag 7. Limbal revaskularisering begynder normalt i de første to dage efter operationen, i overensstemmelse med den forventede gradvise IOP tilbagevenden til baseline.
2. Optomotorisk respons (OMR) analyse
BEMÆRK: Til denne procedure blev der anvendt et specifikt system25.
- Arranger fire computerskærme i en firkant, der afgrænser en arena med en platform i midten. På skærmene vises billedet af en virtuel cylinder med lodret orienterede sinusbølgeriste (skiftevis sorte og hvide striber), der roterer rundt om platformen med en fast hastighed (12 grader/s) og kontrast (100%).
- Placer et videokamera over platformen, så eksperimentatoren kan se dyrets bevægelser. Udfør testen under fotopiske forhold, og indstil softwaren fortrinsvis i manuel/separat tilstand for at evaluere hvert øje separat.
- Lad dyrene vænne sig til hinanden i ca. 2 min på platformen. Bevar den røde trådkorsmarkør på videorammen mellem øjnene på det frit bevægelige dyr, da det angiver midten af den virtuelle cylinder (figur 1G)25.
- Overhold OMR, der består af en refleksiv sporing af dyrets hoved og hals fremkaldt af de roterende riste. Test de venstre og højre visuelle veje ved at dreje sinusbølgeristenes retninger henholdsvis med uret og mod uret.
- Indledningsvis præsentere en stimulus med lav rumlig frekvens (0,042 cyklusser / grad). Forøg derefter frekvensen gradvist, indtil sporing af bevægelse ikke længere bemærkes. Den højeste rumlige frekvens, hvor en klar OMR fremkaldes, svarer til tærsklen for det evaluerede øje.
- Hvis dyret til sidst falder ud af platformen under eksamen, skal du straks returnere det til platformen og genoptage testen.
3. Optagelse af mønsterelektroretinogram (PERG)
BEMÆRK: Elektroretinogrammet blev optaget ved hjælp af et specifikt system til signalbehandling og relateret software til lagring og analyse af bølgeformerne.
- Bedøvelse af dyr dybt ved intramuskulær injektion af ketaminhydrochlorid og xylazinhydrochlorid (henholdsvis 75 mg / kg og 5 mg / kg). Dyb anæstesi (kirurgisk plan) mindsker chancerne for artefakter ved ufrivillige muskelbevægelser eller alternative støjkilder under eksamen. Kontroller for korrekt bedøvelse ved at udføre et tåklemmerespons.
BEMÆRK: De nævnte bedøvelsesmidler påvirker ikke amplituden af responsen26. Da en lille nål indsat i hornhinden blev brugt som den aktive elektrode, foretrækkes intramuskulær anæstesi i stedet for intraperitoneal, da det er lettere at injicere igen, hvis rotten har brug for en boosterdosis (1/2 af den indledende dosis), med lavere chancer for at ændre elektrodepositionen og dermed føre til mere reproducerbare optegnelser under hele eksperimentet, som kan vare op til 60 min. - Topisk bedøve hornhinden med en dråbe proxymetacainhydrochlorid 0,5% og opretholde kollegaens øje fugtet med oftalmiske smøremidler.
- Indsæt forsigtigt den aktive elektrode (kanyle i rustfrit stål 0,25 mm × 15 mm) i hornhindens tidsmæssige periferi. Desuden indsættes reference- og jordelektroderne (kanyle af rustfrit stål 0,4 mm × 37 mm) i det subkutane væv i henholdsvis den ipsilaterale temporale canthus og i et af bagbenene (figur 1I).
- For PERG skal du indstille stimulus til et sort-hvidt reserveringsskakbræt, skiftevis ved 15 reverseringer / s med konstant gennemsnitlig luminans (250 cd / m2). Indstil båndpasfilteret til 1 Hz-100 Hz.
