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Neuroscience

कृन्तकों में शल्य चिकित्सा से प्रेरित ग्लूकोमा के लिए लिम्बल वैस्कुलर प्लेक्सस का फुल-सर्कल कॉटराइजेशन

Published: February 15, 2022 doi: 10.3791/63442
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य लिम्बल वैस्कुलर प्लेक्सस के 360 डिग्री थर्मिक कॉटराइजेशन के आधार पर ग्लूकोमाटस न्यूरोडीजेनेरेशन के एक नए मॉडल को चिह्नित करना है, जो सबस्यूट ओकुलर हाइपरटेंशन को प्रेरित करता है।

Abstract

ग्लूकोमा, दुनिया भर में अंधापन का दूसरा प्रमुख कारण, ओकुलर विकारों का एक विषम समूह है जो ऑप्टिक तंत्रिका और रेटिना गैंग्लियन सेल (आरजीसी) अध: पतन को संरचनात्मक क्षति की विशेषता है, जिसके परिणामस्वरूप आंख से मस्तिष्क तक दृश्य जानकारी के संचरण को बाधित करके दृश्य शिथिलता होती है। ऊंचा इंट्राओकुलर दबाव सबसे महत्वपूर्ण जोखिम कारक है; इस प्रकार, रोग के कारणों और प्रभावों की जांच के लिए आनुवंशिक या प्रयोगात्मक दृष्टिकोण द्वारा कृन्तकों में ओकुलर उच्च रक्तचाप के कई मॉडल विकसित किए गए हैं। उनमें से, कुछ सीमाओं की सूचना दी गई है जैसे कि सर्जिकल इनवेसिवनेस, अपर्याप्त कार्यात्मक मूल्यांकन, व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता, और रेटिना क्षति का अत्यधिक परिवर्तनीय विस्तार। वर्तमान कार्य कृन्तकों में ओकुलर उच्च रक्तचाप को प्रेरित करने के लिए एक सरल, कम लागत वाली और कुशल विधि की विशेषता है, जो जलीय हास्य जल निकासी के एक प्रमुख घटक, लिम्बल संवहनी जाल के कम तापमान, पूर्ण-सर्कल कॉटराइजेशन पर आधारित है। नया मॉडल एक तकनीकी रूप से आसान, गैर-आक्रामक, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सबस्यूट ओकुलर उच्च रक्तचाप प्रदान करता है, जो प्रगतिशील आरजीसी और ऑप्टिक तंत्रिका अध: पतन से जुड़ा हुआ है, और एक अद्वितीय पोस्ट-ऑपरेटिव नैदानिक वसूली दर है जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और व्यवहार दोनों तरीकों से विवो कार्यात्मक अध्ययन में अनुमति देता है।

Introduction

चिकित्सा साहित्य ग्लूकोमा को ऑप्टिक न्यूरोपैथियों के एक विषम समूह के रूप में समझता है जो रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं (आरजीसी), डेंड्राइट, सोमा और अक्षतंतु के प्रगतिशील अध: पतन की विशेषता है, जिसके परिणामस्वरूप ऑप्टिक डिस्क की संरचनात्मक कपिंग (उत्खनन) और ऑप्टिक तंत्रिका की कार्यात्मक गिरावट होती है, जिससे आंखसे मस्तिष्क तक दृश्य जानकारी के संचरण को बाधित करके अनियंत्रित मामलों में एमॉरोसिस होता है।. ग्लूकोमा वर्तमान में दुनिया भर में अपरिवर्तनीय अंधापन का सबसे आम कारण है, 20402 में लगभग 111.8 मिलियन लोगों तक पहुंचने की भविष्यवाणी की गई है, इस प्रकार रोगियों के जीवन की गुणवत्ता (क्यूओएल) को गहराई से प्रभावित करता है और महत्वपूर्ण सामाजिकआर्थिक चिंताओं को जन्म देता है।

ऊंचा इंट्राओकुलर दबाव (आईओपी) ग्लूकोमा के विकास और प्रगति के लिए सबसे महत्वपूर्ण और एकमात्र परिवर्तनीय जोखिम कारक में से एक है। ग्लूकोमा के कई प्रकारों में, सामान्य तनाव ग्लूकोमा (एनटीजी) को छोड़कर सभी, रोग के नैदानिक इतिहास में किसी समय ऊंचा आईओपी से जुड़े होते हैं। आईओपी को लक्षित करने और रोग की प्रगति को धीमा करने या रोकने के लिए उल्लेखनीय नैदानिक और शल्य चिकित्सा प्रगति के बावजूद, ग्लूकोमा 4,5 के कारण रोगी अभी भी दृष्टि खो देते हैं। इसलिए, इस बीमारी के जटिल और बहुक्रियाशील पैथोफिज़ियोलॉजी की पूरी तरह से समझ अधिक प्रभावी उपचार के विकास के लिए अनिवार्य है, खासकर आरजीसी को न्यूरोप्रोटेक्शन प्रदान करने के लिए।

रोग तंत्र की समझ के लिए विभिन्न प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों के बीच, ओकुलर हाइपरटेंशन (ओएचटी) पर आधारित पशु मॉडल मानव ग्लूकोमा से सबसे अधिक मिलते-जुलते हैं। कृंतक मॉडल विशेष रूप से उपयोगी होते हैं क्योंकि वे कम लागत वाले होते हैं, संभालना आसान होता है, आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया जा सकता है, एक छोटा जीवनकाल होता है, और मनुष्यों की तुलना में ओकुलर शारीरिक और शारीरिक विशेषताएं पेश करते हैं, जैसे जलीय हास्य उत्पादन और जल निकासी 6,7,8,9,10,11,12,13।. वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले मॉडलों में एपिस्क्लरल नसों 14 में हाइपरटोनिक सलाइन के इंजेक्शन के बाद ट्रैब्युलर मेशवर्क का स्क्लेरोसिस, माइक्रोबीड्स 15 या विस्कोस्टिक पदार्थों का इंट्राकैस्ट्रियल इंजेक्शन 16, भंवर नसों का संयोजन 17, आर्गन लेजर 18 के साथ ट्रेब्युलर जाल का फोटोकॉएक्शन, सर्कमलिम्बल सीवन 19, और उम्र से संबंधित ओएचटी (डीबीए / 2 जे चूहों) के ट्रांसजेनिक मॉडल का उपयोग शामिल है।. हालांकि, इनवेसिवनेस, कॉर्निया के पोस्ट-ऑपरेटिव ओपेसिफिकेशन, एंटीरियर सेगमेंट व्यवधान, व्यापक सीखने के मोड़, महंगे उपकरण, और अत्यधिक परिवर्तनीय पोस्टऑपरेटिव आईओपी, वर्तमान मॉडल से जुड़े कुछ रिपोर्ट किए गए नुकसान ों में से हैं, जिससे ओएचटी के वैकल्पिक मॉडल का विकासइन समस्याओं को दूर करने की मांग करता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल कृन्तकों में लिम्बल प्लेक्सस कॉटराइजेशन (एलपीसी) के आधार पर ग्लूकोमा के प्रॉक्सी के रूप में ओएचटी को प्रेरितकरने के लिए एक नई शल्य चिकित्सा प्रक्रिया को औपचारिक रूप देता है। यह एक आसान, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, सुलभ और गैर-इनवेसिव मॉडल है जो आईओपी ऊंचाई की उच्च दक्षता और कम परिवर्तनशीलता प्रदान करता है, जो पूर्ण नैदानिक वसूली की विशिष्ट उच्च दर से जुड़ा हुआ है, इसलिए प्रत्येक प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले जानवरों की कम संख्या में विवो कार्यात्मक मूल्यांकन प्रदान करता है। सर्जरी तकनीक कुछ दिनों में बेसलाइन स्तरों पर धीरे-धीरे वापसी के साथ सबस्यूट ओएचटी को प्रेरित करती है, जो तीव्र कोण-बंद ग्लूकोमा में देखे गए उच्च रक्तचाप से ग्रस्त हमले को मॉडल करती है। इसके अलावा, मॉडल में आईओपी रिकवरी के बाद निरंतर ग्लूकोमाटस न्यूरोडीजेनेरेशन होता है, जो आरजीसी के माध्यमिक अध: पतन के भविष्य के यांत्रिक अध्ययनों के लिए उपयोगी है, जो आईओपी के पर्याप्त नियंत्रण के बावजूद मानव ग्लूकोमा के कई मामलों में होता है।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को एसोसिएशन फॉर रिसर्च इन विजन एंड ओप्थाल्मोलॉजी (एआरवीओ) से नेत्र और दृश्य अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए बयान के अनुपालन में किया गया था और स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र, रियो डी जनेरियो के संघीय विश्वविद्यालय (प्रोटोकॉल 083/17) से वैज्ञानिक प्रयोग में जानवरों के उपयोग पर नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। वर्तमान काम में, दोनों लिंगों के लिस्टर हुड चूहों का उपयोग किया गया था, जिनकी आयु 2-3 महीने थी और वजन 180-320 ग्राम था। हालांकि, प्रक्रिया को विभिन्न आयु श्रेणियों के विभिन्न चूहे उपभेदों में अनुकूलित किया जा सकता है।