BEMÆRK: Den hurtige reverserende stimulus genererer steady-state PERG, en stabil og reproducerbar sinusform, der samler den bølgekomponent, der sandsynligvis er forbundet med RGC bioelektrisk respons: NII-afbøjning af transient-state PERG. - Placer dyret 20 cm fra stimulusskærmen (LCD-skærm 0,58 m; Figur 1I), overvåg signalets baseline, og start PERG-optagelse ved at trykke på knappen Analyse på anskaffelsessystemet.
- Under proceduren skal dyrene tilpasses det omgivende lys (hvidt lys på ~ 140 lux). Her blev seks forskellige rumlige frekvenser (i cyklusser pr. grad: 0,018, 0,037, 0,073, 0,146, 0,292, 0,585) præsenteret i tilfældig rækkefølge.
BEMÆRK: Den software, der bruges til signalbehandling, udfører automatisk gennemsnit. Gennemsnittet på 200-300 individuelle bølger blev anset for tilstrækkeligt til at skille sig ud fra støj og analysere bølgeamplitude.
4. Kvantificering af retinale ganglionceller somas
BEMÆRK: Følgende procedure er til kvantificering af RGC-somaer baseret på immunhistokemisk farvning af retinale fladmonterede med et antistof mod det hjernespecifikke homeobox/POU-domæneprotein 3A (Brn3a).
- Udsæt forsøgsdyr for eutanasi med cervikal dislokation, forud for kuldioxidindånding for at fremkalde bevidstløshed.
- Umiddelbart efter eutanasi dissekeres begge øjne under et stereomikroskop ved hjælp af tandede tang og buet saks.
- Udfør omhyggelig dissektion, så både den distale del af ekstraokulære muskler og caruncle forbliver fastgjort til kloden, da de er vigtige vartegn for topografisk orientering af nethinden (beskrevet i trin 4.5). Prøv at gemme en strækning af synsnerven, der er knyttet til kloden så længe som muligt til fremtidig analyse.
- Efter enukleation anbringes øjnene i en 1 ml opløsning af 4% paraformaldehyd (4% PFA) i 0,1 M fosfatbuffer (PBS) og opbevares i 24 timer for korrekt kemisk fiksering.
- Adskil nethinden fra resten af det okulære væv.
- Under et dissekerende mikroskop placeres øjeæblet i en petriskål dækket med 1x PBS, og vær opmærksom på vigtige landemærker som nasal caruncle, choroidsprækker og scleral aftryk fra hvirvelvener for korrekt topografisk orientering27.
- Træng ind i det forreste kammer fra den centrale hornhinde ved hjælp af tandede tang og buet saks (westcott). Foretag to radiale snit til det overlegne (dorsale) aspekt af sclera, mod synsnervens scleral foramen for at afgrænse øjets dorsale kvadrant.
- Adskil hornhinden fra resten af kloden gennem et langsgående 360 ° snit ved scleral limbus. Linsen og iris fjernes, og den dorsale retinale kvadrant afgrænses ved hjælp af de samme sclerale radiale afgrænsninger, som er beskrevet ovenfor (trin 4.5.2).
- Fjern forsigtigt nethindevævet fra choroid og sclera, undgå både tilfældige flænger i hele vævet og eventuelt topografisk tab af orientering.
- Adskil ciliarylegemet fra retinal ora serrata. Fjern forsigtigt det resterende glaslegeme fra nethindekoppen ved hjælp af både buet ikke-tandet tang plus buet saks (træk glaslegemet og disseker det tæt på den indre begrænsende membran) og en lille børste.
BEMÆRK: Fjernelse af glasagtig humor er et vigtigt skridt for at opnå et stærkt og rent immunhistokemisk signal.
- Overfør isolerede nethinden til en 24-brønds kulturplade (en nethinden pr. Brønd), der indeholder 1 ml 1x PBS, og hold den indre nethinden opad.