1. ओकुलर हाइपरटेंशन सर्जरी और क्लिनिकल फॉलो-अप

  1. जानवरों को नियंत्रित तापमान वाले वातावरण और 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र (सुबह 6 बजे: शाम 6 बजे: लाइट ऑफ) के साथ मानक पेलेटाइज्ड गामा-विकिरणित भोजन (नुविलैब® सीआर -1, क्विमटिया एस / ए, ब्राजील) और पानी (ट्रिपल फिल्टर, गैर विषैले सक्रिय चारकोल के साथ) उपलब्ध है।
  2. 10% केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड के तीन भागों और 2% ज़ाइलेज़िन हाइड्रोक्लोराइड (डिल्यूएंट: बाँझ पानी) के एक भाग से बना एक स्टॉक एनेस्थेटिक कॉकटेल मिश्रण तैयार करें।
  3. पृष्ठीय त्वचा को पकड़कर जानवर को धीरे से नियंत्रित करें और मिश्रण के शरीर के वजन के 1 μL / g के इंट्रापरिटोनियल प्रशासन द्वारा संज्ञाहरण को प्रेरित करें (केटामाइन: 75 मिलीग्राम / किग्रा; xylazine: 5 मिलीग्राम / किग्रा)। पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया करके लगभग 5 मिनट के बाद उचित एनेस्थेटाइजेशन की जांच करें।
  4. प्रोक्सीमेटाकेन हाइड्रोक्लोराइड 0.5% आईड्रॉप को स्थापित करके दोनों आंखों की सतहों को एनेस्थेटाइज करें। 30-60 सेकंड तक प्रतीक्षा करें और एक छोटे बाँझ कपास के फाहे के साथ नाक या पार्श्व बुलबार नेत्रश्लेष्मला को धीरे से छूकर, ग्लोब के पूर्ववर्ती पहलू से शेष घोल को हटा दें।
  5. बेंचटॉप पर जानवर को वेंट्रल डेक्यूबिटस स्थिति में रखकर प्रयोगात्मक और विपरीत नियंत्रण आंखों दोनों के बेसलाइन आईओपी को मापें ताकि कॉर्नियल सतह टोनोमीटर की नोक तक आसानी से पहुंच सके।
  6. या तो एप्लेनेशन या रिबाउंड हैंडहेल्ड टोनोमीटर (चित्रा 1 ए) का उपयोग करें। टोनोमीटर टिप को इस तरह रखें कि यह केंद्रीय कॉर्नियल ज़ोन को लंबवत रूप से थोड़ा स्पर्श करे। 3-5 विश्वसनीय मशीन-जनित औसत प्राप्त करें और औसत करें। छह सफल व्यक्तिगत मापों के बाद डिवाइस द्वारा प्रत्येक माध्य की स्वचालित रूप से गणना की जाती है।
    1. रिबाउंड टोनोमीटर को एक जांच के साथ लोड करें और डिवाइस की नोक को ऊपर की ओर रखते हुए, इसे चालू करने के लिए माप बटन को एक बार दबाएं, ताकि जांच को गिरने से बचाया जा सके। चालू करने के बाद, डिस्प्ले 00 दिखाएगा जो दर्शाता है कि उपकरण मापने के लिए तैयार है।
    2. डिवाइस को कॉर्निया से 1-4 मिमी की दूरी पर जांच की नोक के साथ रखें और उपकरण को स्थानांतरित किए बिना माप बटन को तेजी से और सावधानी से दबाकर माप प्राप्त करें। प्रत्येक सफल उपाय को एक छोटी बीप द्वारा पहचाना जाता है और छह बार के बाद, माध्य डिवाइस की स्क्रीन पर प्रदर्शित होता है।
      नोट: एप्प्लेनेशन टोनोमीटर के साथ एक लंबे अनुभव के बावजूद, पूरी प्रक्रिया को अनुकूलित करने के लिए लेखक एक रिबाउंड टोनोमीटर के उपयोग की सलाह देते हैं, जो विश्वसनीय आईओपी माप का आसान अधिग्रहण प्रदान करता है।
  7. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत जानवर को एक मामूली पार्श्व डेक्यूबिटस स्थिति पर रखें, और 40x आवर्धन पर प्रयोगात्मक आंख का निरीक्षण करके सर्जरी की सावधानीपूर्वक योजना बनाएं। कार्मेलोज सोडियम या सोडियम हाइलूरोनेट की एक बूंद डालकर प्रक्रिया के दौरान विपरीत नियंत्रण आंख स्नेहन को बनाए रखना न भूलें।
  8. घुमावदार बल की सहायता से, प्रयोगात्मक नेत्रगोलक को धीरे से आगे बढ़ाएं ताकि लिम्बस13 के 360 ° को घेरने वाले वाहिका को उजागर किया जा सके। दूसरी ओर, कम तापमान वाले नेत्र कैटरी (1,300 डिग्री फारेनहाइट) के साथ कॉर्निया के चारों ओर वाहिकाओं को धीरे से काट लें; बोवी मेडिकल, यूएसए) (चित्रा 1 बी-ई)।
    नोट: उल्लिखित कॉटरी में एक गोल नोक है जिसे लिम्बल वास्कुलचर अनुदैर्ध्य रूप से छूना चाहिए।
  9. सावधान रहें कि कॉर्नियल परिधि को उत्तेजित न करें, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप पोस्ट-ऑपरेटिव कॉर्नियल ओपसिफिकेशन हो सकता है, जो रेटिना फ़ंक्शन के विवो मूल्यांकन में रोकता है।
  10. स्क्लेरल लिंबस पर क्युटराइजेशन के छोटे गोलाकार निशानों के उद्भव का निरीक्षण करें, लिम्बल वास्कुलचर का पुनरावृत्ति, और संचालित आंख में पुतली का फैलाव, जो एक सफल शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के संकेत हैं।
    नोट: चूंकि चूहों और चूहों का लिम्बल वास्कुलचर शारीरिक रूप से13,24 के समान है और उपयोग किए जाने वाले कॉटरी में एक कोमल छोटी नोक है, यह प्रोटोकॉल माउस आंख के साथ-साथ बिना किसी अनुकूलन के भी काम कर सकता है।
  11. सर्जरी के बाद, दोनों आंखों में तत्काल पोस्ट-ऑपरेटिव आईओपी की जांच करें जैसे कि चरण 1.5 में वर्णित है।
  12. नेत्र प्रेडनिसोलोन एसीटेट (1.2 मिलीग्राम / एमएल) की एक बूंद लागू करें और इसे लगभग 40 सेकंड के लिए प्रयोगात्मक आंख की पूर्ववर्ती सतह के संपर्क में रखें, फिर इसे एंटीबायोटिक दवाओं के नेत्र मरहम (ऑक्सीटेट्रासाइक्लिन हाइड्रोक्लोराइड 30 मिलीग्राम / जी प्लस पॉलीमाइक्सिन बी 10,000 यू / जी; या सिप्रोफ्लोक्सासिन 3.5 मिलीग्राम / जी) के साथ बदलें। प्रक्रिया के बाद दर्द को रोकने के लिए ट्रामाडोल हाइड्रोक्लोराइड (एकल खुराक; 2 मिलीग्राम / किग्रा) का इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन करें।
  13. संज्ञाहरण से पशु वसूली का बारीकी से पालन करें, अधिमानतः गर्म वातावरण में जैसे कि हीटिंग पैड या उचित बिस्तर के साथ अपने आवास पिंजरे के अंदर। श्वसन पैटर्न पर ध्यान दें।
  14. गैर-स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवा (एनएसएआईडी, जैसे, केटोरोलैक ट्रोमेटामोल 0.5% आई ड्रॉप) और एंटीबायोटिक मरहम (अधिमानतः सर्जरी के तुरंत बाद उपयोग किया जाने वाला) से बनी सामयिक दवाओं के साथ प्रयोगात्मक आंखों का दैनिक नैदानिक अनुवर्ती करें।
    नोट: स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ आंखों की बूंदों के बजाय एनएसएआईडी के उपयोग की सिफारिश की जाती है क्योंकि बाद में ओएचटी को प्रेरित कर सकता है और नियमित रूप से कृन्तकों में ग्लूकोकार्टोइकोड्स-प्रेरित ग्लूकोमा मॉडल के लिए लागू किया जाता है।
    1. मामूली बेहोशी (केटामाइन: 18.75 मिलीग्राम / किग्रा; ज़ाइलेज़िन: 1.25 मिलीग्राम / किग्रा) के तहत, शारीरिक सर्कैडियन आईओपी उतार-चढ़ाव के कारण पूर्वाग्रह से बचने के लिए, दिन की एक ही अवधि में आईओपी को अधिमान्य रूप से मापें।
    2. ओकुलर परीक्षा के दौरान, दुर्लभ नैदानिक अंतःक्रियाओं पर ध्यान दें, जैसे कि हाइफेमा, कॉर्नियल फाइब्रोसिस, या यूवियल प्रोलैप्स से जुड़े स्क्लेरल पतलेपन। कॉर्नियल एडिमा, केमोसिस और नेत्रश्लेष्मला हाइपरमिया आम लेकिन अस्थायी हैं।
    3. पोस्टऑपरेटिव दिन 7 पर पूर्ण नैदानिक वसूली पर ध्यान दें। लिम्बल रिवैस्कुलराइजेशन आमतौर पर सर्जरी के बाद पहले दो दिनों में शुरू होता है, बेसलाइन पर अपेक्षित क्रमिक आईओपी वापसी के अनुरूप।

2. ऑप्टोमोटर प्रतिक्रिया (ओएमआर) विश्लेषण

नोट: इस प्रक्रिया के लिए, एक विशिष्ट प्रणाली का उपयोग किया गया था।

  1. एक चतुष्कोण में चार कंप्यूटर मॉनिटर व्यवस्थित करें, जो बीच में एक मंच के साथ एक क्षेत्र को सीमांकित करते हैं। मॉनिटर पर, लंबवत उन्मुख साइन-वेव ग्रेटिंग (वैकल्पिक काले और सफेद धारियों) के साथ एक आभासी सिलेंडर की छवि प्रदर्शित करें, जो एक निश्चित गति (12 डिग्री / सेकंड) और कंट्रास्ट (100%) पर प्लेटफॉर्म के चारों ओर घूम रहा है।
  2. प्लेटफ़ॉर्म के ऊपर एक वीडियो कैमरा रखें, जिससे प्रयोगकर्ता जानवर की गतिविधियों को देख सके। फोटोपिक स्थितियों में परीक्षण करें और प्रत्येक आंख का अलग-अलग मूल्यांकन करने के लिए सॉफ्टवेयर को मैन्युअल / अलग मोड पर अधिमानतः सेट करें।
  3. जानवरों को मंच पर लगभग 2 मिनट के लिए रहने की अनुमति दें। स्वतंत्र रूप से चलने वाले जानवर की आंखों के बीच वीडियो फ्रेम पर लाल क्रॉसहेयर कर्सर बनाए रखें, क्योंकि यह आभासी सिलेंडर (चित्रा 1 जी) 25 के केंद्र को इंगित करता है।
  4. ओएमआर का निरीक्षण करें, जिसमें घूर्णन झंझरी द्वारा प्राप्त जानवर के सिर और गर्दन की रिफ्लेक्सिव ट्रैकिंग शामिल है। क्रमशः साइन-वेव ग्रेटिंग की दिशाओं को घड़ी और प्रतिघड़ी के अनुसार घुमाकर बाएं और दाएं दृश्य मार्गों का परीक्षण करें।
    1. प्रारंभ में कम स्थानिक आवृत्ति (0.042 चक्र / डिग्री) के साथ एक उत्तेजना प्रस्तुत करें। फिर, आवृत्ति को उत्तरोत्तर बढ़ाएं जब तक कि ट्रैकिंग आंदोलन अब ध्यान नहीं दिया जाता है। उच्चतम स्थानिक आवृत्ति जिसमें एक स्पष्ट ओएमआर प्राप्त किया जाता है, मूल्यांकन की गई आंख की दहलीज स्थानिक आवृत्ति से मेल खाती है।
    2. यदि जानवर अंततः परीक्षा के दौरान प्लेटफॉर्म से गिर जाता है, तो तुरंत इसे प्लेटफॉर्म पर वापस करें और परीक्षण फिर से शुरू करें।

3. पैटर्न-इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम (पीईआरजी) की रिकॉर्डिंग

नोट: इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम को सिग्नल प्रोसेसिंग के लिए एक विशिष्ट प्रणाली और तरंगों के भंडारण और विश्लेषण के लिए संबंधित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके दर्ज किया गया था।