- Permeabiliser væv ved at vaske 3x i 10 minutter med et nonionisk overfladeaktivt stof 0,5% fortyndet i 1x PBS (0,3 ml). Derefter skal vævet forsigtigt rystes i 5% bovint serumalbumin (BSA) i nonionisk overfladeaktivt stof 2% og 1x PBS (blokerende opløsning; 0,25 ml) i 60 minutter ved stuetemperatur.
- I trin 4.7 fremstilles Brn3a primær antistofopløsning ved at fortynde 1:200 i nonioniske overfladeaktive stoffer 0,5 % og 1x PBS plus 5 % BSA og opbevares ved 4 °C.
- Efter 60 minutters vævsblokering inkuberes nethinden i 0,2 ml primær antistofopløsning ved 4 °C i 72 timer under forsigtig omrystning.
- Vævet vaskes 3x i 10 minutter med 1x PBS, og derefter inkuberes vævet i 2 timer ved stuetemperatur i 0,2 ml sekundær antistofopløsning fortyndet 1:750 i 1x PBS plus 5% BSA.
- Yderligere inkuberes vævet i 10 minutter i nuklear modpletopløsning til fluorescerende kernefarvning. Immunhistokemi afsluttes med et sidste vasketrin med 1x PBS (0,3 ml) gentaget 3x.
- Overfør nethinden ved hjælp af to små børster på glasmikroskopglas, og hold glaslegemet opad. Den dorsale retinale kvadrant placeres oppe på mikroskopets dias (tidligere afgrænset i trin 4.5.3). Lav yderligere to radiale snit mod synsnervehovedet for at afgrænse de andre 3 kvadranter (nasal, ventral og tidsmæssig).
BEMÆRK: Snitdimensionerne er ikke faste. De bør ikke være for korte, der forringer en effektiv fladning af nethinden på diaset og bør ikke være for lange, så den når synsnerven foramen og fuldstændigt adskiller den afgrænsede retinale kvadrant fra resten af vævet. - Til sidst påføres 0,2 ml antifade monteringsmedium på et glasdæksel og placeres på den fladmonterede nethinden til vævsmikroskopisk analyse. For at estimere RGC's densitet skal du undersøge de flade monteringer under et konfokal epifluorescensmikroskop ved hjælp af et 40x / 1.3-mål.
- For hver kvadrant i nethinden skal du tage otte fotos: to fra den centrale nethinden (~ 0,9 mm fra optisk disk), tre fra midten af nethinden (~ 2,0 mm fra optisk disk) og tre fra den perifere nethinde (~ 3,7 mm fra optisk disk), i alt 32 fotos pr. nethinden. Brug FIJI-softwaren til at tælle Brn3a-positive celler og estimere den gennemsnitlige celletæthed.
5. Undersøgelse af synsnerven
- Efter eutanasi og øjeæble enukleation (trin 4.1-4.3), fjern det proksimale segment af den intraorbitale del af synsnerven (1-2 mm), herunder en del af den intraokulære del, og anbring straks prøverne i hætteglas / rør indeholdende 0,2-0,3 ml koldt fikseringsmiddel (2,5% glutaraldehydopløsning i 0,1 M natriumcacodylatbuffer (pH 7,4)) i 2 timer.
BEMÆRK: Følgende trin til behandling af synsnerven udføres i de samme hætteglas/rør fra trin 5.1 - Vask materialet 3x i 5 min med kold 0,1 M natriumcacodylatbuffer. Postfikseringsvæv i 1 time under forsigtig omrystning i en opløsning af 1,0% osmiumtetroxid i 0,8% kaliumferrocyanid og 5 nM calciumchlorid fortyndet i 0,1 M natriumcacodylatbuffer ved 4 °C (0,1-0,2 ml).
- Vask synsnervefragmenter 3x i 5 min med kold 0,1 M natriumcacodylatbuffer og derefter med koldt destilleret vand, 3x for1 min. Opbevar materialet natten over under forsigtig omrystning i en opløsning af 1,0% uranylacetat i destilleret vand til farvning ved 4 °C (0,1-0,2 ml). Vask fragmenter 3x med koldt destilleret vand.