  1. केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड और ज़ाइलेज़िन हाइड्रोक्लोराइड (क्रमशः 75 मिलीग्राम / किग्रा और 5 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रा-मस्कुलर इंजेक्शन द्वारा जानवरों को गहराई से एनेस्थेटाइज करें। डीप एनेस्थीसिया (सर्जिकल प्लेन) परीक्षा के दौरान अनैच्छिक मांसपेशी आंदोलनों या शोर के वैकल्पिक स्रोतों द्वारा कलाकृतियों की संभावना को कम करता है। पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया करके उचित एनेस्थेटाइजेशन की जांच करें।
    नोट: उल्लिखित एनेस्थेटिक एजेंट प्रतिक्रियाके आयाम को प्रभावित नहीं करते हैं। चूंकि कॉर्निया में डाली गई एक छोटी सुई का उपयोग सक्रिय इलेक्ट्रोड के रूप में किया जाता था, इंट्रापरिटोनियल के बजाय इंट्रा-मस्कुलर एनेस्थीसिया को प्राथमिकता दी जाती है, क्योंकि चूहे को बूस्टर खुराक (प्रारंभिक खुराक का 1/2) की आवश्यकता होने पर पुन: इंजेक्ट करना आसान होता है, इलेक्ट्रोड स्थिति को संशोधित करने की संभावना कम होती है और इस प्रकार पूरे प्रयोग के दौरान अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रिकॉर्ड होते हैं, जो 60 मिनट तक रह सकता है।
  2. शीर्ष रूप से कॉर्निया को प्रोक्सीमेटाकेन हाइड्रोक्लोराइड 0.5% की एक बूंद के साथ एनेस्थेटाइज करें, और नेत्र स्नेहक के साथ साथी आंख को नम रखें।
  3. कॉर्निया की अस्थायी परिधि पर सक्रिय इलेक्ट्रोड (स्टेनलेस स्टील सुई 0.25 मिमी × 15 मिमी) को सावधानीपूर्वक डालें। इसके अतिरिक्त, संदर्भ और ग्राउंड इलेक्ट्रोड (स्टेनलेस स्टील सुई 0.4 मिमी × 37 मिमी) को क्रमशः ऊपरी टेम्पोरल कैंथस के चमड़े के नीचे के ऊतक में और पिछले अंगों में से एक में डालें (चित्रा 1 आई)।
  4. PERG के लिए, उत्तेजना को एक काले और सफेद आरक्षित चेकरबोर्ड पर सेट करें, जो निरंतर औसत चमक (250 cd/ m2) के साथ 15 रिवर्सल / सेकंड पर बारी-बारी से हो। बैंड-पास फ़िल्टर को 1 Hz-100 Hz पर सेट करें।
    नोट: तेजी से रिवर्सिंग उत्तेजना स्थिर-अवस्था पीईआरजी उत्पन्न करती है, एक स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य साइनसॉइड जो आरजीसी बायोइलेक्ट्रिकल प्रतिक्रिया से जुड़े तरंग घटक को इकट्ठा करता है: क्षणिक-राज्य पीईआरजी का एनआईआई विक्षेपण।
  5. उत्तेजना स्क्रीन से जानवर को 20 सेमी पर रखें (एलसीडी मॉनिटर 0.58 मीटर; चित्रा 1 आई), सिग्नल बेसलाइन की निगरानी करें, और अधिग्रहण प्रणाली पर विश्लेषण बटन दबाकर पीईआरजी अधिग्रहण शुरू करें।
  6. प्रक्रिया के दौरान, जानवरों को पर्यावरणीय प्रकाश (~ 140 लक्स की सफेद रोशनी) के अनुकूल रखें। यहां, छह अलग-अलग स्थानिक आवृत्तियों (प्रति डिग्री चक्र में: 0.018, 0.037, 0.073, 0.146, 0.292, 0.585) यादृच्छिक अनुक्रम में प्रस्तुत किए गए थे।
    नोट: सिग्नल प्रोसेसिंग के लिए उपयोग किया जाने वाला सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से औसत प्रदर्शन करता है। 200-300 व्यक्तिगत तरंगों का औसत शोर से बाहर खड़े होने और तरंग आयाम का विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त माना जाता था।

4. रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं सोम का परिमाणीकरण।

नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया आरजीसी सोम की मात्रा का परिमाणीकरण के लिए है, जो मस्तिष्क-विशिष्ट होमोबॉक्स / पीओयू डोमेन प्रोटीन 3 ए (बीआरएन 3 ए) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ रेटिना फ्लैट-माउंट के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधलापन पर आधारित है।