- Gradvist dehydreres vævet med en gradueret acetoneserie (0,5 ml hver) med efterfølgende udskiftninger af følgende fortyndinger i destilleret vand: 2x 7 minutters inkubation i 15% iskold acetone; 2x 7 minutters inkubation i 30% iskold acetone; 2x 7 minutters inkubation i 50% iskold acetone; 2x 7 min inkubation i 70% iskold acetone; 2x 7 min inkubation i 80% iskold acetone; 2x 7 minutters inkubation i 90% iskold acetone; 2x 15 min inkubation i 100% acetone ved stuetemperatur (RT).
- Udfør 3 infiltrations- / indlejringstrin med efterfølgende udskiftning af følgende opløsninger: 1 del epoxyharpiks: 2 dele acetone (samlet volumen: 0,5 ml) ved RT i 12 timer; 1 del epoxyharpiks: 1 del acetone (samlet volumen: 0,5 ml) ved RT i 12 timer; 2 dele epoxyharpiks: 1 del acetone (samlet volumen: 0,5 ml), ved RT i 12 timer. Til sidst infiltreres væv i ren epoxyharpiks ved RT i 24 timer.
- Prøverne fjernes fra prøvebæreren, overføres til indlejringsforme, og lad dem polymerisere i 48 timer ved 60 °C. Skær tværgående halvtynde sektioner (300-400 nm) af de optiske nervefragmenter ved hjælp af et ultramikrotom, saml og overfør dem til et mikroskopglasglas. Plet sektioner med toluidinblå og billede det optiske mikroskop ved 100x forstørrelse.
- Til ultrastrukturel analyse skal du udføre ultratynde tværsnit (70 nm), samle dem på kobbergitter og plette dem med uranylacetat og blycitrat. Undersøg sektionerne i et transmissionselektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De kvantitative variabler udtrykkes som middelværdi ± standardfejl for middelværdien (SEM). Bortset fra sammenligningen af IOP-dynamikken mellem OHT og kontrolgrupper (figur 1F) blev statistisk analyse udført ved hjælp af tovejs ANOVA efterfulgt af Sidaks multiple sammenligningstest. En p-værdi < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Figur 1 illustrerer kirurgiske trin i fuldcirkel limbal plexus cauterization (LPC) -modellen med vigtige vartegn såsom 360 ° termisk induceret forsvinden af limbalkar samt den milde til moderate mydriasis i det opererede øje ved afslutningen af proceduren.
I den nuværende serie på 131 rotter inducerede fuldcirkel limbal plexus cauterization (LPC) IOP-forhøjelse umiddelbart efter operationen fra 13,0 ± 0,2 mmHg ved baseline til 22,7 ± 0,4 mmHg. Peak postoperativ IOP blev observeret den første dag efter operationen (25,3 ± 0,6 mmHg), efterfulgt af en gradvis tilbagevenden til baseline niveauer på den 6. postoperative dag (statistisk analyse: multiple t-test korrigeret for flere sammenligninger ved hjælp af Holm-Sidak-metoden; Figur 1F). Hornhindefibrose eller ødem var kliniske intercurrencer, der potentielt kunne kompromittere nøjagtig IOP-måling. Den første var på den ene side sjælden og påvirkede 3,92% af dyrene og blev bemærket sent under den postoperative opfølgning, hvilket sparede de første 5 dage med okulær hypertension og bevarede den subakutte OHT-profil beskrevet23. Hornhindeødem var derimod en mere almindelig komplikation set i de første par dage efter operationen (1-3 dage), men for det meste mild og midlertidig og påvirkede derfor ikke kraftigt IOP23.
Nethindefunktionen blev evalueret både adfærdsmæssigt og elektrofysiologisk ved hjælp af henholdsvis den optomotoriske refleks og mønster-ERG (figur 1G-J). Begge parametre viste to faser af svækkelse: en okulær hypertension akut fase på 3. dag efter operationen og en sekundær degenerationsfase på den 30. dag efter operationen (figur 1H, figur J og tabel 1). I mellemtiden blev der påvist en periode med funktionel genopretning, som tidligere diskuteret andetsteds23.