  1. प्रयोगात्मक जानवरों को गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था इच्छामृत्यु के अधीन किया जाता है, जो बेहोशी को प्रेरित करने के लिए कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेने से पहले होता है।
  2. इच्छामृत्यु के तुरंत बाद, एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत दोनों आंखों को विच्छेदित करें, जिसमें टूथेड फोर्स और घुमावदार कैंची का उपयोग किया जाए।
  3. सावधानीपूर्वक विच्छेदन करें जैसे कि एक्स्ट्राओकुलर मांसपेशियों के बाहर के हिस्से और कार्नेकल दोनों ग्लोब से जुड़े रहें, क्योंकि वे रेटिना के स्थलाकृतिक अभिविन्यास के लिए महत्वपूर्ण स्थल हैं (चरण 4.5 में वर्णित)। भविष्य के विश्लेषण के लिए जब तक संभव हो ग्लोब से जुड़े ऑप्टिक तंत्रिका के एक खिंचाव को बचाने की कोशिश करें।
  4. न्यूक्लियेशन के बाद, आंखों को 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीबीएस) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (4% पीएफए) के 1 एमएल समाधान में रखें और उचित रासायनिक निर्धारण के लिए इसे 24 घंटे तक रखें।
  5. रेटिना को बाकी ओकुलर ऊतकों से अलग करें।
    1. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत नेत्रगोलक को 1x पीबीएस से ढके पेट्री डिश में रखें, और उचित स्थलाकृतिक अभिविन्यास के लिए नाक के कारुनल, कोरॉयड फिशर और भंवर नसों से स्क्लेरल छाप जैसे महत्वपूर्ण स्थलों पर ध्यानदें।
    2. केंद्रीय कॉर्निया से पूर्वकाल कक्ष में प्रवेश करने के लिए टूथेड फोर्सऔर घुमावदार कैंची (वेस्टकॉट) का उपयोग करें। श्वेतपटल के बेहतर (पृष्ठीय) पहलू में दो रेडियल कट बनाएं, ऑप्टिक तंत्रिका के स्क्लेरल फोरमेन की ओर, ताकि नेत्रगोलक के पृष्ठीय चतुर्थांश को सीमांकित किया जा सके।
    3. स्क्लेरल लिम्बस पर अनुदैर्ध्य 360 डिग्री कट के माध्यम से कॉर्निया को दुनिया के बाकी हिस्सों से अलग करें। लेंस और आईरिस को हटा दें और ऊपर वर्णित एक ही स्क्लेरल रेडियल सीमांकन का उपयोग करके पृष्ठीय रेटिना क्वाड्रंट को सीमांकित करें (चरण 4.5.2)।
    4. कोरॉइड और श्वेतपटल से रेटिना ऊतक को सावधानीपूर्वक अलग करें, पूरे ऊतक में यादृच्छिक घावों और अभिविन्यास के अंतिम स्थलाकृतिक नुकसान दोनों से बचें।
    5. सिलिअरी बॉडी को रेटिना ओरा सेराटा से अलग करें। घुमावदार गैर-टूथेड बल और घुमावदार कैंची (विट्रस खींचें और इसे आंतरिक सीमित झिल्ली के करीब विच्छेदित करें) और एक छोटे ब्रश दोनों का उपयोग करके रेटिना कप से शेष विट्रस शरीर को सावधानीपूर्वक निकालें।
      नोट: एक मजबूत और स्वच्छ इम्यूनोहिस्टोकेमिकल संकेत प्राप्त करने के लिए विट्रियस ह्यूमर को हटाना एक महत्वपूर्ण कदम है।
  6. पृथक रेटिना को 24-वेल कल्चर प्लेट (प्रति कुएं एक रेटिना) में स्थानांतरित करें जिसमें 1 x पीबीएस का 1 एमएल हो और आंतरिक रेटिना को ऊपर रखें।
  7. 1x PBS (0.3 एमएल) में 0.5% पतला गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट के साथ 10 मिनट के लिए 3x धोकर ऊतक को परमेबिलाइज करें। फिर कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट 2% और 1x पीबीएस (अवरुद्ध समाधान; 0.25 एमएल) में 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) में ऊतक को धीरे से हिलाते रहें।
  8. चरण 4.7 के दौरान, गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट 0.5% और 1x पीबीएस प्लस 5% बीएसए में 1: 200 पतला करके Brn3a प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  9. ऊतक अवरोधन के 60 मिनट के बाद, कोमल झटकों के साथ 72 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.2 एमएल प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में रेटिना को इनक्यूबेट करें।
  10. ऊतक को 1x PBS के साथ 10 मिनट के लिए 3x धोएं, फिर 1x PBS प्लस 5% बीएसए में 1:750 पतला द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के 0.2 मिलीलीटर में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए ऊतक को इनक्यूबेट करें।
  11. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट नाभिक धुंधला होने के लिए परमाणु काउंटरस्टेन समाधान में 10 मिनट के लिए ऊतक को इनक्यूबेट करें। 1x PBS (0.3 mL) दोहराए गए 3x के साथ अंतिम धोने के चरण के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का निष्कर्ष निकालें।
  12. ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर दो छोटे ब्रश की सहायता से रेटिना को स्थानांतरित करें, विट्रस साइड को बनाए रखें। पृष्ठीय रेटिना क्वाड्रंट को माइक्रोस्कोप स्लाइड ्स पर ऊपर रखें (पहले चरण 4.5.3 में सीमांकित)। अन्य 3 चतुर्थांशों (नाक, उदर और अस्थायी) को सीमांकित करने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका सिर की ओर दो और रेडियल कट बनाएं।
    नोट: कटौती आयाम निश्चित नहीं हैं। वे बहुत छोटे नहीं होने चाहिए जो स्लाइड पर रेटिना के एक कुशल चपटेपन को बाधित करते हैं और बहुत लंबे नहीं होने चाहिए ताकि यह ऑप्टिक तंत्रिका फोरमेन तक पहुंच जाए और सीमांकित रेटिना क्वाड्रंट को बाकी ऊतक से पूरी तरह से अलग कर दे।
  13. अंत में, ग्लास कवरस्लिप पर 0.2 एमएल एंटीफैड माउंटिंग माध्यम लागू करें और इसे ऊतक सूक्ष्म विश्लेषण के लिए फ्लैट-माउंटेड रेटिना पर रखें। आरजीसी घनत्व का अनुमान लगाने के लिए, 40x/1.3 उद्देश्य का उपयोग करके एक कॉन्फोकल एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत फ्लैट माउंट की जांच करें।
  14. रेटिना के प्रत्येक चतुर्थांश के लिए, आठ तस्वीरें लें: केंद्रीय रेटिना से दो (ऑप्टिक डिस्क से ~ 0.9 मिमी), मध्य-रेटिना से तीन (ऑप्टिक डिस्क से ~ 2.0 मिमी), और परिधीय रेटिना से तीन (ऑप्टिक डिस्क से ~ 3.7 मिमी), प्रति रेटिना कुल 32 फोटो। Brn3a-पॉजिटिव कोशिकाओं की गणना करने और औसत सेल घनत्व का अनुमान लगाने के लिए FIJI सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

5. ऑप्टिक तंत्रिका की परीक्षा

  1. इच्छामृत्यु और नेत्रगोलक न्यूक्लियेशन (चरण 4.1-4.3) के बाद, ऑप्टिक तंत्रिका (1-2 मिमी) के इंट्राऑर्बिटल हिस्से के समीपस्थ खंड को हटा दें, जिसमें इंट्राओकुलर भाग का हिस्सा भी शामिल है, और तुरंत नमूनों को 2 घंटे के लिए 0.2-0.3 एमएल कोल्ड फिक्सेटिव (0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर (पीएच 7.4)) में 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड समाधान युक्त शीशियों / ट्यूबों में रखें।
    नोट: ऑप्टिक तंत्रिका प्रसंस्करण के लिए निम्नलिखित चरण चरण 5.1 से एक ही शीशियों / ट्यूबों में किए जाते हैं।
  2. सामग्री को ठंडे 0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर के साथ 5 मिनट के लिए 3x धो लें। 0.8% पोटेशियम फेरोसाइनाइड में 1.0% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड और 0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर में 4 डिग्री सेल्सियस (0.1-0.2 एमएल) पर पतला 5 एनएम कैल्शियम क्लोराइड के घोल में कोमल झटकों के तहत 1 घंटे के लिए ऊतक को ठीक करें।
  3. ऑप्टिक तंत्रिका के टुकड़ों को 5 मिनट के लिए ठंडे 0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर के साथ और बाद में ठंडे आसुत पानी के साथ 3x 1 मिनट के लिए धोएं। सामग्री को 4 डिग्री सेल्सियस (0.1-0.2 एमएल) पर धुंधला करने के लिए आसुत जल में 1.0% यूरिनल एसीटेट के घोल में कोमल झटकों के तहत रात भर रखें। टुकड़ों को ठंडे आसुत जल से 3x धो लें।
  4. एक वर्गीकृत एसीटोन श्रृंखला (प्रत्येक 0.5 एमएल) के साथ ऊतक को उत्तरोत्तर निर्जलित करें, आसुत जल में निम्नलिखित कमजोर पड़ने के बाद के प्रतिस्थापन के साथ: 2x7 मिनट इनक्यूबेशन 15% बर्फ-ठंडे एसीटोन में; 30% बर्फ-ठंडे एसीटोन में 2x7 मिनट इनक्यूबेशन; 50% बर्फ-ठंडे एसीटोन में 2x7 मिनट इनक्यूबेशन; 70% बर्फ-ठंडे एसीटोन में 2x7 मिनट इनक्यूबेशन; 80% बर्फ-ठंडे एसीटोन में 2x7 मिनट इनक्यूबेशन; 90% बर्फ-ठंडे एसीटोन में 2x7 मिनट इनक्यूबेशन; कमरे के तापमान (आरटी) पर 100% एसीटोन में 2x15 मिनट इनक्यूबेशन।
  5. निम्नलिखित समाधानों के बाद के प्रतिस्थापन के साथ 3 घुसपैठ / एम्बेडिंग चरणों का पालन करें: 1 भाग एपॉक्सी राल: 2 भाग एसीटोन (कुल मात्रा: 0.5 एमएल), 12 घंटे के लिए आरटी पर; 1 भाग एपॉक्सी राल: 1 भाग एसीटोन (कुल मात्रा: 0.5 एमएल), 12 घंटे के लिए आरटी पर; 2 भाग एपॉक्सी राल: 1 भाग एसीटोन (कुल मात्रा: 0.5 एमएल), 12 घंटे के लिए आरटी पर। अंत में, 24 घंटे के लिए आरटी पर शुद्ध एपॉक्सी राल में ऊतक में घुसपैठ करें।
  6. नमूना वाहक से नमूने निकालें, उन्हें मोल्ड एम्बेड करने के लिए स्थानांतरित करें, और इसे 60 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए पॉलीमराइज्ड करें। एक अल्ट्रामाइक्रोटोम का उपयोग करके ऑप्टिक तंत्रिका टुकड़ों के ट्रांसवर्सल अर्ध-पतले वर्गों (300-400 एनएम) को काटें, उन्हें माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड पर इकट्ठा और स्थानांतरित करें। टोलुइडाइन नीले रंग के साथ दाग अनुभाग और 100x आवर्धन पर ऑप्टिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवि।
  7. अल्ट्रास्ट्रक्चरल विश्लेषण के लिए, अल्ट्राथिन क्रॉस-सेक्शन (70 एनएम) करें, उन्हें कॉपर ग्रिड पर इकट्ठा करें, और उन्हें यूरिनिल एसीटेट और लीड साइट्रेट के साथ दाग दें। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में अनुभागों की जांच करें।