Sammenlignet med kontrolkammerater viste aksonale tal i halvtynde tværgående optiske nervesektioner progressivt fald efter operationen (3. dag: 68,3% ± 0,9%; 7. dag: 59,2% ± 2,6%; 14. dag: 45,4% ± 2,2%; 30. dag: 28,2% ± 3,0%; tovejs ANOVA: p < 0,0001; Figur 2A). Ultrastrukturelt præsenterede optiske nerver fra kontroløjne tæt pakkede myelinerede fibre, adskilt af tynde gliacelleprocesser og tydelige aksonale mikrotubuli og neurofilamenter (figur 2B). I modsætning hertil fandt vi 3 dage efter OHT fokalforstyrrelse af axonbundter, nogle få degenererede fibre, cytoplasmatisk vakuolering i gliacelleprocesser og kondenseret kromatin i gliacellekerner. Efter 7 dages OHT-induktion var der en stigning i degenererede aksonale fibre, hypertrofiske gliacelleprocesser og hævelse og hulrum i individuelle aksonale fibre. Efter 14 dage var en af de mest fremtrædende ændringer en større disarrangement af de optiske nervefibre, der er forbundet med invasionen af gliacelleprocesser blandt axonerne. Filamentbundter fyldte disse processer og mørke degenererede fibre, og myelinnedbrydning var mere almindelig, forbundet med løsrevne og vakuoliserede lameller (figur 2B).
Tætheden af Brn3a+ profiler faldt over tid (figur 2C), hovedsageligt i dorsale og temporale retinale kvadranter, ned til henholdsvis 32,4 % ± 9,6 % og 35,7 % ± 9,1 % efter 30 dage (figur 2D-G og tabel 2).
Figur 1: Termisk cauterization af limbal vaskulær plexus og konsekvenser for retinal funktion in vivo. (A) Alternative metoder til måling af IOP hos rotter: rebound tonometri (superior) og applanation tonometri (ringere). (B-E) Kirurgisk procedure; pilespids: limbal vaskulær plexus; pil: buet tang, der bruges til at udsætte den forreste overflade af øjeæblet og optimere kirurgisk vurdering af limbalkar; hash: den runde spids af lavtemperatur-oftalmisk cautery; Stjerne: cauterization mærke. Vægtstang: 2 mm. Indsat i (D) viser i højere forstørrelse den limbale vaskulatur, der skal kauteriseres. (F) Tidsforløb for IOP-målinger i OHT (røde) og kontroløjne (sorte) øjne (n = 131). Lodret pil nedad: LPC-kirurgi. * = p < 0,05 (G) Arena til optomotorisk responsanalyse, der består af fire computerskærme arrangeret i en firkant med en platform i midten. Skærmene viser billedet af en virtuel cylinder sammensat af lodrette alternative sorte og hvide striber, der bevæger sig rundt om dyret med konstant rotationshastighed og variable rumlige frekvenser. Det røde trådkors svarer til midten af den virtuelle cylinder. (H) Optomotoriske reaktioner. Der skelnes mellem to forskellige faser ved kirurgisk opfølgning: OHT-fasen (0-5 dage) og den sekundære degenerationsfase (6-30 dage). = p < 0,0001. I) Elektroder og dyrepositionering med henblik på mønster-ERG (PERG): den aktive elektrode i hornhindens temporale periferi og referenceelektroderne og jordelektroderne i det subkutane væv i henholdsvis den ipsilaterale temporale canthus og et af bagbenene. Dyret er placeret 20 cm fra stimulusskærmen. (J) PERG-amplitude ved stimuli med forskellige rumlige frekvenser. I lighed med optomotorisk respons viser PERG-evaluering også to forskellige faser af respons efter operationen: okulær hypertensiv 3 dage efter operationen, efterfulgt af bedring på dag 7 og 14, selvom det stadig er statistisk lavere end naive responser, og et efterfølgende fald på dag 30 efter operationen. c/d = cyklusser pr. grad. Naiv gruppe: øjne af dyr, der ikke udsættes for tidligere eksperimentel manipulation. (H) og (J) viser gennemsnit ± SEM plus individuelle replikater i (H). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Strukturel vurdering af nethinden og synsnerven efter limbal vaskulær plexus cauterization (LPC) med lavtemperatur oftalmisk cautery. (A) Axon tæller på forskellige tidspunkter efter OHT (n = 3). = p = 0,0005, **** = p < 0,0001. (B) Elektronmikrografier af optisk nervedegeneration efter OHT. Det venstre billede viser kontrolsynsnerven, og de følgende billeder illustrerer den progressive degeneration efter 3, 7 og 14 dages OHT. Pilespids: normale myelinerede fibre; tynde pile: degenererede fibre; asterisk: cytoplasmatisk vakuolering; hashes: gliaceller proces; og Nu: gliacellekerne. C) Fotomikrografier af repræsentative tællefelter for RGC'er mærket med et antistof mod Brn3a (rød) og TO-PRO3-mærkede kerner (blå) skalabjælke: 50μm. (D-G) Fordeling af gennemsnitlig Brn3a + celletæthed i de fire kvadranter i nethinden efter 3-30 dages operation. Graferne viser individuelle gennemsnit af RGC-tætheder for 3-11 dyr pr. Gang efter proceduren. * = p < 0,05; ** = p < 0,01; = p < 0,001; = p < 0,0001. Kvantitative data er gennemsnitlige ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Statistisk analyse af PERG-data. Tovejs ANOVA efterfulgt af Sidaks multiple sammenligningstest. P-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. c/d = cyklusser pr. grad. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Regionalt tab af RGC efter LPC. SEM: standardfejl i middelværdien. Kontrol: medøje. P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante (*). Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Limbal plexus cauterization (LPC) er en ny post-trabekulær model med den fordel, at den er målrettet mod let tilgængelige vaskulære strukturer, der ikke kræver konjunktival eller tenon dissektion17,28. Forskellig fra hvirvelvenernes cauterization model, en berømt OHT-model baseret på kirurgisk svækkelse til choroid venøs dræning, forventes venøs overbelastning ikke at påvirke IOP-stigningen i LPC-modellen, da limbale vener er placeret opstrøms i vandig humorudstrømning. Det er også teknisk let at lære og billigt, hvilket for det meste kræver en termisk cautery ved lav temperatur. Desuden er det forbundet med en unik OHT-induktionshastighed og fuld klinisk genopretning (> 90 %, som tidligere rapporteret)23, hvilket reducerer antallet af dyr, der er nødvendige for forsøg, og giver mulighed for både elektrofysiologisk og adfærdsmæssig analyse. Endelig er glaukomatøs degeneration til stede i både RGC-laget og synsnerven inden for en relativt kort tidsramme efter operationen, hvilket muliggør enten kortsigtede eller mellemsigtede eksperimentelle designs23. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for yderligere at belyse virkningen af fuldcirkel limbal vaskulatur cauterization på individuelle retinale lag.
Kritiske trin i den kirurgiske protokol er: (1) kauteriseringsspidsen skal forsigtigt berøre scleral limbus parallelt med karaksen; (2) hornhindevæv skal skånes, ikke kun under kauterisering, men også under dyremanipulation. Udfør regelmæssigt øjendråbeinstillation og fjernelse af overskydende opløsning fra øjenoverfladen med en vatpind (pas på ikke at skrubbe vatpinden på hornhindeoverfladen, mens du fjerner væske, da det fører til hornhindepitelslid og eventuelle komplikationer efter operationen); (3) en fuld cirkel af sammenhængende kauteriseringsmærker skal visualiseres; (4) Forsøm ikke postoperativ klinisk opfølgning med et ikke-steroidt antiinflammatorisk lægemiddel og antibiotikasalve, mindst indtil den 5. dag efter operationen.
Den subakutte IOP-forhøjelse, der ses i den beskrevne model, adskiller sig fra trykdynamikken i åbenvinklet glaukom, men er beslægtet med akut vinkellukningsglaukom, neovaskulær glaukom eller flere typer posttrabekulær glaukom med forhøjet episkleralt venøst tryk29. Dette er en væsentlig begrænsning af denne metode, da åbenvinklet glaukom er den mest udbredte fænotype af sygdommen, karakteriseret ved kronisk OHT og langsomt progressiv RGC-degeneration. Ikke desto mindre repræsenterer foreningen af progressiv normalisering af IOP med kontinuerlig RGC-degeneration en unik mulighed for i samme dyremodel at studere både de biologiske mekanismer, der forbinder okulær hypertension med udvikling og progression af glaukom, såvel som den sekundære degenerative proces, der hovedsagelig observeres i åbenvinklede glaukomtilfælde, hvorefter patienter, der er til stede med glaukom, udvikler sig på trods af klinisk eller kirurgisk succes med at nå målet IOP30. Denne model repræsenterer således en mulighed for bedre at belyse dette fænomen gennem kortsigtede eller mellemsigtede eksperimentelle designs og i sidste ende udvikle trykuafhængige neurobeskyttende terapier til gavn for patienter, der stadig mister synet på trods af den bedste IOP-kontrolbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender vores laboranter José; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza og Luciano Cavalcante Ferreira. Denne forskning blev finansieret af FAPERJ, CNPq og CAPES.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Isofar | 201 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Active electrode for electroretinography | Hansol Medical Co | - | Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm |
| Anestalcon | Novartis Biociências S/A | MS-1.0068.1087 | Proxymetacaine hydrochloride 0.5% |
| Calcium chloride | Vetec | 560 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx | Bovie Medical Corporation | AA00 | Low-temperature ophthalmic cautery |
| Cetamin | Syntec do Brasil Ltda | 000200-3-000003 | Ketamine hydrochloride 10% |
| DAKO | Dako North America | S3023 | Antifade mounting medium |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 28718-90-3 | diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm |
| Ecofilm | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0487 | Carmellose sodium 0.5% |
| EPON Resin | Polysciences, Inc. | - | Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553) |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16110 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Hyabak | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-8042140002 | Sodium hyaluronate 0.15% |
| Icare Tonolab | Icare Finland Oy | TV02 (model number) | Rebound handheld tonometer |
| IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Secondary antibody solution |
| LCD monitor 23 inches | Samsung Electronics Co. Ltd. | S23B550 | Model LS23B550, for electroretinogram recording |
| LSM 510 Meta | Carl Zeiss | - | Confocal epifluorescence microscope |
| Maxiflox | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0489 | Ciprofloxacin 3.5 mg/g |
| MEB-9400K | Nihon Kohden Corporation | - | System for electroretinogram recording |
| monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a | MilliporeSigma | MAB-1585 | Brn3a primary antibody solution |
| Neuropack Manager v08.33 | Nihon Kohden Corporation | - | Software for electroretinogram signal processing |
| Optomotry | CerebralMechanics | - | System for optomotor response analysis |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Potassium ferrocyanide | Electron Microscopy Sciences | 20150 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Reference and ground electrodes for electroretinography | Chalgren Enterprises | 110-63 | Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm |
| Sodium cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Ster MD | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-1.0497.1287 | Prednisolone acetate 0.12% |
| Terolac | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0497.1286 | Ketorolac trometamol 0.5% |
| Terramicina | Laboratórios Pfizer Ltda | MS-1.0216.0024 | Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g |
| Tono-Pen XL | Reichert Technologies | 230635 | Digital applanation handheld tonometer |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher Scientific | T3605 | Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Non-ionic surfactant |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Xilazin | Syntec do Brasil Ltda | 7899 | Xylazine hydrochloride 2% |
| Carl Zeiss | - | Stereo microscope for surgery and retinal dissection |
References
- Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The Pathophysiology and Treatment of Glaucoma A Review. JAMA. 311 (8), 1901-1911 (2014).
- Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: A systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
- Quaranta, L., et al. Quality of Life in Glaucoma: A Review of the Literature. Advances in Therapy. 33 (6), 959-981 (2016).
- Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Archives of Ophthalmology. 120 (10), Chicago, Ill. 1268-1279 (2002).
- Susanna, R., De Moraes, C. G., Cioffi, G. A., Ritch, R. Why Do People (Still) Go Blind from Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 4 (2), 1 (2015).
- Fujikawa, K., et al. VAV2 and VAV3 as candidate disease genes for spontaneous glaucoma in mice and humans. PLoS One. 5 (2), 9050 (2010).
- Mao, M., Hedberg-Buenz, A., Koehn, D., John, S. W., Anderson, M. G. Anterior segment dysgenesis and early-onset glaucoma in nee mice with mutation of Sh3pxd2b. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2679-2688 (2011).
- John, S. W., et al. Essential iris atrophy, pigment dispersion, and glaucoma in DBA/2J mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (6), 951-962 (1998).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Ocular hypertension in mice with a targeted type I collagen mutation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (4), 1581-1585 (2003).
- Chou, T. H., Tomarev, S., Porciatti, V. Transgenic mice expressing mutated Tyr437His human myocilin develop progressive loss of retinal ganglion cell electrical responsiveness and axonopathy with normal iop. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (9), 5602-5609 (2014).
- vander Zypen, E. Experimental morphological study on structure and function of the filtration angel of the rat eye. Ophthalmologica. 174 (5), 285-298 (1977).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N.
- Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G.
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: A paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
- Zhu, M. D., Cai, F. Y. Development of experimental chronic intraocular hypertension in the rabbit. Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology. 20 (3), 225-234 (1992).
- Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61 (3), 379-382 (1995).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 402-410 (2002).
- Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
- Biswas, S., Wan, K. H. Review of rodent hypertensive glaucoma models. Acta Ophthalmologica. 97 (3), 331-340 (2019).
- Pitha, I., et al. Sustained Dorzolamide Release Prevents Axonal and Retinal Ganglion Cell Loss in a Rat Model of IOP-Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 7 (2), 13 (2018).
- Grozdanic, S. D., et al. Temporary elevation of the intraocular pressure by cauterization of vortex and episcleral veins in rats causes functional deficits in the retina and optic nerve. Experimental Eye Research. 77 (1), 27-33 (2003).
- Lani, R., et al. A subacute model of glaucoma based on limbal plexus cautery in pigmented rats. Scientific Reports. 9 (1), 16286 (2019).
- vander Merwe, E. L., Kidson, S. H. The three-dimensional organisation of the post-trabecular aqueous outflow pathway and limbal vasculature in the mouse. Experimental Eye Research. 125, 226-235 (2014).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
- Sasovetz, D. Ketamine hydrochloride: an effective general anesthetic for use in electroretinography. Annals of Ophthalmology. 10 (11), 1510-1514 (1978).
- Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. The Journal of Comparative Neurology. 526 (11), 1749-1759 (2018).
- Blanco, R., et al. A Chronic Ocular-Hypertensive Rat Model induced by Injection of the Sclerosant Agent Polidocanol in the Aqueous Humor Outflow Pathway. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3209 (2019).
- Paranhos, A., Prata, J. A., de Mello, P. A., da Silva, F. A. Post-Trabecular Glaucomas with Elevated Episcleral Venous Pressure. Mechanisms of the Glaucomas. , Humana Press. 139-157 (2008).
- Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective Vulnerability of Specific Retinal Ganglion Cell Types and Synapses after Transient Ocular Hypertension. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of The Society for Neuroscience. 36 (35), 9240-9252 (2016).