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Representative Results

मात्रात्मक चर को माध्य (एसईएम) के माध्य ± मानक त्रुटि के रूप में व्यक्त किया जाता है। ओएचटी और नियंत्रण समूहों (चित्रा 1 एफ) के बीच आईओपी गतिशीलता की तुलना को छोड़कर, सांख्यिकीय विश्लेषण दो-तरफा एनोवा का उपयोग करके किया गया था, जिसके बाद सिदक के कई तुलना परीक्षण किए गए थे। 0.05 < पी-वैल्यू को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।

चित्र 1 पूर्ण-वृत्त लिम्बल प्लेक्सस कॉटराइजेशन (एलपीसी) मॉडल के सर्जिकल चरणों को दर्शाता है, जिसमें महत्वपूर्ण स्थलों जैसे कि 360 डिग्री थर्मल-प्रेरित लिम्बल वाहिकाओं का गायब होना, साथ ही प्रक्रिया के अंत में संचालित आंख में हल्के से मध्यम माइड्रियासिस शामिल हैं।

131 चूहों की वर्तमान श्रृंखला में, फुल-सर्कल लिम्बल प्लेक्सस कॉटराइजेशन (एलपीसी) ने सर्जरी के तुरंत बाद आईओपी ऊंचाई को बेसलाइन पर 13.0 ± 0.2 मिमीएचजी से 22.7 ± 0.4 मिमीएचजी तक प्रेरित किया। सर्जरी के बाद पहले दिन पीक पोस्टऑपरेटिव आईओपी देखा गया (25.3 ± 0.6 मिमीएचजी), इसके बाद 6वें पोस्टऑपरेटिव दिन में बेसलाइन स्तरों पर धीरे-धीरे वापसी हुई (सांख्यिकीय विश्लेषण: होल्म-सिडक विधि का उपयोग करके कई तुलनाओं के लिए कई टी-टेस्ट सही किए गए; चित्रा 1 एफ)। कॉर्नियल फाइब्रोसिस या एडिमा नैदानिक हस्तक्षेप थे जो संभावित रूप से सटीक आईओपी माप से समझौता कर सकते थे। पहला, एक तरफ, दुर्लभ था, जो 3.92% जानवरों को प्रभावित करता था और पोस्टऑपरेटिव फॉलो-अप के दौरान देर से देखा जाता था, इस प्रकार ओकुलर उच्च रक्तचाप के पहले 5 दिनों को छोड़ देता था और23 वर्णित सबस्यूट ओएचटी प्रोफाइल को संरक्षित करता था। दूसरी ओर, कॉर्नियल एडिमा, सर्जरी के बाद पहले कुछ दिनों (1-3 दिनों) के दौरान देखी गई एक अधिक सामान्य जटिलता थी, लेकिन ज्यादातर हल्के और अस्थायी थे, इस प्रकार आईओपी23 को मजबूत रूप से प्रभावित नहीं किया।

रेटिना फ़ंक्शन का मूल्यांकन क्रमशः ऑप्टोमोटर रिफ्लेक्स और पैटर्न-ईआरजी का उपयोग करके व्यवहारिक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रूप से किया गया था (चित्रा 1 जी-जे)। दोनों मापदंडों ने हानि के दो चरणों को दिखाया: सर्जरी के बाद तीसरे दिन एक ओकुलर उच्च रक्तचाप तीव्र चरण, और सर्जरी के बाद 30वें दिन एक द्वितीयक अध: पतन चरण (चित्रा 1 एच, चित्रा जे, और तालिका 1)। बीच में, कार्यात्मक वसूली की अवधि का पता लगाया गया था, जैसा कि पहले कहीं और चर्चा की गईथी।

नियंत्रित साथी ऑप्टिक नसों की तुलना में, अर्ध-पतले ट्रांसवर्सल ऑप्टिक तंत्रिका वर्गों में अक्षीय गणना ने सर्जरी के बाद प्रगतिशील कमी दिखाई (तीसरा दिन: 68.3% ± 0.9%; 7 वां दिन: 59.2% ± 2.6%; 14 वां दिन: 45.4% ± 2.2%; 30वां दिन: 28.2% ± 3.0%; दो-तरफा एनोवा: पी < 0.0001; चित्रा 2 ए)। अल्ट्रा-संरचनात्मक रूप से, नियंत्रित आंखों से ऑप्टिक नसों ने घनी मात्रा में भरे माइलिनेटेड फाइबर प्रस्तुत किए, जो पतली ग्लियल कोशिकाओं की प्रक्रियाओं और स्पष्ट अक्षीय सूक्ष्मनलिकाएं और न्यूरोफिलामेंट्स (चित्रा 2 बी) द्वारा अलग किए गए थे। इसके विपरीत, ओएचटी के 3 दिनों के बाद, हमने एक्सॉन बंडलों का फोकल विघटन, कुछ विघटित फाइबर, ग्लियल कोशिकाओं की प्रक्रियाओं में साइटोप्लाज्मिक रिक्तीकरण, और ग्लियल सेल नाभिक में संघनित क्रोमैटिन पाया। ओएचटी प्रेरण के 7 दिनों के बाद, विघटित अक्षीय फाइबर, हाइपरट्रॉफिक ग्लियल सेल प्रक्रियाओं और व्यक्तिगत अक्षीय तंतुओं में सूजन और रिक्तियों में वृद्धि हुई थी। 14 दिनों में, सबसे प्रमुख परिवर्तनों में से एक ऑप्टिक तंत्रिका तंतुओं की अधिक अव्यवस्था थी, जो अक्षतंतु के बीच ग्लियल सेल प्रक्रियाओं के आक्रमण से जुड़ी थी। फिलामेंट बंडलों ने इन प्रक्रियाओं और गहरे विघटित तंतुओं को भर दिया, और माइलिन टूटना अधिक आम था, जो अलग और वैक्यूलाइज्ड लैमेला (चित्रा 2 बी) से जुड़ा था।

Brn3a+ प्रोफाइल का घनत्व समय के साथ कम हो गया (चित्रा 2C), मुख्य रूप से पृष्ठीय और लौकिक रेटिना क्वाड्रेंट्स में, 30 दिनों के बाद क्रमशः 32.4% ± 9.6% और 35.7% ± 9.1% तक गिर गया (आंकड़े 2 डी-जी और तालिका 2)।

Figure 1
चित्रा 1: लिम्बल संवहनी जाल का थर्मल कॉटराइजेशन और विवो में रेटिना फ़ंक्शन के परिणाम। (ए) चूहों में आईओपी को मापने के लिए वैकल्पिक तरीके: रिबाउंड टोनोमेट्री (बेहतर), और एप्प्लेनेशन टोनोमेट्री (हीन)। (B-E) शल्य चिकित्सा प्रक्रिया; तीर: लिम्बल संवहनी जाल; तीर: घुमावदार बल का उपयोग नेत्रगोलक की पूर्ववर्ती सतह को उजागर करने और लिम्बल वाहिकाओं के लिए शल्य चिकित्सा मूल्यांकन को अनुकूलित करने के लिए किया जाता है; हैश: कम तापमान वाले नेत्र कॉटरी का गोल सिरा; तारांकन: अंकन चिह्न. स्केल बार: 2 मिमी। इनसेट इन (डी) उच्च आवर्धन में दिखाता है कि लिम्बल वास्कुलचर को संकुचित किया जाना चाहिए। (एफ) ओएचटी (लाल) और नियंत्रण (काली) आंखों (एन = 131) में आईओपी माप का समय पाठ्यक्रम। ऊर्ध्वाधर नीचे की ओर तीर: एलपीसी सर्जरी। * = पी < 0.05 (जी) ऑप्टोमोटर प्रतिक्रिया विश्लेषण के लिए एरिना, जिसमें चार कंप्यूटर मॉनिटर शामिल हैं, जो एक चतुष्कोण में व्यवस्थित हैं, बीच में एक मंच के साथ। मॉनिटर एक आभासी सिलेंडर की छवि प्रदर्शित करते हैं जो ऊर्ध्वाधर वैकल्पिक काले और सफेद धारियों से बना होता है जो निरंतर घूर्णी गति और परिवर्तनीय स्थानिक आवृत्तियों के साथ जानवर के चारों ओर घूमते हैं। लाल क्रॉसहेयर आभासी सिलेंडर के केंद्र से मेल खाता है। (एच) ऑप्टोमोटर प्रतिक्रियाएं। सर्जिकल फॉलो-अप पर दो अलग-अलग चरणों को अलग किया जाता है: ओएचटी चरण (0-5 दिन) और द्वितीयक अध: पतन चरण (6-30 दिन)। = पी < 0.0001 (i) पैटर्न-ईआरजी (पीईआरजी) अधिग्रहण के लिए इलेक्ट्रोड और पशु स्थिति: कॉर्निया की अस्थायी परिधि पर सक्रिय इलेक्ट्रोड, और क्रमशः मानव अस्थायी कैंथस और पिछले अंगों में से एक के चमड़े के नीचे के ऊतक में संदर्भ और ग्राउंड इलेक्ट्रोड। जानवर उत्तेजना स्क्रीन से 20 सेमी पर स्थित है। (जे) विभिन्न स्थानिक आवृत्तियों के साथ उत्तेजनाओं पर पीईआरजी आयाम। ऑप्टोमोटर प्रतिक्रिया के समान, पीईआरजी मूल्यांकन भी सर्जरी के बाद प्रतिक्रियाओं के दो अलग-अलग चरणों को दर्शाता है: सर्जरी के 3 दिनों के बाद ओकुलर हाइपरटेंसिव, इसके बाद 7 और 14 वें दिन रिकवरी, हालांकि अभी भी भोले प्रतिक्रियाओं की तुलना में सांख्यिकीय रूप से कम है, और सर्जरी के बाद 30 वें दिन बाद में कमी। c/d = चक्र प्रति डिग्री। भोले समूह: जानवरों की आंखें किसी भी पिछले प्रयोगात्मक हेरफेर से अनजान हैं। (एच) और (जे) एसईएम ± औसत दिखाते हैं, साथ ही (एच) में व्यक्तिगत प्रतिकृतियां दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: कम तापमान वाले नेत्र कॉटरी के साथ लिम्बल वैस्कुलर प्लेक्सस कॉटराइजेशन (एलपीसी) के बाद रेटिना और ऑप्टिक तंत्रिका का संरचनात्मक मूल्यांकन। (ए) ओएचटी (एन = 3) के बाद एक्सॉन अलग-अलग समय पर गिनता है। = p = 0.0005, **** = p < 0.0001 (बी) ओएचटी के बाद ऑप्टिक तंत्रिका अध: पतन के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। बाईं छवि नियंत्रण ऑप्टिक तंत्रिका को दिखाती है, और निम्नलिखित छवियां ओएचटी के 3, 7 और 14 दिनों के बाद प्रगतिशील अध: पतन को दर्शाती हैं। एरोहेड: सामान्य माइलिनेटेड फाइबर; पतले तीर: विघटित फाइबर; तारांकन: साइटोप्लाज्मिक रिक्तीकरण; हैश: ग्लियल कोशिकाएं प्रक्रिया; और एनयू: ग्लियल सेल न्यूक्लियस। (सी) आरजीसी के प्रतिनिधि गिनती क्षेत्रों के फोटोमाइक्रोग्राफ को बीआरएन 3 ए (लाल) और टीओ-प्रो 3 लेबल नाभिक (नीला) के एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया है; स्केल बार: 50μm. (D-G) सर्जरी के 3-30 दिनों के बाद रेटिना के चार चतुर्थांशों में औसत Brn3a + सेल घनत्व का वितरण। ग्राफ प्रक्रिया के बाद प्रति समय 3-11 जानवरों के लिए आरजीसी घनत्व के व्यक्तिगत औसत दिखाते हैं। * = पी < 0.05; ** = पी < 0.01; = पी < 0.001; = पी < 0.0001 मात्रात्मक डेटा का मतलब SEM ± है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: पीईआरजी डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण। दो-तरफा एनोवा के बाद सिदक के कई तुलना परीक्षण हुए। 0.05 से कम पी-वैल्यू को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। c/d = चक्र प्रति डिग्री। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: एलपीसी के बाद आरजीसी का क्षेत्रीय नुकसान। एसईएम: माध्य की मानक त्रुटि। नियंत्रण: साथी आंख। 0.05 से कम पी-मान सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण (*) माना जाता था। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

लिम्बल प्लेक्सस कॉटराइजेशन (एलपीसी) एक नया पोस्ट-ट्रैब्युलर मॉडल है जिसका लाभ यह है कि यह आसानी से सुलभ संवहनी संरचनाओं को लक्षित करता है जिन्हें नेत्रश्लेष्मला या टेनोन विच्छेदन17,28 की आवश्यकता नहीं होती है। कोरॉयड शिरापरक जल निकासी के लिए शल्य चिकित्सा हानि पर आधारित एक प्रसिद्ध ओएचटी मॉडल, भंवर नसों के कॉटराइजेशन मॉडल से अलग, शिरापरक भीड़ से एलपीसी मॉडल में आईओपी वृद्धि को प्रभावित करने की उम्मीद नहीं है, क्योंकि लिम्बल नसें जलीय हास्य बहिर्वाह में ऊपर की ओर स्थित हैं। इसके अलावा, यह तकनीकी रूप से सीखना आसान है और कम लागत वाला है, जिसमें ज्यादातर कम तापमान थर्मिक कैटरी की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, यह ओएचटी प्रेरण और पूर्ण नैदानिक वसूली (> 90%, जैसा कि पहले बताया गया है) 23 की एक अनूठी दर से जुड़ा हुआ है, जो प्रयोगों के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करता है और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और व्यवहार विश्लेषण दोनों की अनुमति देता है। अंत में, ग्लूकोमाटस अपघटन सर्जरी के बाद अपेक्षाकृत कम समय सीमा में आरजीसी परत और ऑप्टिक तंत्रिका दोनों में मौजूद है, जो अल्पकालिक या मध्यम अवधि के प्रयोगात्मक डिजाइनों को सक्षम करता है। व्यक्तिगत रेटिना परतों पर पूर्ण-सर्कल लिम्बल वास्कुलचर कॉटराइजेशन के प्रभाव को और स्पष्ट करने के लिए भविष्य के अध्ययन आवश्यक हैं।

सर्जिकल प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरण हैं: (1) कॉटराइजेशन टिप को पोत अक्ष के समानांतर स्क्लेरल लिंबस को धीरे से छूना चाहिए; (2) कॉर्नियल ऊतक को बख्शा जाना चाहिए, न केवल कॉटराइजेशन के दौरान बल्कि पशु हेरफेर के दौरान भी। नियमित रूप से कॉटन स्वैब के साथ आंखों की सतह से अतिरिक्त घोल को हटाने और हटाने के लिए नियमित रूप से करें (सावधान रहें कि किसी भी तरल को हटाते समय कॉर्नियल सतह पर कपास के फाहे को रगड़ें नहीं, क्योंकि इससे कॉर्नियल एपिथेलियल घर्षण और अंततः सर्जरी के बाद की जटिलताएं होती हैं); (3) सन्निहित आवरण चिह्नों का एक पूर्ण चक्र देखा जाना चाहिए; (4) सर्जरी के बाद कम से कम 5वें दिन तक गैर-स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवा और एंटीबायोटिक मरहम के साथ पोस्टऑपरेटिव नैदानिक अनुवर्ती की उपेक्षा न करें।

वर्णित मॉडल में देखा गया सबस्यूट आईओपी उन्नयन ओपन-एंगल ग्लूकोमा के दबाव की गतिशीलता से भिन्न होता है, लेकिन तीव्र कोण-बंद ग्लूकोमा, नियोवास्कुलर ग्लूकोमा, या कई प्रकार के पोस्ट-ट्रैब्युलर ग्लूकोमा के समान होता है, जिसमें ऊंचा एपिस्क्लरल शिरापरक दबाव29 होता है। यह इस विधि की एक प्रमुख सीमा है, क्योंकि ओपन-एंगल ग्लूकोमा बीमारी का सबसे प्रचलित फेनोटाइप है, जो पुरानी ओएचटी और धीरे-धीरे प्रगतिशील आरजीसी अपघटन की विशेषता है। फिर भी, निरंतर आरजीसी अपघटन के साथ आईओपी के प्रगतिशील सामान्यीकरण का संबंध एक ही पशु मॉडल में, दोनों जैविक तंत्रों का अध्ययन करने का एक अनूठा अवसर दर्शाता है, जो ग्लूकोमा के विकास और प्रगति के साथ ओकुलर उच्च रक्तचाप को जोड़ते हैं, साथ ही माध्यमिक अपक्षयी प्रक्रिया जो ज्यादातर ओपन-एंगल ग्लूकोमा मामलों में देखी जाती है, जिसमें ग्लूकोमा के साथ मौजूद रोगी लक्ष्य आईओपी30 तक पहुंचने में नैदानिक या शल्य चिकित्सा सफलता के बावजूद प्रगति करते हैं।. इस प्रकार, यह मॉडल अल्पकालिक या मध्य-अवधि प्रयोगात्मक डिजाइनों के माध्यम से इस घटना को बेहतर ढंग से स्पष्ट करने का अवसर प्रदान करता है, और अंततः उन रोगियों को लाभ पहुंचाने के लिए दबाव-स्वतंत्र न्यूरोप्रोटेक्टिव थेरेपी विकसित करता है जो अभी भी सर्वोत्तम आईओपी नियंत्रण उपचार के बावजूद दृष्टि खो देते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम अपने प्रयोगशाला तकनीशियन जोस को स्वीकार करते हैं; निल्सन डॉस सैंटोस, डायने मंडेरिनो टोरेस, जोस फ्रांसिस्को टिबुर्सियो, गिल्डो ब्रिटो डी सूजा, और लुसियानो कैवलकेंट फरेरा। इस शोध को FAPERJ, CNPQ और CAPES द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Isofar 201 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Active electrode for electroretinography Hansol Medical Co - Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm
Anestalcon Novartis Biociências S/A MS-1.0068.1087 Proxymetacaine hydrochloride 0.5%
Calcium chloride Vetec 560 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx Bovie Medical Corporation AA00 Low-temperature ophthalmic cautery
Cetamin Syntec do Brasil Ltda 000200-3-000003 Ketamine hydrochloride 10%
DAKO Dako North America S3023 Antifade mounting medium
DAPI Thermo Fisher Scientific 28718-90-3 diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm
Ecofilm Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda MS-1.0298.0487 Carmellose sodium 0.5%
EPON Resin Polysciences, Inc. - Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553)
Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16110 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Hyabak União Química Farmacêutica Nacional S/A MS-8042140002 Sodium hyaluronate 0.15%
Icare Tonolab Icare Finland Oy TV02 (model number) Rebound handheld tonometer
IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific A31570 Secondary antibody solution
LCD monitor 23 inches Samsung Electronics Co. Ltd. S23B550 Model LS23B550, for electroretinogram recording
LSM 510 Meta Carl Zeiss - Confocal epifluorescence microscope
Maxiflox Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda MS-1.0298.0489 Ciprofloxacin 3.5 mg/g
MEB-9400K Nihon Kohden Corporation - System for electroretinogram recording
monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a MilliporeSigma MAB-1585 Brn3a primary antibody solution
Neuropack Manager v08.33 Nihon Kohden Corporation - Software for electroretinogram signal processing
Optomotry CerebralMechanics - System for optomotor response analysis
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19100 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Potassium ferrocyanide Electron Microscopy Sciences 20150 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Reference and ground electrodes for electroretinography Chalgren Enterprises 110-63 Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm
Sodium cacodylate buffer Electron Microscopy Sciences 12300 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Ster MD União Química Farmacêutica Nacional S/A MS-1.0497.1287 Prednisolone acetate 0.12%
Terolac Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda MS-1.0497.1286 Ketorolac trometamol 0.5%
Terramicina Laboratórios Pfizer Ltda MS-1.0216.0024 Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g
Tono-Pen XL Reichert Technologies 230635 Digital applanation handheld tonometer
TO-PRO-3 Thermo Fisher Scientific T3605 Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9036-19-5 Non-ionic surfactant
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 22400 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Xilazin Syntec do Brasil Ltda 7899 Xylazine hydrochloride 2%
Carl Zeiss - Stereo microscope for surgery and retinal dissection

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References

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Lani-Louzada, R., Abreu, C. A., Araújo, V. G., Dias, M. S., Petrs-Silva, H., Linden, R. Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents. J. Vis. Exp. (180), e63442, doi:10.3791/63442 (2022).

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